CN111440611B - 一种食醋来源的碳点及其制备方法与用途 - Google Patents

一种食醋来源的碳点及其制备方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种食醋来源的碳点及其制备方法与用途，属于纳米荧光材料制备技术领域，本发明以食醋为原料，将食醋经过超滤、超声处理后，在高压反应釜160‑200℃条件下反应2.5‑6h得到褐色浓缩液体，再经离心、脱色、抽滤和冷冻干燥得到一种蓝绿色荧光碳点。该制备方法利用绿色食品食醋为碳源，通过简单方便的水热法来制备碳点，具有优良的荧光特性，并且还具有细胞毒性低、生物相容性好等优点，在细胞成像方面有良好的应用潜能。

Description

一种食醋来源的碳点及其制备方法与用途
技术领域
本发明属于纳米荧光材料制备技术领域，具体涉及一种食醋来源的碳点及其制备方法与用途。
背景技术
碳点(Carbon Dots,CDs)是指粒径尺寸小于10nm的一类碳纳米颗粒，呈单分散形态的，几何形状近似球形的零维半导体结构。2004年Xu首次通过电泳法将单层碳纳米管制备出小于10nm的荧光碳纳米粒子，之后碳点便不断的受到关注，成为近年来最受欢迎的荧光碳纳米材料之一。与传统的量子点相比，碳点不仅具有更强的的荧光特性，还具有良好的生物相容性和低毒性等优点。这些优点使其在细胞成像、离子检测、药物传输等领域具有非常大的应用潜力。本发明由食品级的食醋为来源制得碳点，与其他由有机物、无机物制备的碳点相比，更加绿色环保，简单安全，具有较强的细胞相容性和较低的细胞毒性，细胞、小鼠以及人体自身代谢碳点均无困难，此发明拓展了食醋在生物方面的应用价值，具有广阔的市场应用空间。
目前，碳点的制备方法总体可概括为两大类：自上而下和自下而上。自上而下法是通过物理或者化学方法从比较大的碳骨架上剥落碳纳米粒子的合成方法,主要包括电弧放电法，激光刻蚀法，电化学法等。通常这种方法的产率低，耗时较长，反应条件严苛，因此限制了此类方法的发展。自下而上法是通过热解或碳化有机小分子或者将芳香族分子逐步融合来生产碳点，主要包括微波辐射法和水热合成法。水热合成法具有原料广泛且价格低廉，合成时间较短等优点。
在其他碳点制备方法的专利中，有些需要额外添加氮、硫源来增强碳点粒子产率和荧光性能。如公开号为CN105542760A的发明专利《一种掺杂氮、硫的荧光碳点制备方法》，采用水热法以柚子汁作为前驱体，以含N、S的化合物作为钝化剂制备荧光碳点。该方法将柚子汁分别与硫酸铵、过硫酸铵、硫代乙酰铵、硫化铵加入反应釜内加热数小时。将反应液离心，过滤膜，透析后即得碳点水溶液。本发明所用的柚子汁源于自然资源，易于获取，掺杂氮、硫有利于增强其荧光性能。该方法制备过程简单、条件可控，绿色环保。
公开号位CN110358533A的发明专利《一种氮-硫掺杂绿色荧光碳点的制备方法及应用》，其涉及一种以三乙醇胺为溶剂氮-硫掺杂的绿色荧光碳点的制备方法。本发明提供的以三乙醇胺为溶剂制备绿色荧光碳点的方法是：(1)室温条件下，将牛磺酸溶解于三乙醇胺中，超声分散，将上述溶液转移到反应釜中，在一定温度下恒温反应一定时间得到的溶液；(2)进行干燥处理后，加入乙醇洗涤，过滤，得到溶液，旋蒸，即得到绿色荧光碳点固体；(3)本发明中，首次以三乙醇胺为溶剂牛磺酸为碳源制备绿色荧光碳点，操作简单，原料易得且价格便宜，反应条件温和可以调控。另一方面，原料含有大量的N、O、S，无需加掺杂剂就可直接获得氮-硫掺杂的绿色荧光碳点，制得的荧光碳点细胞毒性低、生物相容性好、荧光强度高、荧光稳定性好，该荧光碳点可用于金属离子检测、生物标记以及生物影像等。
而针对于上述技术，往往通过硫、氮的添加来获得更为显著的高产率、高荧光性能等技术效果，但同时也会带来工艺复杂，制备成本提高，环境污染等问题，因此现有技术中，亟待提供一种简便、环保、清洁的荧光碳点制备方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种食醋来源的荧光碳点及其制备方法与用途，以解决现有技术中存在的问题，所述荧光碳点的制备原材料易得，制备方法简单方便、绿色环保，耗时少、产率高。所制得碳点具有优良的荧光特性，细胞毒性低，水溶性和生物相容性高，在细胞成像等方面具有良好的应用前景。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种食醋来源的荧光碳点，所述碳点是以食醋为原料，将所述食醋经离心、超滤、超声、稀释后，进行水热合成，并经过离心、脱色、抽滤、冷冻干燥后获得。
本发明中，食醋中，有机酸只是很微弱几乎没有抗氧化活性，但是部分氨基酸是具有抗氧化活性，因此食醋中，醋酸等有机酸可以作为碳点提供碳源，氨基酸等物质为碳点提供氮元素，可以提高碳点的荧光性能和量子产率。
优选地，所述食醋中，总酸含量≥4.00g/100ml，不挥发酸含量为≥2.00g/100ml，总氮含量≥0.20g/100ml。
更优选地，所述食醋中，总酸含量为4.0-20.0g/100ml，不挥发酸含量为2.00-5.00g/100ml，总氮含量为1.0-10.0g/100ml。
优选地，所述食醋中，醋酸含量为3.00-6.00g/100ml
更优选地，所述食醋中，总氨基酸含量为1.0-3.0g/100mL。
优选地，所述食醋来源于山西老陈醋、福建红曲醋、镇江香醋或镇江陈醋中的一种。
优选地，所述超滤过程中，超滤截留分子量≥10kDa。
优选地，所述水热合成条件为：反应温度为160-200℃，反应时间为2.5-6h。
更优选地，所述水热合成条件为：反应温度为170-190℃，反应时间为3-5h。
更优选地，所述水热合成条件为：反应温度为175-185℃，反应时间为3.5-4.5h。
本发明的另一目的是提供所述食醋来源的荧光碳点的制备方法，步骤如下：
(1)离心、超滤：将食醋进行离心，保留上清液，继续进行超滤，保留滤出液；
(2)超声：对所述步骤(1)得到的滤出液进行超声处理；
(3)水热合成：将所述步骤(2)得到的醋液与水按照体积比1:(1-5)稀释后，放进高压反应釜内，在160-200℃下反应2.5-6h得到浓缩液；
(4)离心，脱色：将所述步骤(3)得到的浓缩液经离心后保留上清液，向所述上清液中加入活性炭进行脱色，待脱色完成后再进行离心，保留上清，得到脱色液；
(5)抽滤，冷冻干燥：将所述步骤(4)所得的脱色液进行抽滤，得到纯净的浓缩液，并进行冷冻干燥，得到荧光碳点。
优选地，所述步骤(1)中，离心条件为4-10℃，4000-6000rpm处理10-20min。
更优选地，所述步骤(1)中，超滤条件为：选用10kDa超滤膜进行超滤。
所述步骤(1)的超滤过程：食醋中含有一定的大分子物质类黑精，而未经过超滤的食醋合成的碳点会含有类黑精等杂质，影响接下来碳点的实际应用效果。本发明通过超滤除去食醋中的类黑精，使水热合成法得到的碳点较为纯净，克服了以未超滤的食醋合成的碳点还有杂质的缺点。本发明的离心条件和超滤条件的设置，可以更好地除去大分子物质类黑精。
优选地，所述步骤(2)中，所述超声处理条件为，在25-30℃条件下超声处理10-20min。
优选地，所述步骤(3)中，所述高压反应釜内，最大压强为10MPa，在反应过程中压强为5-7MPa。
所述步骤(3)中，稀释目的：食醋一般较为浓稠，即使经过超滤某些食醋也会比较浓，稀释后反应不容易变焦糊。
优选地，所述步骤(4)中，所述离心条件为在4-10℃，6000-10000rpm条件下，离心10-20min。
优选地，所述步骤(4)中，所述脱色条件为60-70℃脱色0.5-1.5h，所述活性炭的添加量占比所述上清液质量百分比为1.5-2.5％(w/v)，脱色完成后再进行离心。
所述步骤(4)的离心、脱色过程在于进一步提高碳点的纯度并脱去自身颜色，以防自身颜色遮盖荧光。
优选地，所述步骤(5)中，抽滤条件为，选取孔径为0.22μm微孔滤膜进行抽滤。
优选地，所述步骤(5)中，所述冷冻干燥条件为，在-60～-80℃，压力0.35-0.37Atm条件下进行真空冷冻干燥。
本发明的另一目的是提供所述食醋来源的荧光碳点的用途。
优选地，所述荧光碳点在荧光染剂中的用途。
优选地，所述荧光碳点的浓度为1.0-1.5mg/mL。
本发明的有益效果在于：
传统食醋作为一种酸味调味品，已经有3000多年的制作历史。研究报道食醋中不仅含有丰富的氨基酸、糖类、维生素和微量元素等营养物质，还含有有机酸、多酚类化合物、类黑精、四甲基吡嗪等多种功能因子。在其他碳点制备方法的专利中，有些需要额外添加氮、硫源来增强碳点粒子产率和荧光性能，而食醋中含有丰富的氨基酸、维生素和微量元素等物质，其自身提供了氮、磷、硫源，不需要额外添加，使得碳点的制备更简单方便。另外，食醋是我们日常生活中不可或缺的调味品，用它制备的碳点安全系数高，绿色环保，具有很高的细胞相容性和较低的细胞毒性，对多种细胞均无有害影响。迄今为止，尚未发现以食醋为碳源制备碳点的方法报道。食醋中含有一定的大分子物质类黑精，而未经过超滤的食醋合成的碳点会含有类黑精等杂质，影响接下来碳点的实际应用效果。本发明通过超滤除去食醋中的类黑精，使水热合成法得到的碳点较为纯净，克服了以未超滤的食醋合成的碳点还有杂质的缺点。
本发明采用超滤和冷冻干燥技术制备碳点。超滤技术利用带有微孔的超滤膜对物质进行选择性分离。本项发明是利用超滤技术将传统食醋中的大、小分子物质进行分离，得到分子量小于3500Da的小分子物质。冷冻干燥技术市食品、医药领域常用的一种干燥方法。经过冷冻干燥可以减少物质中大量水分，减缓物质变质的速度，从而最大限度的保持物质活性、营养。本发明利用冷冻干燥技术在低温、真空条件下快速除去碳点浓缩液中水分，使碳点溶液干燥成碳点粉末，易于储存和细胞成像。
本发明利用该技术方法制备碳点，仪器设备简单易行、经济环保，且具有较强的可控性，是目前大规模生产荧光碳点的有效途径。由于反应在密闭的高压反应釜中进行，避免了有毒物质挥发进入环境。最为关键的是，碳点原材料来源为绿色食品，方便易得，经济环保。
与现有技术相比，本发明涉及的一种食醋来源的碳点制备及其应用具有以下优点：
(1)本发明利用水热合成法制备碳点。该方法仪器设备简单易行、耗时较短，而且具有较强的可控性，是目前大规模生产荧光碳点的有效途径。并且该方法还具有经济环保、绿色安全的优点。绿色食品为该制备方法的原材料，并且反应在密闭的高压反应釜中进行，避免了有毒、有害物质挥发进入环境，破坏生态平衡。
(2)本发明更优选地利用我们生活中常用的酸味调味品山西老陈醋为来源制备碳点。山西老陈醋含有丰富的醋酸、丙酸、丁酸等有机酸，含量达到30-50％。据研究表明，在山西老陈醋中检测到赖氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等7种必需氨基酸，组氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丝氨酸等10种非必需氨基酸，3种非蛋白氨基酸。醋酸等有机酸为碳点提供了丰富的碳源，多种氨基酸为碳点提供了大量的氮、硫源。氮、硫元素的加入不仅可以增强碳点粒子的荧光性能和量子产率，还可以增强碳点的生物活性，增强了碳点在生物领域的应用价值。以山西老陈醋为来源制备的碳点绿色环保、经济高效，具有优良的荧光特性，并且还具有细胞毒性低、生物相容性好等优点，在细胞成像等方面有良好的应用潜能。
附图说明
图1由食醋制备碳点的技术路线示意图；
图2由食醋为来源制备碳点的水热合成法示意图；
图3为本发明实施例1制备的碳点的紫外吸收光谱图，其中所制备碳点的吸收曲线在240nm和263nm处有两个吸收峰，分别是由C＝C键π→π*跃迁和C＝O键n→π*跃迁产生；
图4为本发明实施例1制备的碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图。其中，荧光最大激发波长和最大发射波长分别为380nm和470nm；当荧光激发波长从320nm移动到420nm时，碳点的荧光发射波长红移了90nm；
图5为本发明实施例1制备的碳点的高分辨率透射电镜图。从图中可以看出碳点是分散性良好的球形颗粒，粒径分布均匀；
图6为本发明实施例1制备的碳点的细胞毒性评价：人正常肝细胞LO2、人乳腺癌细胞MCF-7、小鼠黑色素瘤细胞B16、小鼠巨噬细胞Raw264.7在不同浓度下的碳点下孵育24小时的相对存活率；
图7为本发明实施例1制备的碳点在人正常肝细胞LO2中的荧光图像，其中在明场(a)下，以及405nm(b)、488nm(c)、650nm(d)激发波下的细胞成像图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明做出进一步说明。
本发明的实施例中，所述食醋中，总酸含量≥4.00g/100ml，不挥发酸含量为≥2.00g/100ml，总氮含量≥0.20g/100ml，醋酸含量为3.00-6.00g/100ml，总氨基酸含量为1.0-3.0g/100mL。
本发明的实施例中，碳点的制备步骤如下：
(1)离心、超滤：将食醋进行离心：4-10℃，4000-6000rpm处理10-20min，保留上清液，继续进行超滤，保留滤出液；
在本发明的一种实施例中，超滤条件为：选用10kDa超滤膜进行超滤。
(2)超声：对所述步骤(1)得到的滤出液在25-30℃条件下超声处理10-20min；
(3)水热合成：将所述步骤(2)得到的醋液与水按照体积比1:(1-5)稀释后，放进高压反应釜内，在160-200℃下反应2.5-6h得到浓缩液；
其中，高压反应釜内，最大压强为10MPa，在反应过程中压强为5-7MPa；
(4)离心，脱色：将所述步骤(3)得到的浓缩液4-10℃，8000-10000rpm条件下，离心10-20min，离心后保留上清液，向所述上清液中加入质量百分比为1.5-2.5％的活性炭，在水浴锅中进行脱色；其中，脱色条件为在60-70℃脱色0.5-1.5h，脱色完成后再进行离心，取上清，得到脱色液。
(5)抽滤，冷冻干燥：将所述步骤(4)的脱色液进行抽滤，得到纯净的浓缩液，并在-60～-80℃，压力0.35-0.37Atm条件下进行真空冷冻干燥，得到荧光碳点。
其中，抽滤条件为，选取孔径为0.22μm微孔滤膜进行抽滤。
在本发明的一种实施例中，步骤(3)步骤(2)得到的醋液与水的体积比可以为：1:1、2:2、1:3、1:4、1:5。
在本发明的一种实施例中，步骤(3)水热合成条件中，反应温度可以为：160℃、165℃、170℃、175℃、180℃、185℃、190℃、195℃、200℃，反应时间可以为2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h、5.0h、5.5h、6.0h。
本发明的实施例中，步骤(3)水热合成条件中，优选温度为170-190℃，优选反应时间为3-5h。
本发明的实施例中，步骤(3)水热合成条件中，优选温度为175-185℃，优选反应时间为3.5-4.5h。
以下实施例中，碳点的粒径和荧光强度的测定方法分别为：
1)碳点的粒径测定方法：
(1)抽真空并接通透射电镜(设备型号：JEM-2100)镜筒内的电源；(2)放入样品；(3)顺时针方向转动透射电镜灯丝电流钮，慢慢加大灯丝电流；(4)观察图像：设定标尺为10nm，推进样品杆，用样品平移传动装置把样品座调到观察位置，即可进行图象观察；(5)照相记录图像。
2)碳点的荧光强度的测定方法：F-2500荧光分光光度计，设定以激发波长激发发射波长，激发和发射狭缝都为20nm，扫描速度1500nm/min，光电倍增管电压400V，发射波长范围在250-700nm。样品处理步骤：吸取所制碳点100μL，与水以质量体积比1:4进行混合稀释，吸取300μL的稀释液加入四面透光的比色皿中放入仪器中进行检测。设置激发波长从320nm增加至440nm(每隔20nm)进行测试，并记录其荧光强度。
实施例1 碳点的制备
(1)离心：量取100mL食醋在4℃，6000rpm,10min条件下进行离心，保留上清液；
(2)超滤：将步骤(1)所得的上清液放在超滤杯中，选用10kDa超滤膜进行超滤，将滤出液分装在烧杯中，丢弃截留物；
(3)超声：将步骤(2)得到的滤出液进行震荡10min，在25℃下超声处理20min；
(4)稀释：将步骤(3)得到的超声处理液与水按照体积比1：1的比例进行稀释；
(5)水热合成：将所得的稀释液放进高压反应釜内，反应过程中压强为6MPa，在180℃下反应4h得到褐色浓缩液；
(6)离心：将步骤(5)所得的浓缩液进行在4℃离心机内离心，转速6000rpm，时间15min，保留上清液。
(7)脱色：将2.0％(w/v)的活性炭加入所述步骤(6)的上清液中，在70℃水浴锅水浴1h中进行脱色，待脱色完成后再进行离心。
(8)抽滤：选取孔径为0.22μm微孔滤膜对步骤(7)所得的纯净脱色液进行抽滤，得到纯净的浓缩液。
(9)冷冻干燥：将步骤(8)得到的纯净浓缩液放置在低温冷冻干燥机中进行冷冻干燥，温度设置-80℃，压力0.37Atm。最后得到荧光碳点。实施例1所得碳点粒径分布较为均匀，大小为3.6±0.9nm，碳点的紫外吸收光谱图参照附图3，碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图，参照图4，碳点的高分辨率透射电镜图参照附图5。
实施例2 碳点的制备
食醋来源与制备步骤同实施例1，唯一不同的是水热合成制备碳点的反应条件为160℃下反应4h。
实施例3 碳点的制备
食醋来源与制备步骤同实施例1，唯一不同的是水热合成制备碳点的反应条件为200℃下反应4h。
实施例4 碳点的制备
食醋来源与制备步骤同实施例1，唯一不同的是水热合成制备碳点的反应条件为180℃下反应3h。
实施例5 碳点的制备
食醋来源与制备步骤同实施例1，唯一不同的是水热合成制备碳点的反应条件为180℃下反应5h。
需要说明的是，本发明实施例2-5制备的碳点在技术效果上与本发明实施例1相近。
实施例6 碳点的制备
食醋来源：选择福建红曲醋(选自产品品牌为永春醋的福建红曲醋)作为食醋来源。福建红曲醋中，氨基酸含量约为0.8-1.5g/ml，总酸含量4.0-20.0g/100ml，不挥发酸含量为2.00-5.00g/100ml，醋酸含量为3.00-4.00g/100ml，总氮含量为1.0-10.0g/100ml。
(1)离心：量取100mL食醋在4℃，6000rpm,10min条件下进行离心，保留上清液；
(2)超滤：将步骤(1)所得的上清液放在超滤杯中，选用10kDa超滤膜进行超滤，将滤出液分装在烧杯中，丢弃截留物；
(3)超声：将步骤(2)得到的滤出液进行震荡，在25℃下超声处理20min；
(4)稀释：将步骤(3)得到的超声处理液雨水按照体积比1：1的比例进行稀释；
(5)水热合成：将所得的稀释液放进高压反应釜内，反应过程中压强为7MPa，在180℃下反应4h得到褐色浓缩液；
(6)离心：将步骤(5)所得的浓缩液进行在4℃离心机内离心，转速6000rpm，时间15min，保留上清液。
(7)脱色：将1.5％(w/v)的活性炭加入所述步骤(6)的上清液中，在70℃水浴锅水浴1h中进行脱色，待脱色完成后再进行离心。
(8)抽滤：选取孔径为0.22μm微孔滤膜对步骤(7)所得的脱色液进行抽滤，得到纯净的浓缩液。
(9)冷冻干燥：将步骤(8)得到的纯净浓缩液放置在低温冷冻干燥机中进行冷冻干燥，温度设置-80℃，压力0.37Atm。最后得到荧光碳点。碳点粒径分布较为均匀，大小为3.3±0.7mm，经过测定碳点的荧光强度为2190a.u.。
在相同反应条件下，实施例1所制得碳点的荧光强度高于实施例6所制得的碳点，说明山西老陈醋更适合作为原料制备碳点。
实施例7 碳点的制备
食醋指标：总酸含量≥6.00g/100ml，不挥发酸含量为≥2.00g/100ml，总氮含量≥0.20g/100ml，总醋酸含量为3.50-4.50g/100ml，总氨基酸含量为1.5-1.8g/100mL。
碳点的制备步骤如下：
(1)离心、超滤：将食醋进行离心：4-6℃，6000rpm处理15min，保留上清液，继续进行超滤，保留滤出液；
其中，超滤条件为：选用10kDa超滤膜进行超滤。
(2)超声：对所述步骤(1)得到的滤出液在26℃条件下超声处理15min；
(3)水热合成：将所述步骤(2)得到的醋液与水按照体积比1:4稀释后，放进高压反应釜内，反应过程中压强为5-7MPa，在175-185℃下反应3-4h得到浓缩液；
其中，高压反应釜内，最大压强为10MPa，在反应过程中压强为6MPa；
(4)离心，脱色：将所述步骤(3)得到的浓缩液4-10℃，8000-10000rpm条件下，离心10-20min，离心后，保留上清液，并向所述上清液中加入1.5-2.5％(w/v)的活性炭，在水浴锅中进行脱色；其中，脱色条件为在60-70℃脱色0.5-1.5h，脱色完成后再进行离心。
(5)抽滤，冷冻干燥：将所述步骤(4)所得的脱色液进行抽滤，得到纯净的浓缩液，并在-70℃，压力0.36Atm条件下进行真空冷冻干燥，得到荧光碳点。
其中，抽滤条件为，选取孔径为0.22μm微孔滤膜进行抽滤。
实施例8 脱色时间单一对比
食醋来源同实施例1。
制备步骤同实施例1，唯一不同的是步骤(7)脱色条件为：将2.0％的活性炭加入上清液中，在70℃水浴锅水浴0.75h中进行脱色，待脱色完成后再进行离心。
实施例9 脱色时间单一对比
制备步骤同实施例1，唯一不同的是步骤(7)脱色条件为：将2.0％的活性炭加入上清液中，在70℃水浴锅水浴1.5h中进行脱色，待脱色完成后再进行离心。
实施例10 活性炭添加量单一对比
制备步骤同实施例1，唯一不同的是步骤(7)脱色条件为：将1.5％的活性炭加入上清液中，在70℃水浴锅水浴1h中进行脱色，待脱色完成后再进行离心。
实施例11 活性炭添加量单一对比
制备步骤同实施例1，唯一不同的是步骤(7)脱色条件为：将2.5％的活性炭加入上清液中，在70℃水浴锅水浴1h中进行脱色，待脱色完成后再进行离心。
对比例1 碳点的制备
食醋来源同实施例1。
(1)离心：量取100mL传统食醋在4℃，6000rpm条件下离心10min，保留上清液；
(2)超滤：将步骤(1)所得的上清液在超滤杯中，选用10kDa超滤膜进行超滤，将滤出液分装在烧杯中，丢弃截留物。
(3)超声：将步骤(2)得到的滤出液震荡10min后，在25℃下超声处理20min；
(4)稀释：将步骤(3)得到的超声处理液与水按照体积比1：1的比例进行稀释；
(5)水热合成：将步骤(4)得到的稀释液放进高压反应釜内，反应过程中压强为6MPa，在180℃下反应4h得到褐色浓缩液。
(6)冷冻干燥：将步骤(5)得到的褐色浓缩液放置在低温冷冻干燥机中进行冷冻干燥，温度设置-80℃，压力0.37Atm。最后得到荧光碳点。对比例1所的碳点粒径分布不太均匀且粒径较大，大小为5.7±1.5nm。
将本发明实施例1与对比例1所制得碳点的粒径大小进行分析，根据数据可得，实施例1所得碳点粒径分布较为均匀，大小为3.6±0.9nm；而对比例1所的碳点粒径分布不太均匀且粒径较大，大小为5.7±1.5nm。由此可以说明，对得到的褐色浓缩液进行离心、脱色、抽滤步骤，可以有效的去除部分杂质，并且获得荧光强度更强的碳点，从而实现更好的细胞成像方面的应用。表1为两种碳点的荧光强度，可以发现实施例1所得的碳点荧光强度较好。
表1 实施例1与对比例1碳点的对比
组别 粒径(nm) 荧光强度(a.u.)
实施例1 3.6±0.9 3132
对比例1 5.7±1.5 2773
对比例2 碳点的制备
食醋来源同实施例1。
(1)离心：量取100mL传统食醋在4℃，6000rpm条件下离心10min，保留上清液；
(2)超声：将步骤(1)得到的上清液震荡10min后，在25℃下超声处理20min；
(3)稀释：量取所述步骤(2)经过超声后的食醋与水按照体积比1：1的比例进行稀释。
(4)水热合成：将稀释液放进高压反应釜内，反应过程中压强为6MPa，在180℃下反应4h得到褐色浓缩液。
(5)离心：将步骤(3)所得的浓缩液进行在4℃离心机内离心，转速6000rpm，时间15min，保留上清液。
(6)脱色：将2.0％的活性炭加入上清液中，在70℃水浴锅水浴1h中进行脱色，待脱色完成后再进行离心。
(7)抽滤：选取孔径为0.22μm微孔滤膜对步骤(5)所得的脱色液进行抽滤，得到纯净的浓缩液。
(8)冷冻干燥：将步骤(6)得到的纯净浓缩液放置在低温冷冻干燥机中进行冷冻干燥，温度设置-80℃，压力0.37Atm。最后得到荧光碳点。并对碳点进行粒径和荧光强度的测定，详见表2。
表2 实施例1与对比例2碳点的对比
组别 粒径(nm) 荧光强度(a.u.)
实施例1 3.6±0.9 3132
对比例2 9.5±2.9 2981
将本发明实施例1与对比例2水热合成法所得的浓缩液进行比较。实施例1所得浓缩液颜色较浅，离心沉淀较少；对比例2所得的浓缩液颜色较深，离心沉淀中有较多沉淀。由此可以说明，超滤可以有效的将食醋中大于10KDa的大分子类黑精去除，使得碳点溶液沉淀较少，有利于以后碳点的应用。
对比例3 温度单一变量对比
食醋来源同实施例1。
制备步骤同实施例1，唯一不同的是步骤(5)水热合成的条件为：将所得的稀释液放进高压反应釜内，在150℃下反应4h得到褐色浓缩液。
对比例4 温度单一变量对比
食醋来源同实施例1。
制备步骤同实施例1，唯一不同的是步骤(5)水热合成的条件为：将所得的稀释液放进高压反应釜内，在210℃下反应4h得到褐色浓缩液。
对比例5 反应时间单一对比
食醋来源同实施例1。
制备步骤同实施例1，唯一不同的是步骤(5)水热合成的条件为：将所得的稀释液放进高压反应釜内，在180℃下反应2h得到褐色浓缩液。
对比例6 反应时间单一对比
食醋来源同实施例1。
制备步骤同实施例1，唯一不同的是步骤(5)水热合成的条件为：将所得的稀释液放进高压反应釜内，在180℃下反应6.5h得到褐色浓缩液。
对比例7 碳点的制备
碳前体来源为乙酸，氮来源为赖氨酸。
(1)制备：量取4g乙酸和1.5g赖氨酸溶于100ml去离子水中制成溶液；
(2)超声：将步骤(1)得到的溶液进行震荡，在25℃下超声处理20min；
(3)稀释：将步骤(2)得到的超声处理液与水按照体积比1：1的比例进行稀释；
(4)水热合成：将所得的稀释液放进高压反应釜内，反应过程中压强为6MPa，在180℃下反应4h得到褐色浓缩液；
(5)离心：将步骤(4)所得的浓缩液进行在4℃离心机内离心，转速6000rpm，时间15min，保留上清液。
(6)脱色：将2.0％的活性炭加入步骤(5)的上清液中，在70℃水浴锅水浴1h中进行脱色，待脱色完成后再进行离心。
(7)抽滤：选取孔径为0.22μm微孔滤膜对步骤(6)所得的脱色液进行抽滤，得到纯净的浓缩液。
(8)冷冻干燥：将步骤(7)得到的纯净浓缩液放置在低温冷冻干燥机中进行冷冻干燥，温度设置-80℃，压力0.37Atm。最后得到荧光碳点。并对碳点进行粒径和荧光强度的测定，详见表3。
表3 实施例1与对比例7碳点的对比
组别 粒径(nm) 荧光强度(a.u.)
实施例1 3.6±0.9 3132
对比例7 4.1±0.7 1718
将本发明实施例1与对比例7水热合成法所得的浓缩液进行比较。从表3可以看出，以山西老陈醋为来源制备的碳点荧光强度显著高于以乙酸为碳源和单一赖氨酸为氮源制备的碳点，其原因是因为食醋中含有种类丰富的氨基酸还有大量的小分子类黑精。
对比例8 脱色时间单一对比
食醋来源同实施例1。
制备步骤同实施例1，唯一不同的是步骤(7)脱色条件为：将2.0％的活性炭加入上清液中，在70℃水浴锅水浴0.25h中进行脱色，待脱色完成后再进行离心。
对比例9 脱色时间单一对比
制备步骤同实施例1，唯一不同的是步骤(7)脱色条件为：将2.0％的活性炭加入上清液中，在70℃水浴锅水浴2.5h中进行脱色，待脱色完成后再进行离心。
对比例10 活性炭添加量单一对比
制备步骤同实施例1，唯一不同的是步骤(7)脱色条件为：将0.5％的活性炭加入上清液中，在70℃水浴锅水浴1h中进行脱色，待脱色完成后再进行离心。
对比例11 活性炭添加量单一对比
制备步骤同实施例1，唯一不同的是步骤(7)脱色条件为：将3.5％的活性炭加入上清液中，在70℃水浴锅水浴1h中进行脱色，待脱色完成后再进行离心。
对比例12 碳点的制备
(1)离心：量取100mL食醋在4℃，6000rpm,10min条件下进行离心，保留上清液；
(2)超滤：将步骤(1)所得的上清液放在超滤杯中，选用10kDa超滤膜进行超滤，将滤出液分装在烧杯中，丢弃截留物；
(3)超声：将步骤(2)得到的滤出液进行震荡10min，在25℃下超声处理20min；
(4)稀释：将步骤(3)得到的超声处理液与水按照体积比1：1的比例进行稀释；
(5)水热合成：将所得的稀释液放进高压反应釜内，反应过程中压强为6MPa，在180℃下反应4h得到褐色浓缩液；
(6)离心：将步骤(5)所得的浓缩液进行在4℃离心机内离心，转速6000rpm，时间15min，保留上清液。
(7)透析：选用10kDa的透析膜在蒸馏水中对步骤(6)所得的上清液进行透析，在15℃下透析48h。
(8)抽滤：选取孔径为0.22μm微孔滤膜对步骤(7)所得的纯净脱色液进行抽滤，得到纯净的浓缩液。
(9)冷冻干燥：将步骤(8)得到的纯净浓缩液放置在低温冷冻干燥机中进行冷冻干燥，温度设置-80℃，压力0.37Atm。最后得到荧光碳点。
实验例1：反应温度对于碳点荧光强度的影响
为了说明在水热合成过程中，同一反应时间下，不同反应温度对最终制备的碳点的荧光强度的影响，因此分别测定本发明实施例1、2、3以及对比例3、4在同一反应时间(4h)条件下，制备得到的碳点的荧光强度。如表4所示，本发明实施例中，反应温度在160-200℃的条件下产生的碳点均具有显著的荧光强度，说明180℃是制备碳点的最佳反应温度。
表4 反应温度对于碳点荧光强度的影响
组别 反应温度(℃) 荧光强度(a.u.)
实施例1 180 3132
实施例2 160 2984
实施例3 200 2761
对比例3 150 2822
对比例4 210 2516
实验例2：反应时间对于碳点荧光强度的影响
为了说明在水热合成过程中，同一反应温度下，不同反应时间对最终制备的碳点的荧光强度的影响，因此分别测定本发明实施例1、4、5以及对比例5、6在同一反应温度(180℃)条件下，制备得到的碳点的荧光强度，如表5所示，
实施例1中在反应时间4h的条件下产生的碳点荧光强度最强，说明反应4h是制备碳点的最佳反应时间。
表5 反应时间对于碳点荧光强度的影响
组别 反应时间(h) 荧光强度(a.u.)
实施例1 4 3132
实施例4 3 2874
实施例5 5 2939
对比例5 2 2549
对比例6 6.5 2758
实验例3 脱色时间对于碳点荧光强度和溶液颜色的影响
为了说明不同的脱色时间对碳点荧光强度的影响，在相同的活性炭添加量下，分别测定不同脱色时间对碳点的荧光强度及溶液颜色的影响。因此分别测定本发明实施例1、实施例8、9以及对比例8、9在2.0％活性炭添加量下，所制得的碳点溶液的荧光强度和溶液颜色，如表6所示。
实施例1中所得碳点的荧光强度较强并且颜色适中，在365nm紫外光照射下荧光明显。在实施例8中，所制碳点的荧光强度略高于实施例1，但在紫外光照射下荧光略低于实施例1，其原因可能是荧光被自身颜色所遮盖。通过增加脱色时间可以发现，脱色时间的长短对碳点荧光强度和溶液颜色影响想不大。因此，综合考虑实际因素，该发明制备的碳点水浴脱色0.5-1.5h较好。
表6 脱色时间对于碳点荧光强度和溶液颜色的影响
组别 脱色时间(h) 荧光强度 溶液颜色
实施例1 1 3132 浅棕色，透亮
实施例8 0.75 3201 棕色，较为透亮
实施例9 1.5 3015 较浅棕色，透亮
对比例8 0.25 3382 深褐色，不透亮
对比例9 2.5 2854 浅棕色，透亮
实验例4 活性炭添加量对于碳点荧光强度和溶液颜色的影响
为了说明不同的活性炭添加量对碳点荧光强度的影响，在相同的脱色时间下，分别测定不同活性炭添加量对碳点的荧光强度及溶液颜色的影响。因此分别测定本发明实施例1、实施例10、11以及对比例10、11在70℃水浴锅水浴1h下，所制得的碳点溶液的荧光强度和溶液颜色，如表7所示。
实施例1中所得碳点的荧光强度较高并且颜色适中，在365nm紫外光照射下荧光明显。在实施例10中，所制碳点的荧光强度略高于实施例1，但在紫外光照射下荧光略低于实施例1，其原因可能是荧光被自身颜色所遮盖。通过增加活性炭添加量可以发现，活性炭的含量越高，脱色效果越好，但也有可能造成荧光强度的损失。因此，综合考虑实际因素，该发明制备的碳点添加1.5-2.5％的活性炭脱色较好。
表7 活性炭添加量对于碳点荧光强度和溶液颜色的影响
Figure BDA0002375980330000181
Figure BDA0002375980330000191
实验例5 活性炭脱色工艺对碳点制备的影响
为了说明活性炭脱色工艺对碳点制备的影响，在相同的前期处理以及制备条件下，分别测定脱色工艺以及透析工艺对碳点的粒径、荧光强度及溶液颜色的影响。因此分别测定实施例1、对比例12，结果如表8所示。
表8 活性炭脱色工艺对碳点制备的影响
组别 粒径(nm) 荧光强度(a.u.) 溶液颜色
实施例1 3.6±0.9 3132 浅棕色，透亮
对比例12 3.8±0.7 821 浅黄色，透亮
实施例1所得的碳点的荧光强度较高并且颜色适中，在365nm紫外光照射下荧光明显。从表8中可以看出，进行脱色后的碳点与进行透析后的碳点相比荧光强度明显减弱。同时考虑到碳点的成像用途，对比例12中，通过透析制备得到的碳点，荧光强度损失明显，所以选择利用活性炭脱色工艺替代透析工艺制备碳点。
实验例6 碳点的细胞毒性实验
为了测定制备获得的碳点对于细胞毒性的影响，特设计以下实验：
测定方法：在96孔板中配制100μL的人正常肝细胞LO2的悬液。将培养板在37℃，5％CO2的条件下预培养，使细胞贴壁。在培养板中加入本发明实施例1制备的碳点，经用去离子水混合后制备得到不同剂量的碳点分散液(0、15、150、1500、3000μg/mL)，在培养箱中孵育24h。向每孔加入10μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育2.5h。利用酶标仪在450nm处检测碳点对LO2的毒性结果如图6和表5所示，碳点浓度在1500μg/mL下孵育24h，LO2细胞的存活率达到75％以上，表现出良好的细胞相容性。
人乳腺癌细胞MCF-7、小鼠黑色素瘤细胞B16、小鼠巨噬细胞Raw 264.7的细胞毒性实验步骤均与人乳腺癌细胞LO2相同。结果如图6和表9所示，碳点浓度在3000μg/mL下孵育24h，MCF-7、B16、Raw 264.7细胞的存活率均可以达到60％以上，都表现出良好的细胞相容性。
由此可以看出，由于制备碳点的原料选择的是食醋，由于食醋有益人身体健康且无毒性，且本发明制备过程中并未添加任何除食醋以外的添加试剂，因此原料无毒无害，因此可以获得细胞的高存活率。当细胞存活率达到60％,就可以判断细胞毒性小。
需要说明的是，本发明实施例2-11制备的碳点在细胞毒性上与本发明实施例1相近。
表9 不同浓度的碳点溶液对不同细胞的细胞活力影响
Figure BDA0002375980330000201
实验例7 细胞成像实验
将人正常肝细胞LO2以1×104每孔接种于96孔板中，每孔体积100μL，在培养箱(37℃，5％CO2)中培养24小时后，用0.01mol/L的磷酸缓冲液冲洗，再用滤纸将孔板周围液体吸干。分别加入本发明实施例1制备的1.0mg/mL的碳点分散液(溶剂为去离子水)，在培养箱(37℃5％CO2)中培养2h，再用0.01mol/L的磷酸缓冲液冲洗，然后置于荧光显微镜下，分别在405nm、488nm、650nm波段下激发，观察碳点的细胞成像情况。
细胞成像结果参照图7所示，可以看到人正常肝细胞LO2细胞在405nm波段激发下呈现出蓝色荧光，在488nm波段激发下呈现出绿色荧光，在650nm波段激发下呈现出红色荧光，说明本发明制得的碳点可以作为荧光染剂用于细胞成像。

Claims (6)

1.一种食醋来源的荧光碳点，其特征在于：所述碳点是以食醋为原料，将所述食醋经离心、超滤、超声、稀释后，经水热合成、离心、脱色、抽滤、冷冻干燥后获得，
荧光碳点的制备步骤如下：
（1）离心、超滤：将食醋进行离心，保留上清液，继续进行超滤，保留滤出液，所述超滤过程中截留分子量≥10 kDa；
（2）超声：对所述步骤（1）得到的滤出液进行超声处理；
（3）水热合成：将所述步骤（2）得到的醋液与水按照体积比1:（1-5）稀释后，放进高压反应釜内，在160-200 ℃下反应2.5-6 h得到浓缩液；
（4）离心，脱色：将所述步骤（3）得到的浓缩液经离心后保留上清液，并加入活性炭进行脱色，经离心后保留上清，得到脱色液；
（5）抽滤，冷冻干燥：将所述步骤（4）的脱色液进行抽滤，得到纯净的浓缩液，并进行冷冻干燥，得到荧光碳点。
2.如权利要求1所述一种食醋来源的荧光碳点，其特征在于：所述食醋中，总酸含量≥4.00g/100 ml，不挥发酸含量为≥2.00g/100 ml，总氮含量≥0.20g/100 ml。
3.如权利要求1所述一种食醋来源的荧光碳点，其特征在于：所述步骤（2）中，所述超声处理条件为，在25-30 ℃条件下超声处理10-20 min。
4.如权利要求1所述一种食醋来源的荧光碳点，其特征在于：所述步骤（4）中，所述脱色条件为60-70 ℃脱色0.5-1.5 h，活性炭的添加量为所述脱色溶液的1.5-2.5 %（w/v）。
5.如权利要求1所述一种食醋来源的荧光碳点，其特征在于： 所述步骤（5）中，所述冷冻干燥条件为，在-60~-80 ℃，压力0.35-0.37 Atm条件下进行真空冷冻干燥。
6.权利要求1-5任一所述荧光碳点在荧光染剂中的用途。
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