CN108273071A - 一种食源性荧光纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种食源性荧光纳米粒的制备方法，包括如下步骤：S1：将三文鱼或鲅鱼在150～350℃烤制10～150min；S2：将烤制后样品浸泡于极性有机溶剂中浸提，浸提后的混合液旋转蒸发至完全除去极性有机溶剂；其中，该样品和该极性有机溶剂的质量与体积比为1:1～1:3，浸提时间为2～48h；S3：采用水和非极性有机溶剂复溶、分液除去非极性有机溶剂层，再加入非极性有机溶剂，反复萃取脱脂，直至水相溶液澄清透明为止；其中，水和每次加入的该非极性有机溶剂的质量与体积比为1:1～1:3；S4：将上述水溶性提取物过液相色谱柱层析，收集荧光部分，冻干，即得。该法突破传统制备荧光纳米粒子方式，具有制备过程简单，其制得的例子生物安全性高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及新型荧光碳纳米材料制备及分子载运应用技术领域，更具体地说，涉及一种食源性荧光荧光纳米粒子、其制备方法及其在生物活性分子载运中的应用。
背景技术
荧光纳米粒子最早被意外发现，在2006年便有人制备并获得了直径小于10nm且具有荧光性能的碳纳米粒，其具有一系列优异的物理及化学性质，如表面效应、量子尺寸效应、量子隧道效应、良好的水溶性、发光稳定性等。荧光纳米粒子在生物成像、生物传感、药物载体及光催化等众多领域表现出良好的应用前景，引起了人们的广泛关注，使其研究得到了飞速发展。
荧光纳米粒子表面存在丰富的带电荷官能团，如氨基，羧基等，这使其可能通过共价接枝或者静电相互作用来装载带有活性基团的活性物质，利用荧光纳米粒子与活性物质之间的荧光能量传递现象实现活性物质释放过程的可视化监测。目前荧光纳米粒子采用水热合成法、电弧放电法合成法、高温高压法、电化学扫描法以及有机物热解法等方法制得，这些制备方法增加了其潜在的生物毒性。
发明内容
本发明针对现有合成的荧光纳米粒子生物安全性存在隐患问题，提出了一种食品源荧光纳米粒子的制备方法及其在生物活性分子载运中的应用，突破传统制备荧光纳米粒子方式，具有制备过程简单，且得到的产品生物安全性高等优点；同时，提供利用荧光纳米粒子载运生物活性分子的应用。
有鉴于此，本发明提出了一种食源性荧光纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将三文鱼或鲅鱼在150～350℃烤制10～150min；在食材的选择上，也不一定非要限定为三文鱼或鲅鱼，其它的能够得到特定的符合本案发明目的性质的材料也能被视为制备原料；
S2：将烤制后样品浸泡于极性有机溶剂中浸提，浸提后的混合液旋转蒸发至完全除去极性有机溶剂；其中，该样品和该极性有机溶剂的质量(g)与体积比(ml)为1:1～1:3，浸提时间为2～48h；
S3：采用水和非极性有机溶剂复溶、分液除去非极性有机溶剂层，再加入非极性有机溶剂，反复萃取脱脂，直至水相溶液澄清透明为止；其中，水和每次加入的该非极性有机溶剂的质量与体积比为1:1～1:3；
S4：将上述水溶性提取物过液相色谱柱层析，收集荧光部分，冻干，即得。
优选地，所述步骤S1中，将500g三文鱼在200℃烤制60min。
进一步地，所述步骤S2中，极性有机溶剂为无水乙醇。样品和无水乙醇的质量体积比优选为1:2，浸提时间优选为10h。
具体地，所述步骤S3中，非极性有机溶剂为三氯甲烷。水和三氯甲烷的体积比为1:1。
进一步地，步骤S4的色谱柱的填料任选自葡聚糖凝胶、D101大孔树脂和C18填料，比如Sepax C18。
本发明还提出了一种食源性荧光纳米粒，其特征在于，该食源性荧光纳米粒为，由烤制的鱼类制备而来，粒径分布在1.6-3.6nm，平均粒径大小为2.64±0.42nm且晶格间距在0.21nm的球形粒子。
进一步地，所述鱼类选自三文鱼或鲅鱼。
具体地，该食源性荧光纳米粒为表面具有官能团，该官能团包括C-C、C＝C、C-O、C-N、C＝O、C＝N、C-N、C-H、C-O或C＝O。
进一步地，该食源性荧光纳米粒的寿命为大于6.00ns。
进一步地，该食源性荧光纳米粒的荧光光谱最大激发波长300-500nm，最大发射波长在330-650nm。
本发明还提出了一种上述食源性荧光纳米粒在搭载生物活性物质中的应用。
本发明还提出一种包含任一上述食源性荧光纳米粒的复合物，其特征在于，该复合物还包括多巴胺或阿霉素。当然，该复合物也可以包括其它药物，甚至是营养物质，活生物活性小分子等任何能实现载运目的的物质。
本发明的技术方案有如下优点：
(1)选择了食源性的原料作为荧光纳米粒的制备来源，并在具体选择鱼类后，发现并提取出其中的荧光纳米粒；
(2)由于烤制的鲅鱼和三文鱼等蛋白食品早已成为人们日常生活中的一道美味菜肴，已被人类享用几个世纪，因此从中提取的荧光纳米粒子的生物安全性非常高，因而在安全性要求较高的生物活性分子载运领域将拥有巨大的应用潜力；
(3)提出了具体的食源性荧光纳米粒的制备方法，该制备方法与传统合成方法相比较，原料来源于食品、具有纳米小尺寸效应、制备过程简单、生物安全性高、水分散性好、高荧光稳定性等优点，荧光纳米粒子表面存在丰富的带电荷官能团，这使其可能通过共价接枝或者静电相互作用来担载带有活性基团的活性物质，利用荧光纳米粒子与活性物质之间的荧光能量传递现象实现活性物质释放过程的可视化监测；
(4)本发明制备得到的荧光纳米粒子具有很好的细胞相溶性，可搭载生物活性物质进入机体细胞内，但是不靶向细胞核；且能顺利搭载生物活性物质进入机体的目标脏器中；
(5)本发明制备得到的荧光纳米粒子搭载能力强，甚至在高达2mg/ml以上时，其载药能力仍随着药物浓度增加而增加。
附图说明
图1为本发明制备的荧光纳米粒子的透射电镜图；
图2为本发明制备的荧光纳米粒子的X射线光电子能谱图；
图3为本发明制备的荧光纳米粒子的细胞活力实验；
图4为本发明制备的荧光纳米粒子的荧光光谱图；
图5为本发明制备的荧光纳米粒子以及与多巴胺作用后的红外光谱图；
图6为本发明制备的荧光纳米粒子以及与多巴胺作用后的荧光寿命图；
图7为本发明制备的荧光纳米粒子与多巴胺作用后的透射电镜图；
图8为本发明制备的荧光纳米粒子与多巴胺作用后的荧光光谱；
图9为本发明的荧光纳米粒子在肝癌细胞中的分布；
图10为本发明的荧光纳米粒子在小鼠肠道中的分布；
图11为本发明的荧光纳米粒子在小鼠脑部中的分布；
图12为本发明的荧光纳米粒子在小鼠肝部中的分布；
图13为本发明的荧光纳米粒子在小鼠肺部中的分布；
图14为本发明的荧光纳米粒子在小鼠肾部中的分布；
图15为本发明的载药后荧光纳米粒子的细胞活力图。
具体实施方式
如前所述，本发明旨在提供一种食源性荧光纳米粒及其制备方法和应用。以下将结合实验例的内容进行具体描述。
特别需要指出的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
荧光纳米粒子的形貌采用透射电镜(JEM-2100 JEOL,Tokyo,Japan)、原子力显微镜(5500M,Hitachi,Tokyo,Japan)观察，光学性质采用荧光分光光度计(F-2700,Hitachi,Tokyo,Japan)，荧光寿命采用稳态/瞬态荧光分光光度计测定(FLS980,EdinburghInstrumentsCo.,Livingston,UK)，元素与官能团组成采用X射线光电子能谱(ESCALAB250,Thermo VG,Waltham,MA,U.S.A.)以及傅里叶红外光谱仪分析(Perkin Elmer,Norwalk,USA)。此外，本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明提出了一种食源性荧光纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将三文鱼或鲅鱼在150～350℃烤制10～150min；
S2：将烤制后样品浸泡于极性有机溶剂中浸提，浸提后的混合液旋转蒸发至完全除去极性有机溶剂；其中，该样品和该极性有机溶剂的质量与体积比(g/ml)为1:1～1:3，浸提时间为2～48h；
S3：采用水和非极性有机溶剂复溶、分液除去非极性有机溶剂层，再加入非极性有机溶剂，反复萃取脱脂，直至水相溶液澄清透明为止；其中，水和每次加入的该非极性有机溶剂的质量与体积比为1:1～1:3；
S4：将上述水溶性提取物过液相色谱柱层析，收集荧光部分，冻干，即得相应的荧光纳米粒。
对该荧光纳米粒子的形貌，元素与官能团组成，细胞毒性，光学性质以及荧光寿命等性质进行分析后，将荧光纳米粒子与药物、营养物质，生物活性小分子等进行包埋或担载，达到安全载运生物活性分子的目的。
该担载过程具体来说，在荧光纳米粒子中添加一定量的生物活性物质，在一定温度下进行自组装或者是化学键合反应，然后混合液经过分离去除自由生物活性物质，获得荧光纳米粒子-活性物质复合体。
优选地，所述步骤S1中，将500g三文鱼在200℃烤制60min。
进一步地，所述步骤S2中，极性有机溶剂为无水乙醇。样品和无水乙醇的质量体积比(g/ml)优选为1:2，浸提时间优选为10h。
具体地，所述步骤S3中，非极性有机溶剂为三氯甲烷。水和三氯甲烷的体积比为1:1。
进一步地，步骤S4的色谱柱的填料任选自葡聚糖凝胶、D101大孔树脂或C18填料，比如Sepax C18。
本发明还提出了一种食源性荧光纳米粒，其特征在于，该食源性荧光纳米粒为，由烤制的鱼类制备而来，粒径分布在1.6-3.6nm，平均粒径大小为2.64±0.42nm且晶格间距在0.21nm的球形粒子。
进一步地，所述鱼类选自三文鱼或鲅鱼。
具体地，该食源性荧光纳米粒为表面具有官能团，该官能团包括C-C、C＝C、C-O、C-N、C＝O、C＝N、C-N、C-H、C-O或C＝O。
进一步地，该食源性荧光纳米粒的寿命为大于6.00ns。比如，荧光纳米粒子可用于肿瘤成像，一般来说，荧光寿命越长肿瘤成像效果越明显。
进一步地，该食源性荧光纳米粒的荧光光谱最大激发波长370300-500nm，比如370nm，，最大发射波长在330-500，比如650nm。
本发明还提出一种本发明还提出了一种上述食源性荧光纳米粒在搭载生物活性物质中的应用。
本发明还提出一种包含任一上述食源性荧光纳米粒的复合物，其特征在于，该复合物还包括多巴胺或阿霉素。当然，该复合物也可以包括其它药物，甚至是营养物质，生物活性小分子等任何能实现载运目的的物质。通过向荧光纳米粒子中添加一定量的药物、营养物质或生物活性小分子，在一定温度下进行自组装或者是化学键合反应，然后混合液经过分离去除未结合的自由组分，即获得荧光纳米粒子-活性物质复合体。
实施例1
500g三文鱼(购于大连长兴水产品市场)经过200℃烤制60min，将经过烤制的三文鱼浸泡于2倍体积的无水乙醇中，浸提10h，取出上清液，旋转蒸发至完全除去乙醇，采用水:三氯甲烷＝1:1的混合溶液复溶、然后去除三氯甲烷，再加入三氯甲烷萃取脱脂，直至水相溶液澄清透明为止，将水相粗提溶液浓缩后经过D101大孔吸附树脂柱层析，收集荧光部分，冷冻干燥得到荧光纳米粒子。
荧光纳米粒子的TEM分析(图1)，可知本方法可成功制备出球形荧光纳米粒子，该荧光纳米粒子粒径分布在1.6-3.6nm，平均粒径大小为2.64±0.42nm，并且具有良好的结晶度，晶格间距约0.21nm。通过X射线光电子能谱分析得到荧光纳米粒子主要有碳氮氧氢等元素组成(图2)，并且含有C-C/C＝C、C-O/C-N、C＝O/C＝N，C-N、C-H，C-O、C＝O等官能团组成。MTT实验(图3)表明荧光纳米粒子在5mg/mL时细胞活力没有下降，说明荧光纳米粒子生物安全性较高。荧光纳米粒子的荧光光谱(图4)中可以看到最大激发波长为380nm，最大发射在450nm。荧光纳米粒子的红外光谱(图5)中可以看出荧光纳米粒子表面含有C-C、C-O、C-N、C-H等官能团组成。将荧光寿命图谱(图6)进行拟合后得到荧光纳米粒子的寿命为6.43ns。
10mg/mL的荧光纳米粒子中添加2mg/mL多巴胺(DA)(Aladdin Reagent Inc.)，在室温下反应10h然后混合液过0.22um的滤膜，将过滤好的混合液进行透射电镜，荧光寿命，红外光谱以及荧光性的测定。透射电镜(图7)结果表明荧光纳米粒子和多巴胺聚合后粒径增加到4.37±0.63nm，红外光谱(图5)中发现荧光纳米粒子和多巴胺聚合后C-O键的比例较荧光纳米粒子增加，荧光纳米粒子和多巴胺聚合后荧光寿命(图6)降为4.45ns。荧光光谱(图8)最大激发波长370nm，最大发射波长在500nm，以上结果表明荧光纳米粒子和多巴胺发生了聚合，并且荧光纳米粒子与多巴胺之间发生荧光能量传递现象，说明荧光纳米粒子可以载运多巴胺活性物质。
实施例2
取实施例1制备得到的荧光纳米粒子，利用肝癌细胞(中科院上海细胞所)完全培养基作为溶剂配制成10mg/mL的荧光纳米粒子，采用此荧光纳米粒子的溶液在37℃下培养肝癌细胞5h，然后在激光共聚焦显微镜下测定荧光纳米粒子在细胞中的分布。将荧光纳米粒子配制成水溶液，按照2g/kg的计量喂食模式鼠(SPF级小鼠，大连医科大学)，6h后宰杀后取肠，脑部，肝脏，肺部以及肾脏等，采用小动物活体荧光成像仪观察荧光纳米粒子的分布。
从图9中可以看出荧光纳米粒子可以进入细胞内部但是没有进入细胞核，这说明荧光纳米粒子具有很好的细胞相溶性，可搭载生物活性物质进入机体细胞内，但是不靶向细胞核。从图10中可以看出荧光纳米粒子进入肠道中，从图11中可以看出荧光纳米粒子可以穿过血脑屏障进入脑部，从图12可以看出荧光纳米粒子可以进入肝脏中，从图13可以看出荧光纳米粒子可以进入肺中，从图14可以看出荧光纳米粒子可以进入肾中，说明荧光纳米粒子可以搭载生物活性物质进入机体。
实施例3
取实施例1中的荧光纳米粒子，按照质量比16：1加入DOX(Sigma)，4℃避光搅拌反应24h。冷冻干燥后，每1g载药后荧光纳米粒子加入30ml无水乙醇溶解，5000rpm离心，反复3次直至上清无色透明，将沉淀物在-20℃避光挥发乙醇24h。将其溶于MEM(北京宝希迪有限公司)和1640(大连美仑生物科技有限公司)培养液中，分别将HepG2(中科院上海细胞所)和B16F10(中科院上海细胞所)细胞接种到96孔板内，经过2天，进入对数生长期；避光配制10，5，2，1，0.5，0.2，0.1mg/ml的载药荧光纳米粒子培养基，同时配置相同浓度的荧光纳米粒子培养基作为对照。加入细胞，孵育24h后，加入MTT(Aladdin Reagent Inc.)试剂，反应4h，DMSO溶解测570nm的吸光度，考查荧光纳米粒子的载药效果。
从MTT(图15)实验结果可以看出在低剂量载药荧光纳米粒子培养基(0.1mg/ml)时，对照组和实验组(即载药组，+DOX)的细胞活力基本没有变化，当随着载药荧光纳米粒子培养基的浓度增加，HepG2和B16F10细胞活力逐渐降低，此结果表明荧光纳米粒子搭载DOX进入细胞，并且成功发挥其功效，甚至在2mg/ml以上浓度时，其活力仍在降低，表明其拥有巨大的载药潜力。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种食源性荧光纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将三文鱼或鲅鱼在150～350℃烤制10～150min；
S2：将烤制后样品浸泡于极性有机溶剂中浸提，浸提后的混合液旋转蒸发至完全除去极性有机溶剂；其中，该样品和该极性有机溶剂的质量与体积比为1:1～1:3，浸提时间为2～48h；
S3：采用水和非极性有机溶剂复溶、分液除去非极性有机溶剂层，再加入非极性有机溶剂，反复萃取脱脂，直至水相溶液澄清透明为止；其中，水和每次加入的该非极性有机溶剂的质量与体积比为1:1～1:3；
S4：将上述水溶性提取物过液相色谱柱层析，收集荧光部分，冻干，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，极性有机溶剂为无水乙醇，样品和无水乙醇的质量体积比为1:2，浸提时间为10h。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，非极性有机溶剂为三氯甲烷，水和三氯甲烷的体积比为1:1。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤S4的色谱柱的填料任选自葡聚糖凝胶、D101大孔树脂和C18。
5.一种食源性荧光纳米粒，其特征在于，该食源性荧光纳米粒为，由烤制的鱼类制备而来，粒径分布在1.6-3.6nm，平均粒径大小为2.64±0.42nm且晶格间距在0.21nm的球形粒子。
6.根据权利要求5所述的食源性荧光纳米粒，其特征在于，所述鱼类选自三文鱼或鲅鱼。
7.根据权利要求5或6所述的食源性荧光纳米粒，其特征在于，该食源性荧光纳米粒为表面具有官能团，该官能团包括C-C、C＝C、C-O、C-N、C＝O、C＝N、C-N、C-H、C-O或C＝O。
8.根据权利要求5或6所述的食源性荧光纳米粒，其特征在于，该食源性荧光纳米粒的寿命为大于6.00ns。
9.如权利要求5-8任一所述食源性荧光纳米粒在搭载生物活性物质中的应用。
10.包含如权利要求5-8任一所述食源性荧光纳米粒的复合物，其特征在于，该复合物还包括多巴胺或阿霉素。
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