CN110591695B - 基于fret机理的荧光碳点核酸探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于FRET机理的荧光碳点核酸探针及其制备方法，该核酸探针为碳点‑吖啶黄复合物。其制备方法包括以下步骤：1)制备碳点；2)利用得到的碳点和吖啶黄制备碳点‑吖啶黄复合物。本发明设计了一种碳点‑吖啶黄复合体系，通过FRET(荧光共振能量转移)作用能有效检测目标核酸的浓度；该方法是基于比率型的荧光检测方法，具有灵明度高、可重复性好等优点。

Description

基于FRET机理的荧光碳点核酸探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学与纳米材料领域，特别涉及一种基于FRET机理的荧光碳点核酸探针及其制备方法。
背景技术
核酸作为生命的遗传物质，其结构的完整性决定了细胞是否能够维持正常的生理功能以及细胞的分裂增殖、分化。核酸结构的完整性也同时决定了生命体能否正常地生长发育，生命体繁殖过程中的遗传与变异。DNA分子结构的多样性对其性质以及功能影响甚大。在临床上的化学抗癌疗法便是以DNA为化学药物作用靶标，这是癌症治疗的一种有效手段，DNA也被广泛地用于疾病的诊断、药物的设计。因此简便，高灵敏度，选择性地识别各种结构的核酸向来是科学家们所关注的热点。荧光探针由于其灵敏度高、响应快、成本低，近年来得到了广泛的研究。
碳点是一种新型的碳纳米材料，具有良好的水溶性和生物相容性，同时，该材料还具有荧光发射波长可调节、荧光量子产率高、结构稳定、抗光漂白能力强等特点，在生物成像、检测、诊治等方面具有广泛的应用前景。因此，使用碳点作为荧光探针并应用于DNA检测越来越受到人们的关注，但现在缺少基于碳点的核酸探针。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于FRET机理的荧光碳点核酸探针及其制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于FRET机理的荧光碳点核酸探针，该核酸探针为碳点-吖啶黄复合物。
其制备方法包括以下步骤：
1)制备碳点；
2)利用得到的碳点和吖啶黄制备碳点-吖啶黄复合物。
优选的是，所述步骤1)包括：取柠檬酸溶于去离子水，搅拌均匀使其完全溶解，再加入乙二胺，搅拌均匀后，将溶液移入反应釜，加热反应；将反应完的溶液过滤，用透析袋在水中透析，透析后取內液，旋转蒸发后冷冻干燥，制得碳点。
优选的是，所述步骤1)具体包括：称取柠檬酸1.5g，溶于40mL去离子水，搅拌均匀使其完全溶解，用移液枪加入1mL乙二胺；搅拌均匀后，将溶液移入80mL聚四氟乙烯衬底的反应釜，在180℃下反应8小时；待反应釜冷却，将反应完的溶液过滤，用截留分子量为500D的透析袋在水中透析24小时，期间换2次水；透析后取內液，旋转蒸发后冷冻干燥，制得碳点。
优选的是，所述步骤2)包括：将EDC、NHS和步骤1)制得的碳点超声分散在DMF中，混合溶液在室温下持续搅拌；接着将吖啶黄加入到混合溶液中，继续搅拌，然后将混合溶液用透析袋在水中透析，透析后取內液，旋转蒸发后冷冻干燥，制得所述碳点-吖啶黄复合物。
优选的是，所述步骤2)具体包括：将50mg EDC、50mg NHS和50mg碳点粉末超声分散在2mL DMF中，混合溶液在室温下持续搅拌1小时，活化羧基基团；接着将100mg吖啶黄加入到混合溶液中，继续搅拌24小时；之后，将混合溶液用截留分子量为500D的透析袋在水中透析24小时，透析后取內液，旋转蒸发后冷冻干燥，制得所述碳点-吖啶黄复合物，并将其分散在水中，于4℃下保存待用。
本发明的有益效果是：本发明设计了一种碳点-吖啶黄复合体系，通过FRET(荧光共振能量转移)作用能有效检测目标核酸的浓度；该方法是基于比率型的荧光检测方法，具有灵明度高、可重复性好等优点。
附图说明
图1为本发明的一种实施例中的碳点制备的示意图；
图2为本发明的一种实施例中的碳点-吖啶黄复合物制备的示意图；
图3为本发明的一种实施例中制备的碳点的透射电镜图；
图4为本发明的一种实施例中制备的碳点的激发光谱和发射光谱图；
图5为本发明的一种实施例中使用的吖啶黄的激发光谱和发射光谱图；
图6为本发明的一种实施例中的核酸探针应用于DNA检测的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本实施例的一种基于FRET机理的荧光碳点核酸探针，该核酸探针为碳点-吖啶黄复合物。其制备方法，包括以下步骤：
1)制备碳点；
2)利用得到的碳点和吖啶黄制备碳点-吖啶黄复合物。
在一种实施例中，核酸探针的具体制备方法为：
1、制备碳点：称取柠檬酸1.5g，溶于40mL去离子水，搅拌均匀使其完全溶解，用移液枪加入1mL乙二胺；搅拌均匀后，将溶液移入80mL聚四氟乙烯衬底的反应釜，在180℃下反应8小时；待反应釜冷却，将反应完的溶液过滤，用截留分子量为500D的透析袋在水中透析24小时，期间换2次水；透析后取內液，旋转蒸发后冷冻干燥，制得碳点；参照图1，为碳点制备的示意图；
2、制备碳点-吖啶黄复合物：将50mg EDC、50mg NHS和50mg碳点粉末超声分散在2mL DMF中，混合溶液在室温下持续搅拌1小时，活化羧基基团；接着将100mg吖啶黄加入到混合溶液中，继续搅拌24小时；之后，将混合溶液用截留分子量为500D的透析袋在水中透析24小时，透析后取內液，旋转蒸发后冷冻干燥，制得所述碳点-吖啶黄复合物，并将其分散在水中，于4℃下保存待用。参照图2，为碳点-吖啶黄复合物制备的示意图。
参照图3，为上述实施例中制备的碳点的透射电镜(TEM)照片。从图中可以看出，该碳点的均一性非常好，每个碳点的尺寸大约为5-6nm。通过高分辨TEM(图3右上角的内图)可知，该碳点具有明显的晶格结构。
参照图4，为上述实施例中制备的碳点的激发光谱(Ex)和发射光谱(Em)，从图中可知，单纯碳点的激发峰在350nm左右，发射峰在460nm处。
参照图5，为上述实施例中使用的吖啶黄的激发光谱(Ex)和发射光谱(Em)，从图中可知，吖啶黄的激发峰在450nm处，发射峰在500nm左右。
该碳点-吖啶黄复合物作为核酸探针的作用机理为：碳点和吖啶黄具有不同的激发光谱和发射光谱，且碳点的发射峰与吖啶黄的激发峰接近，碳点和吖啶黄结合生产碳点-吖啶黄复合物后，引起荧光共振能量转移效应，350nm左右的光照射后，碳点-吖啶黄复合物中得到碳点发射的460nm的荧光能被吖啶黄吸收(荧光猝灭)，并发射500nm的荧光；当体系中加入目标DNA后，目标DNA插入吖啶黄中，碳点发射的460nm的荧光不会再被吖啶黄吸收(荧光恢复)，从而使体系发出460nm的荧光，使体系500nm的荧光明显减弱，而460nm处的荧光显著增强，从而可以通过这两处的荧光发射强度对比(F500/F460)来实现对目标DNA浓度的检测。
本发明在DNA检测中的一种具体应用：
首先将上述实施例得到的碳点-吖啶黄复合物加入到Tris-HCl缓冲溶液中配置成一定浓度的核酸探针；
然后在2支比色皿中均加入1mL上述核酸探针溶液，标记为1号和2号。在1号比色皿中加入1mL缓冲液，在2号比色皿中加入1mL目标DNA，在室温下静置2小时；
然后，在日立F-4600荧光分光光度计上分别测量荧光光谱。测量结果如图6，从图6可知，随着DNA的加入，与未加入DNA的1号体系相比，加入有DNA的2号体系中，500nm处的荧光明显减弱而460nm处的荧光显著增强。从而可以通过这两处的荧光发射强度对比(F500/F460)来实现对目标DNA浓度的检测。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (3)

1.一种基于FRET机理的荧光碳点核酸探针，其特征在于，该核酸探针为碳点-吖啶黄复合物；
所述的基于FRET机理的荧光碳点核酸探针的制备方法，包括以下步骤：
1）制备碳点；
2）利用得到的碳点和吖啶黄制备碳点-吖啶黄复合物；
所述步骤1）包括：取柠檬酸溶于去离子水，搅拌均匀使其完全溶解，再加入乙二胺，搅拌均匀后，将溶液移入反应釜，加热反应；将反应完的溶液过滤，用透析袋在水中透析，透析后取內液，旋转蒸发后冷冻干燥，制得碳点；
所述步骤2）包括：将EDC、NHS和步骤1）制得的碳点超声分散在DMF中，混合溶液在室温下持续搅拌；接着将吖啶黄加入到混合溶液中，继续搅拌，然后将混合溶液用透析袋在水中透析，透析后取內液，旋转蒸发后冷冻干燥，制得所述碳点-吖啶黄复合物。
2.根据权利要求1所述的基于FRET机理的荧光碳点核酸探针，其特征在于，所述步骤1）具体包括：称取柠檬酸1.5g，溶于40mL去离子水，搅拌均匀使其完全溶解，用移液枪加入1mL乙二胺；搅拌均匀后，将溶液移入80mL聚四氟乙烯衬底的反应釜，在180℃下反应8小时；待反应釜冷却，将反应完的溶液过滤，用截留分子量为500D的透析袋在水中透析24小时，期间换2次水；透析后取內液，旋转蒸发后冷冻干燥，制得碳点。
3.根据权利要求2所述的基于FRET机理的荧光碳点核酸探针，其特征在于，所述步骤2）具体包括：将50mg EDC、50mg NHS和50mg 碳点粉末超声分散在2mL DMF中，混合溶液在室温下持续搅拌1小时，活化羧基基团；接着将100mg 吖啶黄加入到混合溶液中，继续搅拌24小时；之后，将混合溶液用截留分子量为500D的透析袋在水中透析24小时，透析后取內液，旋转蒸发后冷冻干燥，制得所述碳点-吖啶黄复合物，并将其分散在水中，于4℃下保存待用。
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