CN112858680B - 用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器及制备方法，该传感器包括带有荧光的Fe@QD@Apt和DNA修饰的金纳米粒子，该带有荧光的Fe@QD@Apt和DNA修饰的金纳米粒子通过互补配对DNA与Apt组装在一起。本发明基于荧光能量共振转移技术，检测方法具有方便快捷、价格低廉、超低检测限的特点，为液体活检应用提供重要思路。

Description

用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器及制备方法
技术领域
本发明属于生化检测技术领域，尤其涉及一种用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器及制备方法。
背景技术
作为一种活细胞释放的细胞外囊泡，外泌体从其母细胞继承了大量生物物质，并积极参与细胞间，细胞间环境的通讯，并在生理和病理过程中发挥重要作用。由于其独特的起源，丰富的生物学信息以及分离后的良好稳定性，外泌体已成为具有广泛应用前景的生物标志物。外泌体上特异性或过表达的蛋白质描述与疾病的发生和发展密切相关。例如，黑色素瘤细胞衍生的外泌体表达高水平的PD-L1蛋白，从而干扰免疫细胞的活性以抑制免疫系统。这种影响与过度表达的上皮恶性肿瘤标志物EpCAM对上皮恶性肿瘤(典型的是结肠癌，食道癌，胃癌，肝细胞癌和肺癌)相似。在此基础上，系统地鉴定外泌体并解决外泌体上相应特征蛋白(例如EpCAM)的差异水平，可以解决当前对有效和准确预测癌症以及实时监测疗效和预防转移的挑战。
要分析外泌体，对其的高效分离应该是第一步。尽管有各种方法(例如蛋白质印迹，酶联免疫吸附测定，聚合酶链反应)，仪器(质谱，流式细胞仪，拉曼光谱)和其它生物学方法检测外泌体，其局限性是显而易见的。比如，需要大量样品，昂贵且专用的仪器，专业的操作人员，繁琐的操作步骤，昂贵的试剂的要求，无疑会阻碍其在及时、经济的体外诊断中的广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述现有技术中存在的不足，提供一种用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器及制备方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器的制备方法，包括以下步骤：
S1.向含5-15mg/mL的表面带羧基的超顺磁Fe3O4纳米粒子的PBS缓冲液中加入0.5-1.5mg PEI，振荡1-2h后磁分离，得到Fe@PEI；再加入含有0.2-1μL羧基量子点的硼酸盐缓冲液，得到Fe@QD；
S2.向50-70μM PAA溶液中加入100-150μM EDC和220-250μM NHS，活化1-2h后，加入5-15μM适配体，37℃振荡10-15h，得到PAA-Apt；
S3.向S1中所得Fe@QD加入PEI溶液再修饰一层PEI，磁分离后加入S2所得PAA-Apt，振荡30-50min后磁分离弃去上清液，于PBS缓冲液中重悬，得到Fe@QD@Apt；
S4.向含15-25μM巯基-DNA的醋酸盐缓冲液加入5-15mM TCEP，25℃孵育1-2h，再加入10-15nm的金纳米粒子，室温反应13-18h，逐滴加入醋酸盐缓冲液，然后加入1-2M NaCl溶液，得到Au-DNA；
S5.向S3所得Fe@QD@Apt悬浮液中加入PBS缓冲液，然后滴加S4所得Au-DNA，在37℃下孵育4-5h，用PBS缓冲液清洗，即得。
本发明的传感器基于荧光能量共振转移(FRET)技术，分为两个部分，第一部分是带有荧光的Fe@QD@Apt，其中，外围的Apt为可特异性识别某种特定抗原的适配体。第二部分是DNA修饰的金纳米粒子，这一段DNA可与第一部分的Apt部分互补配对，因此这两个部分可以通过互补配对组装在一起，与此同时第一部分的荧光发射峰处在金纳米粒子的吸收峰内，两者发生荧光能量共振转移(FRET)，因此组装体的荧光强度大幅降低，在检测到外泌体后，外泌体会特异性结合适配体Apt，从而撕裂与Au的结合，FRET被打断，从而荧光强度上升，实现荧光的“点亮”，从而来达到检测外泌体的目的。
进一步地，S2中EDC、NHS和适配体的体积比为8-12:4-6:3-5；优选为10:5:3.5。
进一步地，S3中通过加入0.5-1.5mg PEI振荡1-2h后磁分离来修饰PEI。
进一步地，S3中通过加入1mg PEI振荡1h后磁分离来修饰PEI。
进一步地，S4中巯基-DNA、TCEP、金纳米粒子、醋酸盐缓冲液和NaCl溶液的体积比为30-40:5-8:5500-6500:50-70:550-650；优选为36:6:6000:60:600。
进一步地，S5中Fe@QD@Ap悬浮液、PBS缓冲液和Au-DNA的体积比为1-3:10-20:1-3；优选为2:15:2。
上述的方法制备得到的用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器，包括带有荧光的Fe@QD@Apt和DNA修饰的金纳米粒子；带有荧光的Fe@QD@Apt和DNA修饰的金纳米粒子通过部分互补配对DNA与Apt组装在一起，带有荧光的Fe@QD@Apt的荧光发射峰处在DNA修饰的金纳米粒子的吸收峰内。
进一步地，Apt为可特异性识别抗原的适配体。
进一步地，适配体为CD63或EpCAM。
进一步地，CD63及与其配对的DNA的序列如下：
AptCD63：5'-CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA-3'；
SH-DNACD63：5'-GAGCGAGGTGGGGTGTTTTTTTTT-3'。
进一步地，EpCAM及与其配对的DNA的序列如下：
AptEpCAM：5'-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTGTTT-3'；
SH-DNAEpCAM：5'-GCAACCTCTGTAATATTTTTTTTT-3'。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明的传感器作为用于液体活检手段的工具，敏感、特异地分离和描述癌症外来体，对于肺癌的诊断，药物敏感性评估和预后监测具有重要意义。基于有效的免疫磁珠外来体分离技术和FRET机理，本发明开发了一种FRET磁适体传感器。高度特异性的外泌体分离以及专门设计的用于报告外泌体存在和癌变信息的点亮FRET策略强调了传感器的优势。通过判断荧光信号的增加，外来体检测变得更加直观和可读。而且它对表达特定表面蛋白(如CD63，EpCAM)的外泌体具有很高的选择性。此外，它还具有对外泌体的高灵敏度，超低检测限为每毫升13个颗粒。最重要的是，通过使用适当的适配体，该传感器系统显示出从健康样品中筛选出具有过度表达的抗原的肺癌外泌体的巨大潜力。本发明的传感器可以与各种适配体集成在一起，因此可以在广泛的生物医学研究和诊断领域中扩展其应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为检测结果图；其中，a、b图为用CD63作为aptamer的检测结果，c、d图为用EpCAM检测的结果；其中，a、c图中标记由上至下依次对应图中由上至下的图线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明较佳的实施例提供一种用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器的制备方法，具体步骤如下:
1、材料准备
(1)准备Fe@QD：根据水热法制备表面带羧基的超顺磁Fe3O4纳米粒子，最后分散在PBS缓冲液中(0.3M NaCl,1.54mM KH2PO4,1.34mM Na2HPO4,pH7.2)，10mg/mL；加入1mL PEI溶液(1mg/mL,溶解在上述PBS缓冲液中)，振荡1小时后磁分离，得到Fe@PEI；加入1mL分散液(含有0.5μL羧基量子点，8μM in borate buffer,pH9.0)，得到Fe@QD。
(2)准备Fe@QD@Apt：PAA溶解在咪唑-盐酸缓冲液中(0.1M,pH7.0)，60μM的PAA溶液中，加入EDC(1mL,120μM)和NHS(500μL,240μM)，活化1小时后，加入氨基的CD63适配体(350μL,10μM)，37℃振荡12h。然后将Fe@QD再修饰一层PEI(同步骤(1)中方法一样)，磁分离后加入PAA-AptCD63，振荡40min后磁分离去掉上清液，重悬于PBS缓冲液中，得到Fe@QD@AptCD63，浓度定为1mg/mL。
(3)制备金纳米粒子并修饰上DNA链段(Au-DNA)：柠檬酸还原法制备出13nm的金纳米粒子，然后修饰巯基-DNA：巯基-DNA(36μL,20μM)中加入醋酸盐缓冲液(4μL,500mM,pH5.2)和TCEP(6μL,10mM)，25℃孵育1h，加入6mL制备的金纳米粒子，室温反应16h，逐滴加入醋酸盐缓冲液(60μL,500mM,pH8.2)，然后加入NaCl溶液(600μL,1M)，得到Au-DNA。
2、组装体
制备Fe@Au：将Fe@QD@AptCD63悬浮液2mL置于20mL棕色玻璃瓶中，加入PBS缓冲液15mL，滴加2mL Au-DNA，轻摇。混合物在37℃下孵育4小时，然后用PBS缓冲液清洗，补充到2ml供进一步使用。最终组装的纳米粒子被命名为Fe@Au。
实施例2
本发明较佳的实施例提供一种用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器的制备方法，具体步骤如下:
1、材料准备
(1)准备Fe@QD：根据水热法制备表面带羧基的超顺磁Fe3O4纳米粒子，最后分散在PBS缓冲液中(0.3M NaCl,1.54mM KH2PO4,1.34mM Na2HPO4,pH7.2)，10mg/mL；加入1mL PEI溶液(1mg/mL,溶解在上述PBS缓冲液中)，振荡1小时后磁分离，得到Fe@PEI；加入1mL分散液(含有0.5μL羧基量子点，8μM in borate buffer,pH9.0)，得到Fe@QD。
(2)准备Fe@QD@Apt：PAA溶解在咪唑-盐酸缓冲液中(0.1M,pH7.0)，60μM的PAA溶液中，加入EDC(1mL,120μM)和NHS(500μL,240μM)，活化1小时后，加入氨基的EpCAM适配体(350μL,10μM)，37℃振荡12h。然后将Fe@QD再修饰一层PEI(同步骤(1)中方法一样)，磁分离后加入PAA-AptEpCAM，振荡40min后磁分离去掉上清液，重悬于PBS缓冲液中，得到Fe@QD@AptEpCAM，浓度定为1mg/mL。
(3)制备金纳米粒子并修饰上DNA链段(Au-DNA)：柠檬酸还原法制备出13nm的金纳米粒子，然后修饰巯基-DNA：巯基-DNA(36μL,20μM)中加入醋酸盐缓冲液(4μL,500mM,pH5.2)和TCEP(6μL,10mM)，25℃孵育1h，加入6mL制备的金纳米粒子，室温反应16h，逐滴加入醋酸盐缓冲液(60μL,500mM,pH8.2)，然后加入NaCl溶液(600μL,1M)，得到Au-DNA。
2、组装体
制备Fe@Au：将Fe@QD@AptEpCAM悬浮液2mL置于20mL棕色玻璃瓶中，加入PBS缓冲液15mL，滴加2mL Au-DNA，轻摇。混合物在37℃下孵育4小时，然后用PBS缓冲液清洗，补充到2ml供进一步使用。
实验例
将实施例1制得的Fe@Au分别与待检测物：(1)分散在PBS缓冲液的外泌体；(2)粗分离的病人血浆；孵育40-60分钟，测分散液的荧光强度变化，外泌体浓度越高或者病人血浆中含有该蛋白表达高的则荧光强度恢复更高。
检测模型外泌体样本
将Fe@Au(200μL，0.5mg/mL)移入无酶无菌管中，并通过磁力分离除去上清液，用PBS(0.15M NaCl，1.54mM KH2PO4、1.34mM Na2HPO4，pH7.2)洗涤两次，然后加入200μL浓度不同的外泌体(在PBS中为5×109-5×102particles/mL)，并在4℃下温和摇动孵育40-60分钟。完成后，除去上清液，将所得复合物用PBS洗涤3次，补充相同体积的PBS，并用激发光为310nm的HORIBA荧光分光光度计(FLuorolog-3，HORIBA Jobin Yvon Ltd，法国)进行测试。
检测人的血清样本
对于人血清样品，通过在4℃(2000g，20分钟)进行低速离心去除血细胞和血小板，然后用PBS稀释，直接与Fe@Au孵育60分钟，并通过荧光检测，检测方法同上。
检测结果如图1所示，由图可知，Fe@Au荧光强度很低，检测到外泌体后荧光强度升高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川大学
<120> 用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器及制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccccacct cgctcccgtg acactaatgc ta 32
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagcgaggtg gggtgttttt tttt 24
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cactacagag gttgcgtctg tcccacgttg tcatgggggg ttggcctgtt t 51
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcaacctctg taatattttt tttt 24

Claims (2)

1.一种用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.向含 5-15mg/mL 的表面带羧基的超顺磁 Fe3O4纳米粒子的 PBS 缓冲液中加入
0.5-1.5mg PEI，振荡 1-2h 后磁分离，得到Fe@PEI；再加入含有 0.2-1μL 羧基量子点的硼
酸盐缓冲液，得到Fe@QD；
S2.向 50-70μM PAA 溶液中加入 100-150μM EDC 和 220-250μM NHS，活化 1-2h 后，
加入 5-15μM 适配体，37℃振荡 10-15h，得到 PAA-Apt；
S3.向 S1 中所得Fe@QD加入 PEI再修饰一层 PEI，磁分离后加入 S2 所得 PAA-Apt，振荡 30-50min 后磁分离弃去上清液，于 PBS 缓冲液中重悬，得到Fe@QD@Apt；
S4.向含 15-25μM 巯基-DNA 的醋酸盐缓冲液加入 5-15mM TCEP，25℃孵育 1-2h，再加
入 10-15nm 的金纳米粒子，室温反应 13-18h，逐滴加入醋酸盐缓冲液，然后加入 1-2M NaCl溶液，得到 Au-DNA；
S5.向 S3 所得Fe@QD@Apt悬浮液中加入 PBS 缓冲液，然后滴加 S4 所得 Au-DNA，在37℃下孵育 4-5h，用 PBS 缓冲液清洗，即得；
所述 S2 中 EDC、NHS 和适配体的体积比为 8-12:4-6:3-5；
所述 S3 中通过加入 0.5-1.5mg PEI 振荡 1-2h 后磁分离来修饰 PEI；
所述 S4 中巯基-DNA、TCEP、金纳米粒子、逐滴加入的醋酸盐缓冲液和 NaCl 溶液的体积比为 30-40:5-8:5500-6500:50-70:550-650，且所述S4中的DNA与适配体部分互不配对；
所述S5中Fe@QD@Ap悬浮液、PBS缓冲液和Au-DNA的体积比为1-3:10-20:1-3；
所述适配体为氨基化的CD63适配体或氨基化的EpCAM适配体；所述氨基化的CD63 适配体及与其配对的 DNA 的序列如下：Apt CD63 ：5'-CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA-3'；氨基化的SH-DNA CD63 ：5'-GAGCGAGGTGGGGTGTTTTTTTTT-3'；所述氨基化的EpCAM适配体及与其配对的 DNA 的序列如下：
Apt EpCAM：5'-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTGTTT-3'；
SH-DNA EpCAM：5'-GCAACCTCTGTAATATTTTTTTTT-3'。
2.权利要求1所述的方法制备得到的用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器，其特征在于，包括带有荧光的Fe@QD@Apt和 DNA 修饰的金纳米粒子；所述带有荧光的Fe@QD@Apt和 DNA 修饰的金纳米粒子通过互补配对 DNA 与 Apt 组装在一起，带有荧光的Fe@QD@Apt的荧光发射峰处在 DNA 修饰的金纳米粒子的吸收峰内。
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