CN109100511B - 用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子及其制备方法 - Google Patents

用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种兼具荧光性能的免疫磁性纳米粒子及其制备方法与应用，以磁性纳米粒子Fe3O4作为内核，通过在磁性纳米粒子Fe3O4表面沉积量子点层，构建出具有荧光性能的磁性纳米粒子，在荧光磁性纳米粒子上进一步引入入抗上皮细胞粘附分子抗体和氨基化聚乙二醇分子，获得免疫磁性纳米粒子。该免疫磁性纳米粒子能够对循环肿瘤细胞实现快速特异性捕获和释放；此外，量子点标记的磁性纳米粒子，可实现循环肿瘤细胞捕获和释放过程的可视化。

Description

用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子及 其制备方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，涉及循环肿瘤细胞的特异性捕获和释放技术。
背景技术
癌症的转移是癌症致死的主要原因，而从肿瘤处转移并进入血液循环系统的循环肿瘤 细胞(Circulating tumor cells,CTCs)被认为与癌症的转移息息相关。引人注意的是，肿瘤 患者外周血中CTCs的数量与治疗效果及病人的生存率有很强的相关性。因此，CTC的检 测和计数可用于预测癌症是否转移、治疗过程的监测和癌症的预后评估。然而，CTCs在外 周血中的发生率极低，数十亿个血细胞中仅有一个到上百个CTCs，因此可靠且高效的CTCs 分离对CTCs的研究至关重要。
最近许多用于CTCs检测的新技术被开发出来，主要包括密度梯度分离策略、基于尺寸 的过滤技术、基于免疫的分离策略(如修饰有抗体的微柱的CTC芯片、及免疫磁分离平台)。 这些技术都是基于CTCs与血细胞不同的物理性质(例如大小、密度、电荷、变形性等)或 /和生物特性(例如细胞表面蛋白表达)来将CTCs于血细胞分开。其中，免疫磁分离方法是最常用的方法之一，该方法以超顺磁性氧化铁(SPIOs)为分离基质，用与CTCs特异性结合抗体或分子靶向CTCs细胞。例如，Huang等人基于柠檬酸包覆的SPIOs设计了一种多功 能的“智能”粒子(MSPs,6-8μm)，但其饱和磁化强度只有～2emu g-1，且经过45分钟的 孵育后，仅有38％至44％MCF-7细胞可以从大鼠全血中被重新富集到(Multifunctional“Smart”Particles Engineered from Live Immunocytes:Toward Capture and Releaseof Cancer Cells.Adv.Mater.2015,27,310–313.Huang,C.等)。为了进一步缩短孵育时间，提高CTCs 捕获效率，Min等人使用修饰有二抗的磁珠分离与免疫化量子点结合的CTCs，捕获效率可 达80％，纯度为18％～23％，捕获及计数过程能在50分钟内完成；然而，MSPs潜在的临床 应用可能会被其冗长的材料制备过程以及复杂的捕获过程所限制(EfficientCapture and Simple Quantification of Circulating Tumor Cells Using QuantumDots and Magnetic Beads. Small 2015,11(21),2536–2542.分钟,H.等)。
另一方面，高效的将CTCs从分离基质上释放下来，且不影响CTCs的细胞结构和功能， 为CTCs的下游研究奠定了坚实的基础。目前，温度驱动聚合物相变、电化学刺激、酶降解 和化学竞争结合触发等释放方式已经被用于CTCs的释放。例如，Cheng等人制备了一种带 有热敏涂层的支架，涂层可以在37摄氏度时溶解，进而将捕获的细胞释放下来；但该CTCs 捕获释放平台仅能在含有10-100个人类乳腺癌细胞的血样实现58％-74％的释放效率 (Three-Dimensional Scaffold Chip with Thermosensitive Coating for Captureand Reversible Release of Individual and Cluster of Circulating TumorCells.Anal.Chem.2017,89(15), 7924-7932.Cheng,S.B.等)。Zhang等人使用1厘米×1厘米捕捉基质及已经捕获到的CTCs 作为电极，利用电化学刺激来释放基质上的CTCs,在全血中能达到约50％的释放率；该释 放方法细胞回收率相对较低，且电刺激可能会损害细胞结构完整性、扰乱细胞微环境等(Programmable Fractal Nanostructured Interfaces forSpecific Recognition and Electrochemical Release of CancerCells.Adv.Mater.2013,25,3566–3570.Zhang,P.C.等)。
因此，在不破坏CTCs结构、维持CTCs活性和功能的前提下，使用简便的方法，构建一种能快速、高效捕获以及温和释放CTCs的纳米级免疫磁性平台，将为CTCs计数及下游 研究奠定坚实的基础。
发明内容
本发明的目的旨在针对上述现有技术中存在的问题，提供一种用于循环肿瘤细胞可视 化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子，以便在不破坏CTCs结构、维持CTCs活性和功能的免 疫磁性前提下，实现快速、高效捕获及温和释放CTCs。
本发明另一目的旨在提供一种上述用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳 米粒子的制备方法。
本发明基本思路为，结合层层自组装技术(Layer-by-layer，LbL)及化学刺激响应释放 磁性纳米颗粒的策略，构建一种具有可视化功能、特异靶向上表皮型CTCs及可温和释放 CTCs表面磁性纳米颗粒的纳米级免疫磁性平台。首先在磁性纳米粒子Fe3O4上通过LbL组装技术依次沉积第一高分子聚合物层、量子点层、第二高分子聚合物层和透明质酸层，构建出荧光磁性纳米粒子，用于实现磁性纳米材料的荧光标记，且透明质酸层能提供大量的羧基，用于后续功能组分的修饰；为了使最终获得的材料能特异性靶向上表皮型CTCs且具有抗非特异性蛋白吸附能力，进一步在荧光磁性纳米粒子表面引入抗上皮细胞粘附分子抗体(anti-EpCAM抗体)和聚乙二醇(PEG)，从而获得免疫磁性纳米粒子(APMNs)。且 anti-EpCAM抗体分子与荧光磁性纳米粒子之间的连接结构含有二硫键，便于后续在还原剂 (谷胱甘肽，GSH)作用下，将CTC表面结合的荧光磁性纳米粒子脱离下来。
本发明提供的用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子制备方法，包 括以下步骤：
(1)制备荧光磁性纳米粒子MLNs
通过静电作用，在磁性纳米粒子Fe3O4上依次沉积第一高分子聚合物层、量子点层、第 二高分子聚合物层和透明质酸层，得到荧光磁性纳米粒子MLNs；所述第一高分子聚合物与 第二高分子聚合物相同或不同，第一高分子聚合物和第二高分子聚合物为聚丙烯酰胺或聚 乙烯亚胺；所述量子点为CdSSe/ZnS量子点；
(2)制备免疫磁性纳米粒子APMNs
(21)将荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧基进行活化，再将活化羧基后的荧光磁性纳米粒子MLNs、胱胺二盐酸盐及pH为7.5～8.5、DMF体积浓度为10％～20％的PBS缓冲液 混合，并在振荡条件下于室温反应12～36h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.3～7.4的PBS缓冲液进行洗涤得到产物一；所述荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧基总含量与胱胺二盐酸盐的摩尔比为1:1；
(22)将产物一与pH为8.0～8.5、二硫苏糖醇(DTT)浓度为50～100mM的PBS缓冲 液混合，并在振荡条件下于室温反应30～60分钟，之后对所得反应液进行磁分离并收集分 离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.3～7.4的PBS缓冲液进行洗涤得到产物二；所述 二硫苏糖醇的用量为至少使产物一的二硫键反应完全；
(23)将产物二、3-(2-吡啶二硫基)丙酸N-羟基琥珀酸亚胺酯(SPDP)及pH为8.0～8.5、 丙酮体积浓度为10～20％的PBS缓冲液混合，并在振荡条件下于室温反应12～24h，之后对 所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.3～7.4的PBS缓 冲液进行洗涤得到产物三；所述荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧基总含量与3-(2-吡啶二 硫基)丙酸N-羟基琥珀酸亚胺酯的摩尔比为1:2；
(24)将产物三表面羧基进行活化，再将羧基活化后的产物三、氨基化聚乙二醇及pH 为7.5～8.5的PBS缓冲液混合，并在振荡条件下于室温反应5～24h，之后对所得反应液进行 磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.3～7.4的PBS缓冲液进行洗涤得 到产物四；所述荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧基总含量与氨基化聚乙二醇摩尔比为2:1；
(25)将产物四、抗体及pH为7.3～7.4的PBS缓冲液混合，并在振荡条件下于4～7℃反应12～24h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.3～7.4的PBS缓冲液进行洗涤得到兼具荧光性能的免疫磁性纳米粒子APMNs；所述抗体为anti-EpCAM抗体；所述抗体与产物四质量比等于或大于1:100。
上述用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子制备方法，所采用的磁 性纳米粒子Fe3O4可以采用本领域已经披露的制备方法获得，参见The design andsynthesis of a hydrophilic core–shell–shell structured magnetic metal–organicframework as a novel immobilized metal ion affinity platform forphosphoproteome research.Chem.Commun.,2014, 50,6228—6231,Chunhui Deng等以及Ti4+-immobilized multilayer polysaccharide coated magnetic nanoparticles forhighly selective enrichment of phosphopeptides J.Mater.Chem.B 2014,2,4473-4480,Hanfa Zou等。
上述用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子制备方法，所述步骤(1) 的目的是制备具有荧光性能的荧光磁性纳米粒子MLNs，本发明采用的是层层自组装技术 (LbL)，LbL组装技术是一种“自下而上”的以静电相互作用为主要驱动力的，被广泛用于分层结构材料组装的技术。通过对材料种类及沉积顺序的调节优化，可以和谐地组合出具有不同结构、组成及目标功能的纳米材料。本发明中，采用的量子点(QDs，具体为 CdSSe/ZnS，购于杭州纳米晶科技有限公司，货号为LW01-LW10)具有吸收谱较宽、发射 波长可调和光氧化稳定性较高等特性，是一种常用的生物医学成像和诊断的荧光探针；透 明质酸(HA)是一种自然界存在的分子量较大的(约106Da)糖胺聚糖，以自由和复合的 形式存在与生物系统中，将其修饰在磁性纳米粒子Fe3O4上，可以增加其生物相容性，此外， HA特异性受体CD44蛋白在几乎所有的癌症类型中都被过度表达，所以HA在一定程度上 还可有助于肿瘤细胞的靶向。由于量子点(QDs)和透明质酸(HA)均带负电，因此本发 明以聚丙烯酰胺(PAH)或聚乙烯亚胺(PEI)等带正电的聚电解质作为第一高分子聚合物 层和第二高分子聚合物层，将透明质酸(HA)和量子点(QDs)等材料通过静电作用沉积 在磁性纳米粒子Fe3O4上。该制备过程具体包括以下分步骤：
(11)将Fe3O4磁性纳米粒子与含有第一高分子聚合物的NaCl水溶液混合，之后在振荡条件下反应15～60分钟，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液进行洗涤得到第一高分子聚合物层包覆Fe3O4的磁性纳米粒子，记为产物L1；
(12)将产物L1与含有CdSSe/ZnS的水溶液混合，之后在振荡条件下反应15～60分钟， 对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液洗涤得到 量子点层包覆产物L1的磁性纳米粒子，记为产物L2；
(13)将产物L2与含有第二高分子聚合物的NaCl水溶液混合，之后在振荡条件下反应15～60分钟，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液洗涤得到第二高分子聚合物层包覆产物L2的磁性纳米粒子，记为产物L3；
(14)将产物L3与含有透明质酸的的NaCl水溶液混合，之后在振荡条件下反应15～60 分钟，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液洗 涤得到透明质酸层包覆产物L3的磁性纳米粒子，记为荧光磁性纳米粒子MLNs；
所述Fe3O4磁性纳米粒子质量、第一高分子聚合物质量、第二高分子聚合物质量、CdSSe/ZnS质量、透明质酸质量之比为1:(4～12):(4～12):(0.1～0.3):(4～12)。
上述用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子制备方法，步骤(11)～ (14)中所述含有第一高分子聚合物的NaCl水溶液中第一高分子聚合物的浓度为0.5～1.5mg/mL；所述含有第二高分子聚合物的NaCl水溶液中第二高分子聚合物的浓度为0.5～1.5mg/mL；所述含有透明质酸的NaCl水溶液中透明质酸的浓度为0.5～1.5mg/mL；所述 含有CdSSe/ZnS的水溶液中CdSSe/ZnS的浓度为0.05～0.15mg/mL。所述含有第一高分子聚 合物的NaCl水溶液、含有第二高分子聚合物的NaCl水溶液、含有透明质酸的的NaCl水溶液以及洗涤用NaCl水溶液中NaCl的浓度为2.9～8.8mg/mL；所述含有第一高分子聚合物的NaCl水溶液、含有第二高分子聚合物的NaCl水溶液、含有透明质酸的的NaCl水溶液以及 洗涤用NaCl水溶液的pH为7.5～8.5，可以通过添加1M HCl或NaOH水溶液来调节各溶 液的pH值。
上述用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子制备方法，为了能够使 第一高分子聚合物、第二高分子聚合物、透明质酸和量子点能够均匀沉积在磁性纳米粒子 Fe3O4表面，步骤(11)～(14)中的反应是在振荡条件下进行，振荡操作所采用的振荡器的转速为300～450转/分钟。
上述用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子制备方法，步骤(2)首 先将荧光磁性纳米粒子MLNs表面的羧基活化，然后通过荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧 基引入氨基化聚乙二醇和anti-EpCAM抗体。为了保证荧光磁性纳米粒子MLNs表面有大量 的抗体被引入，所以需要先通过酰胺缩合反应在荧光磁性纳米粒子MLNs引入胱胺二盐酸 盐，为后续anti-EpCAM抗体修饰做好准备，再通过与DTT和SPDP进行还原、氧化反应， 进一步引入含有二硫键的高分子结构。又由于anti-EpCAM抗体容易失活且其体积较大，会 对聚乙二醇的引入产生一定的位阻，在引入anti-EpCAM抗体之前，需要先引入氨基化聚乙 二醇，再引入抗体。
荧光磁性纳米粒子MLN表面的羧基总含量可根据TEM结果进行估计，为了保证荧光磁性纳米粒子MLN表面羧基的使用率，步骤(21)、步骤(23)、步骤(24)中原料的使 用量均以荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧基总含量为计量基础。步骤(21)中，将荧光磁 性纳米粒子MLNs表面羧基活化的实现方式为：将荧光磁性纳米粒子MLNs、EDC(1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)及HOBt(1-羟基苯并三氮唑)或NHS(N-羟基丁 二酰亚胺)加入到pH为6.5～6.8的PBS缓冲液中，在振荡条件下于室温活化羧基1.5～2.5h， 之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，即得到活化羧基后的荧光磁性纳 米粒子MLNs；所述荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧基总含量、EDC、HOBt或NHS摩尔 比约为1:3:3。步骤(24)中，将产物三表面羧基活化的实现方式为：将产物三、EDC及 HOBt或NHS加入到pH为6.5～6.8的PBS缓冲液中，在振荡条件下于室温活化羧基1.5～2.5h， 之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，即得到活化羧基后的产物三；所 述产物三表面的羧基按荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧基总含量计量，所述荧光磁性纳米 粒子MLNs表面羧基总含量、EDC、HOBt或NHS摩尔比约为1:3:3。
上述用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子制备方法，步骤(22) 中二硫苏糖醇DTT用量为至少使产物一的二硫键反应完全，一般至少使二硫苏糖醇DTT 与产物一中的二硫键摩尔比大于5:1即可。
上述用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子制备方法，步骤(2)中 所有PBS缓冲液通过添加1M HCl或NaOH水溶液来调节其pH值；上述涉及使用PBS缓冲液的操作，PBS缓冲液的量为使磁性纳米粒子均匀分散即可。
通过上述制备方法得到的免疫磁性纳米粒子，呈现完整的球形，粒径均匀且分布较 窄，平均粒径约为370nm，这种形状规整、尺寸均匀的纳米粒子比较适合用于CTCs细胞的捕获与释放应用。该免疫磁性纳米粒子以超顺磁性四氧化三铁(Fe3O4纳米颗粒)作为内核，使得免疫磁性纳米粒子整体饱和磁化强度达到58emu g-1,具有较高的饱和磁化强度，从而对外加磁场具有很好的磁响应性能。磁性纳米粒子Fe3O4表面沉积的透明质酸层和量子点层，分别赋予磁性纳米粒子良好的生物相容性和荧光性能。免疫磁性纳米粒子表面引入的anti-EpCAM抗体可用于特异性捕获CTCs细胞，而磁性内核与抗体之间的连接结构含有的二硫键，便于后续在还原剂的作用下，将CTCs表面结合的磁性纳米粒子脱离下来。
通过上述制备方法得到的免疫磁性纳米粒子，可以用于循环肿瘤细胞特异性捕获和释 放。上皮细胞粘附分子(EpCAM)和细胞角蛋白家族成员(CK8、CK18和CK19)在上皮 型肿瘤细胞上存在，血细胞上却不存在；因此，上皮细胞粘附分子(EpCAM)和细胞角蛋 白家族成员(CK8、CK18和CK19)已经成为检测上皮表型患者CTCs的“金标准”；因 此修饰有anti-EpCAM抗体的免疫磁性纳米粒子，能特异地靶向并结合CTCs细胞。经研究 表明，谷胱甘肽(GSH)是动物细胞中主要的低分子量硫醇，在细胞中发挥着许多重要的 生理功能，基于谷胱甘肽介导的二硫键断裂方法已被广泛应用于药物/基因运载等，该方法 对细胞损伤极小。本发明中，将GSH运用于释放CTCs细胞表面的免疫磁性纳米粒子 APMNs，具体实现方法为：在荧光磁性纳米粒子与抗体之间的连接结构设计了二硫键，以 GSH作为还原剂，将二硫键断裂，从而使免疫磁性纳米粒子从CTCs细胞表面脱离下来。 本发明提供的免疫磁性纳米粒子不仅对CTCs细胞具有较高的捕获效率，而且采用GSH释 放免疫磁性纳米粒子后的CTCs细胞存活率极高，且很好的维持了CTCs细胞活性和功能(包 括增殖能力，迁移能力，侵袭能力)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明以磁性纳米粒子Fe3O4作为内核，磁性纳米粒子Fe3O4表面沉积有量子点层， 构建出具有荧光性能的荧光磁性纳米粒子，进一步构建的荧光磁性纳米粒子表面引入了氨 基化聚乙二醇和anti-EpCAM抗体获得免疫磁性纳米粒子APMNs，通过这种方式获得的免 疫磁性纳米粒子APMNs不仅可以对CTCs细胞具有较高的富集效率，且由于磁性纳米粒子与抗体连接的结构中含有二硫键，以GSH为还原剂，极易将磁性纳米粒子从CTCs细胞表 面脱离下来，从而实现对CTCs的特异性捕获和释放；此外，量子点可用于磁性纳米粒子的 荧光标记，可以更加简单直观地表征免疫磁性纳米粒子是否从CTCs细胞上释放下来，以及 释放效率；
2、本发明提供的免疫磁性纳米粒子，磁性纳米粒子Fe3O4表面还沉积有透明质酸层， 其不仅增加免疫磁性纳米粒子的生物相容性，还可在一定程度上有助于CTCs的靶向；
3、本发明提供的免疫磁性纳米粒子，为了进一步增加材料的生物相容性及增强抗非特 异性蛋白、细胞的吸附能力，还在磁性纳米粒子部分表面引入了聚乙二醇；
4、利用本发明提供的免疫磁性纳米粒子可以实现对CTCs细胞的高效捕获和温和释放 (捕获和释放过程在半小时内完成)，释放免疫磁性纳米粒子后的CTCs细胞很好的维持了 细胞活性和功能性(包括增殖能力、迁移能力和侵袭能力)，从而为其下游研究和体外培 养奠定了坚实基础。
附图说明
图1为本发明用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子制备流程图。
图2为本发明实施例制备的磁性纳米粒子由透射电镜检测得到的形貌表征图和粒径分 布图；其中，A-C分别为磁性纳米粒子Fe3O4、实施例1制备的荧光磁性纳米粒子MLNs 及实施例1制备的免疫磁性纳米粒子APMNs的TEM图(标尺为100μm)，D-F分别为实 施例1制备的磁性纳米粒子Fe3O4、实施例1制备的荧光磁性纳米粒子MLNs及实施例1制 备的免疫磁性纳米粒子APMNs的粒径分布直方图。
图3为本发明实施例1制备荧光磁性纳米粒子过程中的粒子表面电位变化图。
图4为本发明实施例1制备的免疫磁性纳米粒子APMNs在不同激光激发下的标记效果 图(标尺：10μm)；其中A为沉积有量子点的免疫磁性纳米粒子APMNs在红色激光(633nm)激发下的共聚焦图，B为罗丹明B异硫氰酸酯标记PAH的APMNs(不含QDs)在红色激 光(633nm)激发下的共聚焦图，C为APMNs与异硫氰酸荧光素标记的二抗(FITC-二抗) 在振荡条件下孵育1h所得产物在绿色激光(488nm)激发下的共聚焦图，D为APMNs与 FITC-二抗孵育产物与20Mm GSH水溶液在振荡条件下孵育15分钟后，所得产物在绿色激 光(488nm)激发下的共聚焦图。
图5为本发明实施例1制备的免疫磁性纳米粒子表面抗体引入含量表征图；其中A为 不同浓度FITC标记的二抗在488nm激光激发下得到的荧光强度-二抗浓度标准曲线，B为APMNs先与不同质量anti-EpCAM抗体孵育，再与过量FITC标记的二抗孵育得到的产物 在488nm激光激发下得到的荧光强度随加入anti-EpCAM抗体质量变化曲线。
图6为本发明实施例制备的磁性纳米粒子磁性能表征图；其中A为磁性纳米粒子Fe3O4和实施例1制备的荧光磁性纳米粒子MLNs在室温条件下测得的磁滞回线，B为不同浓度APMNs水溶液在600nm处的紫外吸收谱图，C为永磁体捕获免疫磁性纳米粒子APMNs的 时间-效率图。
图7为本发明实施例制备的免疫磁性纳米粒子APMNs用于CTCs细胞捕获和释放的过 程示意图。
图8为应用例1-3和应用对比例1-6中免疫磁性纳米粒子APMNs捕获MCF-7细胞、HepG2细胞和Jurkat T细胞捕获效果图(C-E中标尺：50μm；右上角放大图中的标尺为 10μm)；其中A为免疫磁性纳米粒子APMNs对MCF-7细胞、HepG2细胞和Jurkat T细胞 的捕获效率随孵育时间变化图，B为免疫磁性纳米粒子APMNs对MCF-7细胞、HepG2细 胞和Jurkat T细胞的捕获效率随免疫磁性纳米粒子APMNs浓度变化图，C-E为免疫磁性纳 米粒子APMNs与MCF-7细胞、HepG2细胞和Jurkat T细胞相互作用的共聚焦图，其中细 胞核由Hochest 33342预染，呈蓝色，免疫磁性纳米粒子APMNs呈红色。
图9为本发明应用例4中免疫磁性纳米粒子APMNs在不同体系中特异捕获CTCs细胞的能力测试分析图；其中(a)为免疫磁性纳米粒子APMNs在不同体系中特异捕获CTCs 前后对比图(标尺为50μm)，捕获前组1、组2、组3、组4四幅图为由GFP-MCF-7和Jurkat-T 组成的混合细胞体系共聚焦图，捕获前组1、组2、组3、组4中GFP-MCF-7和Jurkat-T比 例分别为1:1，1:40，1:100及1:104，捕获后组1、组2、组3、组4四幅图为免疫磁性纳米 粒子APMNs分别从组1、组2、组3、组4混合细胞体系富集细胞共聚焦图，(b)为组1、 组2、组3、组4四种混合细胞体系中富集前后MCF-7细胞所占比例统计图，(c)为免疫 磁性纳米粒子APMNs在三种不同类型样品中捕获CTCs细胞的检测限及效率统计图，横坐 标为加入到不同类型样品中的CTCs细胞数目，纵坐标为免疫磁性纳米粒子APMNs在三种 不同类型样品中捕获的CTCs细胞数目。
图10为本发明应用例5中，采用GSH将免疫磁性纳米粒子APMNs从CTCs细胞表面 释放效果图及释放细胞死活染色图(标尺为50μm)；其中A为免疫磁性纳米粒子APMNs 捕获CTCs细胞后在405nm和633nm激光激发下得到的叠加共聚焦图，B为免疫磁性纳米 粒子APMNs捕获的CTCs细胞，经GSH处理15分钟后所得细胞在405nm和633nm激光 激发下得到的叠加共聚焦图，C为免疫磁性纳米粒子APMNs捕获的CTCs细胞，经GSH 处理30分钟后所得细胞405nm和633nm激光激发下得到的叠加共聚焦图，D为免疫磁性 纳米粒子APMNs捕获的CTCs细胞，经GSH处理30分钟后，所得细胞的经死活染色后， 在488nm和543nm激光激发下得到的叠加共聚焦图(吖啶橙/碘化丙啶，AO/PI)。
图11为本发明应用例5中，GSH处理后MCF-7细胞体外培养状态图(标尺为100μm)；其中day2是指细胞刚刚贴壁时的细胞体外培养状态图，day3是指第一次传代前的细胞体外培养状态图，day5是指第一次传代后达到细胞融合率达90％时的细胞体外培养状态图，day7 是指第二次传代后达到90％融合率时的细胞体外培养状态图。
图12为本发明应用例6中，经过免疫磁性纳米粒子APMNs捕获、GSH处理后的MCF-7细胞的功能分析图；A-B为实验组细胞(经过免疫磁性纳米粒子APMNs捕获，GSH处理 后的MCF-7细胞)与对照组细胞(未经过捕获及GSH处理过程的MCF-7细胞)迁移能力 比较图(标尺为100μm)，C-D为实验组细胞(经过免疫磁性纳米粒子APMNs捕获，GSH 处理后的MCF-7细胞)与对照组细胞(未经过捕获及GSH处理过程的MCF-7细胞)侵袭 能力比较图(标尺为50μm)，E为实验组和对照组细胞迁移面积百分比统计结果柱状图， F为实验组和对照组细胞侵入transwell小室下表面的细胞的数目统计结果柱状图。
图13为本发明应用例7中，采用三色细胞免疫法(ICC)鉴定从模拟临床样本样本(含 100个MCF-7每毫升的健康志愿者血液中捕获的MCF-7细胞的共聚焦图(标尺为10μm)。
图14为本发明应用例8中，免疫磁性荧光纳米粒子APMNs从病人血液样本中捕获CTCs的测试结果图；其中A为免疫磁性荧光纳米粒子APMNs从11个病人血样中捕获的 CTCs细胞的数目统计图，B一些典型的CTCs三色ICC染色叠加共聚焦图(标尺为10μm)。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述 实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领 域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明 所保护的范围。
本发明提出的用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子制备流程如图 1所示，首先在磁性纳米粒子Fe3O4上通过LbL组装技术依次沉积第一高分子聚合物层 (PAH或PEI)、量子点层、第二高分子聚合物层(PAH或PEI)和透明质酸层(HA)， 构建出荧光磁性纳米粒子(MLNs)；进一步在荧光磁性纳米粒子表面引入抗上皮细胞粘附 分子抗体(anti-EpCAM抗体)和聚乙二醇(PEG)获得免疫磁性纳米粒子(APMNs)，先 将荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧基利用EDC/HOBt(或NHS)活化，再通过与胱胺二盐 酸盐、二硫苏糖醇(DTT)和3-(2-吡啶二硫基)丙酸N-羟基琥珀酸亚胺酯(SPDP)反应 后将anti-EpCAM抗体连接到磁性纳米粒子表面，同时在抗体与磁性纳米粒子之间的连接结 构中形成二硫键，以便于后期将免疫磁性纳米粒子从CTCs细胞表面释放脱离；为了进一步 增加材料的生物相容性，本发明在部分活化羧基后，通过缩合反应引入了聚乙二醇。
为了对本发明提供的技术方案更加清楚，下面结合实施例给出更加详细的说明和解 释。
以下实施例中采用的Fe3O4纳米颗粒的具体制备过程为：将原料1.157g六水和氯化铁、 3.303g醋酸铵和0.4g柠檬酸钠加入到盛有60mL乙二醇的反应釜中，磁力搅拌1～3h使上述 原料混合均匀后，移除搅拌子，将反应釜放入加热炉中，升温至200℃，反应16小时后，关掉加热炉电源，将反应釜在加热炉中保温1小时再将反应釜取出。待反应釜冷却至室温后，对反应液进行磁分离1h以上并收集分离出的固体产物；然后依次用乙醇和去离子水对固体产物重复洗涤5遍左右，至上清液完全澄清透明，收集黑色磁性纳米粒子即磁性纳米粒子Fe3O4，将其置于4～7℃冰箱待用。
通过上述方法得到的纳米颗粒可以很好的分散在水中，形成稳定的超顺磁性纳米颗粒 悬浮液。利用Zetasizer Nano ZS90型粒度分析仪对得到的Fe3O4纳米颗粒进行动态光散射仪 (Dynamic Light Scattering，DLS)测量，分析结果如图2(D)所示，从图中可以看出，Fe3O4纳米颗粒粒径在300nm左右。
虽然透明质酸表面的羧基比较多，但是由于大部分都与第二高分子聚合物结合，本发 明按照透明质酸层羧基含量与透明质酸摩尔比1:1来计量透明质酸层有效羧基含量。以下实 施例中荧光磁性纳米粒子(MLNs)表面羧基总含量的确定方法为：通过荧光磁性纳米粒子 与磁性纳米粒子Fe3O4的体积差得到单颗荧光磁性纳米粒子表面修饰第一的高分子聚合物 层/量子点层/第二高分子聚合物层/透明质酸层总修饰层的体积，取总修饰层的密度为 1.2g/cm3，计算出总修饰层的质量，之后取总修饰层质量的八分之一为透明质酸层的质量， 将其除以透明质酸的分子量，便可得到单颗荧光磁性纳米粒子上的羧基含量。依据四氧化 三铁的密度和荧光磁性纳米粒子(MLNs)的质量(0.5mg)，得到荧光磁性纳米粒子的大 概总体积，将其除以单颗荧光磁性纳米粒子的体积，即得到荧光磁性纳米粒子总颗粒数。 单颗荧光磁性纳米粒子上的羧基含量乘以荧光磁性纳米粒子总颗粒数即得到0.5mg荧光磁 性纳米粒子上的羧基含量。
以下实施例中振荡操作是在常规振荡器中完成的，所采用的振荡器的转速为300～450 转/分钟。
以下实施例中使用的PBS缓冲液的pH值通过添加1M HCl或NaOH水溶液来得到。 例如pH为6.5～6.8的PBS缓冲液是通过向外购的pH约为7.3～7.4的0.01M PBS缓冲液中 添加1M HCl水溶液来得到，pH为7.5～8.5、DMF(二甲基甲酰胺)体积浓度为10％～20％ 的PBS缓冲液是通过向外购的pH约为7.3～7.4的0.01M PBS缓冲液中添加DMF和1M NaOH水溶液来得到，pH为7.5～8.5的PBS缓冲液是通过向外购的pH约为7.3～7.4的0.01M PBS缓冲液中添加1M NaOH水溶液来得到，pH为8.0～8.5、二硫苏糖醇浓度为25～100mM 的PBS缓冲液是通过向外购的pH约为7.3～7.4的0.01M PBS缓冲液中添加DTT和1M NaOH水溶液来得到，pH为8.0～8.5、丙酮含体积浓度为10～20％的PBS缓冲液是通过向外 购的pH约为7.3～7.4的0.01MPBS缓冲液中添加丙酮和1M NaOH水溶液来得到。
以下实施例中采用的anti-EpCAM抗体为市场外购，其厂家为Cell SignalingTechnology， 货号为14452。
实施例1
本实施例用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子的制备包括以下步 骤：
(1)制备荧光磁性纳米粒子MLNs
分别配置聚丙烯酰胺(PAH)浓度为0.5mg/mL的NaCl溶液、透明质酸(HA)浓度为0.5mg/mL的NaCl溶液、CdSSe/ZnS浓度为0.05mg/mL的CdSSe/ZnS水溶液和NaCl浓度 为2.9mg/mL的NaCl水溶液，聚丙烯酰胺(PAH)的NaCl溶液洗液中NaCl浓度为2.9mg/mL， 透明质酸(HA)的NaCl溶液中NaCl浓度为2.9mg/mL。将配置的各溶液按照以下步骤制 备荧光磁性纳米粒子MLNs：
(11)向盛有0.5mg磁性纳米粒子Fe3O4的容器中加入4mL含有PAH的NaCl水溶液， 之后在振荡条件(振荡器的转速为450转/分钟)下反应15分钟，对所得反应液进行磁分离 并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液反复洗涤三次，得到PAH包覆Fe3O4的磁性纳米粒子，记为产物L1；
(12)向盛有产物L1的容器中加入含有1mL CdSSe/ZnS的水溶液，之后在振荡条件(振荡器的转速为450转/分钟)下反应15分钟，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液反复洗涤三次，得到量子点层包覆产物L1的磁性 纳米粒子，记为产物L2；
(13)向盛有产物L2的容器中加入4mL含有PAH的NaCl水溶液，之后在振荡条件 (振荡器的转速为450转/分钟)下反应15分钟，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的 固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液反复洗涤三次，得到PAH包覆产物L2的磁性纳米 粒子，记为产物L3；
(14)向盛有产物L3的容器中加入4mL含有HA的的NaCl水溶液，之后在振荡条件(振荡器的转速为450转/分钟)下反应15分钟，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液反复洗涤三次，得到HA包覆产物L3的磁性纳米 粒子，记为荧光磁性纳米粒子MLNs。
(2)制备免疫磁性纳米粒子APMNs
根据步骤(1)所得荧光磁性纳米粒子MLNs TEM检测结果估计MLNs表面羧基总含量。以0.5mg荧光磁性纳米粒子为例。.根据TEM图可知：磁性纳米粒子Fe3O4的平均直径 为D1＝301.20±29.91nm，荧光磁性纳米粒子(MLNs)的平均直径为D2＝336.64±22.37nm。 一个荧光磁性纳米粒子(MLNs)的聚合物透明质酸的质量为：
V总修饰层＝4/3π[(D2/2)3-(D1/2)3]＝5.7×106nm3
总修饰层密度为ρ＝1.2±0.1g/cm3，取ρ总修饰层＝1.2g/cm3
M总修饰层＝V总修饰层*ρ总修饰层＝6.84×10-15g
按照总聚合物质量的1/8计算透明质酸质量：M透明质酸层＝1/8*M总修饰层＝8.6×10-16g
一颗荧光磁性纳米粒子(MLNs)上透明质酸层所含末端羧基含量为：
透明质酸摩尔分子量Mw＝776.6486
一颗荧光磁性纳米粒子(MLNs)上羧基含量＝M透明质酸层/Mw＝1.1×10-19mol
0.5mg荧光磁性纳米粒子(MLNs)上透明质酸所含末端羧基含量为：
四氧化三铁的密度为：ρ四氧化三铁＝5.18g/cm3
V荧光磁性纳米粒子＝M荧光磁性纳米粒子/ρ四氧化三铁＝9.65×10-2cm3
V单颗荧光磁性纳米粒子＝4/3π*(D2/2)3＝2.0×10-14cm3
荧光磁性纳米粒子(MLNs)上羧基总含量＝(V荧光磁性纳米粒子/V单颗荧光磁性纳米粒子)*一颗荧 光磁性纳米粒子(MLNs)上羧基含量＝5.3×10-7mol。
即0.5mg荧光磁性纳米粒子(MLNs)上透明质酸所含末端羧基总含量为5.3×10- 7mol。
(21)根据步骤(1)所得荧光磁性纳米粒子MLNs TEM检测结果估计MLNs表面羧 基总含量，然后按照MLNs表面羧基总含量：EDC：HOBt摩尔比1:3:3计量，将MLNs、 EDC和HOBt加入到pH为6.8的PBS缓冲液中，在振荡条件(振荡器的转速为450转/分 钟)下于37℃活化羧基2h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，得到 活化羧基后的MLNs；再按照MLNs表面羧基总含量：胱胺盐酸盐摩尔比1:1计量，将活化 羧基后的MLNs和胱胺二盐酸盐加入到pH为8.0、DMF体积浓度为10％的PBS缓冲液中， 在振荡条件(振荡器的转速为450转/分钟)下于37℃反应12h，之后对所得反应液进行磁 分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.4的PBS缓冲液反复洗涤三次得到 产物一；
(22)向产物一中加入pH为8.5、0.1mL DTT浓度为50mM的PBS缓冲液，在振荡条 件(振荡器的转速为450转/分钟)下于室温反应30分钟，之后对所得反应液进行磁分离并 收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.4的PBS缓冲液反复洗涤三次，得到产物 二；
(23)按照MLN表面羧基总含量与SPDP摩尔比为1:2，将产物二和SPDP加入到pH 为8.0、丙酮体积浓度为10％的PBS缓冲液中，在振荡条件(振荡器的转速为450转/分钟) 下于室温反应12h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物 用pH为7.4的PBS缓冲液反复洗涤三次得到产物三；
(24)按照MLNs表面羧基总含量：EDC：HOBt摩尔比1:3:3计量，将产物三、EDC 和HOBt加入到pH为6.8的PBS缓冲液中，在振荡条件(振荡器的转速为450转/分钟) 下于37℃活化羧基2h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，得到活化 羧基后的产物三；再按照MLNs表面羧基总含量：氨基化聚乙二醇摩尔比约为2:1，将羧基 活化后的产物三和氨基化聚乙二醇加入到pH为8.0的PBS缓冲液中，在振荡条件(振荡器 的转速为450转/分钟)下于37℃反应5h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固 体产物，再对固体产物用pH为7.4的PBS缓冲液反复洗涤三次，得到产物四；
(25)将1mg产物四与10μganti-EpCAM抗体加入到0.5mLpH为7.4的PBS缓冲液中，在振荡条件(振荡器的转速为450转/分钟)下于4℃反应12h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.4的PBS缓冲液反复洗涤五次，得到 最终目标产物免疫磁性纳米粒子APMNs。
(一)形貌及尺寸分布
采用JEM-CX100透射电子显微镜对磁性纳米粒子Fe3O4、实施例1制备的荧光磁性纳米粒子MLNs和免疫磁性纳米粒子APMNs进行形貌分析，得到的TEM形貌图如图2(A) -(C)所示，从图中可以看出，制备得到的荧光磁性纳米粒子MLNs和免疫磁性纳米粒子 APMNs大小均一且粒径分布较窄、形貌规整的球形；且随着修饰步骤的增多而增大，B、C 中明显可以看到磁性纳米粒子表面对比度较小的晕，证明PAH、QDs、HA和抗体已经成功 地修饰到Fe3O4磁性纳米粒子表面。
采用Zetasizer Nano ZS90型粒度分析仪检测了磁性纳米粒子Fe3O4、荧光磁性纳米粒子 MLNs和免疫磁性纳米粒子APMNs的粒径分布，检测结果如图2(D)-(F)所示，从图 中可以看出，磁性纳米粒子Fe3O4、荧光磁性纳米粒子MLNs和免疫磁性纳米粒子APMNs 平均粒径分别为301nm、335.6nm、375.2nm，即随着修饰步骤的增多，粒子粒径逐渐变大， 这进一步证明PAH、QDs、HA和抗体已经成功地修饰到磁性纳米粒子Fe3O4表面。
(二)微观结构
采用Zetasizer Nano ZS90型粒度分析仪对步骤(1)制备荧光磁性纳米粒子的过程中磁 性纳米粒子Fe3O4、产物L1、产物L2、产物L3和荧光磁性纳米粒子MLNs表面电位进行测试，分析结果如图3所示，从图中可以看到材料表面电位随层层自主装过程的变化，磁 性纳米粒子Fe3O4表面电位为-20mV，吸附带正电的PAH后，其表面电荷逆转，变为 +39.7mV，随着QDs、PAH和HA依次沉积吸附，磁性纳米离子表面电位分别变为-28.9mV、 39mV和-35mV。磁性纳米粒子表面电荷的反转说明每层材料的成功沉积。
所述免疫磁性纳米粒子APMNs在红色激光激发下得到的共聚焦图如图4(A)所示，从图中可以看出，APMNs呈现鲜亮的红色，说明QDs已经成功修饰到磁性纳米粒子Fe3O4上。
将用于制备荧光磁性纳米粒子MLNs的PAH采用罗丹明B异硫氰酸酯(购于Sigma 公司，CAS：36877-69-7，货号R1755)标记，罗丹明标记PAH的方法参考Protein Encapsulationvia Porous CaCO3Microparticles Templating，Biomacromolecules 2004,5,1962-1972.Volodkin, D.V.等中披露的方法，然后将采用该标记过的PAH为原料按照步骤(13)和步骤(14)在 磁性纳米粒子表面依次沉积PAH和HA，得到磁性纳米粒子Fe3O4/PAH/HA；之后将磁性纳 米粒子Fe3O4/PAH/HA替代步骤(2)中的荧光磁性纳米粒子，在磁性纳米粒子Fe3O4/PAH/HA 表面引入氨基化聚乙二醇和anti-EpCAM抗体得到罗丹明标记PAH的APMNs。其在红色激 光激发下得到的共聚焦图如图4(B)所示，从图中可以看出，APMNs呈现鲜亮的红色，说明PAH已经成功修饰到磁性纳米粒子Fe3O4上。
将APMNs与过量FITC-二抗(购于abcam公司，货号为ab6717)在4℃条件下共孵育1h，然后对孵育所得产物进行磁分离，所得固体产物进一步用PBS缓冲液洗涤后，重新吹 散在PBS缓冲液中，之后在488nm激光激发下得到的共聚焦图如图4(C)所示，从图中 可以看出，所得产物呈现绿色，说明anti-EpCAM抗体已经成功修饰到荧光磁性纳米粒子 APMNs上。向上述产物中加入20mM GSH溶液，振荡条件下反应15分钟，经磁分离得到 的固体产物进一步用PBS缓冲液洗涤后，重新吹散在PBS缓冲液中，之后在488nm激光激 发下得到的共聚焦图如图4(D)所示，从图中可以看出，所得产物不再呈绿色，说明与FITC- 二抗结合的anti-EpCAM抗体从APMNs表面脱离下来。证明anti-EpCAM抗体与磁性内核 之间的含有二硫键的连接结构被成功构建。
为了进一步确定APMNs上抗体结合量，在488nm激光激发不同浓度的FITC-二抗水溶 液，测量其在520nm处发射荧光强度，得到对应的荧光强度-二抗浓度标准曲线如图5(A)， 从图中可以看出发射荧光强度随着二抗浓度增加而增强。为了确定APMNs中抗体的荷载 量，向100μg产物四中加入不同质量的anti-EpCAM抗体，然后将步骤(25)所得免疫磁性纳米粒子APMNs再与过量FITC-二抗在4℃条件下共孵育1h，然后对孵育所得产物进行磁 分离，所得固体产物在488nm激光激发，测量其在520nm发射荧光强度，检测得到的荧光 强度随anti-EpCAM抗体加入质量的变化曲线如图5(B)所示，从图中可以看出，随 anti-EpCAM抗体的增多(从0.5μg到1μg)，所得产物发射荧光荧光强度增加，说明加入 的anti-EpCAM抗体全部被接枝到100μg磁纳米粒子上；而当anti-EpCAM抗体加入量超过 1μg后，所得产物发射荧光荧光强度几乎没有增加，说明磁纳米粒子上的anti-EpCAM抗体 已经饱和。所以1mgAPMNs上约能荷载10μg抗体。
(三)磁性能
采用Model BHV-525型振动样品磁强计(VSM)分别检测了磁性纳米粒子Fe3O4、荧光磁性纳米粒子MLNs在-18000Oe到18000Oe范围内的磁滞回线，结果如图6(A)所示， 从图中可以看出，所有样品的磁滞回线均经过原点，无剩磁和矫顽力，说明磁性纳米粒子 Fe3O4、荧光磁性纳米粒子MLNs均无剩磁和矫顽力，具有超顺磁性，且饱和磁化强度较高， 分别为64.3emu/g及58emu/g。
为进一步测试免疫磁性纳米粒子APMNs的磁响应时间，不同浓度的免疫磁性纳米粒子 APMNs水溶液在600nm处吸收强度进行检测，检测的APMNs浓度-紫外吸收强度标准曲线如图6(B)所示。可以看出，免疫磁性纳米粒子APMNs在600nm处的紫外吸收强度 随其浓度的增加呈线性增加。用永磁体吸附100μg/mL的免疫磁性纳米粒子APMNs水溶液， 测量不同吸附时间被永磁体吸附的APMNs在600nm处的吸光值，再根据APMNs浓度-紫 外吸收强度标准曲线算出不同吸附时间被永磁体吸附的APMNs百分比，所得APMNs吸附 百分比随吸附时间变化曲线如图6(C)所示。从图6(C)可以看出，在1分钟时，约95％ 的APMNs便能被永磁体吸附，进一步证明APMNs磁响应能力很强，磁响应时间短，为后 续CTCs从血液中的快速分离打下坚实的基础。
实施例2
本实施例用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子的制备包括以下步 骤：
(1)制备荧光磁性纳米粒子MLNs
分别配置聚丙烯酰胺(PAH)浓度为1.0mg/mL的NaCl溶液、聚丙烯酰胺(PAH)浓 度为1.2mg/mL的NaCl溶液、透明质酸(HA)浓度为1.0mg/mL的NaCl水溶液、CdSSe/ZnS 浓度为0.1mg/mL的CdSSe/ZnS水溶液(溶液C)和NaCl浓度为8.8mg/mL的NaCl水溶液， 聚丙烯酰胺(PAH)的NaCl溶液中NaCl浓度为8.8mg/mL，透明质酸(HA)的NaCl溶液 中NaCl浓度为8.8mg/mL。将配置的各溶液按照以下步骤制备荧光磁性纳米粒子MLNs：
(11)向盛有0.5mg磁性纳米粒子Fe3O4的容器中加入4mL含有PAH(PAH浓度为1.0mg/mL)的NaCl水溶液，之后在振荡条件(振荡器的转速为400转/分钟)下反应30分 钟，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液反复 洗涤三次，得到PAH包覆Fe3O4的磁性纳米粒子，记为产物L1；
(12)向盛有产物L1的容器中加入含有1mL CdSSe/ZnS的水溶液，之后在振荡条件(振荡器的转速为400转/分钟)下反应30分钟，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水水溶液反复洗涤三次，得到量子点层包覆产物L1的磁 性纳米粒子，记为产物L2；
(13)向盛有产物L2的容器中加入4mL含有PAH(PAH浓度为1.2mg/mL)的NaCl 水溶液，之后在振荡条件(振荡器的转速为400转/分钟)下反应30分钟，对所得反应液进 行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水水溶液反复洗涤三次，得到 PAH包覆产物L2的磁性纳米粒子，记为产物L3；
(14)向盛有产物L3的容器中加入4mL含有HA的的NaCl水溶液，之后在振荡条件(振荡器的转速为400转/分钟)下反应30分钟，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水NaCl水溶液反复洗涤三次，得到HA包覆产物L3的磁 性纳米粒子，记为荧光磁性纳米粒子MLNs。
(2)制备免疫磁性纳米粒子APMNs
(21)根据步骤(1)所得荧光磁性纳米粒子MLNs TEM检测结果估计MLNs表面羧 基总含量，然后按照MLNs表面羧基总含量：EDC：HOBt摩尔比1:3:3计量，将MLNs、 EDC和HOBt加入到pH为6.6的PBS缓冲液中，在振荡条件(振荡器的转速为400转/分 钟)下于25℃活化羧基1.5h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，得 到活化羧基后的MLNs；再按照MLNs表面羧基总含量：胱胺盐酸盐摩尔比1:1计量，将活 化羧基后的MLNs和胱胺二盐酸盐加入到pH为7.5、DMF体积浓度为20％的PBS缓冲液 中，在振荡条件(振荡器的转速为400转/分钟)下于25℃反应24h，之后对所得反应液进 行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.4的PBS缓冲液反复洗涤三次 得到产物一；
(22)向产物一中加入pH为8.0、DTT浓度为0.1mL 50mM的PBS缓冲液，在振荡条 件(振荡器的转速为400转/分钟)下于室温反应45分钟，之后对所得反应液进行磁分离并 收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.4的PBS缓冲液反复洗涤三次，得到产物 二；
(23)按照MLN表面羧基总含量与SPDP摩尔比为1:2，将产物二和SPDP加入到pH 为8.5、丙酮体积浓度为20％的PBS缓冲液中，在振荡条件(振荡器的转速为400转/分钟) 下于室温反应18h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物 用pH为7.4的PBS缓冲液反复洗涤三次得到产物三；
(24)按照MLNs表面羧基总含量：EDC：HOBt摩尔比1:3:3计量，将产物三、EDC 和HOBt加入到pH为6.6的PBS缓冲液中，在振荡条件(振荡器的转速为400转/分钟) 下于25℃活化羧基1.5h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，得到活 化羧基后的产物三；再按照MLNs表面羧基总含量：氨基化聚乙二醇摩尔比2:1，将羧基活 化后的产物三和氨基化聚乙二醇加入到pH为7.5的PBS缓冲液中，在振荡条件(振荡器的 转速为400转/分钟)下于25℃反应12h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固 体产物，再对固体产物用pH为7.4的PBS缓冲液反复洗涤三次，得到产物四；
(25)将1mg产物四与15μg anti-EpCAM抗体加入到0.1mLpH为7.4的PBS缓冲液中，在振荡条件(振荡器的转速为400转/分钟)下于5℃反应18h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.4的PBS缓冲液反复洗涤五次，得到 最终目标产物免疫磁性纳米粒子APMNs。
实施例3
本实施例用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子的制备包括以下步 骤：
(1)制备荧光磁性纳米粒子MLNs
分别配置聚丙烯酰胺(PAH)浓度为1.3mg/mL的NaCl溶液、聚丙烯酰胺(PAH)浓 度为1.5mg/mL的NaCl溶液、透明质酸(HA)浓度为1.5mg/mL的NaCl溶液、CdSSe/ZnS 浓度为0.15mg/mL的CdSSe/ZnS水溶液(溶液C)和NaCl浓度为5mg/mL的NaCl水溶液， 聚丙烯酰胺(PAH)的NaCl溶液洗液中NaCl浓度为5mg/L，透明质酸(HA)的NaCl溶 液中NaCl浓度为5mg/mL。将配置的各溶液按照以下步骤制备荧光磁性纳米粒子MLNs：
(11)向盛有0.5mg磁性纳米粒子Fe3O4的容器中加入4mL含有PAH(PAH浓度为1.3mg/mL)的NaCl水溶液，之后在振荡条件(振荡器的转速为300转/分钟)下反应60分 钟，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液反复 洗涤三次，得到PAH包覆Fe3O4的磁性纳米粒子，记为产物L1；
(12)向盛有产物L1的容器中加入含有1mL CdSSe/ZnS的水溶液，之后在振荡条件(振荡器的转速为300转/分钟)下反应60分钟，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液反复洗涤三次，得到量子点层包覆产物L1的磁性 纳米粒子，记为产物L2；
(13)向盛有产物L2的容器中加入4mL含有PAH(PAH浓度为1.5mg/mL)的NaCl 水溶液，之后在振荡条件(振荡器的转速为300转/分钟)下反应60分钟，对所得反应液进 行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液反复洗涤三次，得到PAH 包覆产物L2的磁性纳米粒子，记为产物L3；
(14)向盛有产物L3的容器中加入4mL含有HA的的NaCl水溶液，之后在振荡条件(振荡器的转速为300转/分钟)下反应60分钟，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液反复洗涤三次，得到HA包覆产物L3的磁性纳米 粒子，记为荧光磁性纳米粒子MLNs。
(2)制备免疫磁性纳米粒子APMNs
(21)根据步骤(1)所得荧光磁性纳米粒子MLNs TEM检测结果估计MLNs表面羧 基总含量，然后按照MLNs表面羧基总含量：EDC：HOBt摩尔比1:3:3计量，将MLNs、 EDC和HOBt加入到pH为6.5的PBS缓冲液中，在振荡条件(振荡器的转速为300转/分 钟)下于20℃活化羧基2.5h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，得 到活化羧基后的MLNs；再按照MLNs表面羧基总含量：胱胺盐酸盐摩尔比1:1计量，将活 化羧基后的MLNs和胱胺二盐酸盐加入到pH为8.5、DMF体积浓度为15％的PBS缓冲液 中，在振荡条件(振荡器的转速为300转/分钟)下于20℃反应36h，之后对所得反应液进 行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.3的PBS缓冲液反复洗涤三次 得到产物一；
(22)向产物一中加入pH为8.5、0.1mL DTT浓度为100mM的PBS缓冲液，在振荡 条件(振荡器的转速为300转/分钟)下于室温反应60分钟，之后对所得反应液进行磁分离 并收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.3的PBS缓冲液反复洗涤三次，得到产 物二；
(23)按照MLN表面羧基总含量与SPDP摩尔比为1:2，将产物二和SPDP加入到pH 为8.0、丙酮体积浓度为15％的PBS缓冲液中，在振荡条件(振荡器的转速为300转/分钟) 下于室温反应24h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物 用pH为7.3的PBS缓冲液反复洗涤三次得到产物三；
(24)按照MLNs表面羧基总含量：EDC：HOBt摩尔比1:3:3计量，将产物三、EDC 和HOBt加入到pH为6.5的PBS缓冲液中，在振荡条件(振荡器的转速为300转/分钟) 下于20℃活化羧基2.5h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，得到活 化羧基后的产物三；再按照MLNs表面羧基总含量：氨基化聚乙二醇摩尔比2:1，将羧基活 化后的产物三和氨基化聚乙二醇加入到pH为7.5的PBS缓冲液中，在振荡条件(振荡器的 转速为300转/分钟)下于20℃反应24h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固 体产物，再对固体产物用pH为7.3的PBS缓冲液反复洗涤三次，得到产物四；
(25)将1mg产物四与20μg anti-EpCAM抗体加入到1mLpH为7.3的PBS缓冲液中， 在振荡条件(振荡器的转速为300转/分钟)下于7℃反应24h，之后对所得反应液进行磁分 离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.3的PBS缓冲液反复洗涤五次，得到 最终目标产物免疫磁性纳米粒子APMNs。
应用例
本发明进一步提供了上述免疫磁性纳米粒子在捕获和释放CTCs细胞方面的应用，免 疫磁性纳米粒子对CTCs细胞捕获和释放过程，如图7所示，首先将免疫磁性纳米粒子APMNs加入到待处理的样本中，然后在振荡条件下孵育一定时间，孵育过程结束后通过 磁分离方式将固体产物分离出来，之后再用GSH对表面含有APMNs的CTCs细胞进行处 理，使富集在CTCs上的免疫磁性纳米粒子APMNs脱离。继后对得到的CTCs细胞进行下 游分析(包括细胞增殖、迁移能力和侵袭能力等)，以进一步确定捕获和释放过程对CTCs 细胞活性和功能性的影响。
以下应用例中以MCF-7或GFP-MCF-7细胞为例，对利用实施例1制备的免疫磁性纳米粒子捕获和释放CTCs进行详细的说明。
应用例1
本应用例的目的在于考察免疫磁性纳米粒子APMNs浓度对免疫磁性纳米粒子APMNs 捕获MCF-7细胞的捕获效率的影响，本应用例包括以下步骤：
(1)将细胞融合率达80～90％的MCF-7细胞用胰酶消化30s，然后将胰酶消化的MCF-7 细胞重悬到完全培养基(DMEM，高糖)中。取出部分悬浮有细胞的培养基进行细胞计数， 并将其用DMEM(高糖)完全培养基进一步稀释至细胞浓度为6.67×105个/毫升。
(2)将免疫磁性纳米粒子APMNs用完全培养基(DMEM，高糖)稀释到0.5mg/mL， 得到APMNs的培养基悬浮液。
(3)按照表1中的比例，将APMNs的培养基悬浮液、完全培养基(DMEM，高糖) 和MCF-7细胞的完全培养基(DMEM，高糖)悬浮液加入到6个Ep管内，并混合均匀， 然后将6个Ep管分别固定到摇床上，在500转/分钟振荡下孵育15分钟。
(4)振荡结束后将6个Ep管内的产物进行磁分离，同时收集上清液，用细胞计数仪对上清液中的细胞进行计数，每个样品测三次，取其平均值记为上清液中的细胞数，进而得到上清液细胞浓度。
未捕获细胞总数＝上清液细胞浓度×上清液体积
投入细胞总数＝投入细胞浓度×投入细胞体积
捕获效率＝(1-未捕获细胞总数/投入细胞总数)×100％
根据上述公式，便可获得六组样品不同浓度APMNs捕获MCF-7细胞的捕获效率。
表1.不同浓度APMNs捕获MCF-7细胞实验材料添加表
应用对比例1
将MCF-7细胞替换为HepG2细胞，重复上述步骤(1)-(4)，得到APMNs不同浓 度下捕获HepG2细胞的捕获效率。
应用对比例2
将MCF-7细胞替换为Jurkat T细胞，高糖DMEM完全培养基替换为1640完全培养基，重复上述步骤(1)-(4)，得到APMNs不同浓度下捕获Jurkat T细胞的捕获效率。
将应用例1、应用对比例1和应用对比例2得到的APMNs不同浓度下捕获各种细胞的捕获效率进行统计，结果如图8(B)所示，从图中可以看出，无论免疫磁性纳米粒子浓度 怎样变化，Jurkat T细胞的捕获效率皆在5％及以下。而随着APMNs浓度从0.08mg/mL增 加到0.13mg/mL，MCF-7细胞和HepG2细胞的捕获效率略微增加，但在0.15mg/mL及更大 浓度时，这两种细胞的捕获效率皆与0.13mg/mL时的捕获效率相当，说明用于捕获MCF-7 细胞和HepG2细胞的免疫磁性纳米粒子浓度约为0.13mg/mL。
应用例2
本应用例的目的在于考察孵育时间对免疫磁性纳米粒子APMNs捕获MCF-7细胞的捕 获效率的影响，本应用例包括以下步骤：
(1)将细胞融合率达80～90％的MCF-7细胞用胰酶消化30s，然后将胰酶消化的MCF-7 细胞重悬到DMEM(高糖)完全培养基中。取出部分悬浮有细胞的培养基进行细胞计数， 并将其用DMEM(高糖)完全培养基进一步稀释至细胞浓度为6.67×105个/毫升。
(2)将免疫磁性粒子APMNs用完全培养基(DMEM，高糖)稀释到0.5mg/mL，得到APMNs的培养基悬浮液。(3)分别向六个Ep管内加入0.5mL APMNs的培养基悬浮液、 0.2mLDMEM(高糖)完全培养基和0.3mL MCF-7细胞的培养基悬浮液，并混合均匀，然 后将6个Ep管分别固定到摇床上，以500转/分钟的速度轻微振荡孵育30s、60s、90s、120s、 5分钟及15分钟。
(4)振荡结束后将6个Ep管内的产物进行磁分离，同时收集上清液，用细胞计数仪对上清液中的细胞进行计数，每个样品测三次，取其平均值记为上清液中的细胞数，进而得到上清液细胞浓度。
未捕获细胞总数＝上清液细胞浓度×上清液体积
投入细胞总数＝投入细胞浓度×投入细胞体积
捕获效率＝(1-未捕获细胞总数/投入细胞总数)×100％
根据上述公式，便可获得六组样品不同孵育时间下APMNs捕获MCF-7细胞的捕获效率。
应用对比例3
将MCF-7细胞替换为HepG2细胞，重复上述步骤(1)-(4)，得到不同孵育时间下APMNs捕获HepG2细胞的捕获效率。
应用对比例4
将MCF-7细胞替换为Jurkat T细胞，高糖DMEM完全培养基替换为1640完全培养基，重复上述步骤(1)-(4)，得到不同孵育时间下APMNs捕获Jurkat T细胞的捕获效率。
将应用例2、应用对比例3和应用对比例4得到的不同孵育时间下APMNs捕获各种细胞的捕获效率进行统计，结果如图8(A)所示，从图中可以看出，无论孵育时间怎样变化，Jurkat T细胞的捕获效率皆在5％及以下。而随着APMNs与细胞孵育时间从30s增加到60s，MCF-7细胞和HepG2细胞的捕获效率略微增加，但在90s及更长时间时，这两种细胞的捕 获效率皆与60s时的捕获效率相当，说明免疫磁性纳米粒子与细胞的较佳孵育时间约为60s，即1分钟。
应用例3
本应用例的目的在于研究免疫磁性纳米粒子APMNs与MCF-7细胞的相互作用强弱，本应用例包括以下步骤：
(1)将细胞融合率达80～90％的MCF-7细胞用胰酶消化30s，然后将胰酶消化的MCF-7细胞重悬到完全培养基(DMEM，高糖)中。将所得细胞用20mM Hochest33324PBS溶液(pH＝7.4)于室温预染10分钟，PBS缓冲液(pH＝7.4) 清洗两次后，之后将预染后的细胞重新分散在完全培养基(DMEM，高糖)。
(2)取出部分悬浮有预染细胞的培养基进行细胞计数，并将其用完全培养基(DMEM，高糖)进一步稀释至细胞浓度为6.67×105个/毫升。
(3)将免疫磁性粒子APMNs用完全培养基(DMEM，高糖)稀释到0.5mg/mL，得到APMNs的培养基悬浮液。
(4)分别向Ep管内加入0.5mL APMNs的培养基悬浮液、0.2mL DMEM(高糖)完全 培养基和0.3mL MCF-7细胞培养基悬浮液，并混合均匀，然后将Ep管固定到摇床上，以 500转/分钟的速度振荡孵育60s。
(5)振荡结束后将Ep管内的产物进行磁分离，收集磁分离所得固体产物，用PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗三次后，将固体产物分散在PBS缓冲液(pH＝7.4)中，置于玻底皿上， 在405nm及633nm激光激发下得到相应的共聚焦叠加图，如图8(C)所示。
应用对比例5
将MCF-7细胞替换为HepG2细胞，重复上述步骤(1)-(5)，得到在405nm及633nm 激光激发下得到相应的共聚焦叠加图，如图8(D)所示。
应用对比例6
将MCF-7细胞替换为Jurkat T细胞，高糖DMEM完全培养基替换为1640完全培养基，重复上述步骤(1)-(5)，得到在405nm及633nm激光激发下得到相应的共聚焦叠加图， 如图8(E)所示。
从图8(C)-(E)可以看出，由于APMNs含有QDs，其在633nm激光激发下呈红色， 图8(C)、(D)中，细胞周围出现大量的红色荧光信号，说明APMNs对MCF-7细胞和 HepG2细胞具有较强的亲和作用；而图8(E)中为一偶然发现的Jurkat T细胞，且细胞周 围几乎没有红色荧光信号，说明APMNs与Jurkat T细胞亲和能力差，APMNs的抗非特异 性吸附能力较强。因此，结合图8(A)-(D)，可以看出APMNs对EpCAM高表达细胞 (如MCF-7细胞和HepG2细胞)的亲和性远大于EpCAM几乎不表达的细胞(Jurkat T细 胞)，说明本发明提供的免疫磁性纳米粒子特异性靶向EpCAM高表达的细胞能力较强， 且具有较强的抗非特异性吸附能力。
应用例4
为了进一步研究APMNs在混合细胞体系中特异性富集目标细胞的能力强弱，本应用例 以GFP标记的MCF-7细胞(GFP-MCF-7细胞)为目标模型细胞，Jurkat T细胞为干扰细胞， 配置了不同比例的共混细胞样本。具体操作如下：将两种细胞用20mMHochest33324PBS 溶液于室温预染10分钟，用PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗两次后，将预染细胞重新分散在含 10％胎牛血清(体积比，FBS)的PBS缓冲液(pH＝7.4)中。对两种细胞进行计数后，按 照GFP-MCF-7：Jurkat T数量比1:1、1:40、1:100及1:104混合得到细胞混合液，向混合细 胞液中分布加入0.05mg APMNs，之后在振荡条件下孵育1分钟后，对孵育产物进行磁分离， 再用PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗两次后，收集分离所得固体产物，分散在PBS缓冲液(pH＝7.4) 中，于405nm及488nm激光激发下拍摄对应共聚焦图，并统计富集后GFP-MCF-7细胞所 占比例。得到的标记共聚焦图和统计结果如图9所示。从图9(a)可以看出，在GFP-MCF-7 比例越来越小的混合细胞系统中，APMNs特异性富集目标GFP-MCF-7细胞的仍然能力很 强。从图9(b)可以看出，经过富集，GFP-MCF-7细胞所占的百分比由50％，2.43％，1％，0.01％，分别提高到92.78％，57.69％，45.83％，5.27％，分别提高了1.86，23.74，45.83，527倍。以上结果说明免疫磁性纳米粒子APMNs在大量白细胞的干扰下，仍能有效的富 集目标细胞，这为后续免疫磁性纳米粒子APMNs在全血(含有大量干扰白细胞)中的运用 奠定坚实的基础。
为了探究APMNs在不同环境中对目标细胞的检测限，本应用例在PBS缓冲液(pH＝7.4)、 106个Jurkat T细胞和健康人全血中分别放置了极少数目的GFP-MCF-7细胞(每毫升5-200 个)。再向加入GFP-MCF-7细胞的PBS缓冲液、106个Jurkat T细胞转和健康人全血中加入 0.05mg APMNs后在振荡条件下孵育1分钟后，将孵育所得产物进行磁分离，并收集磁分离 所得产物，再将磁分离所得产物重新分散于PBS缓冲液(pH＝7.4)后，分别加入1-20个96孔 板的孔中，之后在荧光显微镜下逐一统计发绿色荧光的细胞，统计结果如图9(c)所示，从 图中可以看出，APMNs在PBS缓冲液、106个Jurkat T细胞转及复杂的全血中，平均捕获效 率分别能达到99％，97％及89％，且最低检测限为5个。由此可见，本发明制备得到的免疫 磁性纳米粒子在复杂的情况下，也能灵敏地，高效地富集到CTCs细胞。
应用例5
本应用例以MCF-7为模型目标细胞，对采用GSH将APMNs从CTCs细胞释放情况以 及释放细胞的死活情况、体外培养情况进行测试。
本应用例包括以下步骤：
(1)将细胞融合率达80～90％的MCF-7细胞用胰酶消化30s，然后将胰酶消化的MCF-7 细胞重悬到完全培养基(DMEM，高糖)中。将所得细胞用20mM Hochest33324PBS溶液于室温预染10分钟，之后用PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗两次后，再将预染细胞分散在完全 培养基(DMEM，高糖)。
(2)取出部分悬浮有细胞的培养基进行细胞计数，并将其用完全培养基(DMEM，高糖)进一步稀释至细胞浓度为6.67×105个/毫升。
(3)按照免疫磁性纳米粒子和培养基质量体积比为1mg：4mL计量，将实施例1制备的免疫磁性纳米粒子APMNs加入到DMEM(高糖)完全培养基中，得到APMNs的培养 基悬浮液。
(4)分别向Ep管内加入0.5mL APMNs的培养基悬浮液、0.2mL DMEM(高糖)完全 培养基和0.3mL MCF-7细胞培养基悬浮液，并混合均匀，然后将Ep管固定到摇床上，以 500转/分钟的速度轻微振荡孵育60s。
(5)振荡结束后将Ep管内的产物进行磁分离，收集磁分离所得固体产物，并用PBS缓冲(pH＝7.4)液清洗三次后，再将将部分固体产物分散在PBS缓冲液中，置于玻底皿上，在405nm及633nm激光激发下得到相应的共聚焦叠加图，如图10(A)所示。
(6)将剩余固体产物分为两等份分别与GSH浓度为50mM的PBS缓冲液(pH＝7.4) 在室温下孵育15分钟、30分钟后，将Ep管内的产物进行磁分离，收集上清液，将上清液 于1200转/分进行离心，离心所得产物进一步用PBS缓冲液(pH＝7.4)于1200转/分离心洗 涤，最后将离心所得产物分散在PBS缓冲液中，置于玻底皿上，在405nm及633nm激光激 发下得到相应的共聚焦叠加图，如图10(B)和(C)所示。
(7)取部分与GSH孵育30分钟后得到的离心产物，使用AO/PI染料(购于索莱宝有限公司，AO货号为CA1143，PI货号为P8080)分别对死活细胞进行染色，之后经PBS缓 冲液(pH＝7.4)离心洗涤两次，并收集离心所得沉淀，再向所得沉淀中加入100μL PBS缓 冲液，经吹散后加入到玻璃底皿中，于488nm及543nm激光激发得到相应的共聚焦叠加 图，如图10(D)所示。
(8)取部分与GSH孵育30分钟后得到的离心产物，用PBS缓冲液(pH＝7.4)于1200转/分钟离心洗涤两次，并收集离心所得沉淀，再将含有细胞的沉淀重新分散于培养基中，置于二十四孔板中继续培养，分别于第3天和第5天进行细胞传代。并在细胞贴壁、第一 次传代前、第一次传代达到90％融合率时及第二次传代后达到90％融合率时，用倒置荧光 显微镜下采集明场下的图像，如图11所示。
从图10(A)-(C)可以看出，采用GSH处理前，细胞表面有红色荧光信号，即免疫 磁性纳米颗粒APMNs分布在细胞表面；GSH与以上细胞-材料共混物孵育15分钟后，仅 个别细胞表面仍有少量红色材料残余；GSH与以上细胞-材料共混物孵育30分钟后，细胞 表面没有可见红色材料，说明细胞表面的免疫磁性纳米粒子APMNs全部从细胞上释放下来 了。从图11可以看出，与GSH孵育30分钟后所得的细胞存活率极高，说明捕获及释放过 程对细胞的活性影响小，这为后续CTCs的体外培养，扩增奠定了基础。
如图11所示，从图中可以看出，经GSH处理的MCF-7细胞仍能正常增殖传代，说明捕获和释放过程对细胞增殖能力基本没有影响。
应用例6
本应用例目的在于确定细胞富集及释放过程对CTCs细胞迁移能力和侵袭能力的影响。
本应用例以伤口愈合实验来测试细胞富集及释放过程对CTCs细胞迁移能力的影响，迁 移能力通过伤口愈合实验来测定，实验步骤为：用200μL的无菌枪头在融合细胞层(此处 细胞指的是未经任何处理的MCF-7细胞及应用例5中与GSH孵育30分钟并经PBS缓冲液 离心洗涤后所得MCF-7细胞)上划出一个空白的无细胞区域后，用PBS缓冲液(pH＝7.4)小心清洗两次，再用2mL无血清培养基(DMEM，高糖)培养剩余细胞。于0小时、12小 时和24小时拍摄空白区域图像。N小时伤口愈合面积百分比＝(初始无细胞区域面积-N小 时无细胞区域面积)/初始无细胞区域面积×100％。两组细胞伤口愈合面积百分比随时间变 化如图12(A)、(B)、(E)所示，从图中可以看出，未经GSH处理的MCF-7细胞和 经GSH处理的MCF-7细胞的迁移能力相当，说明利用本发明提供的免疫磁性纳米粒子对 MCF-7细胞的捕获释放过程均未对MCF-7细胞的迁移能力造成明显影响。
本应用例以Tranwell侵袭实验来测试细胞富集及释放过程对CTCs细胞侵袭能力的影 响，具体方法如下：将分散在150μL无血清中的2×104个肿瘤细胞(含未经任何处理的MCF-7细胞及应用例5中与GSH孵育30分钟并经PBS缓冲液(pH＝7.4)离心洗涤后所得 MCF-7细胞)接种到已铺好基质胶的transwell小室中，在下室加入750μL胎牛血清含量为 30％的培养基(DMEM，高糖)。36小时后，将残留在上表面的细胞刮去，将侵入transwell 小室下表面的细胞用100％甲醇室温下固定10分钟，固定结束后用PBS缓冲液(pH＝7.4) 清洗三次，再用体积度30％甲醛PBS缓冲液孵育10分钟，孵育结束后用PBS缓冲液(pH＝7.4) 清洗三次，最后用0.1％结晶紫乙醇溶液室温染色5分钟，染色结束后用PBS缓冲液(pH＝7.4) 清洗三次。整个操作结束后随机选择5个视野拍照并统计入侵细胞的数量，如图(C)、(D)、 (F)所示，从图中可以看出，未经GSH处理的MCF-7细胞和经GSH处理的MCF-7细胞 的侵袭能力相当，说明利用本发明提供的免疫磁性纳米粒子对MCF-7细胞的捕获释放过程 均未对MCF-7细胞的侵袭能力造成明显影响。
应用例7
本应用例以MCF-7细胞为目标细胞。
由于非特异性吸附，血液细胞也会被CTCs富集材料所吸附，因此本应用例采用三色细 胞免疫法(ICC)鉴定将CTCs细胞与干扰细胞分开，从模拟临床血样中捕获MCF-7细胞的 能力。标准的三色ICC法通常包括对能选择性结合上皮细胞【FITC标记的抗细胞角蛋白19 单克隆抗体，FITC-CK19(购于Abcam，货号为ab52459)，488nm激光激发呈绿色】、白 细胞【Alexa Flour 647标记的抗白细胞共同抗原，Alexa Flour 647-CD45(购于NovusBiologicals，货号为NBP1-79127AF647)，633nm激光激发呈红色】的探针，以及细胞核染 料(Hochest 33324(购于Sigma，CAS号：23491-52-3，货号为B2261)，405nm激光激发呈 蓝色)。因此，带有蓝色荧光信号及绿色荧光信号的细胞被认为是CTCs，而带有蓝色荧光信 号及红色荧光信号的细胞被认为是白细胞。
将100个MCF-7细胞加入到1mL健康人全血中，制备模拟临床样本；之后向样本中加入实施例1制备得到的免疫磁性纳米粒子APMNs 0.05mg，在振荡条件下孵育5分钟，再对 孵育所得产物进行磁分离并收集分离所得产物，然后用PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗磁分离产物一次后，将收集到的细胞用4％多聚甲醛固定10分钟，固定结束后用PBS缓冲液清洗三次；再与0.1％聚乙二醇辛基苯基醚孵育10分钟，孵育结束后再用PBS缓冲液清洗三次；之后用1％牛血清蛋白孵育30分钟，孵育结束后用PBS缓冲液清洗三次；之后加入30μg mL-1 FITC-CK19、30μg mL-1APC-CD45、20mM Hochest 33324后染色30分钟，染色结束后用PBS 缓冲液清洗三次。在染色过程结束后，将染色细胞分散在PBS缓冲液中，置于玻底皿上，在 405nm，488nm，633nm激光激发下得到对应的共聚焦图及共聚焦叠加图，如图13所示。从 图中可以看出，肿瘤细胞呈圆形或椭圆形，带有蓝色荧光信号及绿色荧光信号，由于APMNs 没有捕获到白细胞，因此没有拍摄到白细胞的图像，图13中白细胞对应的共聚焦图像为空白。
应用例8
本应用例采用三色细胞免疫法鉴定从向上皮表型癌患者及健康正常志愿者全血中捕获 CTCs细胞的数目。
分别向9例正常人和11例病人1.5mL全血样本中加入实施例1制备得到的免疫磁性纳米 粒子APMNs 0.05mg，在振荡条件下孵育1分钟，再对孵育所得产物进行磁分离并收集分离 所得产物，然后用PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗磁分离产物三次，将收集到的细胞用4％多聚 甲醛固定10分钟，固定结束后用PBS缓冲液清洗三次；再与0.1％聚乙二醇辛基苯基醚孵育 10分钟，孵育结束后再用PBS缓冲液清洗三次；之后用1％牛血清蛋白孵育30分钟，孵育结 束后用PBS缓冲液清洗三次；之后加入30μg mL-1FITC-CK19、30μg mL-1APC-CD45、20mMHochest 33324后染色30分钟，染色结束后用PBS缓冲液清洗三次。在染色过程结束后，将染色细胞分散在PBS缓冲液中，置于玻底皿上，在405nm，488nm，633nm激光激发下拍摄 对应的共聚焦叠加图，并统计20例样本中CTCs细胞数量，测试结果如图14所示。
在健康人血液样本中，未发现CTCs，而癌症患者血样中发现的CTCs细胞数目统计如 图14(A)所示，从图中可以看出，本发明提供的免疫磁性纳米粒子APMNs可以实现对CTCs细胞的高效捕获，不同肿瘤病人相同体积血液样本中CTCs细胞数目不相同是与病人本身情况相关。典型的CTCs细胞三色ICC染色图如图14(B)所示，肿瘤细胞呈圆形或 椭圆形，带有蓝色荧光信号及绿色荧光信号。

Claims (7)

1.一种用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制备荧光磁性纳米粒子MLNs
通过静电作用，在磁性纳米粒子Fe3O4上依次沉积第一高分子聚合物层、量子点层、第二高分子聚合物层和透明质酸层，得到荧光磁性纳米粒子MLNs；所述第一高分子聚合物与第二高分子聚合物相同或不同，第一高分子聚合物和第二高分子聚合物为聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺；所述量子点为CdSSe/ZnS量子点；
(2)制备免疫磁性纳米粒子APMNs
(21)将荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧基进行活化，再将活化羧基后的荧光磁性纳米粒子MLNs、胱胺二盐酸盐及pH为7.5～8.5、DMF体积浓度为10％～20％的PBS缓冲液混合，并在振荡条件下于室温反应12～36h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.3～7.4的PBS缓冲液进行洗涤得到含有二硫键的产物一；所述荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧基总含量与胱胺二盐酸盐的摩尔比为1:1；
(22)将产物一与pH为8.0～8.5、二硫苏糖醇浓度为50～100mM的PBS缓冲液混合，并在振荡条件下于室温反应30～60分钟，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.3～7.4的PBS缓冲液进行洗涤得到产物二；所述二硫苏糖醇的用量为至少使产物一的二硫键反应完全；
(23)将产物二、3-(2-吡啶二硫基)丙酸N-羟基琥珀酸亚胺酯及pH为8.0～8.5、丙酮体积浓度为10～20％的PBS缓冲液混合，并在振荡条件下于室温反应12～24h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.3～7.4的PBS缓冲液进行洗涤得到产物三；所述荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧基总含量与3-(2-吡啶二硫基)丙酸N-羟基琥珀酸亚胺酯的摩尔比为1:2；
(24)将产物三表面羧基进行活化，再将羧基活化后的产物三、氨基化聚乙二醇及pH为7.5～8.5的PBS缓冲液混合，并在振荡条件下于室温反应5～24h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.3～7.4的PBS缓冲液进行洗涤得到产物四；所述荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧基总含量与氨基化聚乙二醇摩尔比为2:1；
(25)将产物四、抗体及pH为7.3～7.4的PBS缓冲液混合，并在振荡条件下于4～7℃反应12～24h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用pH为7.3～7.4的PBS缓冲液进行洗涤，得到免疫磁性纳米粒子APMNs；所述抗体为anti-EpCAM抗体；所述抗体与产物四质量比等于或大于1:100。
2.根据权利要求1所述用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子制备方法，其特征在于所述步骤(1)包括以下分步骤：
(11)将Fe3O4磁性纳米粒子与含有第一高分子聚合物的NaCl水溶液混合，之后在振荡条件下反应15～60分钟，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液进行洗涤得到第一高分子聚合物层包覆Fe3O4的磁性纳米粒子，记为产物L1；
(12)将产物L1与含有CdSSe/ZnS的水溶液混合，之后在振荡条件下反应15～60分钟，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液洗涤得到量子点层包覆产物L1的磁性纳米粒子，记为产物L2；
(13)将产物L2与含有第二高分子聚合物的NaCl水溶液混合，之后在振荡条件下反应15～60分钟，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液洗涤得到第二高分子聚合物层包覆产物L2的磁性纳米粒子，记为产物L3；
(14)将产物L3与含有透明质酸的NaCl水溶液混合，之后在振荡条件下反应15～60分钟，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用NaCl水溶液洗涤得到透明质酸层包覆产物L3的磁性纳米粒子，记为荧光磁性纳米粒子MLNs；
所述Fe3O4磁性纳米粒子质量、第一高分子聚合物质量、第二高分子聚合物质量、CdSSe/ZnS质量、透明质酸质量之比为1:(4～12):(4～12):(0.1～0.3):(4～12)。
3.根据权利要求2所述用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子制备方法，其特征在于所述含有第一高分子聚合物的NaCl水溶液中第一高分子聚合物的浓度为0.5～1.5mg/mL；所述含有第二高分子聚合物的NaCl水溶液中第二高分子聚合物的浓度为0.5～1.5mg/mL；所述含有透明质酸的NaCl水溶液中透明质酸的浓度为0.5～1.5mg/mL；所述含有CdSSe/ZnS的水溶液中CdSSe/ZnS的浓度为0.05～0.15mg/mL。
4.根据权利要求2或3所述用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子制备方法，其特征在于所述含有第一高分子聚合物的NaCl水溶液、含有第二高分子聚合物的NaCl水溶液、含有透明质酸的NaCl水溶液以及洗涤用NaCl水溶液中NaCl的浓度为2.9～8.8mg/mL；所述含有第一高分子聚合物的NaCl水溶液、含有第二高分子聚合物的NaCl水溶液、含有透明质酸的NaCl水溶液以及洗涤用NaCl水溶液的pH为7.5～8.5。
5.根据权利要求1所述用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子制备方法，其特征在于步骤(21)中，将荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧基活化的实现方式为：将荧光磁性纳米粒子MLNs、EDC及HOBt/NHS加入到pH为6.5～6.8的PBS缓冲液中，在振荡条件下于室温活化羧基1.5～2.5h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，即得到活化羧基后的荧光磁性纳米粒子MLNs；所述荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧基总含量、EDC、HOBt/NHS的摩尔比为1:3:3。
6.根据权利要求1所述用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子制备方法，其特征在于步骤(24)中，将产物三表面羧基活化的实现方式为：将产物三、EDC及HOBt/NHS加入到pH为6.5～6.8的PBS缓冲液中，在振荡条件下于室温活化羧基1.5～2.5h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，即得到活化羧基后的产物三；所述产物三表面的羧基按荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧基总含量计量，所述荧光磁性纳米粒子MLNs表面羧基总含量、EDC、HOBt/NHS摩尔比为1:3:3。
7.权利要求1至6任一权利要求所述制备方法得到的用于循环肿瘤细胞可视化捕获及释放的免疫磁性纳米粒子。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112394167A (zh) * 2019-08-19 2021-02-23 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 用于捕获和鉴定CTCs的荧光纳米磁珠及其制法和应用
CN110747169B (zh) * 2019-10-28 2023-04-07 天津市康婷生物工程集团有限公司 一种捕获循环肿瘤细胞的方法
CN111454907A (zh) * 2020-04-14 2020-07-28 厦门大学 一种循环肿瘤细胞快速无损伤捕获、释放和检测试剂盒
WO2021261334A1 (ja) * 2020-06-23 2021-12-30 国立大学法人静岡大学 標的物質の検出又は定量のためのナノ粒子及びその製造方法、並びに標的物質の検出又は定量方法
CN112858680B (zh) * 2021-01-14 2022-10-04 四川大学 用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器及制备方法
CN112899231A (zh) * 2021-01-15 2021-06-04 中山大学 一种可视化肿瘤细胞检测试剂、试剂盒及其制备方法与应用
CN113720666A (zh) * 2021-09-01 2021-11-30 致慧医疗科技(上海)有限公司 人尿样分离癌细胞的分离方法
CN113777089A (zh) * 2021-10-12 2021-12-10 福建省致慧医疗科技有限公司 一种非抗体依赖的循环肿瘤细胞检测方法
CN116593693B (zh) * 2023-07-11 2023-09-19 四川大学华西医院 一种磁性适配体探针、其制备方法和应用及迁移体富集方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106771185A (zh) * 2016-12-05 2017-05-31 湖北省肿瘤医院 一种鼻咽癌循环肿瘤细胞检测试剂盒
CN107858144A (zh) * 2017-11-10 2018-03-30 四川大学 一种用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101933618B1 (ko) * 2011-11-29 2018-12-31 삼성전자주식회사 표적 물질 검출 및 분리 장치, 및 이를 이용한 표적 물질 검출 및 분리 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106771185A (zh) * 2016-12-05 2017-05-31 湖北省肿瘤医院 一种鼻咽癌循环肿瘤细胞检测试剂盒
CN107858144A (zh) * 2017-11-10 2018-03-30 四川大学 一种用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Layer-by-layer assembly of versatile nanoarchitectures with diverse dimensionality: a new perspective for rational construction of multilayer assemblies;Fang-Xing Xiao，et al;《Chem.Soc.Rev.,》;20160607;第45卷(第11期);第3019-3304页 *

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