CN101475224B

CN101475224B - 聚乙烯吡咯烷酮修饰超顺磁性纳米氧化铁的制备法

Info

Publication number: CN101475224B
Application number: CN2009100957394A
Authority: CN
Inventors: 吴育连; 黄海
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2009-01-22
Filing date: 2009-01-22
Publication date: 2010-09-08
Anticipated expiration: 2029-01-22
Also published as: CN101475224A

Abstract

本发明公开了一种聚乙烯吡咯烷酮修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法，依次进行以下步骤：1)在惰性气体的保护下，于室温中将FeCl ₃·6H ₂O、FeCl ₂·4H ₂O和聚乙烯吡咯烷酮溶解于一缩二乙二醇中；2)在惰性气体的保护下，在上述所得的黄褐色溶液中加入NaOH和一缩二乙二醇的混合液进行反应；3)将上述所得的黑色悬浮液冷却至室温，加入乙酸乙酯离心；4)将离心所得的固体分散于无水乙醇中，再加入乙酸乙酯离心；5)重复步骤4)2～3次，得黑色固体；6)将黑色固体分散在去离子水中，置于截留分子量为10～15w的透析袋中透析至少48小时。本发明所得的聚乙烯吡咯烷酮修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒，用于胰岛移植物功能示踪。

Description

聚乙烯吡咯烷酮修饰超顺磁性纳米氧化铁的制备法

技术领域

本发明属于生物和医药技术领域，涉及材料化学，具体为通过高温多元醇过程技术，合成具有良好生物相容性的聚乙烯吡咯烷酮修饰的超顺磁性氧化铁(PolyvinylpyrrolidoneCoated Superparamagnetic Iron Oxide，PVP-SPIO)纳米颗粒，本发明还涉及该纳米颗粒在医学方面的用途。

背景技术

随着生活水平提高，糖尿病已成为威胁全人类健康、生命的重大社会问题，给社会造成巨大的经济负担。而胰岛移植被认为是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病的最有效手段，但由于缺乏有效的、无创伤的胰岛移植物监测技术，不能早期干预和预防原发性移植物失功能及免疫排斥反应的发生，导致目前移植效率及疗效不太理想。近几年分子影像学无创监测体内胰岛功能出现新的突破，为存活胰岛数量(BCM)监测技术发展奠定良好基础。

建立体内功能胰岛分子影像学示踪技术，动态监测胰岛移植后不同阶段胰岛功能活力维持与凋亡发生、发展，预测胰岛移植物功能的有效性，评价胰岛移植成功率及处理措施的有效性，是临床上糖尿病防治迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种聚乙烯吡咯烷酮修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(PVP-SPIO)的制备方法，采用该方法制得的PVP-SPIO纳米颗粒能用于胰岛移植物功能示踪。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种PVP-SPIO纳米颗粒的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、在惰性气体的保护下，于室温中将FeCl₃·6H₂O、FeCl₂·4H₂O和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解于一缩二乙二醇中，得到黄褐色溶液；所述FeCl₃·6H₂O与FeCl₂·4H₂O的摩尔比为2∶1，聚乙烯吡咯烷酮与FeCl₃·6H₂O的摩尔比为10～15∶1；

2)、在惰性气体的保护下，在上述黄褐色溶液中加入NaOH和一缩二乙二醇的混合液，先在室温下反应2～3小时，再缓慢升温至210℃～220℃，于210℃～220℃的温度下回流反应1.5～2.5小时，得到黑色悬浮液；所述NaOH与FeCl₃·6H₂O的摩尔比＝4∶1；

3)、将黑色悬浮液冷却至室温，加入乙酸乙酯离心，去除上清液；

4)、将离心所得的固体分散于无水乙醇中，再加入乙酸乙酯离心，去除上清液；所述乙酸乙酯与无水乙醇的体积比为5～10∶1；

5)、重复步骤4)2～3次，得黑色固体；

6)、将黑色固体分散在去离子水中，置于截留分子量为10～15w的透析袋中透析至少48小时，得到分散在去离子水中的PVP-SPIO纳米颗粒悬浮液。

作为本发明的PVP-SPIO纳米颗粒制备方法的进一步改进：步骤1)和步骤2)均在搅拌条件下进行。

作为本发明的PVP-SPIO纳米颗粒制备方法的进一步改进：惰性气体为Ar。

在本发明的PVP-SPIO纳米颗粒的制备方法中，步骤6)中透析的目的是为了从而进一步去除残余的PVP和DEG(一缩二乙二醇)，透析时间一般是48～168小时。

本发明还同时提供了上述PVP-SPIO纳米颗粒的用途，用于胰岛移植物功能示踪。

作为本发明的PVP-SPIO纳米颗粒的用途的改进：利用磁标记示踪技术早期监测胰岛移植物状态以及早期凋亡和氧化损伤的发生。

本发明的PVP-SPIO纳米颗粒的制备方法，是采用高温水解金属醇盐螯合物过程，制备出核心粒径为5～10nm的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Superparamagnetic Iron Oxide，SPIO)，并进一步应用聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidon，PVP)对颗粒进行表面修饰，从而得到高分散性、强磁性、粒径均匀的PVP-SPIO纳米颗粒。该PVP-SPIO纳米颗粒分散在去离子水中，呈黄褐色，可以长时间放置不产生团聚。

该PVP-SPIO纳米颗粒在动物胰岛细胞系和原代胰岛移植物的体内、外标记MRI扫描实验中证实具有良好的生物兼容性、稳定性和超顺磁性。通过PVP-SPIO纳米颗粒标记不同功能状态的动物胰岛细胞，体内移植后MRI扫描监测表明，PVP-SPIO纳米颗粒标记示踪技术可以早期监测胰岛移植物凋亡发生、发展，从而预测胰岛移植物功能的有效性。

采用本发明方法制得的PVP-SPIO纳米颗粒通过透射电子显微镜(TEM)、X射线衍射(XRD)、选区电子衍射(SAED)、高分辨透射电镜照片(HRTEM)；纳米激光粒度仪(DLS)和傅立叶红外吸收光谱(FTIR)等表征方法对其结构和形貌进行了表征，并通过振动样品磁强计(VSM)分析了其磁学性能，所得结果分别如图1～图7所示。具体结果如下：

TEM扫描提示颗粒核心直径约为5～10nm，尺寸分布集中，在水溶液中分散性良好。纳米激光粒度仪分析结果提示粒径尺寸，包括SPIO核心和外部的修饰层，其平均尺寸为45nm。颗粒表面裹有约30～40nm厚的PVP修饰层，所产生的空间位阻作用平衡了作用在颗粒表面的磁性和范德华吸引力，这为PVP-SPIO纳米颗粒提供了良好的胶体稳定性和生物相容性。从PVP-SPIO纳米颗粒的XRD图谱中可以看出纳米颗粒的所有衍射峰位都与立方相的Fe₃O₄标准图谱(JCPDS 85-1436)一致，而且衍射图谱中没有观察到其他杂质的衍射峰，说明合成的样品具有较高的纯度。从SAED图中可以观察到很清晰的衍射环，这说明样品结晶性好。对衍射花样进行标定可以知道颗粒为立方相的Fe₃O₄，这与X射线衍射的结果相符。从高分辨透射电镜照片图中可以看出存在两组高分辨条纹，一组条纹之间的间距为0.25nm，对应立方相Fe₃O₄的(220)晶面，一组条纹之间的间距为0.29nm，对应立方相Fe₃O₄的(311)晶面，这与选区电子衍射的结果相符。另外，从高分辨透射电镜照片可以知道单个的Fe₃O₄纳米颗粒为单晶。为了进一步证实修饰剂被成功包覆在纳米颗粒的表面，我们利用FTIR对SPIO纳米颗粒的表面修饰基团进行表征。从图中可以明显看到PVP的特征峰：2924cm^-1处的吸收峰是C-H键的不对称伸缩振动特征峰，1645cm^-1处的吸收峰为C＝O键的伸缩振动特征吸收峰，1220cm^-1处的吸收峰为C-N键的伸缩振动特征峰，以上这些特征峰说明PVP也被成功包裹在了SPIO纳米颗粒的表面。图7是PVP修饰的SPIO纳米颗粒在室温(300K)下，外磁场为2K时的磁滞回线。从图中可以看出PVP-SPIO纳米颗粒样品表现出超顺磁性，没有余磁和矫顽力，在包覆较厚修饰层(40～45nm)后仍具有较高的饱和磁化强度，达到63emu/g。

通过PVP-SPIO纳米颗粒在小鼠Beta-TC-6细胞的体外标记实验，证明其具有良好的标记效率和生物兼容性。MTT比色法检测PVP-SPIO纳米颗粒标记后的Beta-TC-6胰岛细胞活性结果看，400μgFe/mL浓度以下标记24h对胰岛细胞活性没有影响。在PVP-SPIO纳米颗粒100μgFe/mL标记胰岛细胞24h后，观察3代细胞的生长曲线，发现其对胰岛细胞的长期生长没有明显影响。流式细胞仪检测结果提示，100μgFe/mL PVP-SPIO纳米颗粒标记胰岛细胞并不会引起细胞早期凋亡和细胞内ROS(活性氧族)的明显增加。普鲁士兰铁染色证明100μgFe/mL PVP-SPIO纳米颗粒能够有效标记小鼠Beta-TC-6细胞，透射电镜进一步证实PVP-SPIO纳米颗粒进入胰岛细胞胞浆。葡萄糖刺激胰岛素释放试验结果证实PVP-SPIO纳米颗粒100μgFe/mL标记胰岛细胞24h后，未对胰岛细胞的胰岛素分泌功能造成损害。体外MRI扫描提示，2×10⁵小鼠Beta-TC-6细胞以0，25，50，100，200，400μg Fe/mL PVP-SPIO纳米颗粒标记24h后，T2信号随PVP-SPIO浓度增加而逐渐增强。

注：T2信号是MRI扫描T2相图像的产生来源，正常组织表现的T2信号高，呈白色。如果移植的胰岛细胞未经PVP-SPIO纳米颗粒标记，那么在MRI上和正常组织没有区别。经过PVP-SPIO纳米颗粒标记的胰岛细胞在MRI上表现出低信号，呈黑色，那么和周围正常组织区别非常明显。T2信号的强弱也和SPIO的磁性强弱、浓度或标记的效率呈正比。

将制备的PVP-SPIO纳米颗粒用DMEM高糖培养基(High Glucose-Dulbecco’smodified Eagle’s medium)以100μg Fe/mL浓度稀释，加入PLL(Poly-L-Lysin hydrobromide)与Fe质量之比为100∶1，与100个分离纯化的C57BL/6小鼠胰岛共孵育24h。用PBS洗3次除去残留PVP-SPIO纳米颗粒，离心后用50μL PBS稀释吹散标记过的胰岛，同种异体移植入C57BL/6小鼠左肾包膜下。在移植后1、8、15天，在临床3.0T核磁共振仪(GESigna Excite HD，Milwaukee，WI，USA)用30mm动物线圈进行扫描。发现肾包膜下移植物T2相呈现低信号，并随移植后的时间逐渐消退。将受体小鼠的肾脏进行病理切片，通过胰岛素免疫组织化学染色和普鲁士蓝染色，证明受体小鼠肾脏包膜下有经过PVP-SPIO纳米颗粒标记的胰岛细胞存在，和MRI扫描结果一致。该实验说明PVP-SPIO纳米颗粒可以有效标记小鼠的胰岛移植物，并且可以通过临床MRI动物线圈扫描观察移植物的部位和存活状况。

用H₂O₂500uM作用小鼠Beta-TC-6细胞1h，建立胰岛细胞氧化损伤模型。正常组和损伤组小鼠Beta-TC-6细胞，用制备的PVP-SPIO纳米颗粒以100μgFe/mL浓度(PLL与Fe质量之比为100∶1)标记24h后，C57BL/6小鼠开腹行左肾包膜下移植。移植后1天，用3.0T核磁共振30mm动物线圈进行扫描。T2map测量移植物T2值和R2值，计算每个受体移植物和正常肾皮质的R2值之比，观察到损伤组R2比值明显低于正常组，并具有统计学意义。制备的PVP-SPIO纳米颗粒标记不同功能状态的胰岛细胞，可以通过体内MRI扫描，观察到信号的改变，从而为临床上无创检测胰岛移植物功能奠定基础。

注：R2比值是为了表示经过PVP-SPIO纳米颗粒标记的胰岛移植物在MRI上信号的强弱，和移植物的状态呈正相关。我们通过比值，即和每个受体小鼠的正常肾皮质之比，来排除每个受体的个体差异，使得R2值更有可比性。

本发明具有以下特点：1、高温水解金属醇盐螯合物过程制备的PVP-SPIO纳米颗粒具有很好的高分散性、均一性和强磁性；2、在小鼠胰岛细胞系和原代胰岛移植物的体内、外标记MRI扫描实验中证实制备的PVP-SPIO纳米颗粒具有良好的生物兼容性、稳定性和超顺磁性；3、制备的PVP-SPIO纳米颗粒对小鼠胰岛细胞系和原代胰岛具有很高的标记效率，在体内、外MRI扫描中具有良好的信号表现；4、PVP-SPIO纳米颗粒标记示踪技术可以初步早期监测胰岛移植物凋亡发生、发展，从而观测胰岛移植物功能的有效性。

综上所述，本发明的PVP-SPIO纳米颗粒用于MRI示踪技术，为临床上无创监测胰岛移植物功能状态，评价移植物有效性提供安全、有效的手段。对促进人功能胰岛移植示踪的发展以及治疗糖尿病有重要的科学意义和广泛的应用前景。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1PVP-SPIO纳米颗粒的透射电镜照片；

图2PVP-SPIO纳米颗粒的X射线衍射照片；

图3PVP-SPIO纳米颗粒的选区电子衍射照片；

图4PVP-SPIO纳米颗粒高分辨透射电镜照片；

图5PVP-SPIO纳米颗粒的纳米激光粒度仪照片；

图6PVP-SPIO纳米颗粒的傅立叶红外吸收光谱照片；

图7PVP-SPIO纳米颗粒的振动样品磁强计照片；

图8MTT比色法检测PVP-SPIO纳米颗粒标记小鼠Beta-TC-6胰岛细胞活性；

图9PVP-SPIO纳米颗粒标记小鼠Beta-TC-6胰岛细胞普鲁士兰铁染色照片；

图10PVP-SPIO纳米颗粒标记小鼠Beta-TC-6胰岛细胞透射电镜照片；

图11PVP-SPIO纳米颗粒标记100个C57BL/6小鼠原代胰岛同种异体肾包膜下移植模型MRI扫描照片；

注：图11中A代表移植后1天，T2冠状位扫描图像；B代表移植后1天，T2横断位扫描图像；C代表移植后8天，T2冠状位扫描图像；D代表移植后8天，T2横断位扫描图像；E代表移植后15天，T2冠状位扫描图像；F代表移植后15天，T2横断位扫描图像。

图12PVP-SPIO纳米颗粒标记小鼠Beta-TC-6胰岛细胞，同种异体肾包膜下移植模型，胰岛素免疫组织化学染色和普鲁士蓝染色照片；

注：图12中A代表胰岛素免疫组化染色照片；B代表胰岛素/普鲁士蓝双染色照片。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明。

实施例1、一种聚乙烯吡咯烷酮修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(PVP-SPIO纳米颗粒)的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、在惰性气体Ar的保护下，于室温(20℃)中在搅拌条件下将0.27gFeCl₃·6H₂O、0.1gFeCl₂·4H₂O、2.7gPVP溶解于18ml的一缩二乙二醇(DEG)中，得到黄褐色溶液；

2)、在惰性气体Ar的保护下，在搅拌条件下，在上述黄褐色溶液中加入由0.16gNaOH和9ml DEG所组成的混合溶液，反应液立刻由黄褐色变为黑绿色；先在室温下反应2.5小时，再缓慢升温至210℃，于210℃的温度下回流反应2小时；反应过程中一直保持搅拌；最终得到黑色悬浮液；

3)、将黑色悬浮液冷却至室温，加入100ml乙酸乙酯5000rpm离心，去除上清液；得黑色固体；

4)、将上述离心所得的固体(即黑色固体)分散于20ml无水乙醇中，再加入100ml乙酸乙酯5000rpm离心，去除上清液；得黑色固体；

5)、将步骤4)所得的黑色固体按照步骤4)的方法进行重复处理，重复2～3次，得黑色固体；

6)、将步骤5)所得的黑色固体分散在10ml去离子水中，置于截留分子量为14w的透析袋中透析72小时，以进一步去除残余PVP和DEG，得到分散在去离子水中的PVP-SPIO纳米颗粒悬浮液。

实施例2、一种聚乙烯吡咯烷酮修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(PVP-SPIO纳米颗粒)的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、在惰性气体Ar的保护下，于室温(10℃)中在搅拌条件下将0.54gFeCl₃·6H₂O、0.2gFeCl₂·4H₂O、8.1gPVP溶解于36ml的一缩二乙二醇(DEG)中，得到黄褐色溶液；

2)、在惰性气体Ar的保护下，在搅拌条件下，在上述黄褐色溶液中加入由0.32gNaOH和18ml DEG所组成的混合溶液，反应液立刻由黄褐色变为黑绿色；先在室温下反应3小时，再缓慢升温至220℃，于220℃的温度下回流反应2小时；反应过程中一直保持搅拌；最终得到黑色悬浮液；

3)、将黑色悬浮液冷却至室温，加入200ml乙酸乙酯离心，去除上清液；得黑色固体；

4)、将上述离心所得的固体(即黑色固体)分散于40ml无水乙醇中，再加入260ml乙酸乙酯离心，去除上清液；得黑色固体；

6)、将步骤5)所得的黑色固体分散在20ml去离子水中，置于截留分子量为12w的透析袋中透析130小时，以进一步去除残余PVP和DEG，得到分散在去离子水中的PVP-SPIO纳米颗粒悬浮液。

实施例3、一种聚乙烯吡咯烷酮修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(PVP-SPIO纳米颗粒)的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、在惰性气体Ar的保护下，于室温(30℃)中在搅拌条件下将0.27gFeCl₃·6H₂O、0.1gFeCl₂·4H₂O、3.4gPVP溶解于18ml的一缩二乙二醇(DEG)中，得到黄褐色溶液；

2)、在惰性气体Ar的保护下，在搅拌条件下，在上述黄褐色溶液中加入由0.16gNaOH和9ml DEG所组成的混合溶液，反应液立刻由黄褐色变为黑绿色；先在室温下反应2.5小时，再缓慢升温至215℃，于215℃的温度下回流反应1.5小时；反应过程中一直保持搅拌；最终得到黑色悬浮液；

3)、将黑色悬浮液冷却至室温，加入100ml乙酸乙酯离心，去除上清液；得黑色固体；

4)、将上述离心所得的固体(即黑色固体)分散于20ml无水乙醇中，再加入180ml乙酸乙酯离心，去除上清液；得黑色固体；

6)、将步骤5)所得的黑色固体分散在10ml去离子水中，置于截留分子量为15w的透析袋中透析60小时，以进一步去除残余PVP和DEG，得到分散在去离子水中的PVP-SPIO纳米颗粒悬浮液。

实施例4、一种聚乙烯吡咯烷酮修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(PVP-SPIO纳米颗粒)的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、在惰性气体Ar的保护下，于室温(5℃)中在搅拌条件下将0.14gFeCl₃·6H₂O、0.05gFeCl₂·4H₂O、1gPVP溶解于9ml的一缩二乙二醇(DEG)中，得到黄褐色溶液；

2)、在惰性气体Ar的保护下，在搅拌条件下，在上述黄褐色溶液中加入由0.08gNaOH和4.5ml DEG所组成的混合溶液，反应液立刻由黄褐色变为黑绿色；先在室温下反应2小时，再缓慢升温至220℃，于220℃的温度下回流反应1.5小时；反应过程中一直保持搅拌；最终得到黑色悬浮液；

3)、将黑色悬浮液冷却至室温，加入50ml乙酸乙酯离心，去除上清液；得黑色固体；

4)、将上述离心所得的固体(即黑色固体)分散于10ml无水乙醇中，再加入100ml乙酸乙酯离心，去除上清液；得黑色固体；

6)、将步骤5)所得的黑色固体分散在5ml去离子水中，置于截留分子量为14w的透析袋中透析72小时，以进一步去除残余PVP和DEG，得到分散在去离子水中的PVP-SPIO纳米颗粒悬浮液。

实施例5、PVP-SPIO纳米颗粒体外标记小鼠Beta-TC-6细胞：

(1)将小鼠Beta-TC-6细胞以8×10⁴个种入96孔板，2×10⁵个种入24孔板，生长24h。

(2)将制备的PVP-SPIO纳米颗粒用DMEM高糖培养基以0，25，50，100，200，400μgFe/mL浓度稀释。再分别加入PLL，其质量浓度与Fe之比为100∶1。

(3)将所得的混合液在常温下振荡混匀1h；得6种含不同浓度PVP-SPIO纳米颗粒的培养基。

(4)96孔板分成6组，每组各对应一种浓度PVP-SPIO纳米颗粒的培养基；每孔加入200uL所述培养基。

同样，24孔板分成6组，每组各对应一种浓度PVP-SPIO纳米颗粒的培养基；每孔加入1mL所述培养基。

孵育24h后进行MTT检测，流式细胞仪检测，普鲁士兰染色，TEM观察，葡萄糖刺激胰岛素释放试验和体外MRI扫描。

结果为：MTT检测提示PVP-SPIO纳米颗粒400μgFe/mL以下浓度标记24h，对小鼠Beta-TC-6细胞活性没有明显影响。流式细胞仪检测提示PVP-SPIO纳米颗粒100μgFe/mL浓度标记24h，对小鼠Beta-TC-6细胞没有增加早期凋亡，细胞内ROS水平也没有明显增加。普鲁士蓝染色显示PVP-SPIO纳米颗粒标记的Beta-TC-6细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。电镜结果进一步证实PVP-SPIO纳米颗粒标记的Beta-TC-6细胞胞质内含有较多包裹纳米铁颗粒的囊泡。葡萄糖刺激胰岛素释放试验结果证实PVP-SPIO纳米颗粒100μgFe/mL标记胰岛细胞24h后，未对胰岛细胞的胰岛素分泌功能造成损害。体外MRI扫描提示，不同铁浓度PVP-SPIO纳米颗粒标记2×10⁵Beta-TC-6细胞24h，MRI扫描T2信号随标记铁浓度升高而增加。

实施例6、PVP-SPIO纳米颗粒标记小鼠Beta-TC-6细胞体外MRI扫描：

(1)将小鼠Beta-TC-6细胞以2×10⁵个种入24孔板，生长24h。

(2)制备的PVP-SPIO纳米颗粒，加PLL(其质量浓度与Fe之比为100∶1)，以0，25，50，100，200，400ug Fe/mL浓度与细胞共孵育24h。

(3)胰酶加EDTA消化后细胞计数，取2×10⁵个细胞，离心后用100uL培养基(DMEM高糖培养基，Gibco)吹散后加入到0.2mL Eppendorf管中，再次离心。

(4)将含有梯度浓度PVP-SPIO纳米颗粒标记小鼠Beta-TC-6细胞的Eppendorf管，排列在浸于蒸馏水的塑料架中。

(5)在3.0Tesla的临床核磁共振仪，用8通道的神经血管线圈进行扫描。TR/TE＝2,000/15，30，45，60，75，90，105，120ms；FoV＝4×4cm²；matrix size＝256×256；resolution＝156×156um；slice thickness＝1mm；扫描时间8分32秒。

结果为：制备的PVP-SPIO纳米颗粒标记的小鼠Beta-TC-6细胞团在体外MRI的T2信号，随PVP-SPIO纳米颗粒铁浓度的增加而升高。PVP-SPIO纳米颗粒在100ug Fe/mL浓度时，可以达到理想的信号强度。胰岛素免疫组织化学染色和普鲁士蓝染色证实移植小鼠肾脏包膜下有PVP-SPIO标记的小鼠Beta-TC-6细胞存在，和MRI扫描结果一致。

从上述结果可以得知：制备的PVP-SPIO纳米颗粒具有很好的生物相容性，能够有效标记小鼠Beta-TC-6细胞。

实施例7、PVP-SPIO纳米颗粒标记小鼠Beta-TC-6细胞肾包膜下移植MRI示踪：

(1)将小鼠Beta-TC-6细胞以2×10⁵个种入24孔板，生长24h。

(2)制备的PVP-SPIO纳米颗粒，加PLL(其质量浓度与Fe之比为100∶1)，以100ugFe/mL浓度与细胞共孵育24h。

(3)胰酶加EDTA消化后细胞计数，取2×10⁵个细胞，离心并PBS液洗3遍后，用50uL PBS重悬，开腹注射入已麻醉的C57BL/6小鼠左肾包膜下。

(4)移植后1天，在3.0Tesla的临床核磁共振仪，用小鼠线圈进行扫描。TR/TE＝200/8ms，number of averages＝32，FOV＝3.2×3.2cm²，matrix size＝256×256，resolution＝0.125×0.125mm²，slice thickness＝0.5mm，扫描时间27分18秒。

(5)将移植小鼠的肾脏进行石蜡切片，进行胰岛素免疫组织化学染色和普鲁士蓝染色。

结果为：制备的PVP-SPIO纳米颗粒以100ug Fe/mL标记的小鼠Beta-TC-6细胞24h，行同种异体肾包膜下移植后，能够在临床核磁共振仪小鼠线圈活体扫描中获得理想的移植物磁信号。胰岛素免疫组织化学染色和普鲁士蓝染色证实移植小鼠肾脏包膜下有PVP-SPIO标记的小鼠Beta-TC-6细胞存在，和MRI扫描结果一致。

从上述结果可以得知：制备的PVP-SPIO纳米颗粒具有良好的生物相容性和超顺磁性，能够有效标记小鼠Beta-TC-6细胞，进行同种异体肾包膜下移植MRI活体示踪。

实施例8、PVP-SPIO纳米颗粒标记小鼠原代胰岛肾包膜下移植MRI示踪：

(1)3到4周龄雌性C57BL/6小鼠，麻醉后开腹，结扎胆管下端。

(2)胆囊管开口处做胆总管穿刺，经胆总管、胰管向胰腺腺体注入2mL消化液(Hanks’平衡盐溶液含20mmol/L HEPES和2mg/mL胶原酶IV)。

(3)37℃消化38min后用10mL冰Hanks’平衡盐溶液终止。

(4)用纱布过滤去粗大的组织块，并用冰Hanks’平衡盐溶液洗，500g离心1～2min。

(5)将离心后的细胞用3mL 25％Ficoll溶液吹散，依次加入23％Ficoll溶液2ml、20％Ficoll溶液2ml和11％Ficoll溶液2ml，700g离心5min。

(6)在20％和23％Ficoll溶液分层处吸出胰岛细胞，用10mL冰Hanks’平衡盐溶液洗2遍，在显微镜下挑出完整胰岛100个。

(7)以制备的PVP-SPIO纳米颗粒，加PLL(其浓度与Fe之比为100∶1)，以100ug Fe/mL浓度与胰岛细胞共孵育24h。

(8)离心并用PBS液洗3遍后，用50uL PBS重悬后，开腹注射入已麻醉的C57BL/6小鼠左肾包膜下。

(9)移植后1、8、15天，在3.0Tesla的临床核磁共振仪，用小鼠线圈进行扫描。TR/TE＝200/8ms，number of averages＝32，FOV＝3.2×3.2cm²，matrix size＝256×256，resolution＝0.125×0.125mm²，slice thickness＝0.5mm，扫描时间27分18秒。

结果为：在移植后小鼠MRI扫描显示，1、8、15天均能观察到肾包膜下PVP-SPIO纳米颗粒标记的移植物磁信号，但信号强度随移植后时间延长而逐渐减弱。

从上述结果可以得知：制备的PVP-SPIO纳米颗粒能够有效标记原代的小鼠胰岛细胞，进行同种异体肾包膜下移植MRI活体示踪。

实施例9、PVP-SPIO纳米颗粒标记小鼠Beta-TC-6细胞同种异体移植物MRI功能成像：

(1)选择用H₂O₂打击，作为小鼠Beta-TC-6细胞的损伤模型。

(2)H₂O₂100～1000uM浓度梯度作用小鼠Beta-TC-6细胞1h，MTT比色法检测小鼠Beta-TC-6细胞损伤程度。

(3)以H₂O₂500uM浓度作用小鼠Beta-TC-6细胞1h，建立小鼠胰岛细胞氧化损伤模型，并用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞内ROS水平。

(4)将小鼠Beta-TC-6细胞以2×10⁵个种入6孔板，生长24～48h。

(5)分正常组和损伤组，损伤组用H₂O₂500uM作用小鼠Beta-TC-6细胞1h，使细胞发生氧化损伤；正常组用DMEM培养基代替H₂O₂。

(6)移除H₂O₂后，以制备的PVP-SPIO纳米颗粒，加PLL(其质量浓度与Fe之比为100∶1)，以100ug Fe/mL浓度与正常组和损伤组细胞共孵育24h。

(7)胰酶加EDTA消化后细胞计数，取5×10⁵个细胞，离心后用50uL PBS重悬，开腹注射入已麻醉的C57BL/6小鼠左肾包膜下。

(8)移植后1天，在3.0Tesla的临床核磁共振仪，用小鼠线圈进行扫描。TR/TE＝200/8ms，number of averages＝32，FOV＝3.2×3.2cm²，matrix size＝256×256，resolution＝0.125×0.125mm²，slice thickness＝0.5mm，扫描时间27分18秒。

(9)测量移植物和正常肾皮质的T2map序列的T2和R2值，计算每个受体的移植物和正常肾皮质的R2值之比，对正常组和损伤组的R2比值进行统计学分析。证明PVP-SPIO纳米颗粒标记小鼠Beta-TC-6细胞移植物MRI的信号值变化和移植物的功能状态相关。

(10)对正常组和损伤组的移植小鼠肾脏，进行石蜡切片和Tunel染色，观察移植物的凋亡发生程度。

结果为：通过MTT比色法、流式细胞仪对检测细胞凋亡和细胞内ROS水平的检测，证明H₂O₂500uM浓度作用小鼠Beta-TC-6细胞1h造成小鼠胰岛Beta-TC-6细胞氧化损伤模型成立。制备的PVP-SPIO纳米颗粒标记正常组和损伤组的小鼠Beta-TC-6细胞，移植后MRI扫描图像显示，正常组信号明显较损伤组强。通过计算T2map序列的R2比值，提示正常组R2比值较损伤组高，并且具有统计学意义。移植小鼠肾脏Tunel染色证实损伤组移植物凋亡程度明显高于正常组，其结果与MRI扫描结果一致。

从上述结果可以得知：制备的PVP-SPIO纳米颗粒标记不同活力状态的小鼠胰岛Beta-TC-6细胞，进行同种异体肾包膜下移植，可以通过临床核磁共振仪动物线圈扫描观测移植物图像和信号的差异，来反映移植胰岛细胞的活力状态、凋亡和氧化损伤程度。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种聚乙烯吡咯烷酮修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征是依次进行以下步骤：

1)、在惰性气体的保护下，于室温中将FeCl₃·6H₂O、FeCl₂·4H₂O和聚乙烯吡咯烷酮溶解于一缩二乙二醇中，得到黄褐色溶液；所述FeCl₃·6H₂O与FeCl₂·4H₂O的摩尔比为2∶1，聚乙烯吡咯烷酮与FeCl₃·6H₂O的摩尔比为10～15∶1；

5)、重复步骤4)2～3次，得黑色固体；

2.根据权利要求1所述的聚乙烯吡咯烷酮修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征是：所述步骤1)和步骤2)均在搅拌条件下进行。

3.根据权利要求2所述的聚乙烯吡咯烷酮修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征是：所述惰性气体为Ar。