CN101848704A - 用于制备微粒的技术 - Google Patents

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迈克尔·马拉科夫
房芳
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Abstract

通过使溶于溶剂的大分子或小分子的溶液与抗溶剂和抗衡离子接触并使该溶液致冷而生产微球。微球可用于制备指定尺寸的药物、营养品、化妆品及类似物。

Description

用于制备微粒的技术
相关申请
本文要求2007年7月24日提交的、Fang等人的、标题为“TECHNOLOGY FOR THE PREPARATION OF MICROPARTICLES(用于制备微粒的技术)”的美国临时专利申请序列号60/961,872的优先权。该临时申请的主题在此通过引用并入。本申请和与其同日提交的美国申请号(代理人案号21865-005001/6505)相关。该美国申请的主题在此通过引用并入。
本申请还与国际PCT申请序列号(代理人案号21865-004WO1/6504PC，于2007年1月24日提交)以及2007年1月24日提交的美国申请序列号11/657,812(代理人案号21865-004001/6504)相关。本申请还与公布的美国申请序列号US 20050004020 A1和US20050112751 A1相关。这些申请的每一个均以其整体在此通过引用并入。
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背景
以粉末形式或颗粒形式的感兴趣的化合物的制备和递送在各种行业包括制药、营养品和化妆品行业中是集中的研发活动领域。不管化合物是诸如甾类激素或青霉素抗生素的小分子还是诸如蛋白或核酸的大分子，为了最佳效能，期望具有该化合物的均一的制剂。例如，对于肺部施用诸如治疗蛋白、抗生素或化学治疗剂的化合物，理想地，该化合物应当以离散的微球形式制备，所述微球是具有0.5微米和5.0微米之间的直径的固体或半固体颗粒。还期望微粒具有尽可能高的化合物含量，所述化合物处于维持其活性的形式以用于集中递送和治疗效能。
生产化合物的微粒或纳米颗粒的先前方法涉及复杂的步骤，例如与有机聚合物共混和/或与聚合物形成点阵列；使用特殊且复杂的设备的喷雾干燥技术、喷雾冷冻干燥技术或超临界流体抗溶剂技术；或冻干然后粉碎或磨碎，这通常导致不均匀的颗粒，必须进一步分选。通常，这样的方法包括使化合物钝化并损害其活性(例如蛋白质变性)的工艺步骤，例如加热。此外，某些方法不提供将从溶到固体微粒制剂的化合物的定量回收。诸如通过添加抗溶剂而使化合物从溶液中直接沉淀的其他方法，可以不可控的方式产生微粒，导致尺寸不均匀的和/或聚集的微粒。
因此，存在对无需复杂的或特殊的设备并且产生用于递送的统一尺寸的微粒的用于生产蛋白微粒和其他大分子微粒以及小分子微粒的方法的需求。还存在对生产化合物的以下微粒的方法的需求：相对于微粒的其他组分，所述微粒包含高浓度的所述化合物；当储存在环境温度时，所述微粒是稳定的并长时间维持其活性；并且所述微粒不包含显著量的非活性化合物。也存在对生产化合物的以下微粒的方法的需求，在所述方法中，基本上全部存在于起始物料(例如，化合物的溶液)中的化合物在微粒制剂中得以回收，而具有最小的损失。还存在对包含这些性质的微粒例如作为治疗补剂或营养补剂或在化妆产品中用于施用的需求。
概述
以下提供的制备微粒的方法、微粒自身、组合以及制造的物品(articlesof manufacture)通过各种组成成分、制备步骤和生物物理学参数、物理学参数、生物化学参数和化学参数来表征。正如对本领域技术人员明显的，本文提供的组合物和方法包括以下描述的成分、步骤和/或参数的任何及全部排列和组合。
本文提供了用于生产化合物微粒的方法，所述方法无需复杂的或特殊的设备并且生产均一尺寸的微粒用于递送。本文还提供了生产化合物微粒的方法，所述化合物微粒包含相对于微粒的其他组分较高含量的所述化合物；在储存在环境温度时是稳定的并长时间维持其活性；并且不包含显著量的非活性化合物。还提供了生产化合物微粒的方法，其中基本上全部存在于起始物料中的化合物在微粒制剂中被恢复，具有最小的损失。还提供了生产包含载体的微粒的方法，所述载体促进包含是感兴趣的活性剂或治疗剂的分子的微球的形成，或增进所得微球的稳定性，或促进所得微球向感兴趣的靶(细胞、组织，等)的运输。在某些实施方案中，所述载体可以是诸如明胶或葡聚糖的物质，所述物质能够形成水凝胶。此外，本文提供了包含这些性质的微粒用于例如作为治疗补剂或营养补剂、作为诊断产品或在化妆产品中而施用。
以下提供的制备包括大分子微粒和小分子微粒的化合物微粒的方法、组合物自身、组合以及制造的物品通过各种组成成分、制备步骤和生物物理学参数、物理学参数、生物化学参数和化学参数来表征。正如对本领域技术人员明显的，本文提供的组合物和方法包括以下描述的成分、步骤和/或参数的任何及全部排列和组合。
本文提供的方法可包括以下步骤：
a)将抗衡离子加入包含溶于溶剂的所述化合物的溶液中；
b)将抗溶剂加入所述溶液；和
c)将所述溶液逐渐冷却至低于约25℃的温度，由此形成包含化合物微粒的组合物。在所述方法中，步骤a)、b)和c)可同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。
在某些实例中，抗衡离子不是聚合物。在进一步的实例中，抗溶剂不是聚合物。还可改变步骤所进行的温度。在某些实施方案中，在步骤a)之前，化合物在约或等于30℃或以下的温度溶解于溶剂中。在其他实施方案中，化合物在约或等于25℃或以下的温度溶解于溶剂中。在一个方面中，步骤a)-c)的溶液都没有加热和/或都没有维持在约或等于30℃以上的温度。在某些实例中，在这些方法中的化合物不是蛋白或多肽。
在某些实施方案中，化合物可被加热至环境温度以上的温度以将化合物溶解在溶剂/抗溶剂系统中，然后被冷却至形成微球的温度。例如，对于某些大分子和小分子，化合物可在溶液中被加热至约或等于35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、125℃、150℃、175℃、200℃或更高的温度，然后被冷却至形成微球的例如约或等于190℃、170℃、150℃、125℃、100℃、80℃、75℃、60℃、50℃、40℃、30℃、20℃、15℃的温度或更低的温度。
可改变步骤所进行的顺序。例如，步骤a)和b)可同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行，然后进行步骤c)。在其他实例中，步骤b)和c)在步骤a)之后同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。在进一步的实例中，步骤a)和c)同时进行。在其他实施方案中，步骤a)、b)和c)以如下顺序顺次进行：a)、然后b)、然后c)。在某些实施方案中，抗衡离子和化合物是彼此相同的。在其他实施方案中，化合物和抗衡离子是彼此不同的。在其他实例中，抗衡离子和抗溶剂是彼此相同的。
化合物可以是小分子或大分子。在其中化合物是大分子的情况下，所述大分子可具有如下的分子量：约或等于1000或1000至约或等于50亿或50亿道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于10亿或10亿道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于5000万或5000万道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于2000万或2000万道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于1500万或1500万道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于1000万或1000万道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于500万或500万道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于100万或100万道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于500,000或500,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于300,000或300,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于200,000或200,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于100,000或100,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于50,000或50,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于25,000或25,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于15,000或15,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于10,000或10,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于5,000或5,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于3,000或3000道尔顿；或约或等于1000或1000至约或等于2,000或2000道尔顿。
所述大分子可以是多核苷酸、核酸、多肽、糖肽、蛋白、碳水化合物、脂质、脂肪酸、多糖、碳水化合物-蛋白或多糖-蛋白轭合物、病毒、病毒颗粒、类病毒、朊病毒或其混合物。在其他实例中，所述大分子是激素、前列腺素、抗生素、化学治疗剂、造血药、抗感染药、抗溃疡剂、抗过敏药、解热药、镇痛药、抗炎剂、抗痴呆剂(antidementia agent)、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗抑郁药、精神药物(psychotropic agents)、强心剂、利尿剂、抗心律不齐药、血管舒张药、抗高血压药、抗糖尿病药、抗凝血药或降胆固醇剂。
在一个实施方案中，所述大分子与小分子轭合。在某些实施方案中，所述小分子具有约或等于50至约或等于1000道尔顿的分子量。所述小分子可选自半抗原、激素、前列腺素、抗生素、化学治疗剂、造血药、抗感染药、抗溃疡剂、抗过敏药、解热药、镇痛药、抗炎剂、抗痴呆剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗抑郁药、精神药物、强心剂、利尿剂、抗心律不齐药、血管舒张药、抗高血压药、抗糖尿病药、抗凝血药和降胆固醇剂。例如，小分子可以是抗生素，并且可选自氨基糖苷类、安莎霉素类、碳头孢烯、碳青霉烯类、头孢菌素类、大环内酯类、青霉素类、喹诺酮类、磺胺类和四环素类。在其中所述抗生素是氨基糖苷的情况下，所述氨基糖苷可以是卡那霉素或妥布拉霉素。在其中所述小分子是抗病毒剂的情况下，所述抗病毒剂可用于治疗流行性感冒、副流行性感冒或呼吸道合胞病毒介导的感染。在某些实例中，所述抗病毒剂是扎那米韦或磷酸奥塞米韦。在其中所述小分子是化学治疗剂的实施方案中，所述化学治疗剂可选自烷化剂、蒽环类抗生素、细胞骨架干扰剂(cytoskeletal disruptor)、埃博霉素(epothilones)、拓扑异构酶II的抑制剂、核苷酸类似物、铂基试剂(platinum-based agent)、类视黄醇和长春花生物碱。在某些实例中，所述化学治疗剂是细胞骨架干扰剂，并且所述细胞骨架干扰剂是紫杉醇。在其他实例中，所述小分子是前列腺素。
在某些实施方案中，本文提出的方法中的大分子是核酸。所述核酸可选自DNA、RNA和PNA。在其中核酸是RNA的情况下，所述RNA可以是siRNA、snRNA、tRNA或核酶。在某些实例中，所述大分子是病毒，并且所述病毒是烟草花叶病毒。在其他实施方案中，所述大分子是糖肽，并且所述糖肽是万古霉素。在进一步的实施方案中，所述大分子是肽。例如，所述肽可以是亮丙立得(leuprolide)或生长抑素。
用于本文提供的方法中的溶剂可以是与抗溶剂混溶的或部分混溶的。本文提供的方法还可包括在步骤c)之后从溶液中分离微粒以除去不同于微粒的组分的进一步的过程。在一个方面中，该方法的组合物主要由包含化合物的微粒组成。在一个实施方案中，所述分离通过沉降或通过过滤实现。在另一实施方案中，所述分离通过冷冻干燥实现。
用于本文提供的方法的抗溶剂可选自水、缓冲溶液、脂族醇、芳族醇、氯仿、多元糖醇、芳烃、醛、酮、酯、醚、二噁烷类、烷、烯、共轭二烯、二氯甲烷、四氯化碳、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、乙腈、乙酸乙酯、多元醇、聚酰亚胺、聚亚胺、聚酯、聚醛及其混合物。例如，所述抗溶剂是脂族醇或芳族醇。在其中所述抗溶剂是脂族醇的情况下，所述脂族醇可以是异丙醇。
在实例中，用于本文提供的方法的抗衡离子选自阴离子化合物、阳离子化合物和两性离子化合物。在其中所述抗衡离子是阴离子化合物的实例中，所述阴离子化合物可以是柠檬酸钠、硫酸钠、硫酸锌、硫酸镁、硫酸钾或硫酸钙。在一个方面中，所述阴离子化合物是硫酸钠。在其他实例中，所述抗衡离子选自柠檬酸、衣康酸和新戊酸。在进一步的实例中，所述抗衡离子是氨基酸，例如，诸如甘氨酸或精氨酸。
在本文提供的制备微粒的方法的某些实施方案中，所述抗衡离子是聚合物，并且所述大分子选自多核苷酸、核酸、碳水化合物、脂质、脂肪酸、多糖、碳水化合物-蛋白或多糖-蛋白轭合物、病毒、病毒颗粒、类病毒、朊病毒及其混合物。在一方面中，所述聚合物是抗衡离子和抗溶剂。所述聚合物可以是，例如，聚乙二醇(PEG)或聚乙烯亚胺(PEI)。用于本文提供的方法的抗衡离子还可以是聚合物。在一个实例中，所述聚合物是抗衡离子和抗溶剂。所述聚合物可以是，例如，聚乙二醇(PEG)或聚乙烯亚胺(PEI)。
用于本文提供的方法的溶液的pH可以从约4.0或4.0至约9.0或9.0；从约4.0或4.0至约8.0或8.0；从约4.5或4.5至约7.5或7.5；或从约5.0或5.0至约7.0或7.0。
在本文提供的方法中形成的微粒可通过沉淀、通过相分离或通过胶体形成而获得。所得微粒组合物还可包含耐酸包衣剂、耐蛋白酶包衣剂、肠溶包衣剂(enteric coating agent)、填充剂(bulking agent)、赋形剂、非活性成分、稳定性增强剂、味道和/或气味改性剂或掩蔽剂、维生素、糖类、治疗剂、抗氧化剂、免疫调节剂、跨膜运输改性剂、抗结块剂、壳聚糖或流动性增强剂。在某些实例中，在微粒中的化合物的量相对于步骤a)的溶液中的化合物总量为约5％或5％至大于约99％或99％，w/w；为约5％或5％至约20％或20％，w/w；约10％或10％至约85％或85％，w/w；约20％或20％至约60％或60％，w/w；约25％或25％至约55％或55％，w/w；约30％或30％至约50％或50％，w/w；或约80％或80％至大于约99％或99％，w/w。
所述溶液逐渐冷却至的温度可以在约或等于4℃至约或等于-200℃；在约或等于2℃至约或等于-180℃；在约或等于2℃至约或等于-170℃；或在约0℃或0℃至约-2℃或-2℃至从约-150℃或-150℃至约-165℃或-165℃之间。
在某些方面中，所得组合物在约或等于55℃、50℃、45℃、44℃、42℃、40℃、39℃、38℃、37℃或以下的温度下具有从约或等于1周至约或等于1个月、从约或等于1个月至约或等于6个月、从约或等于6个月至约或等于1年、从约或等于1年至约或等于2年、或从约或等于2年至约或等于5年的贮藏寿命。
在某些实施方案中，所述溶液和/或所得组合物还包括活性剂。在其中所得组合物还包含活性剂的实施方案中，所述活性剂可选自抗生素、化学治疗剂、抗糖尿病药、抗惊厥药、镇痛药、抗帕金森病药、抗炎剂、钙拮抗剂、麻醉剂、抗微生物剂、抗疟药、抗寄生虫药、抗高血压药、抗组胺剂、解热药、α-肾上腺素能激动剂、α-阻断剂、杀生物剂、杀细菌剂、支气管扩张药(bronchial dilator)、β-肾上腺素能阻断药、避孕药、心血管药、钙通道抑制剂、镇静剂、诊断剂、利尿剂、电解质、酶、催眠药、激素、降血糖药、促血糖增高药、肌肉收缩药(muscle contractant)、肌肉松弛药、造形术(neoplastics)、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、眼药、心理兴奋剂、镇静药、类固醇、拟交感神经药、拟副交感神经药、安定药、泌尿道药、疫苗、阴道药、非类固醇类抗炎药、血管紧张素转换酶、多核苷酸、多肽、多糖、酶、激素、维生素、矿物质和营养补剂。
可调节在本文提供的方法中形成的微粒的含湿量，由此在约25℃的温度下储存约6个月至约1年后保持了至少约90％或90％的化合物活性。在其他实例中，调节微粒的含湿量由此在约25℃的温度下储存约6个月至约1年后至少约90％的微粒不聚集。在某些方面中，微粒的含湿量为从约或等于0.01％至约或等于20％；从约或等于0.05％至约或等于15％；从约或等于0.1％至约或等于10％；从约或等于0.2％至约或等于5％；从约或等于6％至约或等于12％；或从约或等于7％至约或等于10.5％。
在本文提供的方法的某些实施方案中，添加至溶液中的抗衡离子的浓度为从约或等于0mM或0mM至约或等于100mM或100mM；从约或等于0mM或0mM至约或等于50mM或50mM；从约或等于0mM或0mM至约或等于20mM或20mM；从约或等于0mM或0mM至约或等于10mM或10mM；约或等于1mM或1mM至约或等于5mM或5mM；或约或等于2mM。
在本文提供的方法中溶液的逐渐冷却可通过致冷(chilling)实现。在其他实施方案中，所述逐渐冷却是通过吸热反应。在某些方面中，所述逐渐冷却的速度为从约或等于0.01℃/min或0.01℃/min至约或等于20℃/min或20℃/min；从约或等于0.05℃/min或约或等于0.1℃/min至约或等于10℃/min或约或等于15℃/min；约或等于0.2℃/min至约或等于5℃/min；约或等于0.5℃/min至约或等于2℃/min；或约或等于1℃/min的速度。
在一个实施方案中，微粒的尺寸为从约或等于0.001μm或0.001μm至约或等于50μm或50μm；约或等于0.3μm或0.3μm至约或等于30μm或30μm；约或等于0.5μm或0.5μm至约或等于10μm或10μm；约或等于0.5μm或0.5μm至约或等于5.0μm或5.0μm；约或等于1.0μm或1.0μm至约或等于5.0μm或5.0μm；或从约或等于1.0μm至约或等于2.0、3.0、4.0或5.0μm。
本文还提供了包含化合物与抗衡离子的微粒的组合物，其中所述化合物和所述抗衡离子是彼此不同的。在某些实施方案中，所述化合物是具有如下分子量的大分子：约或等于1000或1000至约或等于50亿或50亿道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于10亿或10亿道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于5000万或5000万道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于2000万或2000万道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于1500万或1500万道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于1000万或1000万道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于500万或500万道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于100万或100万道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于500,000或500,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于300,000或300,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于200,000或200,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于100,000或100,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于50,000或50,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于25,000或25,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于15,000或15,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于10,000或10,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于5,000或5,000道尔顿；约或等于1000或1000至约或等于3,000或3000道尔顿；或约或等于1000或1000至约或等于2,000或2000道尔顿。
在某些实例中，在组合物中的化合物是小分子。所述小分子可具有约或等于50至约或等于1000道尔顿的分子量。在其中组合物中的化合物是大分子的实例中，所述大分子可选自多核苷酸、核酸、多肽、糖肽、蛋白、碳水化合物、脂质、脂肪酸、多糖、碳水化合物-蛋白或多糖-蛋白轭合物、病毒、病毒颗粒、类病毒、朊病毒及其混合物。在某些实施方案中，所述大分子选自激素、前列腺素、抗生素、化学治疗剂、造血药、抗感染药、抗溃疡剂、抗过敏药、解热药、镇痛药、抗炎剂、抗痴呆剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗抑郁药、精神药物、强心剂、利尿剂、抗心律不齐药、血管舒张药、抗高血压药、抗糖尿病药、抗凝血药和降胆固醇剂。
在某些实施方案中，在组合物中的大分子与小分子轭合。在这样的情况下，小分子选自半抗原、激素、前列腺素、抗生素、化学治疗剂、造血药、抗感染药、抗溃疡剂、抗过敏药、解热药、镇痛药、抗炎剂、抗痴呆剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗抑郁药、精神药物、强心剂、利尿剂、抗心律不齐药、血管舒张药、抗高血压药、抗糖尿病药、抗凝血药和降胆固醇剂。
在一个方面中，小化合物选自激素、前列腺素、抗生素、化学治疗剂、造血药、抗感染药、抗溃疡剂、抗过敏药、解热药、镇痛药、抗炎剂、抗痴呆剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗抑郁药、精神药物、强心剂、利尿剂、抗心律不齐药、血管舒张药、抗高血压药、抗糖尿病药、抗凝血药和降胆固醇剂。在其中小分子是抗生素的实施方案中，所述抗生素可选自氨基糖苷类、安莎霉素类、碳头孢烯、碳青霉烯类、头孢菌素类、大环内酯类、青霉素类、喹诺酮类、磺胺类和四环素类。例如，所述抗生素是青霉素或四环素。在其他实例中，所述抗生素是氨基糖苷，例如，诸如卡那霉素或妥布拉霉素。在其他方面中，所述化合物是抗病毒剂。在这样的情况下，所述抗病毒剂可用于治疗流行性感冒、副流行性感冒或呼吸道合胞病毒介导的感染。例如，所述抗病毒剂可以是扎那米韦或磷酸奥塞米韦。在进一步的实施方案中，所述化合物是化学治疗剂。所述化合物是化学治疗剂时，所述化学治疗剂可选自烷化剂、蒽环类抗生素、细胞骨架干扰剂、埃博霉素、拓扑异构酶II的抑制剂、核苷酸类似物、铂基试剂、类视黄醇和长春花生物碱。在某些实例中，所述化学治疗剂是细胞骨架干扰剂，例如，诸如紫杉醇。在又进一步的实例中，所述化合物是前列腺素。
在某些实施方案中，在本文提供的组合物中的大分子是核酸。所述核酸可选自，例如DNA、RNA和PNA。在其中核酸是RNA的情况下，所述RNA可选自siRNA、snRNA、tRNA和核酶。在某些实例中，所述RNA是siRNA。在其他实施方案中，在本文提供的组合物中的大分子是病毒。例如，所述大分子可以是烟草花叶病毒。在其他方面中，所述大分子是糖肽，例如，诸如万古霉素。在进一步的方面中，所述大分子是肽。所述肽可以是，例如，亮丙立得或生长抑素。
在本文提供的组合物中的化合物可以是不溶于水的。抗衡离子可选自阴离子化合物、阳离子化合物和两性离子化合物。在其中所述抗衡离子是阴离子化合物的情况下，所述阴离子化合物可以是柠檬酸钠、硫酸钠、硫酸锌、硫酸镁、硫酸钾或硫酸钙。在某些实例中，所述阴离子化合物是硫酸钠。在其他实例中，所述抗衡离子选自柠檬酸、衣康酸和新戊酸。在进一步的方面中，所述抗衡离子是氨基酸，例如，诸如甘氨酸或精氨酸。在其他方面中，所述抗衡离子是聚乙二醇(PEG)或聚乙烯亚胺(PEI)。
本文提供的所得微粒组合物还可包含耐酸包衣剂、耐蛋白酶包衣剂、肠溶包衣剂、填充剂、赋形剂、非活性成分、稳定性增强剂、味道和/或气味改性剂或掩蔽剂、维生素、糖类、治疗剂、抗氧化剂、免疫调节剂、跨膜运输改性剂、抗结块剂、壳聚糖或流动性增强剂。在某些方面中，所述组合物在约或等于55℃、50℃、45℃、44℃、42℃、40℃、39℃、38℃、37℃或以下的温度下具有从约或等于1周至约或等于1个月、从约或等于1个月至约或等于6个月、从约或等于6个月至约或等于1年、从约或等于1年至约或等于2年、或从约或等于2年至约或等于5年的贮藏寿命。
本文提供的组合物还可包含活性剂。所述活性剂可选自抗生素、化学治疗剂、抗糖尿病药、抗惊厥药、镇痛药、抗帕金森病药、抗炎剂、钙拮抗剂、麻醉剂、抗微生物剂、抗疟药、抗寄生虫药、抗高血压药、抗组胺剂、解热药、α-肾上腺素能激动剂、α-阻断剂、杀生物剂、杀细菌剂、支气管扩张药、β-肾上腺素能阻断药、避孕药、心血管药、钙通道抑制剂、镇静剂、诊断剂、利尿剂、电解质、酶、催眠药、激素、降血糖药、促血糖增高药、肌肉收缩药、肌肉松弛药、造形术、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、眼药、心理兴奋剂、镇静药、类固醇、拟交感神经药、拟副交感神经药、安定药、泌尿道药、疫苗、阴道药、非类固醇类抗炎药、血管紧张素转换酶、多核苷酸、多肽、多糖、酶、激素、维生素、矿物质和营养补剂。
在本文提供的组合物的微粒中的化合物的量可以是从约或等于0.1％至约或等于99％或更高，w/w；从约或等于0.2％至约或等于95％或更高，w/w；从约或等于0.5％至约或等于90％或更高，w/w；从约或等于1％至约或等于85％或更高，w/w；从约或等于2％至约或等于80％或更高，w/w；从约或等于5％至约或等于75％或更高，w/w；从约65％至约90％w/w；从约70％至约85％、86％、87％、88％、89％或90％w/w；或从约90％至约99％w/w。
在某些方面中，调节微粒的含湿量，由此在约25℃的温度下储存约或等于6个月至约或等于1年后保持了至少约90％或90％的化合物活性。在某些实施方案中，在微粒中的抗衡离子的量为从约0.01％或0.01％至约60％或60％w/w；从约0.5％或0.5％至约50％或50％w/w；从约1％或1％至约2％或2％w/w；从约0.01％或0.01％至约20％或20％w/w；从约0.05％或0.05％至约15％或15％w/w；从约0.1％或0.1％至约10％或10％w/w；或从约0.2％或0.2％至约5％或5％w/w。
在一个方面中，微粒的含湿量为从约6％或6％至约12％或12％。在另一方面中，微粒的含湿量为从约7％或7％至约10.5％或10.5％。
本文提供的组合物可用于食入施用、吸入施用、口服施用、静脉内施用、鼻内施用、肠胃外施用、肺部施用、皮下施用、眼施用或肌肉内施用。在一个方面中，本文提供的组合物的微粒的尺寸为从约0.001μm或0.001μm至约50μm或50μm；从约0.3μm或0.3μm至约30μm或30μm；从约0.5μm或0.5μm至约10μm或10μm；从约0.5μm或0.5μm至约5.0μm或5.0μm；从约1.0μm或1.0μm至约5.0μm或5.0μm；或从约1.0μm至约2.0、3.0、4.0或5.0μm。
本文还提供了制造的物品，所述制造的物品包含本文提供的组合物、用于所述组合物的包装材料和指明所述组合物是用于治疗适应症、营养适应症或化妆适应症的标签。在某些实例中，用于所述物品中的组合物是用于治疗适应症的，例如，诸如，癌症、流行性感冒、副流行性感冒或呼吸疾患。所述物品还可包含用于肺部施用所述组合物的吸入器。在某些实施方案中，所述吸入器是干粉吸入器、计量吸入器或静电递送设备。
本文提供了通过将治疗有效量的本文提供的组合物施用于受治疗者而预防或治疗传染病的方法。在某些方面中，所述传染病选自虫媒病毒感染、肉毒中毒、布氏菌病、念珠菌病、弯曲菌病、水痘、衣原体、霍乱、冠状病毒感染、葡萄球菌感染、柯萨奇病毒、克罗伊茨费尔特-雅各布病、隐孢子虫病、环孢子虫感染(cyclospora infection)、巨细胞病毒感染、爱波斯坦-巴尔病毒感染、登革热、白喉、耳朵感染、脑炎、流行性感冒病毒感染、副流行性感冒病毒感染、贾第虫病、淋病、流行性感冒嗜血杆菌感染、汉坦病毒感染、病毒性肝炎、单纯疱疹病毒感染、HIV/AIDS、螺杆菌感染、人乳头状瘤病毒(HPV)感染、传染性单核细胞增多症、军团杆菌病、麻风病、钩端螺旋体病、利斯特菌病、莱姆病(lyme disease)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎、疟疾、麻疹、马尔堡出血热(marburg hemorrhagic fever)、脑膜炎、猴痘、腮腺炎、分枝杆菌感染、支原体感染、诺瓦克病毒感染、百日咳、蛲虫感染、肺炎球菌疾病、肺炎链球菌感染(Streptococcuspneumonia infection)、肺炎支原体感染、粘膜炎莫拉菌感染、绿脓假单胞菌感染、轮状病毒感染、鹦鹉热、狂犬病、呼吸道合胞病毒感染(RSV)、癣、落矶山斑疹热(rocky mountain spotted fever)、风疹、沙门氏菌病、SARS、疥疮、性传播疾病、志贺菌病、带状疱疹、孢子丝菌病、链球菌感染、梅毒、破伤风、旋毛虫病、结核病、土拉菌病(tularemia)、伤寒、病毒性脑膜炎、细菌性脑膜炎、西尼罗河病毒感染、黄热病、腺病毒介导的感染和疾病、反转录病毒介导的传染病和耶尔森菌人畜共患病(yersiniosis zoonose)。例如，所述传染病可以是流行性感冒、副流行性感冒、呼吸道合胞病毒。
治疗的方法可通过口服施用、静脉内施用、鼻内施用、肠胃外施用、皮下施用、经皮施用、局部施用、关节内施用、肌肉内施用或吸入施用所述组合物而施用。
本文还提供了制备siRNA微粒的方法，所述方法包括以下步骤；
(a)将抗溶剂加入溶于含水溶剂中的siRNA的溶液；和
(b)将所述溶液逐渐冷却至低于约25℃的温度，由此形成包含siRNA微粒的组合物，并且步骤(a)和(b)同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。
所述方法还可包括步骤(c)，加入抗衡离子，其中步骤(a)、(b)和(c)同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。
在某些实例中，在制备siRNA微粒的方法中使用的抗溶剂是异丙醇。在某些实例中，所述溶剂是水。
本文还提供了包含siRNA微粒的组合物。在某些实例中，所述组合物还包含抗衡离子。
本文还提供了制备病毒微粒的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将抗溶剂加入溶于含水溶剂中的病毒的溶液；和
(b)将所述溶液逐渐冷却至低于约25℃的温度，由此形成包含病毒微粒的组合物，其中步骤(a)和(b)同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。
所述方法还可包括步骤(c)，加入抗衡离子，其中步骤(a)、(b)和(c)同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。在某些实例中，在制备病毒微粒的方法中使用的抗溶剂是异丙醇。
本文还提供了制备病毒微粒的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将抗衡离子加入溶于含水溶剂中的病毒的溶液；和
(b)将所述溶液逐渐冷却至低于约25℃的温度，由此形成包含病毒微粒的组合物，其中步骤(a)和(b)同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。
所述方法还可包括步骤(c)，加入抗溶剂，其中步骤(a)、(b)和(c)同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。在某些实施方案中，所述抗溶剂是异丙醇。在其他实施方案中，所述溶剂是水。
本文还提供了包含病毒微粒的组合物。这样的组合物还包含抗衡离子。在某些方面中，所述病毒是烟草花叶病毒。
详细描述
A.定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。贯穿本文全部公开内容所提及的所有专利、专利申请、公布的申请和公开、Genbank序列、网站和其他公布的材料，除非另外说明，以其整体通过引用并入。在本文的术语存在多种定义的情况下，在本部分中的定义有效。在提及URL或其他这样的标识符或地址时，应当理解这样的标识符可能改变并且在互联网上的特定信息可能易变，但可通过搜索互联网而找到等价信息。到其的参考证明了这样的信息的可用性和公共传播。
术语“分子”与“化合物”在本文中互换使用，并且是指包含通过共价键连接的两个或多个原子或离子的天然存在的或化学合成的实体(entity)。所述原子或离子可属于相同的化学元素，或者它们可属于不同的元素。如本文使用的分子或化合物包含以明确的、不变的重量比的组合元素，并且通过化学式表征。所述化合物可以是无机化合物，如本文使用的无机化合物是通常不包含碳-碳键的化合物；或者所述化合物可以是有机化合物，所述有机化合物通常通过碳和氢的存在来表征，并可另外包含诸如氮、氧、卤素和其他这样的原子的杂原子。在本文别处讨论的无机化合物的实例包括碱金属和碱土金属的化合物及其盐和其他衍生物；过渡金属化合物，包括配位化合物及其盐和其他衍生物；无机聚合物，例如聚硅氧烷；以及本领域技术人员已知的其他这样的化合物。在本文别处讨论的有机化合物的实例包括脂族、芳族和脂环族的醇、醛、羧酸、酯、酮、醚、胺、酰胺、内酰胺、其聚合物以及本领域技术人员已知的其他这样的化合物。
如本文使用的术语化合物还指无机化合物和/或有机化合物的组装体(assemblies)，包括大分子组装体，例如噬体(phages)和病毒。
如本文使用的化合物，不管是无机化合物还是有机化合物，可以是大分子或小分子。在本文中使用的术语“大分子”含义是本领域技术人员所理解的含义，并通常指天然存在的或化学合成的有机分子或无机分子，所述有机分子或无机分子大于或等于约1000道尔顿至约或大于1万亿、2万亿、3万亿、5万亿、7万亿、10万亿或更多万亿道尔顿。如本文使用的“大分子”包括含有两个或多个单体子单元或其衍生物的分子，所述单体或其亚基衍生物通过共价键，离子键，或其他化学相互作用例如氢键、离子配对、碱基配对或通过电荷极化形成的电荷之间的配对连接。所述单体子单元可彼此不同或彼此相同，并且在一些实施方案中可形成聚合物。所述聚合物可以是无机聚合物，例如聚硅氧烷、聚硅烷、聚锗烷(polygermane)、聚锡烷(polystannane)或聚磷腈；有机聚合物，聚乙烯(polyethylene或polythene)、聚丙烯、尼龙、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯或聚异丁烯；或生物聚合物，例如多糖、多核苷酸和多肽。大分子还可指这样的分子：不管其具有多于一个的子单元和/或是聚合物，可以形成三级结构和/或四级结构。大分子的实例包括多核苷酸、包括DNA、RNA(包括siRNA、snRNA、tRNA、反义RNA和核酶)的核酸分子、肽核酸(PNA)、诸如亮丙立得和生长抑素的多肽、诸如万古霉素的糖肽、蛋白、碳水化合物或脂质或其衍生物或组合，例如分别包含肽核酸部分或糖蛋白的核酸分子。大分子的实例还包括大分子组装体，例如，病毒、病毒颗粒、噬体、类病毒、朊病毒及其组合和轭合物。
如本文使用的术语“大分子”还意图包括在上述范围内并具有功能的所有分子，包括具有生物学功能的大分子，例如核酸、肽、蛋白、激素、细胞因子、趋化因子等；具有治疗功能的大分子，例如药物；具有营养功能的大分子，例如营养补剂；和具有化妆制剂的大分子，例如皂或面霜。例如，化合物可以是大分子并且还可属于选自以下的一种或多种化合物类型：激素、前列腺素、抗生素、化学治疗剂、造血药、抗感染药、抗溃疡剂、抗过敏药、解热药、镇痛药、抗炎剂、抗痴呆剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗抑郁药、精神药物、强心剂、利尿剂、抗心律不齐药、血管舒张药、抗高血压药、抗糖尿病药、抗凝血药、降胆固醇剂和营养补剂。参照诸如蛋白、肽、核酸和病毒的某些大分子所描述的本文提供的方法、组合物、组合、试剂盒和制造的物品可被修改以用于如本文定义和/或提供的其他大分子。
如本文使用的术语“聚合物”包括多种天然化合物和合成化合物的任一种，所述天然化合物和合成化合物包括连接在一起的分子的两个或多个重复单元，通常约或等于5、10、15、20、数百、数千、高达数百万个或5、10、15、20、数百、数千、高达数百万个重复单元。每个重复单元通常是由本领域技术人员所理解的单体。聚合物可具有相同的重复单元或具有多于一种的重复单元。示例性的重复单体单元包括，例如，核苷酸或核苷酸衍生物，例如在脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和混合的DNA或RNA衍生物或肽核酸(PNA)中发现的那些核苷酸或核苷酸衍生物。其他单体单元可包括，例如在合成的有机聚合物中发现的那些单体单元，所述单体单元包括但不限于，丙烯酰胺、苯乙烯、烃基取代的苯乙烯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、氯乙烯、乙酸乙烯酯、丁二烯、异戊二烯、乙二醇和乙亚胺。示例性的有机聚合物或无机聚合物、天然聚合物和合成聚合物，包括但不限于，琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、其他纤维素衍生物、葡聚糖、葡聚糖衍生物和葡聚糖共聚物、其他多糖、玻璃、硅胶、明胶、聚乙二醇、聚乙烯亚胺、聚乙烯酰亚胺(polyethyleneimide)、聚乙烯吡咯酮、人造纤维、尼龙、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚碳酸酯、聚酯、聚酰胺、乙烯基聚合物、聚乙烯醇、聚苯乙烯和聚苯乙烯共聚物、与二乙烯基苯或类似物交联的聚苯乙烯、丙烯酸树脂、丙烯酸酯和丙烯酸、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺共混物(blends)、乙烯和丙烯酰胺的共聚物、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯衍生物及类似聚合物。
本文使用的术语“小分子”的含义是本领域技术人员所理解的含义，并且通常指天然存在的或化学合成的有机分子或无机分子，所述有机分子或无机分子小于约1000道尔顿，从约或等于1000道尔顿至约或等于950道尔顿、900道尔顿、850道尔顿、800道尔顿、750道尔顿、700道尔顿、650道尔顿、600道尔顿、550道尔顿、500道尔顿、450道尔顿、400道尔顿、375道尔顿、350道尔顿、325道尔顿、300道尔顿、275道尔顿、250道尔顿、225道尔顿、200道尔顿、175道尔顿、150道尔顿、125道尔顿、100道尔顿、75道尔顿、70道尔顿、65道尔顿、60道尔顿、55道尔顿、50道尔顿、45道尔顿、40道尔顿、35道尔顿、30道尔顿、25道尔顿、20道尔顿、15道尔顿、10道尔顿、5道尔顿或更少道尔顿。如本领域技术人员所理解的并在本文中使用的小分子是演化为区分诸如青霉素抗生素的传统药物与诸如蛋白、核酸及类似物的基于遗传工程和生物技术的发展的新型药物的术语。小分子被理解为指不是诸如蛋白或核酸的大分子的任何分子。如本文使用的“小分子”可包括包含两个或多个诸如二肽或二核苷酸的单体子单元的分子，并且通常被理解为指约或等于1000道尔顿或更低分子量的分子。
小分子的实例包括但不限于，无机分子，例如但不限于，一氧化碳、二氧化碳、金属(例如，碱金属、碱土金属、过渡金属)碳酸盐、氰化物、氰酸盐、碳化物、卤化物、硫氰酸盐、氧化物、氢氧化物、硫化物和氢化物(hydrozide)、配位化合物例如钴盐[Co(NH3)6]Cl3和有机金属化合物例如Fe(C5H5)2。是有机化合物的小分子包括，例如，核苷酸、氨基酸、蝶啶如呋氨蝶啶和氨苯蝶啶；嘌呤如乙酸茶碱、7-吗啉甲茶碱、帕马溴、丙可可碱和可可碱；甾醇如胆固醇和羊毛固醇，类固醇如雌激素、睾酮、坎利酮(canrenone)、夹竹桃苷和螺甾内酯(spironolactone)；青霉素，四环素，磺胺衍生物如乙酰唑胺、安布赛特、阿佐塞米(Azosemide)、布美他尼、布他唑胺、二苯基甲烷-4，4’-二磺酰胺、二磺法胺、呋塞米，尿嘧啶如氨美啶和阿米美啶以及类似尿嘧啶，和前列腺素。
如本文使用的术语“小分子”还意图包括在上述范围内并具有功能的所有分子，包括具有生物学功能的小分子，例如激素；具有治疗功能的小分子，例如药物；具有营养功能的小分子，例如营养补剂；和具有化妆制剂的小分子，例如皂或面霜。例如，化合物可以是小分子并且还属于选自以下的一种或多种化合物类型：激素、前列腺素、抗生素、化学治疗剂、造血药、抗感染药、抗溃疡剂、抗过敏药、解热药、镇痛药、抗炎剂、抗痴呆剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗抑郁药、精神药物、强心剂、利尿剂、抗心律不齐药、血管舒张药、抗高血压药、抗糖尿病药、抗凝血药、降胆固醇剂和营养补剂。以诸如氨基糖苷类、青霉素、氨苄西林和前列腺素的某些小分子类型为例说明的本文提供的方法、组合物、组合、试剂盒和制造的物品可被修改以用于如本文定义和/或提供的其他小分子。
本文使用的术语“轭合”(conjugate)是指化学键或化学相互作用。轭合可以是在两个或多个原子、离子或化合物之间的共价的或离子的化学键，或者可通过诸如以下的其他化学相互作用形成：氢键键合、离子配对、碱基配对或通过电荷极化形成的电荷之间的配对。示例性的轭合手段包括抗生物素蛋白链菌素或抗生物素蛋白与生物素的相互作用；疏水相互作用；磁相互作用(例如，使用功能化的磁珠)，极化相互作用，例如在两个极性表面之间或在寡/聚乙二醇之间的润湿缔合(wetting association)；共价键的形成，例如酰胺键、二硫键、硫醚键、或通过交联剂、或通过酸敏感的或可光解的连接体(linker)。
如本文使用的术语“基本上“或“基本”通常是指相对于参考诸如例如核酸或蛋白序列或实体的初始组成至少约60％或60％、约70％或70％、或约或等于75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。因此，包含与来自混合溶液(cocktail solution)的“基本上”所有其他污染物和/或成分包括抗衡离子、盐和溶剂分离的微粒的组合物是指至少约60％或60％、约70％或70％、或约或等于75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的量的污染物和/或试剂已被从其中形成所述微粒的混合溶液中除去。术语“基本上相同的”或“基本上同源的”或类似术语随相关领域技术人员所理解的情景而变化，并且通常是指至少约60％或60％、约70％或70％、或约或等于75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。
如本文使用的术语“主要由……组成”(consists essentially of)或“主要组成为”(consisting essentially of)是指与实体或其性质无关的基本上所有其他组分/成分已被从所述实体中除去或分离的实体。因此，“主要组成为”微粒的组合物是指诸如污染物和溶剂的所有其他成分已经基本上从包含所述微粒的溶液/悬浮液中被除去。
如本文使用的术语“微粒”与“微球”可互换使用并且是指包含感兴趣的化合物的、约或等于0.001微米(μm)至约或等于500微米的尺寸范围(平均长度、宽度或直径)的颗粒。感兴趣的化合物可以是大分子或小分子、有机化合物或无机化合物。感兴趣的化合物可以是活性剂，或者微粒可另外包含活性剂。形成微粒的感兴趣的化合物，例如，包括蛋白、核酸、脂质或多糖的大分子或包括固醇激素或类固醇激素的小分子，可以是活性剂的载体，所述活性剂例如药物或营养补剂。微粒还可包含合成的大分子包括聚合物，例如聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)；以及天然聚合物，例如白蛋白、明胶、壳聚糖和葡聚糖。如本文所述的“微粒”可包含以下化合物或由以下化合物制成：单独的、特定的天然化合物或合成化合物，或多于一种相同的天然化合物或合成化合物(例如，多于一种蛋白)，或多于一种不同类型的天然化合物或合成化合物(例如，抗生素和亮丙立得肽)的组合。
如本文使用的术语“微粒”通常还指不是其所产生自的全部溶液的固体形式的颗粒，尽管本文还考虑包含大分子的溶液的冷冻的和/或干燥的颗粒。更确切地，如本文使用的微粒通常是溶液的一部分组分包括盐、抗衡离子、溶剂和其他成分的组装体，所述组装体通过包括但不限于沉淀、沉降、相分离和胶体形成的方法形成。
如本文使用的术语“沉淀”是指这样的方法，其中在溶液中的感兴趣的溶质或多种溶质诸如微粒组分，不再停留在溶液中并形成与用于形成所述溶液的溶剂或多种溶剂不同的相。微粒的沉淀和控制沉淀的微粒尺寸可通过多种方式实现，所述方式包括但不限于，调节温度、离子强度、pH、介电常数、抗衡离子浓度、有机溶剂浓度、添加聚电解质或聚合物、表面活性剂、洗涤剂或其组合。
如本文使用的术语“相分离”是指诸如溶液的单一的均相转化为诸如固体颗粒在溶剂或溶液中的悬浮液的两相或更多相。
如本文使用的术语“沉降”是指在液体的悬浮液中的或者在溶液中形成的颗粒诸如微粒响应诸如重力、离心力或电力的外力的运动。
术语“溶液”在本文中与“混合溶液”可互换使用并且指两种或多种成分在单相固相、液相或气相中的均一的混合物，其中不同的成分仅在分子水平上是可辨别的。溶液可以是这样的液体，其中诸如盐的一种或多种溶质溶解于诸如水或醇的溶剂中或溶解于诸如水和乙醇的混合物的可混溶溶剂的混合物中。溶液还可以是液体溶液的冷冻形式。
如本文使用的术语“可混溶的”是指诸如液体、固体和气体的一种或多种组分混合在一起而形成单一的均相的能力。因此，如果两种液体可以混合而形成单一的、均一的液体，该液体的不同组分仅在分子水平上可辨别，则所述两种液体是可混溶的。当组分是“部分可混溶的”时，其含义是它们可在一定浓度范围内但不在其他浓度范围混合而形成单一的均相。如本文使用的，当溶剂是与另一溶剂“部分可混溶的”时，其含义是所述溶剂在与另一溶剂混合时在约或等于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％的体积/体积(v/v)或更低的体积/体积的浓度下是可混溶的。
如本文使用的“不可混溶的”是指，当诸如液体、固体或气体的两种或多种组分被混合时，它们形成多于一相。例如，当有机溶剂与含水溶剂(例如，己烷和水)不可混溶时，可看到作为不与含水溶剂层混合的不同的层的有机溶剂。
如本文使用的术语“多肽”是指通过肽键连接的至少两个氨基酸或氨基酸衍生物，包括大量修饰的氨基酸和氨基酸类似物，所述肽键可以是修饰的肽键。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中基本上同义地使用，尽管技术人员将认为肽通常包含少于约50个至约100个氨基酸残基，并且蛋白经常从天然源获得并可包含，例如，翻译后修饰。
多肽或蛋白可从多核苷酸翻译，所述多核苷酸可包括至少编码序列的部分或由于以下原因而未天然翻译的核苷酸序列的部分，所述原因例如，它位于不是编码框的读框或它是内含子序列、3’或5’非翻译序列、诸如启动子的调节序列或类似序列。多肽还可以是化学合成的并可在翻译后或化学合成后通过化学法或酶法而被修饰。多肽可通过磷酸化(磷蛋白)、糖基化(糖蛋白、蛋白多糖)及类似过程而被翻译后修饰，所述翻译后修饰可在细胞中或在体外反应中进行。
如本文使用的术语“融合蛋白”是指这样的蛋白，所述蛋白是从多于一种的蛋白或多肽获得的结构域的轭合物。结构域可以是多肽标签，例如His6标签。所述轭合物可通过凭借化学轭合作用、重组DNA技术或重组表达与化学轭合作用的组合连接所述结构域来制备。
多种化学连接体是本领域技术人员已知的并且包括，但不限于，氨基酸和肽键，通常包括在1个和约60个氨基酸之间、更通常在约10个和30个氨基酸之间的、异双功能的、可裂解的交联剂，所述交联剂包括但不限于，N-(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸琥珀酰亚胺酯、(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯、4-琥珀酰亚胺基-氧羰基-a-(2-吡啶基二硫代)甲苯、磺基琥珀酰亚胺基-6-[a-甲基-a-(吡啶基二硫代)-甲苯酰胺基]己酸酯、N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫代)-丙酸酯、6[3(-(-2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯、6[3(-(-2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸磺基琥珀酰亚胺酯、3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰基酰肼、埃尔曼试剂(Ellman′s reagent)、二氯三嗪酸(dichlorotriazinic acid)和S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸。
如本文使用的术语“唾液酸酶融合蛋白”是指其中一个或多个结构域是唾液酸酶或其部分的融合蛋白，所述部分保持至少约60％或60％、约70％或70％、或约或等于75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的唾液酸酶的催化活性。如本文使用的唾液酸酶融合蛋白还可指包含与唾液酸酶基本上同源的蛋白或多肽并具有唾液酸酶的酶活性的融合蛋白。
如本文使用的术语蛋白的“催化域”是指这样的蛋白或多肽，其中与唾液酸酶基本上同源的序列的仅有的部分是包含对蛋白的催化活性起作用的结构域(例如，SEQ ID NO：1中的残基274-666被鉴定为粘性放线菌(Actinomyces viscosus)唾液酸酶的催化域)或其催化活性片段的氨基酸残基序列。所述催化域或其催化活性片段保持至少约60％或60％、约70％或70％、或约或等于75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的所述蛋白的催化活性。
如本文使用的术语“核酸”是指单链和/或双链的多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)以及RNA或DNA的类似物或衍生物。术语“核酸”中还包括核酸的类似物，诸如肽核酸(PNA)、硫代磷酸DNA、siRNA、snRNA、tRNA、核酶和其他这样的类似物和衍生物或其组合。核酸可指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。该术语还包括从核苷酸类似物制成的作为RNA或DNA的等价物、衍生物、变体和类似物的单(正义或反义的)链和双链多核苷酸。脱氧核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。对于RNA，尿嘧啶碱基是尿苷。
如本文使用的术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指含有至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚物或聚合物，包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和DNA或RNA衍生物，所述DNA或RNA衍生物包含，例如，核苷酸类似物或不同于磷酸二酯键的“主链”键，例如磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸键、硫酯键或肽键(肽核酸)。术语“寡核苷酸”在本文中还与“多核苷酸”基本上同义地使用，尽管本领域的人员将认为，诸如PCR引物的寡核苷酸通常为小于约50个至100个核苷酸的长度。
如本文使用的术语“流动特性”是指给予“流动”能力的性质，其中“流动”是能够允许物质被倒出并呈现物质被倒入的容器的形状，而不受到由于例如聚集的障碍的性质。流体通常具有“流动”的性质，这通常使它们可变形，即，它们可改变它们的形状。如本文使用的术语“流体”涵盖了包含胶体的液体包括乳液、气溶胶和气体。悬浮诸如微粒的固体颗粒的液体、气溶胶和气体也被视为如本文定义的“流体”。
如本文所使用的乳液被定义为两种不可混溶的液体即第一液体和第二液体的溶胶，其中所述第一液体分散于所述第二液体。
如本文使用的表面活性剂(surfactant)(或“表面活性剂”(surface-activeagent))是化学的或天然存在的实体，所述实体在溶解于含水溶液时降低溶液的表面张力或降低溶液中两个或多个相之间的界面张力。表面活性剂分子通常是两亲的并包含亲水头基和疏水尾。表面活性剂分子可作为稳定剂和/或改善本文提供的微粒的流动特性。
如本文使用的组合是指用于某个目的的两个或多个项目之间的任何结合。例如，微粒和吸入器的组合可用于治疗剂的肺部递送。
如本文使用的组合物是指任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、含水的、非水的或其任何组合。
如本文使用的试剂盒是指某种组合，其中组分任选地与使用说明书和/或用于所述组合的试剂和设备一起包装。
如本文使用的术语“酶”是指催化化学反应或生物学过程的蛋白。酶通常促进和/或加速这样的反应和过程。此外，酶通常对特定的反应或过程是特异性的，将一组特定的反应物转化为特定的产物。
如本文使用的术语“胶体”是指诸如微粒的固体颗粒在液体中的分散体，所述液体诸如在其中形成微粒的溶液。术语“胶体稳定性”是指其中颗粒基本上不聚集的胶体。例如，稳定的胶体是其中约30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或更少的固体颗粒例如微粒形成聚集体。
术语“附聚物”是指通过范德华力或表面张力或静电或其组合被松散地保持在一起的一种或多种颗粒例如微球的结合体(association)。在某些情况下，通过静电力保持的结合体可被定义为“絮凝物”。为了本文的目的，“附聚物”也包含“絮凝物”。附聚物通常可被空气或液体中的剪切力容易地分开。术语“分散”或“分散性”是指颗粒“流动”的能力，即，运动不受诸如聚集体的存在而阻碍的程度。
术语“聚集体”或“团块”是指一种或多种颗粒的结合体，所述颗粒例如微球、无定形沉淀、晶状或玻璃状颗粒或其组合。聚集体通常不易于分开，这抑制其分散或形成均一的悬浮液或形成具有所期望的性质的气溶胶的能力。
如本文使用的术语“非变性的”是指蛋白而言的，并且含义是蛋白的构象，即它的二级结构、三级结构、四级机构或其组合，所述构象基本上相对于其天然存在状态的蛋白是未改变的。术语“非变性的”和“自然的”在本文中可互换使用并且是指保持全部或至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的其长度和/或天然构象的蛋白。如在本文中可互换使用的术语“非变性的”或“自然的”包括在细胞中的蛋白的天然状态，例如其长度和包括二级结构、三级结构和四级结构的构象。如本文所定义，“非变性的”或“自然的”蛋白包括在本文提供的组合物中的那些蛋白通常保持全部或至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的天然状态蛋白的正常活性或功能，例如提供氨基酸结构单元的营养素、抗氧化剂、酶、抗体、基因表达的调节剂、支架等。
如本文使用的术语“活性”或“功能”是与“生物活性”可互换的并且指诸如蛋白、维生素、矿物质或药物的化合物的体内活性或由体内施用化合物、组合物或其他混合物产生的生理反应。因此，活性涵盖化合物、组合物和混合物的疗效和药物活性。生物学活性还可在设计为测试或使用这样的活性的体外系统中观察到。
如本文使用的“功能活性”也是与“活性”、“生物活性”或“功能”可互换的，并且指显示与其天然状态相关或与其所属的化合物类型相关的一种或多种活性的化合物。例如，是抗生素的氨基糖苷显示该类型的若干化合物的功能活性。类似地，显示与天然或非变性的蛋白相关的一种或多种活性的多肽或其部分是功能活性的。功能活性包括，但不限于，治疗效能、生物体内活性、催化活性或酶活性、抗原性(结合或与多肽竞争结合至抗多肽抗体的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力和特异性结合至多肽受体或配体的能力。
如本文使用的术语“变性的”是指改变蛋白的天然或非变性的构象即蛋白的二级结构、三级结构或四级结构或其组合的蛋白。改变的构象通常通过包括以下的处理步骤而发生：巴氏杀菌、辐射、加热、化学制品、酶作用、暴露于酸或碱和离子交换及其任何组合。蛋白变性通常导致削弱全部或某些，通常大于50％并且至少约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的最初的性质，所述最初的性质包括其天然或非变性的状态的蛋白的活性和功能。
如本文使用的术语“营养补剂”是指将营养素提供给宿主的物质或组合物，所述营养素包括维生素、矿物质、脂肪酸、氨基酸、碳水化合物、酶、蛋白、生化药剂及其代谢产物、草药和植物，所述宿主例如包括人类的动物。通过营养补剂供给宿主的营养素可包括在宿主饮食中缺失或缺乏的、对于生存、良好健康、治愈疾病或预防疾病所必需的营养素，以及被认为增加良好健康、预防疾病或治愈疾病但不被视为生存或良好健康所必需的营养素。
如本文使用的“疏水的”是指不带电或未电荷极化、或者未充分带电或未充分电荷极化以与水或其他极性溶剂键合的物质，正如本领域技术人员所理解的。疏水配体可在水或极性溶剂存在下通过疏水作用彼此结合或与其他非极性分子或溶剂结合。疏水配体通常还在非极性溶剂中比在极性溶剂中更可溶。非极性溶剂的实例包括诸如己烷的烷烃，诸如乙醚的烃基醚，诸如苯的芳烃，和诸如二氯甲烷和四氯化碳的烃基卤化物，甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯，诸如油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸的脂肪酸，其轭合形式及它们的酯。
术语“不溶于水的”化合物与“疏水的”化合物在本文可互换使用并且指在非水溶剂中比在含水溶剂中具有更大溶解度的化合物。例如，“不溶于水的”化合物是这样的化合物，其在包含约或等于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％按体积计的水或诸如缓冲液的水溶液的溶液中是完全或部分——约或等于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％不溶的。
如本文使用的“亲水的”或“极性的”配体是具有电荷或电荷极化的配体。如本文使用的亲水的配体具有带电的官能团，例如羧酸盐或铵，或具有电荷极化的键，例如将电荷提供给配体的羟基或巯基。亲水的配体可与水和包括以下的其他极性溶剂通过氢键或离子相互作用键合：醇、胺、酰胺、酸、羧酸、酯、腈、酮、二醇和二醇醚。亲水的配体还在极性溶剂中比在非极性溶剂中具有更大的溶解度。
如本文使用的术语“治疗剂”是指在施用于包括人类的宿主时有效改善或消除遗传的或获得性疾病的症状或表现的药剂或治愈所述疾病的药剂。示例性的治疗剂包括，例如，用于癌症治疗的化合物如化学治疗剂、针对细菌感染的化合物如抗生素、抗病毒化合物及类似化合物，正如本领域技术人员所理解的。
如本文使用的术语“载体”或“微载体”是指促进包含是感兴趣的活性剂或治疗剂的分子的微球的形成的分子，或提高所得微球的稳定性的分子，或促进所得微球至感兴趣的靶(细胞、组织等)的运输的分子。在某些实施方案中，载体可用于给予微球稳定性。在其中包含在微球中的感兴趣的治疗剂或活性剂具有高效能并以相对低的浓度(通常，约或等于0.001％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05、0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％、或在约或等于0.001％至约或等于50％的范围内)并入的实施方案中，载体可使微球制剂稳定，否则所述微球制剂可能易于降解。高效能化合物的实例可包括细胞毒性抗癌剂或核酸如siRNA。示例性的载体包括氨基酸、羧酸(例如柠檬酸、马来酸)、包括蛋白和核酸的聚合物、能够形成水凝胶的物质包括明胶和多种多糖、及其组合。在某些实施方案中，是蛋白或诸如tRNA和siRNA的核酸的活性剂被并入微球中，所述微球使用诸如葡聚糖的多糖或诸如明胶的蛋白作为微载体来稳定。
用作载体的分子通常显示安全性和稳定性。对于给定的活性剂或治疗剂，载体系统可以高通量的方式优化。
如本文使用的“贮藏寿命”或“稳定性”是指在微粒组合物制备后所述组合物保持至少约或等于70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的存在于所述组合物中的初始蛋白活性以及微球的其他一般物理特性如尺寸、形状和空气动力学粒径分布的时间。因此，例如，在室温下(本文中定义为在约18℃至约25℃、26℃、27℃或28℃之间的范围)稳定30天或具有30天的贮藏寿命的组合物在18℃至约25℃、26℃、27℃或28℃下贮藏后30天将具有至少约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的存在于所述组合物中的蛋白活性的初始量。本文提供的微粒组合物的贮藏寿命一般为在55℃下至少约10天、在42℃下至少约2-3周和在25℃下至少约8个月或更长，然而，本文考虑通过本文提供的方法制成的、在任何温度下具有任何长度的贮藏寿命的微粒组合物。
如本文使用的“生物活性剂”、“活性剂”、“生物剂”(biological agent)或“药剂”(an agent)是在被引入身体时导致所期望的生物反应的任何物质，所述生物反应例如在细胞、组织或器官水平上改变躯体功能和/或改变诸如体重和外形的美容外观。这样的物质可以是任何合成的或天然的单质(element)或化合物、蛋白、细胞或组织，包括药品、药物、治疗剂、营养补剂、草药、激素或类似物质或其任何组合。该术语还包括本文特别提及的那些活性剂的药学上可接受的、药理学活性的衍生物，包括，但不限于，盐、酯、酰胺、前药、活性代谢产物、异构体、片段、类似物和类似衍生物。当使用术语“生物活性剂”、“生物剂”和“药剂”时，然后，或者当特定活性剂被特别确定时，意图包括活性剂本身以及药学上可接受的、药理学活性的盐、酯、酰胺、前药、活性代谢产物、异构体、片段和类似物。
如本文使用的“受治疗者”被定义为动物，包括哺乳动物，通常为人。
如本文使用的“治疗有效量”是指当组合物以单一剂型施用于受治疗者时产生所期望的治疗效果或反应、预防效果或反应或其他生物效果或反应的活性剂的量。在剂量中的活性剂的具体的量将根据诸如活性剂的性质、治疗的病症的性质、受治疗者的年龄和体型(size)的条件而宽泛地变化。
如本文使用的化合物的“药学上可接受的衍生物”包括所述化合物的盐、酯、烯醇醚、烯醇酯、酸、碱、溶剂合物、水合物或前药。这样的衍生物可通过本领域技术人员使用用于这样的衍生作用的已知方法而容易地制备。产生的化合物可施用于动物或人类而没有显著毒性作用，并且是药学活性的或是前药。药学上可接受的盐包括，但不限于，胺盐，例如但不限于N，N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、氨、二乙醇胺和其他羟基烃基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、1-对氯苄基-2-吡咯烷-1’-基甲基苯并咪唑、二乙胺和其他烃基胺、哌嗪和三(羟甲基)氨基甲烷；碱金属盐，例如但不限于锂、钾和钠；碱土金属盐，例如但不限于钡、钙和镁；过渡金属盐，例如但不限于锌；和其他金属盐，例如但不限于磷酸氢钠和磷酸氢二钠；并且还包括，但不限于，矿物酸盐，例如但不限于盐酸盐和磷酸盐；和有机酸盐，例如但不限于乙酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、丁酸盐、戊酸盐和富马酸盐。药学上可接受的酯包括，但不限于，包括但不限于羧酸、磷酸、次膦酸、磺酸、亚磺酸和硼酸的酸基的烃基酯、烯基酯、炔基酯、芳基酯、杂芳基酯、芳烃基酯、杂芳烃基酯、环烃基酯和杂环基酯。
如本文使用的“治疗”是指其中病症、疾患或疾病的一种或多种症状被改善或被另外有益地改变的任何方式。治疗还包括本文的组合物的任何药学用途，例如用于治疗流行性感冒的用途。
如本文使用的“有机溶剂”是指是有机化合物的溶剂，所述有机化合物是其分子包含碳和氢的一大类化合物的任何成员。这样的溶剂可包括，例如，来自以下类别的化合物：脂族或芳族醇、多元醇、醛、烷、烯、炔、酰胺、胺、芳族化合物、偶氮化合物、羧酸、酯、二噁烷类、醚、卤代烷、亚胺、酰亚胺、酮、腈、酚和硫醇。
如本文使用的“含水溶剂”是指水或包含至少约50％或50％、至少约60％或60％、至少约70％或70％、或约或等于75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的量的水的溶剂混合物。如本文使用的术语“含水溶剂”还指含有水作为溶剂的溶液，例如缓冲液、盐溶液、含有抗衡离子和可溶于水的其他溶质的溶液。
如本文使用的“抗溶剂”是指，当添加到感兴趣的形成微粒的化合物的溶液中时降低所述化合物在所得混合物(即，微粒最终从其中获得的“混合溶液”)中的溶解度的溶剂。抗溶剂通常以这样的量添加：使所述化合物保持在溶液中直到微粒通过逐渐致冷然后是例如通过冻干的微粒恢复的步骤而形成时。因此，抗溶剂以不足以在用于制备混合溶液的温度下(通常，环境温度)使化合物从溶液中沉淀出的量添加至所述化合物的溶液中。抗溶剂可以是与化合物所溶解的溶剂、或与溶剂/抗衡离子溶液、或溶剂/抗衡离子/化合物溶液可混溶的或部分可混溶的。例如，诸如异丙醇的有机溶剂可以是用于水溶性的化合物的抗溶剂，并且水或含水缓冲液可以是用于不溶于水的化合物的抗溶剂。然而，溶剂和抗溶剂均可以是有机溶剂。某些抗溶剂和溶剂还可作为抗衡离子。例如，含水的缓冲溶液可以是抗衡离子以及溶剂或抗溶剂。类似的，诸如聚乙二醇(PEG)或聚乙烯亚胺(PEI)的聚合物可以是抗溶剂和抗衡离子。
如本文使用的术语“溶剂/抗溶剂系统”是指溶剂的混合物，其中可形成微球的化合物在环境温度下是可溶的但在将混合物致冷至环境温度以下时形成微球，所述形成通常是在抗衡离子存在下。如上所述，溶剂和/或抗溶剂还可以是抗衡离子并消除了对另外的抗衡离子的需要。溶剂和抗溶剂通常是互相可混溶的或部分可混溶的，虽然还可以使用其中溶剂和抗溶剂是不可混溶的溶剂/抗溶剂系统。
如本文使用的术语“pI”或“等电点”是指在蛋白或多肽上不存在净电荷的pH。
如本文使用的术语“抗衡离子”是指可引发从大分子或从小分子中形成微粒的带电的或电荷极化的分子，所述大分子例如蛋白、核酸、脂质或寡糖，所述小分子例如四环素或前列腺素。抗衡离子可以是聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或聚乙烯亚胺(PEI)。
抗衡离子的选择可对于每个感兴趣的化合物(大分子或小分子)而凭经验确定。例如，在DAS181融合蛋白(SEQ ID NO：17)的情况下，硫酸钠是抗衡离子，因为它在本文提供的方法中能够引发微粒的形成，而甘氨酸、氯化钠或乙酸钠通常不适于作为用于DAS181的抗衡离子。对于卡那霉素，衣康酸和柠檬酸可作为合适的抗衡离子，因为它们在本文提供的方法中能够引发卡那霉素的微粒的形成，而精氨酸通常不适于作为用于卡那霉素的抗衡离子。
带电的分子是不是抗衡离子可基于包括但不限于以下的参数凭经验确定：配制成微球的分子类型、pH、离子强度、使用的溶剂/抗溶剂系统的类型和盐与诸如活性剂的另外的成分的存在。如本文提供并描述的抗衡离子可以是阴离子的或具有净负电荷或可电荷极化的基团、阳离子的或具有净正电荷或可电荷极化的基团、或两性离子的并具有带负电荷和正电荷的或可电荷极化的基团。
化合物有时可以是其自身的抗衡离子，在不存在任何另外的抗衡离子的情况下促进微粒的形成。例如，在某些条件下，诸如四环素、卡那霉素和氨苄西林的小分子和诸如siRNA和烟草花叶病毒的大分子在不存在添加的抗衡离子的情况下可形成微粒。能够在不存在感兴趣的化合物的情况下独立地形成微粒的其他抗衡离子，例如聚乙烯亚胺(PEI)和乙酸钠/硫酸钠缓冲液，可通过作为“载体”或“种子”促进感兴趣的化合物的微粒的形成和/或成核。
如本文使用的术语“冷却”是指将温度降低至所期望的温度以获得微粒，或在获得所期望的尺寸的微粒后，进一步将温度降低至所期望的温度以通过蒸发溶剂(例如，冷冻干燥)获得微粒的干燥制剂。如本文使用的术语“逐渐冷却”或“逐渐地冷却”或“逐渐地被冷却”的含义是，温度从环境温度(约或等于15℃至约或等于50℃，通常约或等于18℃至约或等于30℃)降低至所期望的温度以形成微粒以适合于在溶液冻结前在溶液中产生微粒的速度或时间量发生。因此，逐渐冷却不同于，例如，其中整个溶液被转化为固体形式而没有产生明显的微粒的快速冷冻、喷雾干燥或喷雾冷冻干燥。
逐渐冷却的速度基于大分子、溶剂、抗衡离子和其他成分的类型以及冷却的方法(例如，吸热反应、热交换器、致冷器或冷冻机或冷冻干燥器)而凭经验确定，并且该速度可例如为以下微粒形成的时间量而变化：约或等于1min、2min、3min、5min、7min、10min、15min、20min、25min、30min、1h、2h、5h或10h至约或等于1.5min、2min、3min、5min、7min、10min、15min、20min、25min、30min、1h、2h、5h、10h或15h。
所期望的尺寸的微粒还可以，例如，通过以下方法形成：使混合物快速致冷(例如，使用热交换器)并允许微粒的悬浮液在没有显著的温度变化的情况下保持一段时间，然后使混合物快速冷冻。
形成微粒的温度也基于大分子或小分子、溶剂、抗衡离子和其他成分的类型以及冷却的方法和均匀性而凭经验确定，并且该温度可从约或等于15℃、10℃、8℃、5℃、4℃、3℃、2℃、1℃、-2℃、-5℃、-7.5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃、-45℃、-50℃、-55℃、-60℃、-70℃、-80℃、-85℃、-90℃、-100℃、-110℃、-115℃、-120℃、-125℃、-135℃、-145℃、-150℃、-160℃、-165℃、-170℃、-175℃、-180℃、-185℃、-190℃、-195℃或-200℃而变化。
术语“环境温度”在本文中有时与“室温”可互换使用并且指在指定区域的环境中的气体或其他介质的温度，其中在微球开始形成之前混合反应物在所述指定区域中混合和/或维持。如本文使用的环境温度可以从约或等于15℃至约或等于50℃，通常约或等于18℃至约或等于30℃，或约或等于25℃至约或等于30℃。
如本文使用的“吸热反应”是从其环境(例如溶液中)吸收热量从而使周围环境或溶液冷却的任何化学反应。例如，向水中加入硫酸铵或乙腈导致吸热反应；因此，这些化合物可分别作为抗衡离子和抗溶剂，并且还促进致冷以形成微粒。吸热反应的其他实例包括，但不限于，氯化铵溶解于水中、水与硝酸铵混合、水与氯化钾混合以及醋酸与碳酸钠反应。
如本文使用的术语“喷雾干燥”是指这样的过程，其中含有诸如蛋白或小分子的分子的溶液通过通常约几毫秒至1-2秒至几十秒的时间雾化到热的干燥介质中而被转化为干燥的颗粒形式。如本文使用的术语“喷雾冷冻干燥”是指这样的过程，其中含有诸如蛋白的大分子的溶液被雾化到诸如液氮的低温介质中以获得冻结的溶液液滴，所述冷冻的溶液液滴然后可通过冻干法而被干燥。如本文可互换使用的术语“快速冷冻”或“速冻”(rapid freezing)或“速冻”(quick freezing)或“闪冻”(flash freezing)是指通过将容纳溶剂或溶液的具有良好传热特性的容器浸入液氮或将溶液直接倾入液氮而冷冻溶剂或溶液，所述溶液包括含有诸如蛋白的大分子的溶液，所述容器例如薄壁的玻璃或塑料或金属试管。“快速冷冻”和“速冻”通常在约几毫秒至1-2秒至几十秒的时间内发生。
如本文使用的术语“冻干”或“冻干法”与“冷冻干燥”是同义词并且指这样的过程，其中包括乳液、胶体或悬浮液的溶液被冷冻并且溶剂被直接蒸发(升华)为汽态而留下固体组分。
B.用于制备微粒组合物的方法
本文提供了制备具有高含量化合物的微球的方法。所述化合物可以是大分子如蛋白，或小分子如前列腺素。本文提供的微球通过在抗衡离子和抗溶剂存在下的控制沉淀而制备。所述微球适于制备可通过多种递送途径递送至受治疗者的药物组合物、诊断组合物、营养品组合物或化妆品组合物，所述递送途径包括肺部施用途径、皮下施用途径、透皮施用途径、肌肉内施用途径、肠胃外施用途径和口服施用途径。所述方法还可以为了增加效率和产量而以成批方式或连续方式进行。
通过本文提供的方法获得的微球可用作用于体内或体外治疗或诊断受治疗者中的疾病状态的预防剂、治疗剂或诊断剂。通过本文提供的方法获得的微球的尺寸可通过调节包括以下的参数而控制：抗溶剂的类型和浓度、溶剂/抗溶剂系统中溶剂和抗溶剂的类型和相对浓度、大分子或小分子浓度、离子强度、抗衡离子类型和浓度、冷却的速度和时间，以提供从0.001微米至50微米或更高的宽泛范围的尺寸的微球，所述微粒可经期望的途径递送治疗剂，所述期望的途径包括肺部途径(示例性的尺寸可包括，但不限于，用于递送至咽喉、气管和支气管以治疗流行性感冒和其他呼吸道感染的1微米至5微米颗粒)、皮下途径、肌肉内途径、静脉内途径和其他途径(使用可包括但不限于几十微米尺寸的颗粒的颗粒)。
本文提供的组合物可配制用于多种施用方式。例如，组合物可口服施用例如通过食入、静脉内施用、鼻内施用、肠胃外施用、皮下施用、透皮施用、局部施用、皮肤施用、关节内施用或肌肉内施用。组合物还可配制用于肺部施用或眼部施用。在某一方面中，本文提供的组合物用于吸入。
本文提供的组合物可配制为片剂、囊片、胶囊、凝胶、小瓶、预装注射器、吸入器、静电设备和其他设备以用于递送。组合物的递送剂量可以从在约或等于0.01mg至约或等于0.1mg；约或等于0.1mg化合物每剂量至约或等于1000mg化合物每剂量，或约或等于0.2mg、0.3mg、0.5mg、0.6mg、0.75mg、1mg、1.5mg、2mg、3mg、5mg、10mg、15mg、20mg、30mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg或约或等于1000mg化合物每剂量。剂量的施用频率，例如，用于治疗或预防流行性感冒，可从每天3次或更多次、至每天2次、至每天一次、至每周2次、至每周一次、至每2周一次或低于每2周一次的频率。对于预防，施用通常可以是以下的级别：约每2周一次或更低的频率，例如每3周一次或每4周或更长时间一次。
根据本文提供的方法配制的组合物可用于防止、预防和/或治疗疾病和疾患。因此，本文提供了通过施用治疗有效量的感兴趣的化合物的微球而防止、预防或治疗疾病的方法。所述疾病和疾患可包括，但不限于神经疾患、呼吸疾患、免疫系统疾患、肌肉疾患、生殖疾患、胃肠疾患、肺部疾患、消化疾患、代谢疾患、心血管疾患、肾疾患、增殖疾患、癌症和炎症。
例如，本文提供的微粒可用于治疗传染病的方法，所述传染病例如虫媒病毒感染、肉毒中毒、布氏菌病、念珠菌病、弯曲菌病、水痘、衣原体、霍乱、冠状病毒感染、葡萄球菌感染、柯萨奇病毒、克罗伊茨费尔特-雅各布病、隐孢子虫病、环孢子虫感染、巨细胞病毒感染、爱波斯坦-巴尔病毒感染、登革热、白喉、耳朵感染、脑炎、流行性感冒病毒感染、副流行性感冒病毒感染、贾第虫病、淋病、流行性感冒嗜血杆菌感染、汉坦病毒感染、病毒性肝炎、单纯疱疹病毒感染、HIV/AIDS、螺杆菌感染、人乳头状瘤病毒(HPV)感染、传染性单核细胞增多症、军团杆菌病、麻风病、钩端螺旋体病、利斯特菌病、莱姆病、淋巴细胞脉络丛脑膜炎、疟疾、麻疹、马尔堡出血热、脑膜炎、猴痘、腮腺炎、分枝杆菌感染、支原体感染、诺瓦克病毒感染、百日咳、蛲虫感染、肺炎球菌疾病、肺炎链球菌感染、肺炎支原体感染、粘膜炎莫拉菌感染、绿脓假单胞菌感染、轮状病毒感染、鹦鹉热、狂犬病、呼吸道合胞病毒感染(RSV)、癣、落矶山斑疹热、风疹、沙门氏菌病、SARS、疥疮、性传播疾病、志贺菌病、带状疱疹、孢子丝菌病、链球菌感染、梅毒、破伤风、旋毛虫病、结核病、土拉菌病、伤寒、病毒性脑膜炎、细菌性脑膜炎、西尼罗河病毒感染、黄热病、腺病毒介导的感染和疾病、反转录病毒介导的传染病、耶尔森菌人畜共患病和任何其他的传染性呼吸疾病、肺部疾病、皮肤病、胃肠疾病和尿道疾病。
可通过施用治疗有效量的感兴趣的化合物的微球而治疗的其他疾病和病症可包括关节炎、哮喘、过敏性病症、阿尔茨海默病、癌症、心血管疾病、多发性硬化(MS)、帕金森病、囊性纤维化(CF)、糖尿病、非病毒性肝炎、血友病、出血障碍(bleeding disorders)、血液疾患、遗传病、激素失调(hormonal disorders)、药物成瘾性和依赖性、疼痛、肾病、肝病、血管生成、肺动脉高压、神经学疾患、代谢病、皮肤病、甲状腺疾病、骨质疏松、肥胖、中风、贫血、炎性疾病和自身免疫性疾病。
本文提供的方法的步骤包括：将含有化合物的溶液与抗衡离子和抗溶剂合并，然后将所得溶液逐渐冷却至微粒形成的温度。在一个实施方案中，所述步骤可如下描述：
1)以在环境温度下不造成化合物沉淀的浓度将抗衡离子和抗溶剂加入含有溶解于合适溶剂的化合物的溶液中；
2)沉淀：通过包括致冷(热交换)和吸热反应的方法使化合物/抗衡离子/抗溶剂混合溶液致冷以引发微球的形成；和
3)脱水：冷冻微球悬浮液并通过升华(冷冻干燥，例如，在以下温度下：约或等于-5℃至约或等于-200℃；或约或等于-20℃至约或等于-200℃，或约或等于-30℃至约或等于-200℃，或约或等于-40℃至约或等于-180℃，或约或等于-45℃至约或等于-180℃，或约-65℃至约-175℃，或约-80℃至约或等于-120℃，或约或等于-65℃至约或等于-100℃)除去抗溶剂和水。
所述方法的以上步骤可以任何顺序顺次地、间歇地或同时地进行，尽管本领域技术人员将理解，脱水以从使微球与溶剂分离的步骤可在微球形成的同时或之后发生，但不在微球引发和/或形成之前发生。在一个实施方案中，抗衡离子和抗溶剂可以任何顺序同时地或顺次地加入含有化合物的溶液，然后致冷。在其他实施方案中，相同的物质充当抗衡离子和抗溶剂(例如，聚合物如聚乙二醇或聚乙烯亚胺)。在又其他实施方案中，含有化合物的溶液可在添加抗衡离子和抗溶剂之前被预冷至适于微球形成的温度。预冷可使用诸如致冷器或冷冻机的设备或通过吸热反应而进行。例如，预冷的化合物的含水溶液可在形成微球之前或与形成微球同时通过加入硫酸铵和乙腈而形成，硫酸铵和乙腈的溶解通过吸热反应进行。
所得微粒的悬浮液可通过进一步冷却至凝固点以下的温度并随后通过，例如，使用标准冷冻干燥器的升华除去挥发物(溶剂、抗溶剂和，在需要时，抗衡离子)而转化为干燥粉末。
在某些实施方案中，添加抗衡离子不是必须的。例如，在某些条件下，在含有合适溶剂的溶液中的某些分子可在抗溶剂存在下而没有添加抗衡离子的情况下形成微粒。不受限于任何理论，所述分子能够充当它们自身的、或所得混合溶液中的其他组分)或其组合的抗衡离子是可能的，所述其他组分例如溶剂、抗溶剂。本文中示例性说明了若干这样的分子，包括siRNA、烟草花叶病毒、四环素、卡那霉素和氨苄西林。因此，本文还提供了通过以下制备微粒的方法：
(a)将抗溶剂加入溶于溶剂的化合物的溶液中；和
(b)将所述溶液逐渐冷却至约25℃以下的温度，由此形成了含有所述化合物的微粒的组合物，其中步骤(a)和(b)同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。
在其他实施方案中，微粒可在不存在抗溶剂的情况下形成。因此，本文还提供了通过以下制备微粒的方法：(a)将抗衡离子加入溶于溶剂的化合物的溶液中；和(b)将所述溶液逐渐冷却至约25℃以下的温度，由此形成了含有所述化合物的微粒的组合物，其中步骤(a)和(b)同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。
在一个实施方案中，通过包括沉降或过滤技术的方法从悬浮液中分离微球，所述微球通过将化合物与抗衡离子和抗溶剂接触然后暴露于低温而形成。在从最初的沉淀混合物中分离后，微球可被洗涤和/或与改善和/或改变化合物和/或微球的特性的其他物质合并。
在另一实施方案中，通过本文提供的方法制备的微球不具有直接的疗效，但充当其他治疗剂或活性剂(包括诊断标志物和营养补剂)的微载体。另外的剂可在沉淀时加入或者可在冻干前加入形成的微球的悬浮液。可选择地，另外的剂可混入含有微球的干燥粉末。
不受限于任何理论，在一个方面中，本文提供的方法可通过以下允许微球的形成：(1)通过抗衡离子中和化合物表面上的电荷；和(2)通过添加抗溶剂和逐渐冷却的组合效果造成化合物在溶剂中降低的溶解度。
通过选择合适的pH，在合适量的抗衡离子存在下，化合物表面上的大量带电基团，在某些实施方案中为所有带电基团，可被中和，所述合适的pH是凭经验确定的并且取决于化合物、抗衡离子和抗溶剂，可以在诸如以下的范围：约或等于1.0至约或等于14.0，通常约或等于pH 2.0至约或等于10.5或更高。通过添加合适的抗溶剂的溶液极性的降低接着可通过沉淀、相分离、胶体形成或其他这样的方法而引发微球的形成。
可选择地，不受限于任何理论，在某些实施方案中，观察到的微球沉淀现象还可通过抗衡离子与抗溶剂由于在低温下与含有化合物的溶剂相互作用的结构化(kosmotropic)(结构形成)效应解释。不考虑潜在的机制，在本文提供的方法中，将相对少量的抗溶剂和抗衡离子加入含有感兴趣的化合物的溶液中(含水溶剂或极性溶剂用于极性化合物；非极性溶剂或有机溶剂用于不溶于水的化合物)和冷却所得混合溶液，导致产生包含所述化合物的微球的组合物。
在一个实施方案中，可通过使混合溶液通过热交换器而进行所述混合溶液的逐渐冷却致冷。可调节热交换器的温度和通过热交换器的混合物的流速以便混合物在形成微球之前被预冷或被致冷至形成微球的温度。
在另一实施方案中，通过本文提供的方法形成的微球通过诸如沉降或过滤技术的方法而从悬浮液中浓缩或分离。在形成微球时，它们的生长(尺寸)可通过调节悬浮液的离子强度、极性、pH或其他参数而控制。微球与混合溶液的液相的分离可通过离心、过滤(中空纤维、切向流等)或其他技术而进行。所得微球或其浓缩的悬浮液可被冻干或空气干燥。
在某些实施方案中，从最初的沉淀混合物中分离的微球和干燥的微球可在作为治疗剂或载体施用前被重建，或者可被悬浮于包含改变微球特性的剂的溶液中。改性剂可包括但不限于填充剂、赋形剂、非活性成分、稳定性增强剂、味道和/或气味改性剂或掩蔽剂、维生素、糖类、治疗剂、抗氧化剂、免疫调节剂、跨膜运输改性剂、抗结块剂、肠溶包衣剂、赋予耐酸性例如抵抗消化系统的酸的剂、赋予蛋白酶抗性的剂、壳聚糖、聚合物和流动性增强剂。
通过本文提供的方法制备的微球的形成和特性可通过改变包括以下的参数而凭经验确定：化合物的性质和浓度、混合溶液的pH、抗衡离子的性质和浓度、抗溶剂的性质和浓度、离子强度和实现逐渐冷却的冷却速度。本文提供的方法的步骤使所述方法顺应例如以微板格式的高通量筛选，以确定用于产生微球的化合物、抗溶剂、抗衡离子、pH、离子强度和冷却梯度(cooling ramp)的合适的组合。
分子
可在一种或多种抗衡离子和抗溶剂存在下在溶液中形成微粒的任何天然存在的或合成的分子或化合物都被预期用于本文提供的方法。所述化合物可以是无机化合物，包括碱金属化合物和碱土金属化合物及其盐和其他衍生物、过渡金属化合物包括配位化合物及其盐和其他衍生物、无机聚合物如聚硅氧烷、和本领域技术人员已知的其他这样的化合物。无机化合物的实例包括含碳但通常不含碳-碳键的一些化合物；例如一氧化碳、二氧化碳、碳酸盐、氰化物、氰酸盐、碳化物和硫氰酸盐。其他无机化合物包括元素周期表的不同于碳的元素形成的化合物。例如，任何金属(例如，碱金属、碱土金属、过渡金属)碳酸盐、氰化物、氰酸盐、碳化物、卤化物(F、Cl、Br、I)、硫氰酸盐、硒氰酸盐、叠氮化物、氧化物、氢氧化物、硫化物和氢化物、配位化合物、有机金属化合物和如本领域技术人员熟知的其他这样的化合物。
受训于材料科学的化学工作者研究并开发了其他类别的无机化合物，例如，聚合材料和/或耐火材料如硅和砷化镓、钇钡铜氧化物，聚合物如硅氧烷、聚硅烷、聚锗烷、聚锡烷和聚磷腈。
所述化合物可以是有机化合物，包括脂族、芳族和脂环族的醇、醛、羧酸、酯、酮、醚、胺、酰胺、内酰胺、其聚合物和本领域技术人员已知的其他这样的化合物。可以是脂族、芳族或脂环族的有机化合物的实例可以是任何以下的化合物和本领域技术人员已知的或熟知的类似类别的化合物：
“烃基”(alkyl)是指直链或支链的、取代或未取代的烃基团，通常从约1个至40个碳原子、1个至20个碳原子或1个至10个碳原子。“低级烃基”通常是1个至6个碳原子的烃基。烃基可以是“饱和的烃基”，含义是其不包含任何烯基团或炔基团，或者烃基可以是“不饱和的烃基”，含义是其包含至少一个烯基团或炔基团。包含至少一个碳-碳双键(C＝C)的烃基由术语“烯基”所提及，并且包含至少一个碳-碳三键(C≡C)的烃基由术语“炔基”所提及，并且在某些实施方案中，炔基是任选地取代的。烃基包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、己烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、己炔基、卤代烃基和杂烃基。
“环烃基”，即饱和的单环或多环环系统，其中形成环的每个原子是碳原子。环烃基可由3、4、5、6、7、8、9或多于9个碳原子形成。环系统通常包含约3个至约12个碳原子。术语“环烃基”包括含有一个或多个不饱和键的环和那些被取代的环。环烃基的实例包括，但不限于，环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环戊二烯、环己烷、环己烯、1，3-环己二烯、1，4-环己二烯、环庚烷和环庚烯。
“杂环”化合物，它是这样的环，其中至少一个形成环的原子是碳原子并且至少一个形成环的原子是杂原子。
“双环”(bicyclic ring)，它是指稠合的两个环。双环包括，例如，萘烷(decaline)、戊搭烯、萘、薁、庚搭烯、异苯并呋喃、色烯、吲哚嗪、异吲哚、吲哚、嘌呤、二氢吲哚、茚、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、二氮杂萘(naphthyrididine)、喹喔啉、噌啉、蝶啶、异色满、色满和其多种氢化的衍生物。双环可被任选地取代。每个环独立地是芳族的或非芳族的。
“芳族”化合物，例如苯基、萘基、菲基、蒽基、四氢化萘基、芴基、茚基和茚满基。芳族化合物包括通过形成环的碳原子之一连接并且任选地带有一个或多个选自以下的取代基的苯型基团：芳基、杂芳基、环烃基、非芳族杂环、卤、羟基、氨基、氰基、硝基、烃基酰胺基、酰基、C1-6烃氧基、C1-6烃基、C1-6羟基烃基、C1-6氨基烃基、C1-6烃基氨基、烃硫基(alkylsulfenyl)、烃亚硫酰基、烃磺酰基、氨磺酰或三氟甲基。芳基可在对位、间位和/或邻位的一处或多处取代。含有取代的芳基的实例包括，但不限于，苯基、3-卤代苯基、4-卤代苯基、3-羟基苯基、4-羟基-苯基、3-氨基苯基、4-氨基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、4-三氟甲氧基苯基、3-氰基-苯基、4-氰基苯基、二甲基苯基、萘基、羟基萘基、羟甲基-苯基、(三氟甲基)苯基、烃氧基苯基、4-吗啉-4-基苯基、4-吡咯烷-1-基苯基、4-吡唑基苯基、4-三唑基苯基和4-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基。
“芳基”化合物，是不包含环杂原子的单环、双环或三环的芳族系统。芳基的实例包括苯基、萘基、蒽基、茚满基、1，2-二氢-萘基、1，4-二氢萘基、茚基、1，4-萘醌基、和1，2，3，4-四氢萘基。
“杂芳基”化合物，是指其中至少一个形成芳环的原子是杂原子的芳环。这样的基团包括噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、吡咯基、呋喃基(furanyl)(呋喃基(furyl))、噻吩基(thiophenyl)(噻吩基(thienyl))、咪唑基、吡唑基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、1，3-噁唑基(噁唑基)、1，2-噁唑基(异噁唑基)、噁二唑基、1，3-噻唑基(噻唑基)、1，2-噻唑基(异噻唑基)、四唑基、吡啶基(pyridinyl)(吡啶基(pyridyl))、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、1，2，3-三嗪基、1，2，4-三嗪基、1，3，5-三嗪基、1，2，4，5-四嗪基、吲唑基、吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、吖啶基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、酞嗪基、噻吩并噻吩基、1，8-二氮杂萘基、其他二氮杂萘基、蝶啶基或吩噻嗪基。杂芳基化合物可以是以双环自由基的形式，和/或可任选地被取代。取代基的实例包括卤、羟基、氨基、氰基、硝基、烃基酰胺基、酰基、C1-6-烃氧基、C1-6-烃基、C1-6-卤代烃基、C1-6-羟基-烃基、C1-6-氨基烃基、C1-6-烃基氨基、烃硫基、烃亚硫酰基、烃磺酰基、氨磺酰或三氟甲基。杂芳基的实例包括，但不限于，以下物质的未取代的和单取代的或二取代的衍生物：呋喃、苯并呋喃、噻吩、苯并噻吩、吡咯、吡啶、吲哚、噁唑、苯并噁唑、异噁唑、苯并异噁唑、噻唑、苯并噻唑、异噻唑、咪唑、苯并咪唑、吡唑、吲唑、四唑、喹啉、异喹啉、哒嗪、嘧啶、嘌呤和吡嗪、呋咱、1，2，3-噁二唑、1，2，3-噻重氮、1，2，4-噻重氮、三唑、苯并三唑、蝶啶、吩噁唑(phenoxazole)、噁二唑、苯并吡唑、喹嗪、噌啉、酞嗪、喹唑啉和喹喔啉。取代基可以是，例如，卤、羟基、氰基、O-C1-6-烃基、C1-6-烃基、羟基-C1-6-烃基和氨基C1-6-烃基。
“非芳族杂环”，即，其中形成环的一个或多个原子是杂原子的非芳族环。非芳族杂环可由3个、4个、5个、6个、7个、8个、9或多于9个原子形成。非芳族杂环可以是任选地取代的。非芳族杂环的实例包括，但不限于，内酰胺、内酯、环状酰亚胺、环状硫代酰亚胺(cyclic thioimide)、环状碳酸酯、四氢噻喃、4H-吡喃、四氢吡喃、哌啶、1，3-二氧芑、1，3-二噁烷、1，4-二氧芑、1，4-二噁烷、哌嗪、1，3-氧硫杂环己烷、1，4-氧硫杂环己二烯、1，4-氧硫杂环己烷、四氢-1，4-噻嗪、2H-1，2-噁嗪、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巴比妥酸、硫代巴比妥酸、二氧代哌嗪、乙内酰脲、二氢尿嘧啶、吗啉、三噁烷、六氢-1，3，5-三嗪、四氢噻吩、四氢呋喃、吡咯啉、吡咯烷、吡咯烷酮(pyrrolidone)、吡咯烷酮(pyrrolidione)、吡唑啉、吡唑烷、咪唑啉、咪唑烷、1，3-间二氧杂环戊烯、1，3-二氧戊环、1，3-二硫杂环戊二烯、1，3-二硫戊环、异噁唑啉、异噁唑烷、噁唑啉、噁唑烷、噁唑烷酮、噻唑啉、噻唑烷和1，3-氧硫杂环戊烷。
“芳烃基”化合物是指用芳基取代的烃基，所述芳基可任选地被取代。
“杂芳烃基”化合物是指用杂芳基取代的烃基，所述杂芳基可任选地被取代。
在有机化合物上的取代基可以是包括以下的若干个取代基之一：“氨基”化合物是指含有-NH2基团的化合物；“羟基”是指-OH基团；“硝基”是指-NO2基团；“O羧基”是指式RC(＝O)O-的基团；“C羧基”是指式C(＝O)OR的基团；“烃氧基”是指式-OR的基团；“乙酰基”或“酰基”是指式C(＝O)CH3的基团；“氰基”是指式CN的基团；“腈”是指具有RC≡N结构的化合物；“异氰酸根合”是指式NCO的基团；“硫代氰酸根合”是指式CNS的基团；“异硫氰酸根合”是指式NCS的基团；“C酰胺基”是指式C(＝O)NR2的基团；“N酰胺基”是指式RC(＝O)NR’的基团；“烃硫基”是指式-SR的基团；“亚硫酰基”是指式-S(＝O)的基团；“磺酰基”是指式-S(＝O)2R的基团；“氨磺酰”是指式-S(＝O)2NR2的基团；“磺酰卤化物”是指式X-S(＝O)2R的化合物，其中X是卤；“酯”是指式RC(＝O)OR’的基团，其中R’≠H；“酰胺”是指式RC(＝O)NR’2的基团。
大分子和小分子
用于根据本文提供的方法形成微粒的化合物可以是大分子或小分子。术语“大分子”被本领域技术人员所理解，并且通常指天然存在的或化学合成的有机分子或无机分子，其分子量为大于或等于约1000道尔顿至约或大于1、2、3、5、7、10或更多万亿道尔顿，约1000或1000至约50亿或50亿、约1000或1000至约10亿或10亿、约1000或1000至约5000万或5000万、约1000或1000至约2000万或2000万、约1000或1000至约1500万或1500万、约1000或1000至约1000万或1000万、约1000或1000至约500万或500万、约1000或1000至约100万或100万、约1000或1000至约500,000或500,000、约1000或1000至约300,000或300,000、约1000或1000至约200,000或200,000、约1000或1000至约100,000或100,000、约1000或1000至约50,000或50,000、约1000或1000至约25,000或25,000、约1000或1000至约15,000或15,000、约1000或1000至约10,000或10,000、约1000或1000至约5,000或5,000、约1000或1000至约3,000或3000、或约1000或1000至约2,000或2000道尔顿。大分子的实例包括蛋白、肽、核酸(包括DNA、RNA、siRNA、snRNA、反义RNA和核酶)、碳水化合物、脂质、脂肪酸、多糖、蛋白轭合物、病毒、病毒颗粒、激素类、碳水化合物-蛋白或多糖-蛋白轭合物、类病毒、朊病毒及其混合物。
本文中使用的术语“小分子”的含义是本领域技术人员所理解的含义，并且通常指天然存在的或化学合成的有机分子或无机分子，其小于约1000道尔顿，从约或等于1000道尔顿至约或等于950道尔顿、900道尔顿、850道尔顿、800道尔顿、750道尔顿、700道尔顿、650道尔顿、600道尔顿、550道尔顿、500道尔顿、450道尔顿、400道尔顿、375道尔顿、350道尔顿、325道尔顿、300道尔顿、275道尔顿、250道尔顿、225道尔顿、200道尔顿、175道尔顿、150道尔顿、125道尔顿、100道尔顿、75道尔顿、70道尔顿、65道尔顿、60道尔顿、55道尔顿、50道尔顿、45道尔顿、40道尔顿、35道尔顿、30道尔顿、25道尔顿、20道尔顿、15道尔顿、10道尔顿、5道尔顿或更少道尔顿。小分子被理解为指不是诸如蛋白或核酸的大分子也不是诸如病毒的大分子组装体的任何分子。如本文使用的“小分子”可包括包含两个或多个单体子单元的分子，诸如二肽或二核苷酸，并且通常被理解为指约或等于1000道尔顿或更低分子量的分子。小分子的实例包括，但不限于，无机分子，例如，但不限于，一氧化碳、二氧化碳、金属(例如，碱金属、碱土金属、过渡金属)碳酸盐、氰化物、氰酸盐、碳化物、卤化物、硫氰酸盐、氧化物、氢氧化物、硫化物和氢化物；配位化合物，例如钴盐[Co(NH3)6]Cl3；和有机金属化合物，例如Fe(C5H5)2。是有机化合物的小分子包括，例如，核苷酸、氨基酸、蝶啶如呋氨蝶啶和氨苯蝶啶；嘌呤如乙酸茶碱、7-吗啉甲茶碱、帕马溴、丙可可碱和可可碱；甾醇如胆固醇和羊毛甾醇，类固醇如雌激素、睾酮、坎利酮、夹竹桃苷和螺甾内酯；青霉素、四环素、磺胺衍生物如乙酰唑胺、安布赛特、阿佐塞米、布美他尼、布他唑胺、二苯基甲烷-4，4’-二磺酰胺、二磺法胺、呋塞米，尿嘧啶如氨美啶和阿米美啶以及类似尿嘧啶，和前列腺素。
大分子和小分子还可以是如上所述的无机化合物或有机化合物或其组合。此外，大分子和小分子可具有多种功能性应用(functionalapplication)，例如治疗剂、诊断剂、营养补剂和其他活性剂。可根据本文提供的方法配制为微粒的大分子剂和小分子剂包括，例如，抗生素、化学治疗剂、疫苗、造血药、抗感染药、抗溃疡剂、抗过敏剂、解热药、镇痛药、抗炎剂、抗痴呆剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗抑郁药、精神药物、强心剂、抗心律不齐药、血管舒张药、抗高血压药、抗糖尿病药、抗凝血药、降胆固醇剂、诊断标志物和包括草药补剂的营养补剂。
此外，大分子剂和小分子剂可选自无机药物和有机药物，包括但不限于作用于以下的药物：周围神经、肾上腺素能受体、胆碱能受体、神经系统、骨骼肌、心血管系统、平滑肌、血液循环系统、突触位点、神经效应器连接的位点、内分泌系统、激素系统、免疫系统、生殖系统、骨骼系统、内分泌物系统、消化系统和排泄系统、组胺系统及类似物。使用本文提供的组合物可递送的活性剂包括但不限于：抗惊厥药、镇痛药、抗帕金森病药、抗炎剂、钙拮抗剂、麻醉剂、抗微生物剂、抗疟药、抗寄生虫药、抗高血压药、抗组胺剂、解热药、α-肾上腺素能激动剂、α-阻断剂、杀生物剂、杀细菌剂、支气管扩张药、β-肾上腺素能阻断药、避孕药、心血管药、钙通道抑制剂、镇静剂、诊断剂、利尿剂、电解质、酶、催眠药、激素、降血糖药、促血糖增高药、肌肉收缩药、肌肉松弛药、造形术、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、眼药、心理兴奋剂、镇静药、类固醇、拟交感神经药、拟副交感神经药、安定药、泌尿道药、疫苗、阴道药、维生素、矿物质、非类固醇类抗炎药、血管紧张素转换酶、多核苷酸、多肽和多糖。
是可用于根据本文提供的方法形成微粒的大分子或小分子的示例性的剂包括：
用于大分子和小分子的示例性的活性剂类别
α-肾上腺素能激动剂，例如阿屈非尼、肾上腺酮(adrenolone)、酰胺福林(amidephrine)、阿拉可乐定、布酞嗪、可乐定、环喷他明、地托咪定、二甲福林、双特戊酰肾上腺素、麻黄碱、肾上腺素、非诺唑啉、胍那苄、胍法辛、羟基苯丙胺、异波帕胺、茚唑啉、握克丁、美芬丁胺、间羟胺、盐酸甲氧明、甲己胺、美替唑啉、米多君、鼻眼净、去甲肾上腺素、去甲苯福林、二甲己胺、鱆胺、羟甲唑啉、盐酸去氧肾上腺素、盐酸苯丙醇胺、苯丙甲胺、福来君、丙己君、伪麻黄碱、利美尼定、昔奈弗林、四氢萘咪唑啉、噻美尼定、曲马唑啉、异庚胺、泰马唑啉、酪胺和赛洛唑啉；
β-肾上腺素能激动剂，如沙丁胺醇、班布特罗、比托特罗、卡布特罗、克仑特罗、氯丙那林、地诺帕明、双羟乙麻黄碱、培沙明、麻黄碱、肾上腺素、乙非君、乙基去甲肾上腺素、非诺特罗、福莫特罗、海索那林、异波帕胺、乙基异丙肾上腺素、异丙肾上腺素、马布特罗、奥西那林、甲氧那明、麻黄苯丙酮、吡布特罗、普瑞特罗、丙卡特罗、普罗托醇、茶丙喘宁、利米特罗、利托君、索特瑞醇、特布他林和扎莫特罗；
α-肾上腺素能阻断剂，如氨磺洛尔、阿罗洛尔、达哌唑、多沙唑嗪、甲磺酰双氢麦角碱、芬司匹利、吲哚拉明、拉贝洛尔、尼麦角林、哌唑嗪、特拉唑嗪、妥拉唑林、曲马唑嗪和育亨宾；
β-肾上腺素能阻断剂，如醋丁洛尔、心得舒、氨磺洛尔、阿罗洛尔、阿替洛尔、苯呋洛尔、倍他洛尔、贝凡洛尔、比索洛尔、波引洛尔、布库洛尔、布非洛尔(befetolol)、丁呋洛尔、布尼洛尔、布拉洛尔、盐酸布替君、丁非洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、塞利洛尔、塞他洛尔、氯拉洛尔、地来洛尔、依泮洛尔、艾司洛尔、茚诺洛尔、拉贝洛尔、左布诺洛尔、甲吲哚心安、美替洛尔、美托洛尔、莫普洛尔、萘肟洛尔、硝苯洛尔、尼普地罗、氧烯洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普拉洛尔、丙萘洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、硫氧洛尔、他林洛尔、特他洛尔、噻吗洛尔、托利洛尔和希苯洛尔；
醇抑制剂，如柠檬酸氰氨化钙、双硫仑、纳迪德和硝法唑；
醛糖还原酶抑制剂，如依帕司他、泊那司他、索比尼尔和托瑞司他；
同化激素，如雄异噁唑、雄烯二醇、勃雄二醇、勃拉睾酮、氯司替勃、乙雌烯醇；甲酰烯龙、4-羟基-19-去甲睾酮、美雄醇、美替诺龙、美曲勃龙、诺龙、诺龙癸酸酯、诺龙对己基氧苯基丙酸酯、诺龙苯丙酸酯、二乙诺酮、羟甲睾酮、苯噻啶、奎勃龙、司腾勃龙和群勃龙；
止痛剂(牙科)如三氯叔丁醇、丁香和丁香酚；
镇痛药(麻醉)，如阿芬太尼、烯丙罗定、阿法罗定、阿尼利定、苄吗啡、贝齐米特、丁丙诺啡、布托啡诺、氯尼他秦、可待因、可待因甲基溴、磷酸可待因、硫酸可待因、地索吗啡、吗拉迈得、地佐辛、地恩丙胺、双氢可待因、醋酸双氢可待因、酮烯醇、双氢吗啡、地美沙多、地美庚醇、二甲噻丁、吗苯丁酯(dioxaphetyl butyrate)、地匹哌酮、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基吗啡、依托尼秦、芬太尼、氢可酮、重酒石酸二氢可待因酮、氢吗啡酮、羟哌替啶、异美沙酮、凯托米酮、左吗喃、洛芬太尼、度冷丁、美普他酚、美他佐辛、盐酸美沙酮、美托酮、吗啡、吗啡的衍生物、苄吗啡十四酸酯、纳布啡、那碎因、二烟酰吗啡、左旋3-羟吗啡烷、去甲美沙酮、去甲吗啡、二苯哌己酮、鸦片、羟考酮、氧吗啡酮、阿片全碱、喷他佐辛、苯吗庚酮、非那佐辛、苯哌利定(pheoperidine)、去痛定、氰苯双哌酰胺、丙庚嗪、二甲哌替啶、异丙哌替啶、丙吡胺、达而丰、舒芬太尼与替利定；
止痛药(非麻醉)，如对乙酰氨基酚、水杨酸对乙酰氨苯酯、乙酰苯胺、乙酰水杨酰水杨酸、阿氯芬酸、阿明洛芬、阿洛普令、双(乙酰水杨酸酯)铝、氨氯苯嗪、2-氨基-4-甲基吡啶、氨丙吡酮、氨基比林、水杨酸铵、安替比林、水杨酸安替比林、安曲非宁、阿扎丙宗、阿司匹林、扑炎痛、苯噁丙酸、苄哌吡酮、苄达明、对溴乙酰苯胺、5-溴水杨酸醋酸酯、丁西丁、丁苯羟酸、丁丙二苯肼、布他西丁、乙酰水杨酸钙、卡马西平、醇苯哌酯、卡必芬、苯噁嗪二酮、氯醛比林、氯乙苯噁嗪酮、胆碱水杨酸、辛可芬、西拉马朵、氯美辛、克罗丙胺、克罗乙胺、右奥沙屈、二苯米唑、二氟尼柳、二羟化铝乙酰水杨酸盐、地匹乙酯、安乃近、依莫法宗、恩芬那酸、依匹唑、依特柳酯、乙水杨胺、乙氧二氨偶氮苯、依托度酸、联苯乙酸、非诺洛芬、夫洛非宁、氟灭酸、氟苯乙砜、氟吡汀、氟丙喹宗、氟比洛芬、磷柳酸、龙胆酸、格拉非宁、异丁芬酸、咪唑水杨酸、吲哚美辛、吲哚洛芬、三苯唑酸、isoladol、异尼辛、酮洛芬、酮咯酸、对乳酰乙氧苯胺、来苯胺、洛索洛芬、赖氨酸乙酰水杨酸盐、乙酰水杨酸镁、甲氧异丁嗪、甲氧夫啉、咪洛芬、吗拉宗、吗啉水杨酸、萘普生、奈福泮、尼芬那宗、5′硝基-2′丙氧基乙酰苯胺、帕沙米特、哌立索唑、非那西丁、盐酸非那吡啶、非诺可、非诺吡酮、苯基乙酰水杨酸盐、水杨酸苯酯、非尼拉朵、哌布宗、哌立酮、普罗利定、丙帕他莫、异丙安替比林、普罗沙唑、奎宁水杨酸酯、雷米那酮、利马唑甲硫酸盐、乙酰水杨胺、水杨苷、水杨酰胺、水杨酰胺邻乙酸、水杨酰硫酸酯、沙索林、沙维林、西美曲特、水杨酸钠、磺甲比林、舒洛芬、他尼氟酯、替诺昔康、特罗芬那酯、粉防己碱、替诺立定、托芬那酸、托普罗宁、曲马多、维米醇、联苯丁酸和佐美酸；
雄激素，如雄酮、勃地酮、脱氢表雄酮、氟甲睾酮、美他诺龙、甲二氢睾酮、美雄酮、17-甲睾酮、17α-甲基睾酮3-环戊烯醇醚、诺乙雄龙、甲诺酮、氧雄龙、羟甲睾酮、康复龙、普拉睾酮、二氢睾酮(stanlolone)、司坦唑醇、睾酮、睾酮17-三氯乙醛半缩醛、17β-环戊丙酸睾酮、庚酸睾酮、烟酸睾酮、苯乙酸睾酮、丙酸睾酮和硫甲睾酮；
麻醉药，如醋胺丁香酚、醋酸阿法多龙、阿法沙龙、amucaine、阿莫拉酮、盐酸阿米洛卡因、表麻滴瞳液、苯佐卡因、贝托卡因、苯柳胺酯、布比卡因、布大卡因、丁二烯、布坦卡因、burethamine、丁硫妥钠、丁托西卡因、卡铁卡因、2-盐酸氯普鲁卡因、己基苯酰爱康因、可卡因、环甲卡因、盐酸二丁卡因、异喹卡因、二甲卡因、盐酸地哌冬、达克罗宁、去水芽子碱、芽子碱、乙基氨基苯甲酸酯、乙基氯化物、依替卡因、乙苯噁啶、β-优卡因、尤普罗辛、非那可明、福吗卡因、环己烯巴比妥、盐酸海克卡因、羟孕酮酯钠、羟基普鲁卡因、羟丁卡因、异丁基对氨基苯甲酸酯、氯胺酮、亮氨卡因甲磺酸酯、左沙屈尔、利多卡因、甲哌卡因、盐酸美普卡因、盐酸美布卡因、美索比妥钠、甲基氯化物、咪唑安定、麦替卡因、纳依卡因、奥他卡因、奥索卡因、乙氧连氮、对乙氧卡因、盐酸非那卡因、苯环利定、苯酚、哌罗卡因、匹多卡因、聚乙二醇单十二醚、丙吗卡因、丙胺卡因、普鲁卡因、丙泮尼地、丙泮卡因、丙美卡因、丙哌卡因、异丙酚、盐酸丙氧卡因、假可卡因、吡咯卡因、盐酸奎宁尿素、利索卡因、水杨酰醇、盐酸丁卡因、硫烯比妥、硫戊巴比妥(thimylal)、仲丁硫巴比妥钠、硫喷妥钠、托利卡因、三甲卡因和佐拉敏；
减食欲剂，如阿米雷司、胺苯氯醛、安非他明、苄非他明(benzaphetamine)、对氯苯丁胺、氯苄雷司、氯福雷司、邻氯苯叔丁胺、环己异丙甲胺、硫酸右旋苯丙胺(destroamphetamine)、安非拉酮、二苯甲哌啶乙醇、N-乙基苯丙胺、芬布酯、芬氟拉明、芬普雷司、呋甲苯丙胺、左芬氟拉明(levophacetoperate)、马吲哚、美芬雷司、甲基麻黄酮、去氧麻黄碱、去甲伪麻黄碱、苯甲曲秦、酒石酸苯甲曲秦、芬美曲秦、喷托雷司、盐酸苯丙醇胺和匹西雷司；
驱虫药(绦虫)，如槟榔碱、鳞毛蕨素、绵马醇、双氯酚、酸藤子酚、苦辛、萘、氯硝柳胺、石榴碱(Pellertierine)、石榴碱鞣酸和奎纳克林；
驱虫药(线虫)，如土木香脑、硝硫氰胺、土荆艾油素、苄酚宁、双硫氰苯、四氯化碳、香芹酚、环苯达唑、乙胺嗪、二苯甲酰乙烷、碘二噻宁、地孟汀、甲紫、4-己雷琐辛、卡英酸、甲苯达唑、2-萘酚、奥克太尔、木瓜蛋白酶、哌嗪、己二酸哌嗪、柠檬酸哌嗪、哌嗪依地酸钙、酒石酸哌嗪、噻嘧啶、扑蛲灵、α-山道年、司替碘铵、四氯乙烯、四咪唑、噻苯达唑、麝香草酚、百里基N-异戊基氨基甲酸酯、三氯酚哌嗪和脲锑胺；
驱虫药(盘尾属)，如伊维菌素和舒拉明钠；
驱虫药(裂体吸虫属)，如硝硫氰胺、氨苯酞胺、酒石酸锑钾、葡萄糖酸锑钠、酒石酸锑钠、巯基乙酸锑钠、巯基乙酰胺锑、胺甲噻吨酮、海恩酮、盐酸胺甲硫蒽酮、尼立达唑、奥沙尼喹、吡喹酮、二巯琥珀酸锑钠、睇波芬和脲锑胺；
驱虫药(吸虫)，如安锑锂明和四氯乙烯；
抗痤疮药，如阿达帕林、苯甲孕酮、壬二酸、过氧化苯酰、西奥克托、环丙孕酮、莫维A胺、间苯二酚、维甲酸、四羟醌和维A酸(Tretinonine)；
抗过敏药，如氨来呫诺、阿司咪唑、氮卓斯汀、色甘酸钠、芬哌丙烷、组胺、异丁司特、奈多罗米、奥沙米特、喷替吉肽、毒葛浸膏、槲叶毒葛浸膏、有毒漆树提取物、瑞吡司特、曲尼司特、曲呫诺和漆酚；
抗阿米巴药，如胂噻醇、比拉米可、卡巴胂、吐根酚碱、氯倍他胺、氯喹、氯苯沙明、金霉素、去氢依米丁、双溴丙脒、二氯尼特、Dephetarsone、依米丁、烟曲霉素、格劳卡苷、甘铋胂、8-羟基-7-碘-5-硫酸喹啉、氯碘羟喹、双碘喹啉、巴龙霉素、泛喹酮、甲苯比妥(phearsone sulfoxylate)、聚苯胂酸、普罗帕脒、喹法米特、塞克硝唑、磺胺苯胂、替克洛占、四环素、硫柳脲苯胂、硫代卡巴胂和替硝唑；
抗雄激素，如戊双氟酚、西奥克托、环丙孕酮、醋酸地马孕酮、福至尔(flutimide)、尼鲁米特和奥生多龙；
抗心绞痛药，如醋丁洛尔、阿普洛尔、胺碘酮、氨氯地平、阿罗洛尔、阿替洛尔、苄普地尔、贝凡洛尔、布库洛尔、布非洛尔、丁呋洛尔、布尼洛尔、布拉洛尔、卡拉洛尔(Carozolol)、卡替洛尔、卡维地洛、塞利洛尔、马来酸肉桂哌乙酯、地尔硫卓、依泮洛尔、非洛地平、戈洛帕米、伊莫拉明、茚诺洛尔、二硝酸异山梨醇酯、伊拉地平、利马前列素、甲吲洛尔、美托洛尔、吗多明、纳多洛尔、尼卡地平、硝苯地平、硝苯洛尔、尼伐地平、尼普地罗、尼索地平、硝酸甘油、氧烯洛尔、奥昔非君、奥扎格雷、喷布洛尔、四硝酸戊四醇酯、吲哚洛尔、丙萘洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、特罗地林、噻吗洛尔、托利洛尔和维拉帕米；
抗心律不齐药，如醋丁洛尔、乙酰卡尼、阿糖腺苷、阿义马林、阿普洛尔、胺碘酮、克冠吗啉、阿普林定、阿罗洛尔、阿替洛尔、贝凡洛尔、甲苯磺酸溴苄胺、Bubumolol、布非洛尔、丁萘夫汀、布尼洛尔、布拉洛尔、盐酸布替君、布托苯定、卡泊酸、卡拉洛尔、卡替洛尔、西苯唑啉、氯拉洛尔、丙吡胺、恩卡尼、艾司洛尔、氟卡尼、戈洛帕米、二氢奎尼丁、英地卡尼、茚诺洛尔、异丙托溴铵、利多卡因、劳拉义明、劳卡尼、甲氧苯汀、美替洛尔、美西律、莫雷西嗪、萘肟洛尔、硝苯洛尔、氧烯洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、吡美诺、普拉洛尔、丙缓脉灵、盐酸普鲁卡酰胺、丙萘洛尔、普罗帕酮、普萘洛尔、吡诺林、硫酸奎尼丁、奎尼丁、索他洛尔、他林洛尔、噻吗洛尔、妥卡尼、维拉帕米、维喹地尔和希苯洛尔；
抗动脉硬化药物，如吡醇氨酯；
抗关节炎药/抗风湿药，如阿洛铜钠、金诺芬、金硫葡糖、金硫醋苯胺、硫唑嘌呤、3-金硫-2-丙醇-1-磺酸钙、塞来考昔、氯喹、氯丁扎利、铜克索林、双醋瑞因、氨基葡萄糖、硫代苹果酸金钠、硫代硫酸金钠、羟氯喹、凯布宗、氯苯扎利、蜂毒素、甲氨蝶呤、金硫乙酸钙和青霉胺；
抗细菌药(抗生素)包括：氨基糖苷类药物如阿米卡星、安普霉素、阿贝卡星、斑伯霉素、布替罗星、地贝卡星、二氢链霉素、阿司米星、庆大霉素、天神霉素、卡那霉素、小诺米星、新霉素、十一烯酸新霉素、奈替米星、巴龙霉素、核糖霉素、西索米星、大观霉素、链霉素、链霉素异烟肼、万古霉素(还被认为是糖肽)和妥布拉霉素；
酰胺醇类药物，如叠氮氯霉素、氯霉素、氯霉素棕榈酸酯、氯霉素泛酸酯、氟苯尼考和甲砜霉素；
安莎霉素类，如利福米特、利福平、利福霉素和利福昔明；
β-内酰胺类，包括：碳青霉素烯类，如亚胺培南；
头孢菌素类，如头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢曲秦、头孢西酮、头孢唑林、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地秦、头孢尼西、头孢哌酮、头孢雷特、头孢噻肟、头孢替安、头孢咪唑、头孢匹胺(Cefpirimide)、头孢泊肟、头孢沙定、头孢磺啶、头孢他啶、头孢特仑、头孢替唑、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢呋辛、头孢唑喃、头孢乙腈钠、头孢氨苄、头孢甘酸、头孢利素、头孢菌素、头孢噻吩、头孢匹林钠、头孢霉定和pivcefalexin；
头霉素类如头孢拉宗、头孢美唑、头孢米诺、cefetan和头孢西丁；
单环β-内酰胺类如氨曲南，卡芦莫南和替吉莫南；
氧头孢烯类如氟氧头孢和拉氧头孢(moxolactam)；
青霉素类，如美西林、氮卓脒青霉素匹酯、阿莫西林、氨苄西林、阿帕西林、阿扑西林、阿度西林、阿洛西林、巴氨西林、苄青霉酸、青霉素钠、羧苄西林、羧苄青霉素苯酯钠、卡茚西林、氯甲西林、邻氯青霉素、环西林、双氯西林、联苯青霉素钠、依匹西林、芬贝西林、氟氯西林(Floxicillin)、海他西林、仑氨西林、美坦西林、甲氧西林钠、美洛西林、萘夫西林钠、苯唑西林、培那西林、氢碘酸喷沙西林、苯乙苄胺青霉素G、苄星青霉素G、二苯甲胺青霉素G、青霉素G钙、海巴明青霉素G、青霉素G钾、普鲁卡因青霉素G、青霉素N、青霉素O、青霉素V、苄星青霉素V、哈胺青霉素V、青哌环素、氨苯乙基青霉素钾、哌拉西林、匹氨西林、丙匹西林、喹那西林、磺苄西林、酞氨西林、替莫西林和替卡西林；
林可酰胺类抗生素，如克林霉素和林可霉素；
大环内酯类，如阿奇霉素、卡波霉素、克拉霉素、红霉素、醋硬脂红霉素、依托红霉素、红霉素葡庚糖酸酯、乳糖红霉素、红霉素丙酸酯、红霉素硬脂酸酯、交沙霉素、吉他霉素、麦迪霉素、米卡霉素、竹桃霉素、普利霉素、罗他霉素、罗沙米星、罗红霉素、螺旋霉素和醋竹桃霉素；
多肽，如安福霉素、杆菌肽、卷曲霉素、多粘菌素E、恩多霉素、恩维霉素、夫沙芬净、短杆菌肽、短杆菌肽S、米卡霉素、多粘菌素、多粘菌素B-甲磺酸、普那霉素、利托菌素、替考拉宁、硫链丝菌素、结核放线菌素、短杆菌酪肽、短杆菌素、万古霉素、紫霉素、紫霉素泛酸酯、维吉霉素和杆菌肽锌；
四环素类，如阿哌环素、金霉素、氯莫环素、地美环素、多西环素、胍甲环素、赖甲环素、甲氯环素、美他环素、米诺环素、土霉素、青哌环素、匹哌环素、罗利环素、山环素、琥氯霉素吡甲四环素和四环素；和
其它的抗生素，如环丝氨酸、莫匹罗星和抗结核菌素；
抗细菌药物(合成的)，包括：2，4-二氨基嘧啶如溴莫普林、四氧普林和甲氧苄啶；
硝基呋喃类，如呋喃他酮、氯化呋噻咪唑、硝呋拉定、硝呋太尔、硝呋复林、硝呋吡醇、硝呋拉嗪、硝呋妥因醇和呋喃妥因；
喹诺酮类及类似物，如氨氟沙星、西诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、依诺沙星、氟罗沙星、氟甲喹、洛美沙星、米洛沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、奥索利酸、培氟沙星、吡哌酸、吡咯米酸、罗索沙星、替马沙星和托氟沙星；
磺胺类，如乙酰磺胺林、乙酰磺胺异噁唑、新百浪多息、苄磺胺、氯胺-B、氯胺-T、二氯胺T、甲醛磺胺噻唑、N2甲酰磺胺异二甲嘧啶、N2-β-D-葡萄糖基磺胺、磺胺米隆、4′-(甲氨磺酰基)对氨基苯磺苯胺、对硝磺胺噻唑、诺丙磺胺、酞磺醋胺、酞磺胺噻唑、柳氮磺嘧啶、琥珀磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺醋酰、磺胺氯达嗪、磺胺柯定、磺胺乙胞嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺戊烯、磺胺地索辛、磺胺多辛、磺胺乙二唑、磺胺脒、磺胺二甲哑唑脒、磺胺林、磺胺洛西酸、磺胺甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲氧甲嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧嗪、磺胺美曲、磺胺米柯定、磺胺噁唑、磺胺、磺胺基甲烷磺酸三乙醇胺盐(Sulfanilamidomethanesulfonic Acid Triethanolamine Salt)、4-磺胺水杨酸、N-磺胺酰磺胺(Sulfanilylsulfanilamide)、磺胺酰脲、N-磺胺酰-3，4-丙谷胺、磺胺硝苯、磺胺-5-甲嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺普罗林、磺胺吡嗪、磺胺吡啶、磺胺异噻唑、磺胺均三嗪、磺胺噻唑、磺胺硫脲、磺胺托拉米、磺胺索嘧啶和磺胺异噁唑；
砜类，如醋氨苯砜、氨苯砜乙酸、醋胺磺氨苯砜钠、氨苯砜、地百里砜、二葡糖氨苯砜钠、苯丙砜、琥珀氨苯砜、对氨基苯磺酸、对磺胺酰苄胺(p-Sulfanilylbenzylamine)、p，p′-二磺酰二苯胺(Sulfonyldianiline)-N，N′二半乳糖苷、亚磺氨苯砜钠和噻唑砜；和
其它如氯福克酚、海克西定、乌洛托品、乌洛托品脱水亚甲基柠檬酸、马尿酸乌洛托品、扁桃酸乌洛托品、次水杨酸乌洛托品、硝羟喹啉和希波酚；
抗胆碱能类，如盐酸阿地芬宁、阿尔维林、Ambutonomium Bromide、地美戊胺、阿米西群、磷酸安普洛托品、甲溴辛托品、阿朴阿托品、阿托品、氧化阿托品、贝那替秦、苯醇酸胺乙酯、苄替米特、苯咯溴铵、甲磺酸苄托品、甲硫贝弗宁、比哌立登、布托溴铵、N-丁基莨菪溴化铵、布卓(Buzepide)、胺苯戊酯、盐酸咳美芬、氯苄沙明、氯苯沙明、西托溴铵、溴奎环二苯酯、环戊君、碘化环宁、盐酸赛克立明、地普托品、右苄替米特、硫酸地布托林、盐酸双环胺、二乙嗪、双苯美林、双己维林、甲硫酸二苯甲哌、N-(1，2-二苯乙基)烟酰胺、双哌维林、地泊溴铵、依美溴铵、溴甲桥苯齐林、普罗吩胺、乙苄托品、乙苄海明、依托多林、尤卡托品、苯维溴铵、芬托溴铵、氟托溴铵、格隆溴铵、海特溴铵、甲硫己环铵(Hexocyclium Methyl Sulfate)、后马托品、莨菪碱、异丙托溴铵、异丙酰铵、阿托甲品、甲氯沙明、溴美喷酯、甲卡拉芬、溴甲胺太林、甲哌噻吨、甲溴东莨菪碱、辛戊胺、氯化奥昔布宁、羟苄利明、奥芬溴铵、戊哌立特、喷噻溴铵、芬卡米特、芬格鲁胺、溴哌喷酯、哌立度酯、哌苯乙醇、甲硫泊尔定、普立地诺、吡芬溴铵、丙环定、溴丙胺太林、环苯哌酯、丙吡咯吗嗪、东莨菪碱、氧化东莨菪碱、芪碘锭、曼陀罗、舒托泊铵、噻昔诺(Thihexinol)、双苯乙硫酯、替莫碘胺、噻哌溴铵、替喹溴胺、曲地碘铵、盐酸苯海索、二苯乙酸莨菪酯、齐酸甲氧托品、托吡卡胺、曲司氯铵、戊沙溴铵和珍托溴铵；
抗惊厥药物，如乙酰苯丁脲、阿布妥因、阿洛双酮、氨鲁米特、4-氨基-3-羟丁酸、苯乳胺、贝克拉胺、布拉氨酯、溴化钙、卡马西平、桂溴胺、氯美噻唑、氯硝西泮、癸氧酰胺、地沙双酮、二甲双酮、去氧苯妥英、依特比妥、依沙双酮、乙琥胺、乙苯妥英、氟苯乙砜、加巴喷丁、5-羟色氨酸、拉莫三嗪、Lomactil、溴化镁、硫酸镁、美芬妥英、甲苯比妥、美沙比妥、1-甲基苯乙妥因、甲琥胺、5-甲基-5-(3-菲基)海因、3-甲基-5-苯基海因、那可比妥、尼美西泮、硝西泮、甲乙双酮、苯乙酰脲、非沙比妥、苯丁酰脲、苯巴比妥、苯巴比妥钠、苯琥胺、苯甲比妥、苯妥英、苯噻妥英钠、溴化钾、吉美前列素、扑米酮、卤加比、溴化钠、丙戊酸钠、茄属、溴化锶、琥氯非尼、舒噻美、替群妥英、噻加宾、三甲双酮、丙戊酸、丙戊酰胺、氨己烯酸和唑尼沙胺；
抗抑郁药，包括：双环类，如苯奈达林、卡罗沙酮、西酞普兰、二甲沙生、吲达品、芬咖明、马来酸氟伏沙明、盐酸茚洛秦、奈福泮、诺米芬辛、羟色氨酸、奥昔哌汀、帕罗西汀、舍曲林、胺苯硫卓酮、曲唑酮、文拉法辛和氯苯吡卓；
酰肼类/肼类，如苯酰甲苄肼、异丙氯肼、异丙烟肼、异卡波肼、尼亚拉胺、奥他莫辛和苯乙肼；
吡咯酮类，如可替宁、罗利普令和咯利普兰；
四环类，如马普替林、美曲吲哚、米安色林和羟丙替林；
三环类，如阿地唑仑、阿米替林、氧阿米替林、阿莫沙平、布替林、氯米帕明、地美替林、地昔帕明、二苯西平、Dimetracrine、二苯噻庚英、多塞平、三氟丙嗪、丙米嗪、N-氧化丙米嗪、伊普吲哚、洛非帕明、美利曲辛、美他帕明、去甲替林、肟替林、奥匹哌醇、苯噻啶、丙吡西平、普罗替林、奎纽帕明、噻奈普汀和曲米帕明；和
其它的如阿屈非尼、贝那替秦、丁氨苯丙酮、布他西丁、地阿诺、醋谷地阿诺、醋氨苯酸地阿诺、地奥沙屈、依托哌酮、非巴氨酯、非莫西汀、芬戊二醇、氟西汀、氟伏沙明、血卟啉、Hypercinin、左芬氟拉明、美地沙明、米那普令、吗氯贝胺、奥沙氟生、吡贝拉林、普罗林坦、吡琥胺酯、氯化铷、舒必利、舒托必利、替尼沙秦、托扎啉酮、托芬那辛、托洛沙酮、反苯环丙胺、L-色氨酸、维洛沙秦和齐美定；
抗糖尿病药，包括：双胍类如丁福明、二甲双胍和苯乙双胍；
激素，如高血糖素、胰岛素、胰岛素注射液、胰岛素锌悬浮液、低精蛋白胰岛素注射液、精蛋白锌胰岛素悬浮液和结晶胰岛素锌；
磺酰脲衍生物，如醋酸己脲、1-丁基-3-间氨基苯磺酰脲、氨磺丁脲、氯磺丙脲、格列波脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列派特、格列本脲、格列噻唑、格列丁唑、格列己脲、格列嘧啶钠、格列平脲、苯磺丁脲、妥拉磺脲、甲苯磺丁脲和甲磺环己脲；和
其它的如阿卡波糖、丙酮二酸钙和米格列醇；
止泻药物，如乙酰鞣酸、鞣酸白蛋白、氨磺苯丙酮、水杨酸铝-碱、西阿尼醇、地芬诺辛、地芬诺酯、利达脒、洛哌丁胺、甲铋喹、延龄草属和乌沙苷；
抗利尿药，如去氨加压素、苯赖加压素、赖氨加压素、鸟氨加压素、羟辛可芬、垂体后叶素、特利加压素和加压素；
抗雌激素药，如醋酸地马孕酮、乙胺氧三苯醇、他莫昔芬和托瑞米芬；
抗真菌药物(抗生素)，包括：多烯类化合物、如两性霉素B、克念菌素、制皮菌素、非律平、制霉色基素、曲古霉素、哈霉素、鲁斯霉素、美帕曲星、那他霉素、制霉菌素、培西洛星和真菌霉素；和其它的如氮丝氨酸、灰黄霉素、寡霉素、十一烯酸新霉素、吡咯尼群、西卡宁、杀结核菌素和绿毛菌素；
抗真菌药物(合成的)，包括：丙烯胺类，如萘替芬和特比萘芬；
咪唑类，如联苯苄唑、布康唑、氯登妥因、氯米达唑、氯康唑、克霉唑、益康唑、恩康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、硝酸盐、硫康唑和噻康唑；
三唑类，如氟康唑、伊曲康唑和特康唑；和
其它的如吖啶琐辛、阿莫罗芬、苯柳胺酯、溴柳氯苯胺、丁氯柳胺、丙酸钙、Chlophenesin、环吡酮、氯羟喹、科帕腊芬内特、地马唑、卡匹帕明、依沙酰胺、氟胞嘧啶、胺氯苯噻唑、海克替啶、氯氟卡班、硝呋太尔、碘化钾、丙酸、巯氧吡啶、水杨苯胺、丙酸钠、舒苯汀、替诺尼唑、托西拉酯、托林达酯、托萘酯、3′，4′，5′，5，7-五羟黄酮、苄硫噻二嗪乙酸、十一碳烯酸和丙酸锌；
抗青光眼药物，如乙酰唑胺、苯呋洛尔、倍他洛尔、布拉洛尔、卡替洛尔、达哌唑、二氯磺胺、地匹福林、肾上腺素、左布诺洛尔、醋甲唑胺、美替洛尔、毛果芸香碱、吲哚洛尔和噻吗洛尔；
抗促性腺激素，如达那唑、孕三烯酮和对羟苯丙酮；
抗痛风药物，如别嘌醇、卡洛芬、秋水仙碱、丙磺舒和磺吡酮；
抗组胺类，包括：烃基胺衍生物如阿伐斯汀、巴米品、溴苯那敏、氯苯那敏、二甲茚定、异丙辛胺、非尼拉敏、吡咯他敏、噻苯哌胺、托普帕敏和曲普利啶；
氨基烃基醚类，如氨醇醋茶碱、溴苯醇胺、卡比沙明、氯马斯汀、二苯吡拉啉(Diphenlypyraline)、多西拉敏、Embrammine、甲氧拉敏、Mephenphydramine、对甲苯海明、奥芬那君、苯托沙敏、哌海茶碱和司他斯汀；
乙二胺衍生物，如阿洛拉胺、对溴苄吡二胺、氯吡拉敏、氯噻吡二胺、希司咯定、美沙喃林、美沙芬林、美沙吡林、芬苯扎胺、美吡拉敏、他拉斯汀、西尼二胺、盐酸松齐拉敏、曲吡那敏和佐拉敏；
哌嗪类，如西替利嗪、氯环力嗪、桂利嗪、氯西尼嗪和羟嗪；
三环类，包括：吩噻嗪类、如二甲氨乙酰吩噻嗪、乙异丁嗪、芬乙嗪、N-氯化羟甲异丙嗪、异丙美沙嗪、美喹他嗪、异丙嗪、帕拉塞嗪和甲磺异丙嗪；和
其它的如阿扎他定、氯苯西泮、赛庚啶、地普托品、异西喷地、氯雷他定和丙硫喷地；和
其它的抗组胺类，如安他唑啉、阿司咪唑、氮卓斯汀、西托肟、克立咪唑、氯苯托品、二苯唑啉、苯海拉明、丙酸氟替卡松、美海洛林(Mebhydroline)、苯茚胺、特酚伪麻片和曲托喹啉；
抗高脂蛋白药，包括：芳氧基链烷酸衍生物，如苄氯贝特(Beclorbrate)、苯扎贝特(Bazafibrate)、比尼贝特、环丙贝特、克利贝特、氯贝丁酯、氯贝酸、依托贝特(Etonfibrate)、非诺贝特、吉非贝齐、尼可贝特、吡贝特、氯烟贝特、双贝特和益多酯；
胆汁酸螯合剂类，如考来烯胺树脂、考来替泊和降胆葡胺；
HMG CoA还原酶抑制剂，如氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀钠和辛伐他汀；
烟酸衍生物烟酰胺铝、阿昔莫司、戊四烟酯、尼可氯酯、尼可莫尔和氧烟酸；
甲状腺激素及类似物，如依塞罗酯、甲状丙酸和甲状腺素；和
其它的如，阿昔呋喃、阿扎胆醇、苯氟雷司、β-亚苄基丁酰胺(β-Benzalbutyramide)、卡尼汀、硫酸软骨素、氯雌酮甲醚、Detaxtran、葡聚糖硫酸钠、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸、香茹嘌呤、夫拉扎勃(Furazbol)、美格鲁托、甲亚油酰胺、双甲雌三醇、鸟氨酸、γ-谷维素、泛硫乙胺、四乙酸季戊四醇酯、α-苯基丁酰胺、吡扎地尔、普罗布考、α-谷甾醇、磺托酸、哌嗪盐、硫地醇、曲帕拉醇和联苯丁酸；
抗高血压药，包括：芳基乙醇胺衍生物，如氨磺洛尔、丁呋洛尔、地来洛尔、拉贝洛尔、丙萘洛尔、索他洛尔和硫氧洛尔；
芳基氧丙醇胺衍生物，如醋丁洛尔、阿普洛尔、阿罗洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、贝凡洛尔、比索洛尔、波吲洛尔、布尼洛尔、布拉洛尔、丁非洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔(Cartezolol)、卡维地洛、塞利洛尔、塞他洛尔、依泮洛尔、茚诺洛尔、甲吲洛尔、美替洛尔、美托洛尔、莫普洛尔、纳多洛尔、尼普地罗、氧烯洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、他林洛尔、Tetraolol、噻吗洛尔和托利洛尔；
苯噻二嗪衍生物，如阿尔噻嗪、苄氟噻嗪、苄噻嗪、苄氢氯噻嗪、布噻嗪、氯噻嗪、氯噻酮、环戊噻嗪、环噻嗪、二氮嗪、依匹噻嗪、乙噻嗪、芬喹唑、氢氯噻嗪、氢氟噻嗪、甲氯噻嗪、美替克仑、美托拉宗、对氟噻嗪、泊利噻嗪、四氯噻嗪和三氯噻嗪；
N-羧基烃基(肽/内酰胺)衍生物，如阿拉普利、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、赖诺普利、莫维普利、培哚普利、喹那普利和雷米普利；
二氢吡啶衍生物，如氨氯地平、非洛地平、伊拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼索地平和尼群地平(Nitrendipirne)；
胍衍生物，如倍他尼定、异喹胍、胍那苄、胍那克林、胍那决尔、胍那佐定、胍乙啶、胍法辛、胍氯酚、胍诺沙苄和胍生；
肼和酞嗪，如布屈嗪、卡屈嗪、双肼屈嗪、恩屈嗪、肼卡巴嗪、肼屈嗪、苯异丙肼、匹尔屈嗪和托屈嗪；
咪唑衍生物，如可乐定、洛非西定、酚妥拉明、甲基磺酸酚妥拉明、噻美尼定和托洛尼定；
季铵类化合物氮戊溴铵、氯化氯异吲哚铵、六甲铵、喷他双(硫酸甲酯)铵(Pentacynium Bis(methyl sulfate)、五甲溴铵、酒石酸潘托铵、氯非那托品(Phenactopinium Chloride)和Trimethidiunum methosulfate；
喹唑啉衍生物，如阿夫唑嗪、布那唑嗪、多沙唑嗪、哌唑嗪、特拉唑嗪和曲马唑嗪；
利舍平衍生物，如比他舍平、地舍平、瑞西那明、利舍平和昔洛舍平；
磺胺衍生物，如安布赛特、氯帕胺、呋塞米、吲达帕胺、喹乙宗、曲帕胺和希帕胺；和
其它的如阿义马林、γ-氨丁酸、丁苯碘胺、坎地沙坦、氯噻酮、西氯他宁、环西多明、鞣酸绿藜安、依普罗沙坦、非诺多泮、氟司喹南、吲哚拉明、厄贝沙坦、酮色林、氯沙坦、美布氨酯(Metbutamate)、美卡拉明、甲基多巴、甲基4-吡啶基酮氨硫脲(Thiosemicarbarzone)、美托拉宗、米诺地尔、莫唑胺、帕吉林、潘必啶、吡那地尔、哌罗克生、普立哌隆、原黎芦碱、萝巴新、瑞西美托、利美尼定、沙拉新、硝普钠、替尼酸、咪噻芬、酪氨酸酶、乌拉地尔和缬沙坦；
抗甲状腺机能亢进药物，如2-氨基-4-甲基噻唑、2-氨噻唑、卡比马唑、3，5-二溴-L-酪氨酸、3，5-双碘酪氨酸、Hinderin、碘、碘硫尿嘧啶、甲巯咪唑、甲硫氧嘧啶、丙硫氧嘧啶、高氯酸钠、硫苯唑林、硫巴比妥和2-硫脲嘧啶；
抗低血压药，如甲硫酸氨甲氧苯嗪、增血压素、二甲福林、多巴胺、双苯次甲丁胺、依替福林、吉培福林、间羟胺、米多君、去甲肾上腺素、Pholedrinead和昔奈福林；
抗甲状腺机能减退药物，如左甲状腺素钠、碘塞罗宁、甲状腺粉、甲状腺浸膏、甲状腺素、替拉曲考和TSH；
抗炎(非类固醇类的)药物，包括：氨基芳基羧酸衍生物、如苯乙氨茴酸、依托芬那酯、氟芬那酸、异尼辛、甲氯芬那酸、甲灭酸(Mefanamic Acid)、尼氟酸、他尼氟酯、特罗芬那酯和托芬那酸；
芳基乙酸衍生物，如阿西美辛、阿氯芬酸、氨芬酸、丁苯羟酸、桂美辛、氯吡酸、双氯酚酸钠、依托度酸、联苯乙酸、芬氯酸、苯克洛酸、芬克洛酸、芬替酸、葡美辛、异丁芬酸、吲哚美新、三苯唑酸、伊索克酸、氯那唑酸、甲嗪酸、奥沙美辛(Oxametacine)、丙谷美辛、舒林酸、噻拉米特、托美丁和佐美酸；
芳基丁酸衍生物，如丁丙二苯肼、布替布芬、芬布芬和联苯丁酸；
芳基羧酸衍生物，如环氯茚酸、酮咯酸和替诺立定；
芳基丙酸衍生物，如阿明洛芬、苯噁洛芬、布氯酸、卡洛芬、非诺洛芬、氟诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、异丁普生、吲哚洛芬、酮洛芬、洛索洛芬、咪洛芬、萘普生、奥沙普秦、吡酮洛芬、吡洛芬、普拉洛芬、丙替嗪酸、舒洛芬和噻洛芬酸；
吡唑类，如二苯米唑和依匹唑；
吡唑酮类，如阿扎丙宗、苄哌吡酮、非普拉宗、莫非布宗、吗拉宗、羟布宗、保泰松、哌布宗、异丙安替比林、雷米那酮、琥布宗和Thiazolinobutazone；
水杨酸衍生物，如醋氨沙洛、阿司匹林、贝诺酯、溴水杨醇、乙酰水杨酸钙、二氟尼柳、依特柳酯、芬度柳、龙胆酸、水杨酸羟乙酯、水杨酸咪唑、赖氨酸乙酰水杨酸、美沙拉秦、水杨吗啉、1-水杨酸萘酯(NarhthylSalicylate)、奥沙拉秦、帕沙米特、乙酰水杨酸苯酯、水杨酸苯酯、醋水杨胺、水杨胺O-乙酸、水杨酰硫酸酯、双水杨酯和柳氮磺吡啶；
噻嗪氨甲酰(Thiazinecarboxamide)，如屈噁昔康、伊索昔康、吡罗昔康和替诺昔康；和
其它的如ε-乙酰氨基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟丁酸、阿米西群、苄达酸、苄达明、布可隆、联苯吡胺、地他唑、依莫法宗、愈创蓝油烃、萘丁美酮、尼美舒利、奥古蛋白、奥沙西罗、瑞尼托林、哌立索唑、哌福肟、普罗喹宗、普罗沙唑和替尼达普；
抗疟药，如醋氨苯砜、酚喹、蒿甲醚(arteether)、蒿甲醚(artemether)、青蒿素、青蒿琥酯、比比林、小檗碱、印度当药、氯胍、氯喹、氯丙胍、金鸡纳霜、金鸡纳定、金鸡纳宁、恩波环氯胍、龙胆苦苷、卤泛群、羟氯喹、盐酸甲氟喹、3-甲醋氨苯胂、帕马喹、甲氧胺喹、伯氨喹、乙胺嘧啶、米帕林、奎宁、重硫酸奎宁、碳酸奎宁、二氢溴酸奎宁、二盐酸奎宁、碳酸乙酯奎宁、甲酸奎宁、葡萄糖酸奎宁、氢碘酸奎宁、盐酸奎宁、水杨酸奎宁、硫酸奎宁、鞣酸奎宁、盐酸奎宁脲、喹西特、氮萘和辉绿质砷酸钠；
抗偏头痛药，如阿吡必利、二氢麦角胺、依来曲普坦、麦角柯碱、麦角异柯宁碱、麦角克列满汀碱、麦角、麦角胺、醋酸氟美烯酮、二甲替嗪、麦角乙脲、美西麦角、那拉曲坦、奥昔托隆、苯噻啶、利扎曲普坦和舒马普坦；
止恶心药，如乙酰亮氨酸单乙醇胺、阿立必利、苯喹胺、氨醇醋茶碱、溴必利、布克力嗪、氯丙嗪、氯波必利、赛克力嗪、茶苯海明、地芬尼多(Dipheniodol)、多潘立酮、格拉司琼、美克洛嗪、Methalltal、甲氧氯普胺、美托哌丙嗪、大麻隆、昂丹司琼(Ondansteron)、奥昔喷地、匹哌马嗪、哌海茶碱、丙氯拉嗪、东莨菪碱、四氢大麻酚、硫乙拉嗪、硫丙拉嗪(Thioproperzaine)和曲美苄胺；
抗肿瘤药，包括：烷化试剂、如烃基磺酸酯、如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；
氮丙啶类，如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派；
乙亚胺类和甲基蜜胺类，如六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、噻替派和三羟甲基三聚氰胺(Trimethylolomelamine)；
氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷氮芥(Chclophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；
亚硝脲类，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；和其它的如喜树碱、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇和哌泊溴烷；
抗生素，如阿克拉霉素、放线菌素F1、氨茴霉素、偶氮丝氨酸、争光霉素、放线菌素C、卡柔比星、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、6-重氮基-5-氧基-L-原亮氨酸、多柔比星、表柔比星、丝裂霉素类、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、普卡霉素、泊非霉素、嘌罗霉素、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；
抗代谢物，包括：叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤和三甲曲沙；
嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟苷；和
嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟脲嘧啶脱氧核苷、氟尿嘧啶(Fluroouracil)和替加氟；
酶，如门冬酰胺酶；和
其它的如醋葡醛内酯、安吖啶、阿莫司汀(Bestrabucil)、比生群、苔藓抑素、卡铂、顺铂、地磷酰胺、秋水仙胺、地吖醌、Elfornithine、依利醋铵、依托格鲁、依托泊苷、硝酸镓、羟基脲、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、白介素-2、香菇多糖、来曲唑、氯尼达明、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、鬼臼酸(Podophyllinicc Acid)、2-乙酰肼、聚硝基立方烷、丙卡巴肼、PSK7、雷佐生、西佐喃、锗螺胺、紫杉酚、替尼泊苷、细格孢氮杂酸、三亚胺醌、2，2′，2″-三氯三乙胺、乌拉坦、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨；
抗肿瘤(激素的)药物，包括：雄激素，如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酪；
抗肾上腺素类，如氨鲁米特、米托坦和曲洛司坦；
抗雄激素物质，如氟他胺和尼鲁米特；和抗雌激素药，如他莫昔芬和托瑞米芬；
抗肿瘤药助剂，包括叶酸补充液，如亚叶酸(Frolinic Acid)；
抗震颤麻痹药，如金刚烷胺、苄丝肼、氨醇醋茶碱、比哌立登、溴隐亭、布地品、卡麦角林、卡比多巴、司来吉兰(a/k/a L-塞利吉林、L-deprenil、L-司来吉兰和司来吉兰)、右苄替米特、二乙嗪、苯海拉明、屈昔多巴、普罗吩胺、乙苄海明、左旋多巴、那高利特、培高利特、吡咯庚汀、普拉克索、普立地诺、普罗地平、喹吡罗、瑞马西胺、罗匹尼罗、特麦角脲、惕各假托品和盐酸苯海索；
抗嗜铬细胞瘤药物，如甲酪氨酸、酚苄明和酚妥拉明；
抗肺囊虫药物，如依洛尼塞(Effornithine)、喷他脒和磺胺甲噁唑；
抗前列腺肥大药物，如己酸孕诺酮、美帕曲星、奥生多龙和保列治7；
抗原生动物药物(Leshmania)，如葡萄糖酸锑钠、乙睇胺、羟芪巴脒、醋碘苯酸、N-泛影葡胺、喷他脒、二脒草替和脲锑胺；
抗原生动物药(毛滴虫属)，如乙酰胂胺、醋胺硝唑、茴香霉素、阿扎硝唑、福米硝唑、呋喃唑酮、曲古霉素、月桂胍、美帕曲星、双唑泰栓、硝呋太尔、硝呋醛肟、尼莫唑、塞克硝唑、苦味酸银、替诺尼唑和替硝唑；
抗原生动物药(锥虫)，如苄硝唑、依氟鸟氨酸、美拉胂醇、硝呋替莫、氧芬胂、盐酸化物、喷他脒、普罗帕脒、嘌罗霉素、喹匹拉明、二脒草替、舒拉明钠、锥虫红和锥虫胂胺；
抗紫癜药物，如樟脑、赛庚啶、二氯松、甘氨酸、卤米松、3-羟基樟脑、薄荷脑、二甲基硫蒽、甲地嗪、苯酚、聚乙二醇单十二醚、利索卡因、樟脑醑、噻苯哌胺、托普帕敏和阿利马嗪；
抗银屑病药物，如阿维A、水杨酸铵、地蒽酚、6-氮尿苷、佛手柑脑、柯桠素、阿维A酯和焦棓酚；
抗精神病药物，包括：丁酰苯、如苯哌利多、溴哌利多、氟哌利多、氟阿尼酮、氟哌啶醇、美哌隆、莫哌隆、匹泮哌隆、Sniperone、替米哌隆和三氟哌多；
酚噻嗪类，如醋奋乃静、布他哌嗪、丙酰奋乃静、氯丙沙嗪、氯丙嗪、氯螺旋嗪、氰美马嗪、地西拉嗪、氟奋乃静、咪克洛嗪、甲哌啶嗪、美索达嗪、甲氧丙嗪、美托奋乃酯、奥沙氟嗪、培拉嗪、哌氰嗪、哌美他嗪、奋乃静、哌西他嗪、哌泊噻嗪、丙氯拉嗪、丙嗪、磺达嗪、醋酸奋乃静、硫利达嗪、三氟拉嗪和三氟丙嗪；
噻吨类，如氯普噻吨、氯哌噻吨、氟哌噻吨和替沃噻吨；
其它三环类，如苯喹胺、卡匹帕明、氯卡帕明、氯胺丙压吖、氯噻平、氯氮平、奥匹哌醇、丙硫喷地、丁苯那嗪和佐替平；和
其它的如阿立必利、氨磺必利、布拉氨酯、氟司必林、吗茚酮、五氟利多、匹莫齐特、螺立林和舒必利；
解热药，如扑热息痛、醋氨沙洛、乙酰苯胺、乌头原碱、乌头、乌头碱、阿氯芬酸、双(乙酰水杨酸)铝、氨氯苯嗪、氨基比林、阿司匹林、贝诺酯、苄达明、小檗碱、对溴乙酰苯胺、丁苯羟酸、丁丙二苯肼、乙酰水杨酸钙、氯乙苯噁嗪酮、水杨酸胆碱、环氯茚酸、二羟基乙酰水杨酸铝、地匹乙酯、安乃近、依匹唑、依特柳酯、水杨酸咪唑、吲哚美辛、三苯唑酸、对乳酰乙氧苯胺、赖氨酸乙酰水杨酸、乙酰水杨酸镁、甲氯芬那酸、吗拉宗、水杨吗啉、萘普生、尼芬那宗、51-硝基-2′-丙氧基乙酰苯胺(propoxyacetanilide)、非那西丁、苯胺脲、非诺可、非诺吡酮、乙酰水杨酸苯酯、水杨酸苯酯、哌布宗、丙帕他莫、异丙安替比林、雷米那酮、醋水杨胺、柳胺乙酸、水杨酸钠、磺甲比林、粉防己碱和替诺立定；
抗立克次体药，如对氨苯甲酸、氯霉素、无味氯霉素、氯霉素泛酸酯和四环素；
抗皮脂溢剂，如二氯羟喹、3-O-二乙酸月桂酰基吡哆醇、吡罗克酮、巯氧吡啶、间苯二酚、硫化硒和噻克索酮；
防腐剂，包括：胍如阿来西定、安巴腙、氯己定和哌氯定；
卤素和卤素化合物，如碘氧化铋、碘式没食子酸碘铋、三溴酚铋、冰片基氯、碘酸钙、含氯石灰、氯氟苯脲、Flurosalan、碘酸、碘、一氯化碘、三氯化碘、碘仿、四碘乌洛托品、奥昔氯生、聚维酮碘、次氯酸钠、碘酸钠、氯氧三嗪、麝酚碘、三氯卡班、三氯生和曲氯新钾；
汞化合物，如水泻剂、汞林钠、汞溴红、氯化汞、氯化汞(加氨的)、对苯酚磺酸钠汞、丁二酰亚胺汞、硫化汞、巴拿马红、羟汞硝酚钠、醋酸亚汞、氯化亚汞、碘化亚汞、硝甲酚汞、四碘汞(II)钾、三碘汞钾液、硫汞苯磺钠和硫柳汞；
硝基呋喃类，如呋喃唑酮、2-(甲氧甲基)-5-硝基呋喃、尼屈昔腙、硝呋醛肟、硝呋肼和硝基哌唑嗪；
酚类，如醋辛酚汞、硫氯酚、水杨酸镉、香芹酚、氯二甲酚、氯苄酚、杂酚油(cresote)、甲酚、对甲酚、芬替克洛、六氯酚、1-萘基水杨酸盐、2-萘基水杨酸、2，4，6-三溴-间甲酚和3′，4′，5′-三氯柳苯胺；
喹啉类，如氨喹脲、苯甲酰喹、溴羟喹啉、二氯羟喹、氯喹那多、氯羟喹、乙氢去甲奎宁、尤普罗辛、哈喹诺、白毛莨碱、8-羟基喹啉、8-羟基喹啉硫酸酯和碘氯代羟基喹啉；和
其它的如醋酸铝溶液、次醋酸铝溶液、硫酸铝、3-氨基-4-羟丁酸、硼酸、氯己定、氯阿唑丁、间醋酸甲酚酯、硫酸铜、双溴丙脒、鱼石脂、间甲酚磺酸-甲醛缩聚物7、诺昔硫脲、奥硝唑、β-丙内酯、α-萜品醇；
镇痉剂，如阿利苯多、氨布醋胺、氨丙嗪、阿朴阿托品、甲硫贝弗宁、比坦维林、布他维林、布托溴铵、N-丁基莨菪溴化铵、卡罗维林、西托溴铵、桂美君、氯波必利、毒芹碱氢溴化物、毒芹碱盐酸化物、碘化环宁、双苯美林、地索普明、吗苯丁酯、地泊溴铵、六氢芬宁、依美溴铵、依沙维林、非克立明、非那拉胺、非诺维林、芬哌丙烷、苯维溴铵、芬托溴铵、黄酮哌酯、夫洛丙酮、葡糖酸、愈创他明、美拉肼、羟甲香豆素、利奥吡咯、美贝维林、莫沙维林、萘维林、辛戊胺、奥他维林、戊哌立特、Phenamacidehydrochloride、间苯三酚、匹维溴铵、哌苯乙醇、盐酸哌泊索仑、普拉维林、吡芬溴铵、丙哌利定、普鲁匹凡(Propivane)、丙吡咯吗嗪、普罗扎平、消旋非明、罗西维林、解痉醚、芪碘锭、舒托泊铵、替莫碘胺、替喹溴胺、苯酰胺桂胺、曲匹布通、3-甲色酮、车轴草属、曲美布汀、N，N-三甲基-3，3-二苯-丙胺、齐酸甲氧托品、曲司氯铵和珍托溴铵；
抗血栓药，如阿那格雷、阿加曲班、西洛他唑、大黄酚苷、达曲班、去纤苷、伊诺肝素、速碧林7、吲哚布芬、Lamoparan、奥扎格雷、吡考他胺、普拉贝脲、瑞维肝素、替德肝素、噻氯匹定、三氟柳和华法林；
镇咳药，如阿洛拉胺、阿米西酮、苯丙哌林、苯佐那酯、比苯溴铵、三溴甲烷、布他米酯、苯丁胺乙酯、乙二磺酸咳美芬、咳必清、止咳能、氯丁替诺、氯哌斯汀、可待因、溴甲可待因、氧化可待因、磷酸可待因、硫酸可待因、环沙酮、右美沙芬、双丁萘磺钠、双氢可待因、醋氢可待酮、二甲啡烷、地美索酯、α，α-二苯-2-哌啶丙醇、羟丙哌嗪、羟蒂巴酚、依普拉酮、地布酸乙酯、乙基吗啡、福米诺苯、Guiaiapate、氢可酮、异米尼尔、左丙氧芬、吗氯酮、那碎因、去甲美沙酮、那可丁、奥昔拉定、奥索拉明、福尔可定、匹考哌林、哔哌氮嗪酯、乙哌双酮、盐酸普诺地嗪、消旋甲啡烷、盐酸他齐普酮、替培啶和齐培丙醇；
抗溃疡药，如乙酰谷酰胺铝络合物、ε-乙醚氨基己酸锌盐、Acetoxolone、阿巴前列素、盐酸苄萘酸酯、次柠檬酸铋溶胶(干燥的)、甘珀酸、西曲酸酯、西咪替丁、恩前列素、艾沙拉唑、法莫替丁、二甲酞酸、吉法酯、愈创蓝油烃、伊索拉定、米索前列醇、尼扎替丁、奥美拉唑、奥诺前列素、γ-谷维素、哌法宁、哌仑西平、普劳诺托、雷尼替丁、利奥前列素、罗沙前列醇、罗曲酸、乙酸罗沙替丁、索法酮、螺佐呋酮、硫糖铝、替普瑞酮、曲莫前列素、Thrithiozine、曲昔派特和佐利米定；
抗尿结石药，如醋羟胺酸、别嘌醇、枸橼酸钾和琥珀酰亚胺；
抗蛇毒素，如更生霉素7抗蛇毒素；
抗病毒药物，包括：嘌呤类和嘧啶类，如无环鸟苷、阿糖胞苷、双脱氧腺苷、双脱氧胞苷、双去氧肌苷、依度尿苷、氟脲嘧啶脱氧核苷、更昔洛韦、碘苷、异丙肌苷、MADU、喷昔洛韦、曲氟尿苷、阿糖腺苷(Vidrarbine)和齐多夫定；和
其它的如乙酰亮氨酸单乙醇胺、金刚烷胺、粘病毒霉素、己可可碱-烟酸复合剂、枯茗醛、结核安、磷卡萘钠、咪喹莫特、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、乙氧丁酮醛、溶菌酶、甲吲噻踪、吗啉胍、鬼臼毒素、利巴韦林、金刚乙胺、司他霉素、匍枝青霉菌素、曲金刚胺、珍那佐酸和抗流行性感冒药物扎那米韦和磷酸奥塞米韦；
抗焦虑药，包括：芳基哌嗪类化合物、如丁螺环酮、吉哌隆、伊沙匹隆和坦度螺酮(Tondospirone)；
苯二氮衍生物，如阿普唑仑、溴西泮、卡马西泮、氯氮卓、氯巴占、氯卓酸钾、氯噻西泮(Chotiazepam)、氯噁唑仑、地西泮、氯氟卓乙酯、依替唑仑、氟地西泮(Fluidazepam)、氟他唑仑、氟托西泮、哈拉西泮、凯他唑仑、劳拉西泮、洛沙平、美达西泮、美他西泮、美沙唑仑、去甲西泮、奥沙西泮、奥沙唑仑、匹那西泮、普拉西泮和托非索泮；
氨基甲酸酯类，如环拉氨酯、依米氨酯、奥芬氨酯、甲丙氨酯、苯丙氨和泰巴氨酯；和
其它的如阿吡坦、苯佐他明、卡普托胺、氯美扎酮、依替福辛、氟辛克生、氟苯乙砜、谷氨酸、羟嗪、来索吡琼、甲氯醛脲、美芬诺酮、米氮平(Mirtazepine)、奥沙那胺、非那二醇、舒立克隆和扎托司琼；
苯二氮拮抗药，如氟马西尼；
支气管扩张剂，包括：麻黄碱衍生物，如沙丁胺醇、班布特罗、比托特罗、卡布特罗、克仑特罗、氯丙那林、双羟乙麻黄碱、麻黄碱、肾上腺素(Epiniphrine)、依普罗醇、乙非君、乙基去甲肾上腺素、非诺特罗、海索那林、乙基异丙肾上腺素、异丙肾上腺素、马布特罗、奥西那林、N-甲麻黄碱、吡布特罗、丙卡特罗、普罗托醇、瑞普特罗、利米特罗、沙美特罗、索特瑞醇、特布他林和妥洛特罗；
季铵化合物，如甲硫贝弗宁、Clutropium Bromide、异丙托溴铵和氧托溴铵；
黄嘌呤衍生物，如，茶碱(acefylline)、哌醋茶碱、安布茶碱、氨茶碱、巴米茶碱、胆茶碱、多索茶碱、二羟丙茶碱、恩丙茶碱、二乙氨乙茶碱、乙羟茶碱、愈创茶碱、羟丙茶碱、可可碱、1-可可碱乙酸和胆茶碱(theophylline)；和
其它的如芬司匹利、美地巴嗪、孟鲁司特、Methoxyphenanime、曲托喹酚和扎鲁司特；
钙通道阻断剂，如：芳基烃基胺、如苄普地尔、地尔硫卓、芬地林、戈洛帕米(Gallopanil)、普尼拉明、特罗地林和维拉帕米；
二氢吡啶衍生物，如非洛地平、伊拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平和尼群地平；
哌嗪衍生物，如桂利嗪、氟桂利嗪和利多氟嗪；和
其它的，如苄环烷、依他苯酮和哌克昔林；
钙调节剂，如骨化二醇、降钙素、骨化三醇、氯甲双磷酸、双氢速甾醇、依降钙素、依替膦酸、依普黄酮、帕米膦酸、甲状旁腺素和醋酸特立帕肽；
强心剂，如Acefylline、乙酰洋地黄毒苷、2-氨基-4-甲基吡啶、氨力农、苯呋地尔琥珀酸酯、布拉地新(Buclasdesine)、黄花夹竹桃次苷B、樟吡他胺、铃兰毒苷、漆麻灵、地诺帕明、去乙酰毛花苷、ditalin、洋地黄、洋地黄毒苷、地高辛、多巴酚丁胺、多巴胺、多培沙明、依诺昔酮、红皮素、非那可明、吉他林、羟基洋地黄毒苷、胍基乙酸、辛胺醇、北美黄莲次碱、异波帕胺、Lanotodises、甲氧酚酰胺、米力农、黄夹次苷B、夹竹桃、毒毛花苷G、奥昔非君、普瑞特罗、海葱次苷、蟾力苏、海葱苷、海葱任宁、毒毛花苷K、硫马唑、可可碱和扎莫特罗；
螯合剂，如去铁胺(Deferozmine)、二硫卡钠、依地酸钙二钠、依地酸二钠、依地酸四钠(Edeate Sodium)、依地酸三钠、青霉胺、喷替酸钙钠、酒石酸对羟福林、二巯丁二酸和曲恩汀；
促胰酶素拮抗剂，如丙谷胺；
胆石溶解剂，如鹅脱氧胆酸、甲基叔丁基醚、单辛精和熊去氧胆酸；
利胆药，如阿利苯多、胆维他、阿嗪米特、胆酸、环丁烯酸、利胆丁酸、环丁酸醇、环香草酮、西那林、去氢胆酸、去氧胆酸、地美罗酸、α-利胆醇、依昔罗酸、非布丙醇(Feguprol)、芬西布醇、非尼戊醇、夫洛梯隆、羟甲香豆素、孟布酮、3-(邻甲氧苯)-2-苯丙烯酸、美托查酮、吗喹酮、柳胺酚、牛胆汁浸膏、4.4′-氧二-2-丁醇、哌普唑林、普罗扎平、4-水杨酰吗啉、辛卡利特、牛胆酸、噻莫西酸、托莰非、舒胆通和香草吗啉；
胆碱能药，如醋克利定、溴化乙酰胆碱、氯化乙酰胆碱、萘二磺乙乳胆铵、苄吡溴铵、氯化氨甲酰甲胆碱、卡巴胆碱、卡普氯铵、地美溴铵、右泛醇、二异丙基对硝苯磷酯、碘化二乙氧膦酰硫胆碱、氯化腾喜龙、依舍立定、糠三甲铵、异氟磷、氯醋甲胆碱、毒蕈碱、新斯的明、奥普碘铵、毒扁豆碱和溴吡斯的明；
乙酰胆碱酯酶抑制剂，如安贝氯铵、溴地斯的明和加兰他敏；
乙酰胆碱酯酶再活化剂，如氯化双复磷(Obidoximine Chloride)和氯解磷定；
中枢神经系统兴奋药和试剂，如阿米庚酸、苯丙氨乙茶碱、苯丙胺苄氰、贝美格、苄非他明、马钱子碱、咖啡因、对氯苯丁胺、氯苯环胺、氯特胺、古柯、磷酸二甲氨乙酯、右奥沙屈、硫酸右旋苯异丙胺、安非拉酮、N-乙基安非他命、香草二乙胺、双苯次甲丁胺、乙色胺、芬坎法明、芬乙茶碱、非诺唑酮(Fenosolone)、三氟乙醚、加兰他敏、己环酸钠、后莫肯芬、马吲哚、Megexamide、去氧麻黄碱、哌甲酯、尼可刹米、匹莫林、戊四氮、苯甲曲秦(Phenidimetrazine)、芬麦特拉辛、芬特明、印防己毒素、哌苯甲醇、普罗林坦和吡咯戊酮；
解充血药，如Amidephrine、咖啡氨醇、环喷他明、麻黄碱、肾上腺素、非诺唑啉、茚唑啉、美替唑啉、萘甲唑林、盐酸异肾上腺素、奥托君、羟甲唑啉、盐酸苯肾上腺素、盐酸苯丙醇胺、苯丙甲胺、丙己君、伪麻黄碱、四氢萘咪唑啉、泰马唑啉和赛洛唑啉；
牙科剂，包括：二膦酸盐(抗牙周病和骨吸收)如阿仑磷酸盐、氯膦酸盐、1-羟基-亚乙基-1，1-二膦酸、氨羟二磷酸二钠和替鲁膦酸；运送预防性的，如精氨酸和氟化钠；
脱敏剂，如硝酸钾和枸橼酸盐、草酸盐；
脱色剂(Depigmentors)，如二氢奎宁、氢醌和莫诺苯宗；
利尿药，包括：有机汞的，如氯汞君、美拉鲁利、汞罗茶碱、硫汞林钠、汞香豆酸、汞香豆林钠、氯化亚汞和汞撒利；
蝶啶类，如呋氨蝶啶和氨苯蝶啶；
嘌呤类，如Acefylline、7-吗啉甲茶碱、帕马溴、丙可可碱和可可碱；
类固醇类，如坎利酮、夹竹桃苷和螺内酯；
磺胺衍生物，如Acetazolmide、安布赛特、阿佐塞米、布美他尼、布他唑胺、氯米非那胺、氯非那胺、氯帕胺、氯索隆、二苯基甲烷-4.4′-二氨苯磺胺、二磺法胺、依索唑胺(Ethbxzolamide)、呋塞米、吲达帕胺、美夫西特、醋甲唑胺、吡咯他尼、喹乙宗、托拉塞米、曲帕胺和希帕胺；
尿嘧啶类，如氨美啶和阿米美；
其它的如阿马诺嗪、阿米洛利、熊果酚苷、氯拉扎尼、依他尼酸、依托唑啉、肼卡巴嗪、异山梨醇、甘露醇、美托查酮、莫唑胺、哌克昔林、替尼酸和尿素；
多巴胺受体激动药，如溴隐亭、多培沙明、非诺多泮、异波帕胺、麦角乙脲、那高利特和培高利特；
杀体外寄生虫药，如阿米曲士、苯甲酸苄酯、甲萘威、克罗米通、DDT、二黄原酸、异龙脑酯硫氰乙酸酯-技术级的(technical)、含硫石灰溶液、林旦、马拉硫磷、油酸汞、二甲基硫蒽和硫黄-制药级的(pharmaceutical)；
酶，包括：消化酶，如α-淀粉酶(猪胰脏)、酯酶、胰脂肪酶、胃蛋白酶和凝乳酶；
粘液溶解酶，如溶菌酶；
青霉素失活酶，如青霉素酶；和
蛋白水解酶，如胶原酶、糜木瓜酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶；
酶诱导剂(肝脏的)，如氟双苯醇；
雌激素，包括：非类固醇类的雌激素类如苯雌酚、溴底乙苯、氯烯雌醚、己二烯雌酚、己烯雌酚、二丙酸己烯雌酚、甲己烯雌酚、磷雌酚、己烷雌酚、美沙雌酸和美雌酚；和
类固醇类雌激素类，如双醋羟雌酮、轭合的雌激素、去氢马烯雌酮、马烯雌甾酮、雌二醇、苯甲雌二醇、雌二醇17β-环戊丙酸酯、雌三醇、雌酮、乙炔雌二醇、美雌醇、莫克雌醇、双甲雌三醇、雌三醇环戊醚和炔雌醚；
胃分泌抑制剂，如肠抑胃素和奥曲肽；
糖皮质激素类，如21-乙酸孕烯醇酮、阿氯米松(Aalclometasone)、阿尔孕酮、安西奈德(Amicinonide)、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯泼尼松、氯倍他索、Blovetasone、氯可托龙、氯泼尼醇、皮质甾酮、可的松、可的伐唑、地夫可特、地奈德、去羟米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龙、二氟泼尼酯、甘草次酸、氟扎可特、氟二氯松、二氟美松(Flumehtasone)、氟尼缩松、氟轻松丙酮、醋酸氟轻松、氟考丁酯、氟可龙、氟米龙、醋酸甲氟龙、醋酸氟甲叉龙、氟泼尼龙、氟羟可舒松、福莫可他、哈西奈德、卤米松、醋酸卤泼尼松、氢可他酯、氢化可的松、醋酸氢化可的松、磷酸氢化可的松(ydrocortisone Phosphate)、氢化可的松21-琥珀酸钠、叔丁醋酸氢化可的松、马泼尼酮、甲羟松、甲泼尼松、甲基去氢氢化可的松、莫米松糠酸酯、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、泼尼松龙21-二乙氨基乙酯、泼尼松龙磷酸钠、泼尼松龙琥珀酸钠、泼尼松龙21-间磺苯甲酸钠、泼尼松龙21-硬脂酰乙醇酸酯、泼尼松龙叔丁乙酯、泼尼松龙21-三乙酸甲酯、泼尼松、强的松龙戊酸酯、泼尼立定、泼尼立定21-二乙氨基乙酸酯、替可的松、曲安西龙、羟氢化泼尼松缩丙酮、苯曲安奈德和丙酮缩去炎松己酸酯；
性腺刺激素，如布舍瑞林、氯米芬、环芬尼、表美雌醇、FSH、HCG和LH-RH；
促性腺激素，如LH和PMSG；
生长激素抑制剂，如奥曲肽和生长抑素；
生长激素释放因子，如舍莫瑞林；
生长刺激剂，如生长激素；
溶血剂，如苯肼和盐酸苯肼；
肝素拮抗剂，如海美溴铵和鱼精蛋白；
肝保护剂，如S-腺苷甲硫氨酸、甜菜碱、西阿尼醇、Citolone、马洛替酯、奥拉米特、磷酰胆碱、原卟啉IX、水飞蓟素-组(group)、二硫辛酸和硫普罗宁；
免疫调节剂，如氨普立糖、布西拉明、二硫卡钠、异丙肌苷、干扰素-y、白介素-2、香菇多糖、目罗他新、普拉通宁(Platonin)、丙考达唑、四米唑、胸腺生成素、胸腺喷丁和鸟苯美司；
免疫抑制剂，如硫唑嘌呤、环孢菌素和咪唑立宾；
离子交换树脂，如天青A羧丙烯酸树脂(Carbacrylic Resins)、考来烯胺树脂、考来替泊、降胆葡胺、雷索德克(Resodec)和聚苯乙烯磺酸钠；
泌乳刺激素，如催乳素；
LH-RH激动剂，如布舍瑞林、戈舍瑞林、醋酸亮丙立得、那法瑞林和曲普瑞林；
抗脂肪肝药，如N-乙酰蛋氨酸、氯化胆碱、去氢胆酸胆碱、枸橼酸二氢胆碱、肌醇、卵磷脂和蛋氨酸；
红斑狼疮抑制剂，如氨三乙酸铋钠、碱式水杨酸铋、氯喹和羟氯喹；
盐皮质素类，如醛甾酮、去氧皮质酮、醋酸脱氧皮质酮和氟氢可的松；
缩瞳药，如卡巴胆碱、毒扁豆碱、毛果芸香碱和毛果芸香属；
单胺氧化酶抑制剂，如司来吉兰、异丙氯肼、异丙烟肼、异卡波肼、吗氯贝胺、2-肼辛烷、帕吉林、苯乙肼、苯氧异丙肼、特戊酰苯肼、普罗地平、托洛沙酮和反苯环丙胺；
粘液溶解剂，如乙酰半胱氨酸、溴己新、羧甲司坦、多米奥醇、来托司坦、溶菌酶、盐酸美司坦、美司钠、索布瑞醇、司替罗宁、硫普罗宁和泰洛沙泊；
肌肉松弛药(骨骼肌的)，如氟喹酮、双烯丙毒马钱碱、苯磺阿曲库铵、巴氯芬、苯佐他明、氯化苄醌铵、C-葫芦箭毒碱、卡立普多、氯美扎酮、氯苯甘油氨酯、氯丙沙嗪、Chlozoxazone、箭毒、环拉氨酯、环苯扎林、丹曲林、十烃溴铵、地西泮、乙哌立松、法扎溴铵、氟美吗酮、戈拉碘铵、溴化氨酰胆碱、己芴溴铵、羟乙桂胺、Lauexium Methyl Sulfate、来普达林、美金刚、美芬新、美芬诺酮、美他沙酮、美索巴莫、粉肌松、尼美西泮、奥芬那君、潘库溴铵、苯丙氨酯、非尼拉朵、哌库溴铵、普罗索仑、硫酸奎宁、司替氨酯、溴化琥珀胆碱、氯琥珀胆碱、碘化琥珀胆碱、溴琥乙氧铵、四氢西泮、硫秋水仙苷、替扎尼定、托哌酮、氯筒箭毒碱、维库溴铵和氯苯唑胺(Zoxolamine)；
麻醉药拮抗药，如阿米苯唑、环佐辛、左洛啡烷、辅酶I、纳美芬(Nalmfene)、烯丙吗啡、烯丙吗啡二烟酸酯、纳洛酮和纳曲酮；
神经保护剂，如地佐环平；
益智药，如乙酰谷酰胺、乙酰肉毒碱、茴拉西坦、二苯美仑、依昔苯酮、非哌西特、艾地苯醌、盐酸茚洛秦(Indeloxazune Hydrochloride)、尼唑苯酮、奥拉西坦、吡拉西坦、丙戊茶碱、吡硫醇和他克林；
眼科药物，如15-酮前列腺素；
卵巢激素，如松弛素；
子宫收缩药，如卡前列素、卡古缩宫素、去氨催产素、麦角新碱、吉美前列素、甲基麦角新碱、缩宫素、垂体后叶素(后的)、前列腺素E2、前列腺素F2a和司巴丁；
胃蛋白酶抑制剂、如淀粉硫酸钠；
蠕动兴奋药，如西沙必利；
孕激素类，如烯丙雌醇、阿那孕酮、醋酸氯地孕酮、去氢氯地孕酮、地美孕酮、去氧孕烯、地美炔酮、地屈孕酮、炔孕酮、炔诺醇、醋酸氟羟孕酮、孕二烯酮、己酸孕诺酮、卤孕酮、17-羟基-16-亚甲基-妊娠素、17α-羟孕酮、17α-羟基孕二烯酮己酸酯、利奈孕酮、美屈孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美仑孕酮、炔诺酮、异炔诺酮、诺孕酮、诺孕酯、炔诺孕酮、诺孕烯酮、诺乙烯酮、喷他孕酮、黄体酮、普美孕酮、奎孕酮和群孕酮；
催乳素抑制剂、如甲麦角林；
前列腺素和前列腺素类似物，如阿巴前列素、卡前列素、恩前列素、吉美前列素(Bemeprost)、利马前列素、米索前列醇、奥诺前列素、依前列醇、前列腺素E1、前列酮素E2、前列腺素F2a、利奥前列素、罗沙前列醇、硫前列酮和曲莫前列素；
蛋白酶抑制剂，如抑肽酶、卡莫司他、加贝酯和萘莫司他；
呼吸兴奋药、如阿米三嗪、贝美格、二氧化碳、克罗丙胺、克罗乙胺、二甲弗林、地莫拉明、多沙普仑、香草二乙胺、福米诺苯、洛贝林、甲哌呫诺、甲氧酚酰胺、尼可刹米、印防己毒素、哌美克隆、吡哆茶碱、丁二酸钠和他克林；
致硬化剂，如乙醇胺、乙胺、2-己基癸酸、聚乙二醇单十二醚、重硫酸奎宁、盐酸奎宁脲、蓖麻油酸钠、十四烷基硫酸钠和三苄糖苷；
镇静药和安眠药，包括：非环状的酰脲、如乙酰阿达林、丙戊酰脲、溴米那(Bomisovalum)、卡普脲、卡溴脲和依克替脲；
醇类，如氯醛己醇、乙氯维诺、甲戊炔醇、4-甲基-5-噻唑乙醇、叔-戊醇和2，2，2-三氯乙醇；
酰胺类，如布酰胺、二乙溴乙酰胺、异溴米特、异戊酰二乙胺、尼普拉嗪、三甲氧苯醋酰胺、曲美托嗪、唑吡坦和佐匹克隆；
巴比妥酸衍生物，如阿洛巴比妥、异戊巴比妥、阿普比妥、巴比妥、溴烯比妥、5，5-乙基仲丁巴比妥钠、布他比妥、丁溴比妥、正丁巴比妥、卡布比妥、环己巴比妥、环戊巴比妥、烯丙异丙甲巴比妥、5-乙基-5-(1-哌啶基)巴比妥酸、5-糠基-5-异丙基巴比妥酸、环庚比妥、己巴比妥钠、海索比妥、甲苯比妥、美西妥拉、那可比妥、尼阿比妥、戊巴比妥钠、苯烯比妥、苯巴比妥、苯巴比妥钠、苯甲比妥酸、丙巴比妥、丙溴比妥、丙羟巴比、双环辛巴比妥、司可巴比妥钠、他布比妥、替曲比妥、另戊稀巴比妥钠和乙烯比妥；
苯二氮衍生物，如溴替唑仑、度氟西泮、艾司唑仑、氟硝西泮、氟西泮、卤沙唑仑、氯普唑仑、氯甲西泮、硝西泮、夸西泮、替马西泮和三唑仑；
溴化物，如溴化铵、溴化钙、乳糖醛酸溴化钙、溴化锂、溴化镁、溴化钾和溴化钠；
氨基甲酸酯类，如戊基叔氨基甲酸酯、炔己蚁胺、Hexaprpymate、氨甲酸甲戊炔酯、二乙烯丙醋胺和三氯氨基甲酸乙酯(Tricholorourethan)；
三氯乙醛衍生物、如卡波氯醛、氯醛甜菜碱、水合氯醛甲酰胺、水合氯醛、氯醛比林、氯醛比林、培曲氯醛和三氯福司；
哌啶二酮类，如格鲁米特、甲乙哌酮、乙哌双酮、吡乙二酮、他谷酰胺和沙利度胺；
喹唑啉酮衍生物，如依他喹酮、甲氯喹酮和甲喹酮；和
其它的，如乙缩醛、苯乙酮、醛醇、缬草酸铵、安非尼酮、d-冰片基α-溴代戊酸乙酯、d-异戊酸龙脑酯、三溴甲烷、2-乙基丁酸钙、Carfinate、α-氯醛糖(Chlorolose)、氯美噻唑、鬼督邮、多西拉敏、依托羟嗪、依托咪酯、酚二唑、高氟奋乃静、氢溴酸、甲氯沙明、薄荷基戊酸酯、阿片、副醛、哌拉平、丙酰马嗪、利马扎封、羟丁酸钠、曲砜那和双乙磺丙烷；
溶血栓药，如APSAC、纤溶酶、原尿激酶、链激酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂和链激酶；
促甲状腺激素，如TRH和TSH；
促尿酸排除剂，如苯溴马隆、二乙氨磺苯酸、乳清酸、羟辛可芬、丙磺舒、磺吡酮、替尼酸和氯苯唑胺；
血管扩张剂(大脑的)，如苄环烷、桂利嗪、胞磷胆碱、环扁桃酯、环烟酯、二氯乙酸二异丙胺、长春西汀(Eburnamorine)、非诺地尔、氟桂利嗪、异丁司特、艾芬地尔、萘呋胺酯、烟卡酯、麦角溴烟酯、尼莫地平、罂粟碱、喷替茶碱、替诺非君、长春胺、长春西丁和维喹地尔；
血管扩张剂(冠状的)，如胺氧三苯、地巴唑、苯呋地尔半琥珀酸酯、苯碘达隆、Chloacizine、卡波罗孟、氯苯呋醇、氯硝甘油、地拉卓、双嘧达莫、氢普拉明、乙氧黄酮、赤藻糖醇、丁四硝赤藻糖醇酯、依他苯酮、芬地林、夫洛地尔、更利芬、己烷雌酚二(β-二乙氨乙基醚)、海索苯定、硝乙醇胺对甲苯磺酸酯(itramin Tosylate)、凯林、利多氟嗪、甘露六硝酯、美地巴嗪、尼可地尔、硝酸甘油、硝酸戊四醇酯、戊硝醇、哌克昔林、匹美茶碱、普尼拉明、硝二羟甲丁醇、吡哆茶碱、曲匹地尔、3-甲色酮、曲美他嗪、磷酸三硝乙醇胺和维司那定；
血管扩张剂(外周的)，如烟酰胺铝、巴美生、苄环烷、倍他司汀、缓激汰、溴长春胺、Bufoniode、丁咯地尔、布他拉胺、西替地尔、环烟酯、桂哌齐特、桂利嗪、环扁桃酯、二异丙胺二氯乙酸酯、依来多辛、Fenoxidil、氟桂利嗪、癸烟酯(Heronicate)、艾芬地尔、烟酸肌醇酯、异克舒令、赖氨酰舒缓激肽、血管舒缓素、莫西赛利、萘呋胺酯、烟卡酯、尼麦角林、尼可呋糖、烟醇、布酚宁、喷替茶碱、己酮可可碱、吡贝地尔、前列腺素E1、舒洛地尔和黄嘌呤脑脉康；
血管保护剂，如苯扎隆、生物类黄酮、色烯卡、红细胞糖苷脂(Clobeoside)、地奥司明、氢醌磺酸钙、七叶树皂角素、Rolescutol、无色矢车菊素、甲七叶茶碱、槲皮素、芦丁和曲克芦丁；
维生素、维生素来源和维生素提取物，如维生素A、B、C、D、E和K及其衍生物、维生素d2、甘草属和甲钴胺；
创伤药，如乙酰半胱氨酸、尿囊素、积雪苷、卡地姆碘、甲壳质、聚糖酐和奥沙西罗；
抗凝血剂，如肝素；
其他，如红细胞生成素(补血的)、非格司亭、非那雄胺(良性前列腺肥大)和干扰素β1-α(多发性硬化症)。
基于核酸的治疗剂，例如反义核酸和siRNA或用于基因治疗的基因。
用于基因治疗的基因递送载体，例如病毒、病毒颗粒和类病毒。
化学治疗剂，包括烷化剂，例如环磷酰胺、氮芥、苯丁酸氮芥和美法仑；蒽环类抗生素如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊柔比星；细胞骨架干扰剂如紫杉醇和多西他赛，以及其他紫杉烷类；埃博霉素；拓扑异构酶II的抑制剂，如依托泊苷、替尼泊苷和Tafluposide；核苷酸类似物及前体类似物，如阿扎胞苷、硫唑嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、去氧氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、巯嘌呤、甲氨蝶呤和硫鸟嘌呤(Tioguanine)(以前为硫鸟嘌呤(Thioguanine))；肽类抗生素如博来霉素；铂基试剂如卡铂、顺铂和奥沙利铂；类视黄醇如长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
在某些实施方案中，待递送的剂是一种或多种蛋白、激素、维生素或矿物质。在某些实施方案中，待递送的剂选自胰岛素、IGF-1、睾酮、长春西汀、海沙瑞林、GHRP-6或钙。在某些实施方案中，所述组合物包含两种或多种剂。
以上列出的活性剂基于在Merck Index，第12版，Merck & Co.Rahway，NJ.(1996)的第THER-1页至THER-28页提出的药物的类别和种类。该文献在此以其整体通过引用并入。
大分子和小分子可通过其以下的能力来表征：与抗衡离子和抗溶剂，例如柠檬酸盐(抗衡离子)和异丙醇(溶剂)，相互作用以形成包含高含量的大分子或小分子的完整的、离散的微球。在微球中的大分子或小分子的含量可从约或等于5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的微球重量/重量(w/w)变化。在某些实施方案中，微球的大分子或小分子含量基本上与形成微球前最初在溶液中的大分子或小分子的量相同。
用于通过本文提供的方法制备微球的大分子可包括肽如生长抑素和亮丙立得、多肽和蛋白、糖肽如万古霉素、碳水化合物包括脂质、脂肪酸、多糖和核酸(DNA、RNA或PNA、siRNA、tRNA)、病毒如烟草花叶病毒、病毒颗粒、类病毒和朊病毒。在某些实施方案中，大分子是蛋白，包括治疗性蛋白如DAS181(具有SEQ ID NO：17中提出的氨基酸残基序列的唾液酸酶融合蛋白)、α1-抗胰蛋白酶、PI8、水蛭蛋白酶抑制剂c、大肠杆菌素(Ecotin)、抑肽酶、重组人DNA酶、胰岛素、干扰素类、重组人DNA酶(例如，可作为吸入治疗药物用于治疗囊性纤维化病的rhDNA酶(Genentech)；还参见Shak等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：9188-9192(1990))、人血清白蛋白、人生长激素、甲状旁腺素和降钙素。在某些实施方案中，所述蛋白质是DAS181，所述抗衡离子是硫酸钠或柠檬酸钠，且所述抗溶剂是异丙醇。在其他实施方案中，所述大分子是核酸，例如，siRNA，所述抗衡离子是聚乙烯亚胺(PEI)且所述抗溶剂是异丙醇。在又其他实施方案中，所述大分子是病毒，例如烟草花叶病毒，所述抗衡离子是硫酸钠/乙酸钠，且所述抗溶剂是异丙醇。在进一步的实施方案中，所述大分子是肽，例如，亮丙立得或生长抑素，所述抗衡离子是谷氨酸钠，且所述抗溶剂是异丙醇。
用于通过本文提供的方法制备微球的小分子可包括抗生素例如氨基糖苷类妥布拉霉素和卡那霉素、青霉素和四环素，甾醇，类固醇激素，前列腺素，化学治疗剂如紫杉醇，或任何其他感兴趣的小分子。例如，在一个实施方案中，所述小分子是四环素，所述抗衡离子是精氨酸且所述抗溶剂是异丙醇。在另一实施方案中，所述小分子是卡那霉素或妥布拉霉素，所述抗衡离子是衣康酸且所述抗溶剂是异丙醇。仍在又一实施方案中，所述小分子是紫杉醇，所述溶剂是叔丁醇，所述抗溶剂是水(其中溶解了柠檬酸钠以形成柠檬酸盐缓冲液)且所述抗衡离子是柠檬酸钠。
本文提供的方法可避免使用可能危及化合物的活性例如小分子化合物的熔化或蛋白的变性和降低其活性的条件，例如加热。因此，根据本文提供的方法提供的微球可用于制备疫苗或需要化合物保持其活性的其他治疗药物，例如，需要以其天然构象存在的蛋白或肽。
在微球沉淀中使用的溶液中的化合物的浓度可以为约或等于0.1mg/ml至约或等于0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、5.0、10.0、12.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100、或200mg/ml。在某些实施方案中，所述浓度在约或等于1mg/ml和约或等于20mg/ml之间。取决于分子的特性(pI、疏水性、溶解性、稳定性等)和其他工艺参数，分子的浓度可凭经验确定以获得所期望的尺寸的微球的形成。一般而言，在加入抗衡离子和有机溶剂之前在溶剂中具有较低溶解度的分子可在较低浓度(0.1mg/ml-5mg/ml)下使用来形成根据本文中的方法的微球，而具有较高溶解度的分子可在1mg/ml-20mg/ml或更高的浓度下使用。如果观察到形成无定形的聚集体或聚集的微球，通常应当降低所述分子的浓度来减少或避免这种聚集。
抗衡离子的性质和浓度
抗衡离子可以是在该方法进行的pH下能中和在分子上的一个或多个带相反电荷的基团的任何化合物。取决于分子的特性(pK、pI、带电基团的性质和数目、表面带电基团的分布、在不同的pH条件下的溶解性和结构稳定性)，可凭经验确定用于微球形成的pH。通常，对于诸如蛋白的大分子，如果在低于该大分子pK的pH下进行沉淀，可使用阴离子抗衡离子。通常，如果在高于该大分子pK的pH下进行沉淀，可使用阳离子抗衡离子。所述抗衡离子可基于其引发微球形成的合适程度而凭经验选择。在某些实施方案中，所述抗衡离子可具有60Da或更高、或约75Da或更高的分子量。所述抗衡离子可以是聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或聚乙烯亚胺(PEI)。
抗衡离子可以是阴离子、阳离子或两性离子。阴离子抗衡离子可以是无机化合物(磷酸盐、硫酸盐、硫氰酸盐、硫代硫酸盐、次氯酸盐、硝酸盐、溴、碘等)或携带包括烯醇、羟基、-SH、羧基、羧甲基、磺丙基、磺酸基和磷的可电荷极化的基团的有机化合物。还可使用携带其他阴离子基团或由于其他的分子特性而带有负电荷的有机化合物。可被用作阴离子抗衡离子的化合物还包括但不限于以下：草酰乙酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、草酸盐、丙酮酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酮戊二酸盐、丁烷三羧酸、氢化粘康酸、环丁烷二羧酸、马来酸二甲酯、脱氧核糖核酸、聚谷氨酸、叶酸、乳酸、抗坏血酸、胭脂红酸、山梨酸、丙二酸、EDTA、MOPS、TES、MES、PIPES、吡啶、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、甜菜碱、硫酸、硫代硫酸、磷酸、三磷酸腺苷、硝酸、衣康酸、特戊酸、二甲基丙二酸和高氯酸。在某些实施方案中，衣康酸、特戊酸、二甲基丙二酸和琥珀酸在本文提供的方法中用作抗衡离子。
阳离子抗衡离子可以是无机化合物(铵、鏻、锍、铯、铷等)或携带称为胺、酰胺、亚胺、酰亚胺、胍、咪唑、二噁烷、苯胺的基团的有机化合物。还可使用携带其他阳离子基团或由于其他的分子特性而具有正电荷极性的有机化合物。可用作阳离子抗衡离子的化合物还包括但不限于以下：Tris、Bis-Tris、Bis-Tris丙烷、二氨基丙烷、哌嗪、哌啶、戊胺、二氨基丁烷、丙胺、三甲胺、三乙胺、精胺、亚精胺、腐胺、尸胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、咪唑、四甲基铵、三甲基铵、铵、铯、铷、咪唑、聚乙烯亚胺(PEI)、DEAE、TEAE、QAE。
还可使用具有以任何组合的任何带电基团的两性抗衡离子。可用作两性抗衡离子的化合物包括但不限于以下：HEPES、BICINE、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、6-氨基己酸、哌啶酸、天然和非天然的氨基酸(例如，组氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸)。
所述抗衡离子可用作酸(例如，硫酸)或碱(例如，咪唑)或它们的盐(例如，硫酸钠或咪唑-HCl)。可用于本文提供的方法的抗衡离子包括National Formulary(美国国家药品集)、United States Pharmacopeia(美国药典)、Japanese Pharmacopeia(日本药典)或European Pharmacopeia(欧洲药典)所列的那些，其临床安全性已经被证实(柠檬酸、苹果酸、氨基酸、硫酸盐等)。在某些实施方案中，用于本文提供的方法的抗衡离子包括其安全性已经确认或划入GRAS(通常视为安全的)种类的抗衡离子。所述抗衡离子(或其盐)在室温(约25℃)或在使用和贮存时意图的温度下可为固体。还可使用两种或多种抗衡离子的组合。挥发性抗衡离子和液体抗衡离子也可用于本文提供的方法中。
抗衡离子的浓度通常保持在约或等于0mM和约或等于0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0和100.0mM之间。在某些实施方案中，所述抗衡离子的浓度在约或等于0.5mM和约或等于20mM之间。取决于大分子或小分子的特性(pI(例如，对于蛋白或肽)、疏水性、溶解性、稳定性等)和其他工艺参数，所述抗衡离子的浓度可使用，例如，如本文提供的高通量的方式而凭经验确定。通常，形成过大的微球、无定形的聚集体或聚集的微球表明抗衡离子的浓度应该降低，而不能形成微球(破碎的玻璃样晶体或薄片)或形成小于期望尺寸的微球表明抗衡离子的浓度应该增加。
在不存在添加的化合物的情况下产生微球的抗衡离子
在筛选用于微球形成的条件的过程中，包括对用于每个感兴趣的化合物的溶剂、抗溶剂、溶剂/抗溶剂系统和抗衡离子(有时在缓冲液中存在，在其他实施方案中没有缓冲液而存在)的类型和性质的经验性改变，发现不含添加的化合物的若干对照反应产生了抗衡离子/缓冲液的微球。例如，含有25％异丙醇的15mM无缓冲的精氨酸溶液产生级别为7的微球，存在一定的结晶度。包含在15％异丙醇中pH 4或pH 6的2mM硫酸钠与0.2mM乙酸钠缓冲液的溶液在两种条件下均导致级别为7的微球。虽然存在一些团块，但还观察到了许多小的、良好地分开的、离散的微球。衣康酸在不添加化合物的情况下也显示出形成微球的倾向。当在15％异丙醇存在下的用氢氧化钠缓冲2mM的衣康酸溶液至pH 4时，形成了微球。用5％异丙醇缓冲至pH 7的、含有2mM衣康酸的类似混合物产生吸湿的微球。类似地，还发现特戊酸不依赖添加的化合物而形成微球。例如，当用氢氧化钠在15％异丙醇存在下将2mM的特戊酸溶液滴定至pH 5时，产生了级别为6的特戊酸微球。
以上类型的抗衡离子可用作用于催化在否则可能不形成微粒的分子中形成微球的工具。
溶剂/抗溶剂系统
适用于本文提供的形成微球的方法的溶剂/抗溶剂系统可基于感兴趣的化合物在溶剂中和在抗溶剂中的相对溶解度，正如本领域技术人员已知且可用的。可选择地，感兴趣的化合物在溶剂和/或抗溶剂中的溶解度可凭经验确定，通过以本文所提供的高通量的方式改变各种溶剂、抗溶剂和抗衡离子的类型和浓度，或通过本领域技术人员已知的其他方法，包括但不限于溶解饱和试验(dissolution saturation testing)。
通常，用于形成微球的感兴趣的化合物是可溶于所选溶剂的(从约或等于1mg/ml至约或等于100mg/ml)。抗溶剂可选自这样的一组溶剂，感兴趣的化合物在所述溶剂中具有有限的溶解度或没有溶解度。通常选择溶剂和抗溶剂以便它们在用于溶解以制备混合溶液的温度下是混溶的或部分混溶的。然而，在某些实施方案中，以下的情况是可能的：溶剂和抗溶剂可具有不同的凝固点；因此，降低温度可导致一种组分冻结，从而增加抗溶剂的浓度，从而诱导沉淀(例如，在某些DAS181微球的制备中使用5％异丙醇作为抗溶剂)。通常，选择不促进不同于感兴趣的化合物的组分(例如，抗衡离子和赋形剂)沉淀的溶剂/抗溶剂系统是所期望的。溶剂和抗溶剂可以是含水液体与非水液体和/或有机液体的组合，或两者均可以是非水液体和/或有机液体。
溶剂的性质和浓度
在形成微粒的感兴趣的化合物中，许多大分子和小分子是可溶于水和含水溶液的；因此，用于这样的分子的溶剂通常是含水的。对于不溶于含水溶剂的化合物，用于本文提供的方法的溶剂通常可以是与水混溶的并且选自醇(甲醇、乙醇、1-丙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇)、氯仿、二甲基氯化物(dimethyl chloride)、多元糖醇(甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇)、芳烃、醛、酮、酯、醚(乙醚)、烷(己烷、环己烷、石油醚)、烯、共轭二烯、甲苯、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、多元醇、聚酰亚胺、聚酯、聚醛、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、四氯化碳及其混合物。在某些实施方案中，所述溶剂可以是挥发性的。在其它的实施方案中，当需要将溶剂并入微球中时，可使用非挥发性的溶剂以对微球提供如新特性(例如，持续释放或增加机械强度)。溶剂的浓度通常可保持在约或等于0.1％，至约或等于0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％体积/体积(v/v)。在某些实施方案中，溶剂的浓度为约或等于1％至约或等于30％，v/v。还可使用与水部分混溶的或完全不混溶的有机化合物作为用于不溶于水的化合物的溶剂。
可用于本文提供的方法的有机溶剂包括醇和在InternationalConference on Harmonisation(ICH)Harmonised Tripartite Guideline(Impurities：Guideline for Residual Solvents)(国际协调会议(ICH)三方协调指导原则(杂质：残留溶剂指导原则))中列为3类和2类溶剂的其它溶剂，其安全处理已经在药物和食品行业中建立。
取决于分子的特性(疏水性、溶解性、稳定性等)和其他工艺参数，溶剂的选择和溶剂的浓度可利用如在微量滴定板或类似芯片或其他设备上高通量筛选而优化。通常，在冷却开始之前的未控制的沉淀，过大尺寸微球、无定形的聚集体、聚集的微球或粘性聚集体的形成表示应当使用提供较高的药物溶解度的溶剂，而不能形成微球(破碎的玻璃样晶体或薄片)或形成小于期望尺寸的微球表示使用具有较低的药物溶解度的溶剂可能是有益的。
抗溶剂的性质和浓度
通常，如果感兴趣的化合物是水溶性的并且在含水溶液中，则抗溶剂是有机溶剂。另一方面，如果感兴趣的化合物是不溶于水的，则抗溶剂是含水溶剂。然而，溶剂和抗溶剂都可以是有机溶剂。在将混合试剂混合和/或通过致冷沉淀以引发微球形成的条件下，抗溶剂通常是与溶剂混溶的或部分混溶的，其中形成微粒的化合物溶解于所述溶剂中。这样的溶剂包括，例如，水和其他含水溶液例如缓冲液、醇(甲醇、乙醇、1-丙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇)、氯仿、多元糖醇(甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇)、芳烃、醛、酮、酯、醚(乙醚)、烷(己烷、环己烷、石油醚)、烯、共轭二烯、甲苯、二氯甲烷、四氯化碳、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、乙腈、乙酸乙酯、多元醇、聚酰亚胺、聚酯、聚醛及其混合物。
在某些实施方案中，所述溶剂可以是挥发性的。在其它的实施方案中，当需要将有机溶剂并入微球中时，可使用非挥发性的有机溶剂以对微球提供如新特性(例如，持续释放或增加机械强度)。有机溶剂的浓度通常可保持在约或等于0.1％，至约或等于0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％体积/体积(v/v)。在某些实施方案中，有机溶剂的浓度在约或等于1％至约或等于30％，v/v。还可使用与水部分混溶的或完全不混溶的有机化合物。
可用于本文提供的方法的有机溶剂包括醇和在InternationalConference on Harmonisation(ICH)Harmonised Tripartite Guideline(Impurities：Guideline for Residual Solvents)(国际协调会议(ICH)三方协调指导原则(杂质：残留溶剂指导原则))中列为3类和2类溶剂的其它溶剂，其安全处理已经在药物和食品行业中建立。
取决于分子的特性(疏水性、溶解性、稳定性等)和其他工艺参数，抗溶剂的选择和抗溶剂的浓度可利用如在微量滴定板或类似芯片或其他设备上高通量筛选而优化。通常，在冷却开始之前的未控制的沉淀，过大尺寸微球、无定形的聚集体、聚集的微球或粘性聚集体的形成表示应当降低抗溶剂的浓度，而不能形成微球(破碎的玻璃样晶体或薄片)或形成小于期望尺寸的微球表示应当增加抗溶剂的浓度。
pH
除了引发微球形成，抗衡离子还可作为缓冲剂。可选择地，在某些实施方案中，缓冲化合物可用于获得期望的pH。在某些实施方案中，缓冲化合物为60Da或更大。取决于分子的特性(pI、疏水性、溶解性和在特定pH下的稳定性等)和其他工艺参数，可凭经验调节最佳pH以获得所期望的尺寸的微球的形成并保持分子的活性。通常，不能形成微球(破碎的玻璃样晶体或薄片)表示分子在使用的条件下可能过于可溶。形成无定形的聚集体可表示沉淀未被良好地控制并且诸如蛋白的分子可能在使用的pH下不稳定或不可溶。
已观察到某些化合物/抗衡离子组合可在某些pH值下导致即刻的且不可控的沉淀。本文提供的高通量筛选方法可用于凭经验确定蛋白、pH和抗衡离子的合适的组合以形成所期望的尺寸的微球。例如，可以常规地且快速地以半高通量或高通量的方式进行经验性的确定，所述经验性的确定包括改变混合物的pH、使用不同的抗衡离子或降低化合物在混合物中的浓度。通常，为了形成基于蛋白或多肽的微球，在所述蛋白的pI以下的pH值提供最佳的微球形成。这种经验性的优化方法可应用于本文提供且说明的其他大分子和小分子。
离子强度
可通过调节抗衡离子或其他盐例如氯化物或乙酸盐的浓度而调整混合溶液的离子强度。在一些实施方案中，无需另外的盐来产生微球。在某些实施方案中，可调节离子强度以保持分子的结构完整性和活性。其中存在特定的盐可能是有益的其他应用的实例包括在微球重建时可能需要特定的张力或缓冲能力的肠胃外制剂和其他药物、或食物。
冷却梯度
在冷却前，含有分子、抗衡离子和合适的溶剂/抗溶剂系统的混合物是在所述分子可溶的温度下最初制备的，所述温度通常为约-15℃至约30℃。在某些实施方案中，冷却之前的初始温度为环境温度(18℃至25℃-30℃)。在其他实施方案中，例如，含有小分子，化合物可在高得多的温度下溶解于溶剂和/或抗溶剂系统，例如约或等于50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、125℃、150℃、175℃、200℃或更高的温度，然后冷却至微球形成的温度，例如约或等于190℃、170℃、150℃、125℃、100℃、80℃、75℃、60℃、50℃、40℃、30℃、20℃、15℃或更低的温度。通过例如在逐渐冷却至在溶液中溶解大分子的温度以下的温度时的沉淀、相分离或胶体形成的方法而形成微球。进行冷却的速度可控制形成和诸如微球尺寸的其他特性。通常，当分子是蛋白时，在液氮中闪冻不产生微球。
进行混合物的冷却和冷冻的速度(冷却梯度)可确定微球的最终尺寸。通常，较快的冷却梯度产生较小的微球而较慢的冷却梯度产生较大的微球。不受限于任何理论，冷却速度可决定以下的速度：(1)产生最初较小微球的成核和(2)最初的微球联合(聚集)并退火为较大微球的融合过程。较小颗粒融合为较大颗粒是时间依赖的过程，该过程可通过例如微球的液体悬浮液在冷冻前存在的持续时间来确定。由于分子之间的键的可逆特性，在本文提供的微球组合物中，较小微球退火为较大颗粒可产生具有光滑表面的微球。取决于所期望的微粒的尺寸，冷却速度可以是从约0.01℃/min或0.01℃/min至约20℃/min或20℃/min；从约或等于0.05℃/min或约或等于0.1℃/min至约或等于10℃/min或约或等于15℃/min、从约或等于0.2℃/min至约或等于5℃/min、从约或等于0.5℃/min至约或等于2℃/min、或约或等于1℃/min。在某些实施方案中，冷却梯度可以在0.1℃每分钟和约40℃每分钟之间。在其他实施方案中，冷却梯度可以在约0.5℃每分钟和15℃每分钟之间。
取决于特定的需要，在某些实施方案中，使生产过程适合于特定的设备可能是所期望的。在某些实施方案中，具有温度控制架的冷冻干燥机可用于所述冷却。在其他实施方案中，吸热反应可用于所述冷却。如果生产的微球比所期望的大，可调节包括分子浓度、抗溶剂、抗衡离子、离子强度和/或pH的其它工艺参数来达到所期望的微球尺寸的降低。
对较快的冷却梯度(较小的粒度)，所述混合溶液可通过热交换器，如以连续模式使用的热交换器。如果需要增加微球尺寸，增加所述混合物成分(分子、抗溶剂、抗衡离子)之一的浓度可提供所期望的微球尺寸的增加。
通常，可均匀地并且以稳定的速度进行冷却来避免形成聚集体和晶体或玻璃状颗粒。取决于抗溶剂的浓度，分子沉淀成微球可以几种方式发生。在较高浓度的抗溶剂(约5％-40％，取决于使用的实际组分)中，所述微球通常可在混合溶液仍在液体形式时形成。在较低浓度的抗溶剂(2％-25％，取决于使用的实际组分)中可首先形成冰晶，此后排出的分子和抗溶剂可达到临界的局部浓度并沉淀。在冷冻干燥机托盘近底部的层的温度的进一步降低可导致液体悬浮液的完全凝固和抗溶剂进一步排出到顶层中。顶层中过量的抗溶剂可导致所述分子未控制的沉淀和微球的聚集。该效果通常可通过选择混合物中合适比例的组分-分子、抗衡离子、抗溶剂、盐等来减轻。此外，在冷冻干燥机托盘中保持薄层的混合物或在致冷时使混合物混合可防止聚集体和晶体的形成，且产生均匀的微球。例如，如果使用相对低浓度的异丙醇(如，2％-6％)，且薄层的混合物(10mm-20mm)加到托盘中，且所述托盘置于预冷(通常-30℃至-75℃)的架上，可获得均匀的微球。
本文提供的方法在某些条件下可导致基本上全部或全部分子从溶液并入微球中。
微粒形成条件的高通量筛选和颗粒形成的优化
取决于分子的特性，可优化用于根据本文提供的方法制备微球的混合溶液的组成。可利用例如其中几十至几百至几千至几万种混合物可以同时筛选的微量滴定板或芯片来以中等或高通量的格式快速进行优化。在某些实施方案中，可筛选很多pH值连同不同浓度的阳离子、阴离子或两性离子的抗衡离子和抗溶剂。例如，可利用各自加入了不同浓度的感兴趣的分子的相同的几个微量滴定板进行所述筛选。可双份筛选每一套试验条件。在某些实施方案中，可使用具有平底孔的微量滴定板，该微量滴定板被打断边缘以允许冷冻干燥机架和所述孔的底部之间良好的热传导。所述微量滴定板可置于冷冻干燥机架上并冷却来形成微球并随后凝固所述悬浮液。在所述孔的内含物冷冻时可应用真空。在冻干结束时，双份平板中的一个可用水或选择的缓冲液重建来观察是否某些条件使所述分子不溶或降低其活性。导致可容易地重新溶解或提供具有期望特性的微球的材料的条件可用光谱测定、色谱法、酶法或其他测定法进一步分析来确定保持了天然结构和活性。在双份平板中冻干的材料可用来显微观察以确定是否形成了微球。生产微球的条件可进一步调节和微调来产生具有期望的尺寸和特性的微球。
可提供进行高通量筛选的试剂盒，且该试剂盒包括用于本文提供的方法的所有成分，包括分子、缓冲液、已知组成的预分配混合物(抗溶剂、抗衡离子)和/或盐中的一种或多种。试剂盒在每一微量滴定板中可包括3、4、5、10、15、20、30、40、50、100或更多(在某些实施方案中，96或更多)种具有预定pH、抗衡离子、离子强度和抗溶剂的缓冲液。可调节试剂盒配备的微量滴定板以便孔的底部与冷冻干燥机的架直接接触。
C.微粒的大规模生产
本文提供的方法可放大规模用于生产大量的微球。例如，基于混合罐和/或冷冻干燥机架空间的容量，本文描述的成批过程适于生产如从数毫克至约一千克范围的量的高质量干粉微球。本文描述的可选择的“连续”过程可用来生产如从几百克至一百千克或更多(100克至100千克和以上)范围的量。连续过程的另外的优点是更好控制所述混合物的致冷。
通过成批过程或连续过程的大规模生产可以按照例如下面描述的一个或多个步骤的任何组合进行：
●分子沉淀为微球：该步骤可以成批方式、通过如下方法进行：将包含期望浓度的分子、有机溶剂和抗衡离子的混合溶液置于冷冻干燥托盘中，并将所述托盘置于冷冻干燥机架上。可选择地，托盘可在致冷的平台或其它种类的设备(例如，冷冻机)中致冷并冷冻，然后冷冻贮存一段时间而后冻干。可选择地，微球可通过在搅拌的容器中沉淀而形成，其中所述容器放置于冷表面上或将冷却管浸入到液体中，或当使用蠕动泵使混合物通过热交换器再循环时。可选择地，可通过使用蠕动泵使所述混合溶液经过热交换器一次以连续方式沉淀而形成微球。
●大量液体(bulk liquid)的去除：微球的悬浮液可利用标准离心、连续流动离心(如，CARR ViaFuge Pilot)、或过滤(如，在玻璃纤维、烧结玻璃、聚合物过滤器、中空纤维滤柱(如由GE Healthcare制造的那些)或切向流过滤盒(TFF盒，如由Millipore或Sartorius制造的TFF盒))来浓缩。大量液体(50％或更高)的去除可产生更快的干燥循环和更高的效率和通量。
●干燥微球：通过任何方式形成的回收的微球可通过常规冷冻干燥来干燥。可选择地，所述微球可在环境温度和大气压下干燥，不使用冷冻干燥机。
D.微粒组合物
包含在通过本文提供的方法获得的微粒组合物中的分子基本上未被所述方法在结构上和化学上改变。例如，当分子是诸如绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白的大分子时，它们的荧光和蛋白的天然构象及活性在微粒中保持。通过挥发除了与微球相关的溶剂和其他组分外的基本上所有的溶剂和/或水分而获得的干燥微球可以存贮，并且所述干燥微球的活性可在重建时基本上得到恢复。本文提供的微粒的相对低的含湿量，如约或等于0.01％至约或等于0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10.0％、10.5％、11.0％、11.5％、12.0％、12.5％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，可提供改进的稳定性。通过本文提供的方法获得的微球在尺寸和形状上也是均匀的，且可重复获得具有期望特性的微球。传统上用来制备干制剂的其他技术(如盐沉淀、醇或丙酮沉淀、冷冻干燥)可导致分子的完全或部分失活，例如蛋白的变性。另外，通过本文提供的方法制备的微球避免了对复杂或特定的喷雾干燥、喷雾冷冻干燥、基于超临界流体抗溶剂过程或研磨过程的需求(见，例如，Laube BL.The expanding role ofaerosols in systemic drug delivery，gene therapy，and vacc ination(气溶胶在系统药物递送、基因治疗和疫苗接种中的扩大的作用).Respir Care 2005；50(9)：1161-1176；Taylor G，Gumbleton M.Aerosols for MacromoleculeDelivery：Design Challenges and Solutions(用于大分子递送的气溶胶：设计挑战和解决方案).American Journal of Drug Delivery 2004；2(3)：143-155；Smyth HDC，Hickey AJ.Carriers in Drug Powder Delivery，Implications for Inhalation System Design(药物粉末递送中的载体。吸入系统设计的启示).American Journal of Drug Delivery 2005；3(2)：117-132；Cryan SA.Carrier-based strategies for targeting protein and peptide drugs tothe lungs(用于靶向蛋白和肽药物到肺部的基于载体的策略).AAPS J2005；7(1)：E20-E41；LiCalsi C，Maniaci MJ，Christensen T，Phillips E，WardGH，Witham C.A powder formulation of measles vaccine for aerosol delivery(用于气溶胶递送的麻疹疫苗的粉末制剂).Vaccine 2001；19(17-19)：2629-2636；Maa YF，Prestrelski SJ.Biopharmaceutical powders：particle formation and formulation considerations(生物药物粉剂：颗粒形成和配制的考虑).Curr Pharm Biotechnol 2000；1(3)：283-302；Maa YF，Nguyen PA，Hsu SW.Spray-drying of air-liquid interface sensitive recombinanthuman growth hormone(气-液界面敏感的重组人生长激素的喷雾干燥).JPharm Sci 1998；87(2)：152-159；Vanbever R，Mintzes JD，Wang J等.Formulation and physical characterization of large porous particles forinhalation(用于吸入的大孔颗粒的配制和物理表征).Pharm Res 1999；16(11)：1735-1742；Bot AI.Tarara TE，Smith DJ，Bot SR，Woods CM，WeersJG.Novel lipid-based hollow-porous microparticles as a platform forimmunoglobulin delivery to the respiratory tract(新的基于脂质的中空多孔微粒作为到呼吸道的免疫球蛋白递送的平台).Pharm Res2000；17(3)：275-283；Maa YF，Nguyen PA，Sweeney T，Shire SJ，Hsu CC.Protein inhalation powders：spray drying vs spray freeze drying(蛋白吸入粉剂：喷雾干燥与喷雾冷冻干燥).Pharm Res 1999；16(2)：249-254；Sellers SP，Clark GS，Sievers RE，Carpenter JF.Dry powders of stable proteinformulations from aqueous solutions prepared using supercriticalCO(2)-assisted aerosolization(利用超临界CO(2)辅助雾化作用从水溶液制备的稳定蛋白制剂的干粉剂).J Pharm Sci 2001；90(6)：785-797；Garcia-Contreras L，Morcol T，Bell SJ，Hickey AJ.Evaluation of novelparticles as pulmonary delivery systems for insulin in rats(作为大鼠中胰岛素的肺部递送系统的新颗粒的评估).AAPS PharmSci 2003；5(2)：E9；PfutznerA，Flacke F，Pohl R等.Pilot study with technosphere/PTH(1-34)-a newapproach for effective pulmonary delivery of parathyroid hormone(1-34)(技术圈/PTH(1-34)的放大试验研究-甲状旁腺素(1-34)有效肺部递送的新方法).Horm Metab Res 2003；35(5)：319-323；Alcock R，Blair JA，O′Mahony DJ，Raoof A，Quirk AV.Modifying the release of leuprolide from spray dried OEDmicroparticles(修改从喷雾干燥的OED微粒中亮丙立得的释放).J ControlRelease 2002；82(2-3)：429-440；Grenha A，Seijo B，Remunan-Lopez C.Microencapsulated chitosan nanoparticles for lung protein delivery(用于肺部蛋白递送的微胶囊化的壳聚糖纳米颗粒).Eur J Pharm Sci 2005；25(4-5)：427-437；Edwards DA，Hanes J，Caponetti G等.Large porousparticles for pulmonary drug delivery(用于肺部药物递送的大孔颗粒).Science 1997；276(5320)：1868-1871；McKenna BJ，Birkedal H，Bartl MH，Deming TJ，Stucky GD.Micrometer-sized spherical assemblies of polypeptidesand small molecules by acid-base chemistry(多肽和小分子通过酸碱化学的微米尺寸的球体组装体).Angew Chem Int Ed Engl 2004；43(42)：5652-5655；Oh M，Mirkin CA.Chemically tailorable colloidal particles from infinitecoordination polymers(来自无限配位聚合物的化学可裁剪的胶体颗粒).Nature 2005；438(7068)：651-654；美国专利第5,981,719号；美国专利第5,849,884号和美国专利第6,090,925号；美国专利申请第20050234114号；美国专利第6,051,256号)。
通过本文提供的方法获得的微粒可具有任何形状-规则的几何形状，包括但不限于球形、椭圆形、正方形、三角形和多边形，或不规则的形状。微粒可具有如下范围的尺寸(平均宽度或直径)：从约或等于0.001微米至约或等于0.002、0.005、0.01、0.02、0.03、0.05、0.1、0.02、0.03、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0或50.0微米或更大。对肺部施用于肺泡，取决于应用，所述尺寸可从约0.1微米或更小至约或等于0.5微米或更大，直至约或等于0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0或5.0微米或更大。对通过吸入施用于喉、气管和支气管，所述尺寸可从约或等于0.5微米至约或等于1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、9.5、10.0 10.0、15.0或20.0微米或更大，或在某些实施方案中从约或等于1.0微米至约或等于2.0微米。在某些实施方案中，所述微粒在形状上基本上为球形。
可用于根据本文提供的方法形成微粒的分子可包括预防剂(preventative agent)、预防药、治疗和诊断剂、加工的食物、膳食补剂、营养补剂、化妆用化合物和聚合物。在某些实施方案中，交联剂、盐或其它化合物可包括在制剂混合物中来改变微球的溶解度和/或增强其机械强度。在某些实施方案中，在大多含水或有机溶剂中不可溶的微球可用来生产如色谱树脂和可分散的研磨剂的颗粒。在其它实施方案中，在诸如用于递送的药物载体的溶剂中具有部分溶解性的微球可用于持续释放的活性剂或治疗制剂的生产。
在某些实施方案中，本文提供的微粒可与吸入设备联合用于将治疗剂量的微球递送到受治疗者的呼吸道和肺部。例如，当所述分子是DAS181蛋白(在SEQ ID NO：17中提出的序列)时，约0.5微米至约8微米、或约1微米至约5微米的微球可通过本文提供的方法、使用硫酸钠作为抗衡离子和异丙醇作为有机溶剂而获得。对于施用以预防或治疗起始于呼吸道的诸如流行性感冒的病毒感染的DAS181微球，微球沉积在喉、气管或支气管中可能是所期望的。配制为微球的DAS181融合蛋白可通过如下方法起作用：使喉/气管/支气管中的受体唾液酸降解，从而阻止在这些位点的病毒结合和感染。为了DAS181微球最佳递送到呼吸道病毒感染可能起始的位点，即喉、气管或支气管，所述微球必须不能(a)太大以致它们在嘴的前端被捕获(即，微球太大，约8微米或更大)；或(b)太小以致它们被深深地吸入肺部，且通过肺泡被系统地吸收到血流中(即，0.5微米或更小)，其中所述微球没有活性和/或可能为毒性的。对于DAS181微球到喉、气管和支气管的递送，约1微米至约5.5-6微米的尺寸范围通常可以是合适的。对于通过本文提供的方法制备的小得多的示例性的分子万古霉素，观察到类似的行为。
吸入器可用来治疗其中蛋白或其它分子可通过吸入治疗法施用的任何病症。典型的吸入设备可包括干粉吸入器、计量吸入器和静电递送设备。吸入递送设备的典型应用包括胰岛素和其它治疗蛋白以及万古霉素的深入肺部的递送。
在某些实施方案中，通过本文提供的方法获得的微球还可通过如下方式递送：口服、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下、透皮、局部或通过适于治疗分子、诊断分子、营养分子或化妆品分子的递送的其它递送方法。用于肺部递送的微球制剂通常可在约0.5微米至约5-6微米的尺寸范围，而那些设计用于其它类型的递送如皮下递送、肠胃外递送或肌肉内递送的微球制剂可在从约或等于10微米至约或等于30、40或50微米的范围内。
在某些实施方案中，本文提供的微球不具有直接的治疗效果，但可用作其它治疗剂的微载体。可用于制备这样的微球的分子的实例包括但不限于多糖、聚糖、蛋白、肽、核酸、聚合物或其组合、或某些小分子如氨基酸、乙酸钠、硫酸钠、柠檬酸钠或其组合。治疗剂或其他活性剂可在微球形成时加入或加入到形成的微球的悬浮液中。可选择地，治疗剂可与干微球组合物通过混合、翻滚(tumble)或药物和食品行业中实施的其他技术而共混。
可作为用于本文提供的微球中的其他治疗剂的微载体的聚合物可以是本文定义的任何聚合物，包括，但不限于，诸如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和混合的DNA或RNA衍生物或肽核酸(PNA)的核酸、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚烃基取代的苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚丁二烯、聚异戊二烯、聚乙二醇和聚乙烯亚胺。其他示例性的有机或无机聚合物、天然或合成的聚合物包括，但不限于，琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、其他纤维素衍生物、葡聚糖、葡聚糖衍生物和葡聚糖共聚物、其他多糖、玻璃、硅胶、诸如明胶的蛋白、聚乙二醇、聚乙烯亚胺、聚乙烯酰亚胺、聚乙烯吡咯酮、人造纤维、尼龙、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚碳酸酯、聚酯、聚酰胺、乙烯基聚合物、聚乙烯醇、聚苯乙烯和聚苯乙烯共聚物、与二乙烯基苯或类似物交联的聚苯乙烯、丙烯酸树脂、丙烯酸酯和丙烯酸、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺共混物、乙烯基和丙烯酰胺的共聚物、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯衍生物及类似聚合物。
在某些实施方案中，微载体可以是能够形成水凝胶的物质。水凝胶是遇水膨胀的聚合基质，其可吸收水而形成弹性凝胶。已测试了作为用于局部或系统递送至多种靶组织包括眼和骨的药物递送系统的水凝胶和水凝胶微球。先前已经使用诸如油/水乳液法的复杂方法实现了水凝胶微球的制造。本文提供的方法促进了水凝胶微球的简单制造。
能够形成水凝胶的物质的实例包括但不限于各种天然的、遗传改造的、衍生的和合成的聚合物如蛋白(胶原、明胶、丝)和多糖(壳聚糖、葡聚糖、结冷胶(gellan gum)、琼脂糖)。实施例22和23说明了能够形成水凝胶的物质(明胶、葡聚糖)可被并入通过本文提供的方法制备的微球制剂，导致能够形成水凝胶的微球。可将感兴趣的治疗剂或活性剂在导致根据本文提供的方法的微球形成的步骤中、在任何时候且以任何次序添加到包含形成水凝胶的物质的混合物制剂中。可选择地，可将治疗剂或活性剂添加到用于水合/膨胀所述微球的溶液中，或可添加到膨胀的微球的悬浮液中并允许扩散至颗粒中。
水凝胶微球可被交联以降低其溶解性/腐蚀和提供更持续的释放。可使用本领域技术人员已知的多种交联官能团进行交联，所述交联使用自然缩合或介导交联的试剂如EDC(盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)或利用碳二亚胺和非-碳二亚胺化学的其他化合物，所述多种交联官能团包括，但不限于，羧基、氨基、羟基、磷酸盐和/或巯基。
在某些实施方案中，交联剂、聚合物、亲脂性物质、盐如在含水溶剂中具有差的溶解度的盐、或其组合或其他化合物可包含在制剂混合溶液中以改变微球的溶解度和/或增强其机械强度。微球的缓慢溶解可用于持续释放通过以下方法递送的治疗剂：口服、吸入、鼻内、静脉内、肌肉内、透皮、局部、皮下和适于治疗分子、诊断分子、营养分子或化妆品分子的递送或应用的其他递送方法。在某些实施方案中，所述微球可以具有肠溶衣的片剂或胶囊的形式通过口服递送，从十二指肠内吞，且所述分子释放到血流或其它作用位点。
在某些实施方案中，例如当分子是蛋白或其他大分子时，可通过所述大分子的部分变性而使所述微球不可溶，所述大分子在递送时变得复性且生物可利用的。
在其它实施方案中，所述微球形状是基本上球形的，且可具有从约0.1微米至30.0微米的范围的平均直径。在又其他实施方案中，所述微球的平均直径可在从约0.5微米到5.0微米、或从约1.0微米到2.0微米的范围内。
在又一方面中，本文提供了用于将微球递送至诸如需要药物治疗的动物或人类患者的受治疗者的设备和方法。合适的递送途径可包括肠胃外的如肌肉内、静脉内和皮下地，和非肠胃外的，如口服、含服、鞘内、鼻、肺部、透皮、跨粘膜和类似的递送途径。递送设备可包括无针的或有针的注射器以及吸入器。
所述递送设备可包括单一剂量的微球，所述微球用于治疗通过体内大分子的快速或持续释放可治疗的病症，或者它们可包括多剂量的微球，或者可以是多室的并递送多于一种配制为微球的化合物。在单一剂量中存在的微球数量取决于分子的种类和活性。可选择单一剂量来获得已被优化用于治疗特定医学病症的一段时间范围内的持续释放。例如，当分子是诸如DAS181融合蛋白(SEQ ID NO：17)的大分子时，包含DAS181的微球组合物的递送剂量可从约或等于0.5mg蛋白每剂量至约或等于100mg蛋白每剂量、或约或等于0.75mg、1mg、1.5mg、2mg、3mg、5mg、10mg、15mg、20mg、30mg、40mg、45mg、50mg、55mg或60mg蛋白每剂量。当分子是小分子时，递送剂量可从约或等于0.1mg化合物每剂量至约或等于1000mg化合物每剂量之间、或约或等于0.2mg、0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、3mg、5mg、10mg、15mg、20mg、30mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg或1000mg化合物每剂量。
微球的分子组分可以是能够根据本文提供的方法形成微球的任何分子。例如，小分子化合物，诸如本领域技术人员所理解的和本文所提供的那些小分子化合物，包括治疗剂、诊断分子、营养补剂和化妆品，考虑用于根据本文提供的方法制备微粒。本文示例性说明的是属于多种类型小分子化合物的小分子，包括氨基糖苷类妥布拉霉素和卡那霉素、青霉素化合物氨苄西林和四环素。其他小分子化合物可包括，但不限于，甾醇如胆固醇和羊毛甾醇，类固醇如雌激素、睾酮、坎利酮、夹竹桃苷和螺甾内酯，磺胺衍生物如乙酰唑胺、安布赛特、阿佐塞米、布美他尼、布他唑胺、二苯基甲烷-4，4’-二磺酰胺、二磺法胺、呋塞米，尿嘧啶如氨美啶和阿米美啶以及类似尿嘧啶，和前列腺素。有机或无机的、天然或合成的药物化合物或药物可通过将所述药物附到所述小分子然后从所述分子-药物络合物或轭合物形成微球而并入所述微球。
在其他实施方案中，所述分子是包括以下的大分子：蛋白包括酶和重组蛋白，肽如生长抑素和亮丙立得，糖肽如万古霉素，碳水化合物，脂质，脂肪酸，多糖，碳水化合物-蛋白或多糖-蛋白轭合物，核酸如DNA、PNA、RNA、siRNA、tRNA，病毒，病毒颗粒，类病毒，朊病毒，小分子(例如半抗原)与蛋白的轭合物，或其混合物。在某些实施方案中，有机或无机的、天然或合成的药物化合物或药物可通过将所述药物附到诸如蛋白的大分子然后从大分子-药物络合物或轭合物形成微球而并入所述微球。本领域技术人员应当理解，所述大分子可以是分子的一部分，所述分子例如肽、双链核酸分子的单链区段或病毒颗粒或具有三级结构和/或四级结构的其他大分子。
在某些实施方案中，所述大分子是治疗蛋白，包括，但不限于，唾液酸酶、唾液酸酶融合蛋白、包含融合至GAG-结合域的唾液酸酶催化域的融合蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、胰岛素、干扰素、人生长激素、降钙素、rhDNA酶或甲状旁腺素，并且所述微球的蛋白含量可以是从约或等于50％至约或等于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。对于肺部施用，所述微球可具有在如下范围内的平均尺寸：从约或等于0.5微米至约或等于5.0微米，并且在某些实施方案中，在约或等于1微米和约或等于2微米之间。
可用于通过本文提供的方法形成微球的其他蛋白和肽可包括，但不限于，治疗蛋白包括DAS181(DAS181；SEQ ID NO：17)、a1-抗胰蛋白酶、大肠杆菌素、水蛭蛋白酶抑制剂c、丝氨酸蛋白酶抑制剂、阿法链道酶(Pulmozyme)(rhDNA酶)、倍他洛尔TM、双氯芬酸TM、多柔比星、乙酰半胱氨酸、醋酸亮丙立得、促黄体激素释放激素(LHRH)、(D-Tryp6)-LHRH、醋酸那法瑞林、胰岛素、胰岛素钠、胰岛素锌、鱼精蛋白、溶菌酶、α-乳清蛋白、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、β-乳球蛋白、胰蛋白酶、降钙素、甲状旁腺素、碳酸酐酶、卵清蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、磷酸化酶b、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、IgG、纤维蛋白原、聚左旋赖氨酸、IgM、DNA、醋酸去氨加压素、生长激素释放因子(GHRF)、生长抑素、亮丙立得、安替肽、因子VIII、G-CSF/GM-CSF、人生长激素(hGH)、β干扰素、抗凝血酶III、α干扰素、α干扰素2b。
术语“大分子”或“小分子”还可包括多种不同的大分子和/或小分子并且包括诸如以下的组合：药物化合物和用于将所述药物化合物靶向需要治疗的组织、器官或肿瘤的亲和分子的组合。亲和分子可以是例如配体或受体。配体的实例可包括病毒、细菌、多糖或毒素，当施用于动物时其可作为抗原而产生免疫应答并导致抗体的产生。本文提供的微球还可从大分子和小分子的组合或混合物来制备。
吸入器设备可用来将治疗化合物或诊断化合物，例如以上所列的那些，递送到受治疗者的呼吸道和肺部。例如，蛋白微球或抗生素微球如万古霉素微球可例如通过以下方法制备：将所述蛋白或万古霉素的水溶液与诸如柠檬酸的羧酸或硫酸或其它抗衡离子以及诸如异丙醇的有机溶剂相接触，然后冷却该溶液以形成微球。所述蛋白可以是治疗蛋白，如唾液酸酶、蛋白酶抑制剂、胰岛素、人生长激素、降钙素、rhDNA酶或甲状旁腺素，且所述微球的蛋白含量或万古霉素含量可以是约或等于70％至约或等于90％或更多、95％或更多或至少约99％或更多。对于肺部施用，诸如DAS181微球或万古霉素微球的微球可被筛分为具有从约0.5微米至5.0微米或在约1微米至约2微米之间的范围的平均直径。
可优化用于形成微球的孵育条件以通过调节包括pH、温度、分子浓度或反应或孵育的持续时间的参数来并入在微球形成前的溶液中存在的分子总量的至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
在某些实施方案中，不产生具有期望特性的微球的分子或化合物可通过与可形成具有期望特性的微球的载体分子合并或偶联而并入具有诸如如下期望特性的微球中：尺寸、递送性能(profile)、机械强度。在某些实施方案中，所述载体大分子是蛋白，且所述分子或化合物结合进所述微球和/或结合至所述微球的表面。在某些实施方案中，所述分子或化合物还可作为抗衡离子，并引发和/或促进微球的形成。
当制备包含蛋白的微球时，在微球形成过程中在冷却所述混合物前可加入蛋白稳定剂诸如甘油、脂肪酸、糖如蔗糖、离子如锌、氯化钠或本领域技术人员已知的任何其它蛋白稳定剂来最小化蛋白变性。这样的稳定剂还可加入从其他大分子或小分子配制的微球。
在某些实施方案中，还可用诸如提供耐酸性如耐消化酸或蛋白酶抗性的合适的分子和/或包衣剂包覆到微球的表面。在其它实施方案中，所述微球可用诸如脂肪酸或脂质的化合物非共价地包覆。包衣可通过如下方法而应用到微球：通过浸入溶解的包衣物质，然后将用所述物质对微球喷雾，或通过使用本领域技术人员已知的其它方法。在某些实施方案中，直接将脂肪酸或脂质加入到形成微球的混合溶液中。
通过降低温度形成微球可通过成批方式或连续方式的众多常规方法而进行。微球形成还可通过包括但不限于调节气压、重力或表面张力包括加晶种(seeding)的其他方法启动。微球形成可在暴露于这些条件时立刻发生或需要如本文所提供的延长的一段时间。
D.示例性的化合物
A.肽
可用于通过本文提供的方法形成微粒的示例性的肽如下描述。
生长抑素
生长抑素(还称为生长激素抑制素(GHIH)或生长素释放抑制激素(SRIF))是肽激素，其通过与G蛋白偶联的生长抑素受体的相互作用和抑制许多二级激素(secondary hormone)的释放而调节内分泌系统并影响神经传递和细胞增殖。生长抑素具有由单个前蛋白原(preproprotein)的选择性切割产生的两种活性形式：一种具有14个氨基酸，另一种具有28个氨基酸。相应于前生长抑素原(包括信号序列和前肽)、前生长抑素(包括前肽)、生长抑素28(SS-28，所述的28个氨基酸的肽)、生长抑素14(SS-14，所述的14个氨基酸的肽)的示例性的序列分别在SEQ ID NO：18-21中提出。
生长抑素主要由下丘脑的室旁核的神经内分泌神经元产生并在消化系统中的若干位置包括胃、肠和胰腺的δ细胞分泌。
由于生长抑素的多种生物作用，其在例如治疗神经内分泌疾患和肿瘤中具有治疗意义，所述生物作用包括抑制生长激素(GH)的释放从而对抗生长激素释放激素(GHRH)的作用；抑制促甲状腺激素(TSH)的释放；和降低胃肠激素的释放，所述胃肠激素例如胃泌素、胆囊收缩素(CKK)、分泌素促胃动素、血管活性肠肽(VIP)、抑胃肽(GIP)、肠高血糖素(GIP)；和胰激素、胰高血糖素和胰岛素。
亮丙立得
亮丙瑞林(Leuprorelin)(INN)或醋酸亮丙立得(leuprolide acetate)(USAN)是促性腺激素释放激素激动剂(GnRH激动剂)。通过导致对垂体GnRH受体持续的刺激，它最初导致刺激(加剧)，但此后降低了促性腺激素黄体生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)的垂体分泌(下调)。如同其他的GnRH激动剂，亮丙立得可用于治疗激素应答性癌症如前列腺癌或乳腺癌、雌激素依赖的病症(例如子宫内膜异位症或子宫平滑肌瘤)以治疗性早熟和控制IVF中的卵巢刺激。其还被视为用于性欲错乱症的可能的治疗方法。亮丙立得的示例性序列在SEQ ID NO：22中提出。
B.抗生素
抗生素包括抑制或完全破坏微生物如细菌、真菌或原生动物的生长的任何化合物。可用于通过本文提供的方法形成微粒的示例性的抗生素如下描述。
氨基糖苷类
氨基糖苷类是有效对抗某些类型的细菌的一组抗生素。它们包括阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、链霉素、妥布拉霉素和安普霉素。相信氨基糖苷类通过以下起作用：结合至细菌的30S核糖体亚单位(某些通过结合至50s亚单位起作用)，抑制肽基-tRNA从A位点到P位点的易位并且还造成mRNA的错读，使细菌不能合成对其生长必不可少的蛋白。
糖肽
糖肽抗生素是一类抗生药物。它们包括糖基化的环状或多环的非核糖体肽。示例性的糖肽抗生素包括万古霉素、替考拉宁、雷莫拉宁和decaplanin。这类药物通过抑制肽聚糖合成而抑制易感微生物中的细胞壁的合成，从而抑制微生物的生长。
青霉素类
青霉素类是一类β-内酰胺抗生素，其包括诸如以下的化合物：氨苄西林、阿洛西林、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、萘夫西林、青霉素、哌拉西林和替卡西林。β-内酰胺抗生素通过抑制在细菌的细胞壁中的肽聚糖交联的形成而起作用。青霉素的β-内酰胺部分结合至连接细菌中肽聚糖分子的酶(转肽酶)，然后这削弱了细菌的细胞壁(换句话说，所述抗生素导致细胞溶解或死亡)。
四环素类
四环素类是一类天然的和合成的光谱抗生素，其成员包括，例如，四环素、氯四环素、土霉素、地美环素、半合成强力霉素、赖甲环素、甲氯环素、美他环素、米诺环素和罗利环素。四环素类通过抑制翻译而抑制细胞生长。四环素类结合至30S核糖体亚单位的16S部分并防止氨酰tRNA结合至核糖体的A位点。
C.化学治疗剂
可用于治疗癌症的药理剂落在化学治疗剂的一般范围内(generalumbrella)，并且考虑根据本文提供的方法以微球形式制备所述化学治疗剂。示例性的化学治疗剂为紫杉醇。
紫杉醇
紫杉醇是用于治疗癌症的有丝分裂抑制剂药物。紫杉醇对于治疗多种癌症，包括肺癌、卵巢癌、乳腺癌和晚期卡波西肉瘤(advanced forms ofKaposi′s sarcoma)，是有效的药物。其连同多西他赛形成紫杉烷类的药物类别。紫杉醇还用于防止冠状动脉支架的再狭窄(复发的窄化)；被局部递送至冠状动脉的壁，紫杉醇包衣限制了新内膜(伤疤组织)在支架内的生长。
D.核酸
核酸，包括具有治疗意义的核酸，被预期用于制备如本文提供的微球。示例性的治疗性核酸为siRNA。
siRNA
小干扰RNA(siRNA)，有时被称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类在生物系统中起多种作用的、20-25个核苷酸长度的双链RNA分子。siRNA参与RNA干扰(RNAi)途径，其中siRNA干扰特定基因的表达。除了它们在RNAi途径中的作用，siRNA还可在RNAi相关的途径例如作为抗病毒机制)或在塑造基因组的染色质结构中起作用。鉴于它们敲除基本上任何感兴趣的基因的潜在能力，通过siRNA的RNAi已在可能的治疗应用(例如治疗流行性感冒)中产生了极大兴趣。存在越来越多的设计用于识别多种生物学途径中的重要基因的大规模RNAi筛选。因为疾病过程还依赖于多种基因的活性，在某些情况下用siRNA关闭基因的活性被认为能够产生治疗益处。例如，如在Qing等人，(2003)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，100：2718-2723中所描述，某些siRNA已显示抑制PR8和WSN流行性感冒在MDCK细胞中的产生。这些siRNA的序列(有义链和反义链)在SEQID NO：23-26中提出。
E.前列腺素
前列腺素是经酶衍生自脂肪酸的一组脂质化合物的任何成员，是激素或类激素，并且在动物体内具有重要的且多效性的功能和作用。每个前列腺素包含20个碳原子，包括5-碳环。它们是介质并具有多种生理效应。前列腺素连同血栓烷和前列环素形成脂肪酸衍生物的类前列腺素(prostanoid)类别；所述类前列腺素类别是类二十烷酸的子类。
前列腺素由于其多效性作用而具有多种临床应用，包括：
促进生产、分娩或流产(PGE2或PGF2，有或没有孕酮拮抗剂米非司酮)；
防止具有特定发绀型心脏缺陷(cyanotic heart defect)的新生儿中久存性动脉导管的关闭(PGE1)；
防止并治疗胃溃疡(PGE)；
在肢体的严重的雷诺氏现象或局部缺血中作为血管扩张药；
在肺动脉高压中；
在青光眼的治疗中；和
治疗勃起机能障碍或在手术后的阴茎康复中。
F.病毒
病毒作为载体或介体(vector)具有多种应用，包括在基因治疗中和作为灭活病毒在疫苗中的应用。考虑根据本文提供的方法的制备病毒的微粒，包括病毒的衍生形式如病毒颗粒或灭活病毒，所述病毒包括，但不限于，动物病毒、植物病毒、噬体、流行性感冒病毒、副流行性感冒病毒、腺病毒、反转录病毒、呼吸道合胞病毒、基于DNA的病毒(DNA-based virus)、冠状病毒和轮状病毒。本文示例性说明的是烟草花叶病毒(TMV)。
烟草花叶病毒(TMV)
烟草花叶病毒(TMV)是感染植物的RNA病毒，尤其感染烟草和茄科(Solanaceae)的其他成员。该病毒具有棒状外观。其壳体是由2130个外壳蛋白分子和1个6390个碱基长度的基因组RNA分子组成。外壳蛋白自身在RNA周围装配为棒状的螺旋结构，所述RNA形成了发夹环结构。蛋白单体包含装配为4个主要的α-螺旋的158个氨基酸，所述α-螺旋通过最接近病毒颗粒的轴的突出的环连接。
除了它对农作物损失的影响，关于TMV的结构的非常详细的认识和它不感染动物的事实使其成为用于包括以下的领域中的研究的有价值的工具：结构分子生物学、X-射线衍射和病毒组装与解体。
G.蛋白
可用于通过本文提供的方法形成微粒的示例性的蛋白如下描述：
唾液酸酶
唾液酸酶，也被称为神经氨酸酶和N-酰基神经氨酰甘油水解酶(N-acylneuraminosylglycohydrolase)，是催化末端唾液酸残基从唾液酸-糖轭合物(sialo-glycoconjugate)去除的外切糖苷酶类。唾液酸是具有9-碳主链的一类α酮酸，其通常发现于连接至糖蛋白和糖脂的寡糖链的最外部的位置。这些分子涉及多种生物学功能和过程，例如先天免疫的调节、细胞粘着和炎性细胞与靶细胞之间的相互作用，其可能通过结合多种凝集素来调节(Varki等人(1992)Curr Opin Cell Biol 4：257-266)。唾液酸还是优秀的碳源、氮源、能源和细胞壁生物合成前体的来源。仍进一步地，真核细胞上的唾液酸可用作致病微生物的受体或共受体，所述致病微生物包括但不限于流行性感冒病毒、副流行性感冒病毒、某些冠状病毒和轮状病毒、流行性感冒嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、粘膜炎摩拉菌(Moaxella catarrhalis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。最著名的唾液酸家族成员是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，其为多数其他种类的生物合成的前体。在自然中发现在Neu5Ac和碳水化合物支链的倒数第二个半乳糖残基之间的两种主要连接，Neu5Acα(2，3)-Gal和Neu5Acα(2，6)-Gal。Neu5Acα(2，3)-Gal和Neu5Acα(2，6)-Gal两种分子都可被流行性感冒病毒识别，并可用作受体，病毒通过所述受体结合和引发感染。然而人流行性感冒病毒似乎优选Neu5Acα(2，6)-Gal，而禽类和马的流行性感冒病毒主要识别Neu5Acα(2，3)-Gal(Ito等(2000)Microbiol Immunol 44：423-730)。人呼吸道上皮细胞表达两种形式的唾液酸，但是α(2，6)连接的唾液酸比α(2，3)连接的唾液酸更丰富。低丰度的α(2，3)连接的唾液酸更可能作为禽类病毒物种屏障的基础，并且表明降低在气道上皮细胞上表达的唾液酸受体的水平可能降低流行性感冒病毒的感染性。因此，从唾液酸-糖轭合物中除去末端唾液酸残基的唾液酸酶使其本身作为潜在的流行性感冒病毒治疗剂，所述治疗剂的作用为降低受体唾液酸的水平。唾液酸酶还可作为用于在感染过程中利用唾液酸的任何其他病原的治疗剂，所述病原包括但不限于：肺炎支原体、粘膜炎摩拉菌、幽门螺杆菌、流行性感冒嗜血杆菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、副流行性感冒病毒和某些冠状病毒和轮状病毒。
唾液酸酶倾向于高度地底物特异性。它们可靶向特定种类的复杂分子，如糖蛋白或糖脂；特定的糖键(如2-3、2-6或2-8)；或可对连接糖(linkagesugar)本身(如，D-半乳糖，N-乙酰-D-半乳糖胺)的性质敏感。底物分子包括但不限于：寡糖、多糖、糖蛋白、神经节苷脂和合成分子。例如，唾液酸酶可切割在唾液酸残基和底物分子剩余部分之间具有α(2，3)-Gal，α(2，6)-Gal或α(2，8)-Gal连接的键。唾液酸酶还可切割在唾液酸残基和底物分子剩余部分之间的任何或所有连接。很多唾液酸酶蛋白已经从微生物和高等真核生物中纯化，且其中几个已经显示催化末端唾液酸残基的去除，然后可作为病原微生物的受体。例如，在大的细菌唾液酸酶中是可降解流行性感冒受体唾液酸Neu5Acα(2，6)-Gal和Neu5Acα(2，3)-Gal的那些唾液酸酶，其包括来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、粘性放线菌、产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)和生绿小单孢菌(Micromonosporaviridifaciens)的唾液酸酶。其他可作为治疗剂的唾液酸酶包括人唾液酸酶，如由基因NEU2和NEU4编码的那些人唾液酸酶。
唾液酸酶-GAG融合蛋白
唾液酸酶-GAG融合蛋白是由融合到糖胺聚糖(GAG)-结合序列的唾液酸酶蛋白或其催化活性部分组成。如此，这些蛋白有效地包含锚定域(GAG-结合序列)和治疗域(唾液酸酶蛋白或其催化活性部分)。设计唾液酸酶-GAG融合蛋白以与上皮细胞结合并除去周围的唾液酸，并因此可用作在感染过程中利用唾液酸的病原的治疗剂。当融合蛋白例如作为吸入剂施用以治疗流行性感冒感染时，所述融合蛋白结合至上皮细胞的能力增加其保持力。所述GAG-结合序列作为将唾液酸酶栓定至呼吸道上皮细胞并增加其保持力和效力的上皮细胞-锚定域。
与肝素密切相关的硫酸类肝素是一种糖胺聚糖(GAG)，其广泛存在于包括呼吸道上皮细胞表面的细胞膜上。很多蛋白特异性结合至肝素/硫酸类肝素，且已经鉴别在这些蛋白中的GAG-结合序列。例如，人血小板因子4(PF4)(SEQ ID NO：3)、人白细胞介素8(IL8)(SEQ ID NO：4)、人抗凝血酶III(AT III)(SEQ ID NO：5)、人载脂蛋白E(ApoE)(SEQ ID NO：6)、人血管相关迁移细胞蛋白(AAMP)(SEQ ID NO：7)或人双调蛋白(SEQ IDNO：8)的GAG-结合序列已经显示展示了对肝素的高亲和力(Lee等.(1991)PNAS 88：2768-2772；Goger等..(2002)Biochem.41：1640-1646；Witt等.(1994)Curr Bio 4：394-400；Weisgraber等.(1986)J Bio Chem 261：2068-2076)。这些蛋白的GAG-结合序列不同于它们的受体结合序列，所以它们不诱导与全长蛋白或受体结合域相关的生物活性。这些序列或可结合肝素/硫酸类肝素的其它序列可用作在唾液酸酶-GAG融合蛋白中的上皮细胞锚定域。
在唾液酸酶-GAG融合蛋白的情境中，唾液酸酶可包括整个唾液酸酶蛋白或其催化活性部分。例如，唾液酸酶-GAG融合蛋白可包括SEQ IDNO：1中提出的来自粘性放线菌的901个氨基酸的唾液酸酶蛋白。在另一个实例中，唾液酸酶-GAG融合蛋白可包括SEQ ID NO：2提出的来自粘性放线菌的唾液酸酶蛋白的394个氨基酸的催化活性部分。GAG-结合序列可通过重组方法连接到唾液酸酶上。在某些实例中，所述融合蛋白可包括氨基酸连接体，如四甘氨酸残基。此外，连接可以是通过GAG-结合序列的N-端或C-端或唾液酸酶的N-端或C-端。唾液酸酶-GAG融合蛋白示例性的实例包括在SEQ ID NO：9-13和17中提出的那些多肽。在进一步的实例中，唾液酸酶和GAG-结合序列组分可通过本领域已知的任何方法使用化学连接体或肽连接体而连接。
蛋白酶抑制剂8
蛋白酶抑制剂8(PI8)，还称为Serpin B8，是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor)(丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin))。丝氨酸蛋白酶抑制剂是结构相关联的蛋白的大的超家族，所述结构相关联的蛋白在病毒、昆虫、植物和高等有机体中表达，但不在细菌或酵母中表达。丝氨酸蛋白酶抑制剂调节在包括如下很多生物学过程中所涉及的蛋白酶活性：凝固、纤溶、炎症、细胞迁移和肿瘤发生。它们包括暴露表面的反应性位点环(RSL)，所述反应性位点环通过模拟蛋白酶底物序列而作为蛋白酶的“诱饵”。在靶蛋白酶结合至丝氨酸蛋白酶抑制剂时，所述RSL被切割，此后所述蛋白酶共价连接至丝氨酸蛋白酶抑制剂。在新形成的丝氨酸蛋白酶抑制剂-蛋白酶复合物中的蛋白酶是无活性的(Huntington等.(2000)Nature407：923-926)。
PI8是鸡卵白蛋白为原型(archtype)的丝氨酸蛋白酶抑制剂亚家族中成员。像属于这个家族的其它丝氨酸蛋白酶抑制剂一样，PI8缺少典型的可切割的N-端信号序列，产生主要位于细胞内的374个氨基酸的蛋白(SEQID NO：14)。这种人卵白蛋白样亚家族的其它成员包括纤溶酶原激活物抑制剂2型(PAI-2)、单核细胞中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(MNEI)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)-1、leupin(SCCA-2)maspin(PI5)、蛋白酶抑制剂6(PI6)、蛋白酶抑制剂(PI9)和bomapin(PI10)。在这个家族内，丝氨酸蛋白酶抑制剂PI6、PI8和PI9显示最高的结构同源性(高达68％的氨基酸同一性)(Sprecher等.(1995).J Biol Chem 270：29854-29861)。PI-8已显示体外抑制胰蛋白酶、凝血酶、因子Xa、枯草菌溶素A、弗林蛋白酶还有糜蛋白酶。其由血小板释放，且显示涉及弗林蛋白酶活性的调节和因此的血小板聚集的调节(LeBlond等.(2006)Thromb Haemost 95：243-252)。
除了在调节内源生物学过程如凝固中的作用，丝氨酸蛋白酶抑制剂还可起到抑制外源微生物的生物活性的作用。例如，多种丝氨酸蛋白酶抑制剂已经显示降低了在培养细胞、鸡胚胎和感染小鼠肺中的流行性感冒病毒激活。丝氨酸蛋白酶抑制剂结合至在流行性感冒病毒表面上的血球凝集素(HA)分子并抑制其活性，这样降低了所述病毒的感染性。例如，胰蛋白酶抑制剂如：抑肽酶(Zhimov等，(2002)J Virol 76：8682-8689)、亮肽素(Zhimov等，(2002)J Virol 76：8682-8689；Tashiro等.(1987)J Gen Virol 68：2039-2043)、大豆蛋白酶抑制剂(Barbey-Morel等.(1987)J Infect Dis 155：667-672)、e-氨基己酸(Zhimov等，1982.Arch Virol 73：263-272)和n-p-甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮(TLCK)(Barbey-Morel等.(1987)J InfectDis 155：667-672)，都已经显示抑制流行性感冒病毒感染，且为用于治疗流行性感冒病毒感染的候选治疗剂。因此，作为相关的胰蛋白酶抑制剂，PI8也可作为在治疗流行性感冒病毒感染中的治疗剂。
表面活性剂
本文提供的组合物可包含一种或多种表面活性剂，其以足够使混合溶液和/或微球稳定的量添加。适量表面活性剂的选择是化合物、溶剂和抗溶剂的特性的函数。
在某些实施方案中，表面活性剂选自十二烷基硫酸钠；失水山梨醇月桂酸酯、失水山梨醇棕榈酸酯、失水山梨醇硬脂酸酯(在Span
Figure GPA00001066848501041
20-40-60等商标名下可获得)；聚山梨醇酯，如聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯(在吐温
Figure GPA00001066848501042
20-40-60等商品名下可获得)；苯扎氯铵、混合链的磷脂、阳离子脂质、寡脂质(oligolipid)、磷脂、肉碱、鞘氨醇、鞘磷脂、神经酰胺、糖脂、脂蛋白、载脂蛋白、两性蛋白、两性肽、合成的两性聚合物、及其组合。本文使用的其它示例性表面活性剂包括但不限于：
i)天然脂质，即胆固醇、鞘氨醇及衍生物、神经节苷脂、鞘氨醇衍生物(黄豆)、植物鞘氨醇和衍生物(酵母)、胆碱(磷脂酰胆碱)、乙醇胺(磷脂酰乙醇胺)、甘油(磷脂酰-DL-甘油)、肌醇(磷脂酰肌醇)、丝氨酸(磷脂酰丝氨酸(钠盐))、心磷脂、磷脂酸、卵衍生的脂质、溶血(单酰基)衍生物(溶血磷脂)、氢化磷脂、脂质组织提取物，
ii)合成脂质，即，不对称的脂肪酸、对称的脂肪酸-饱和系列、对称的脂肪酸-不饱和系列、酰基辅酶A(乙酰基辅酶A、丁酰辅酶A、巴豆酰(crotanoyl)辅酶A、己酰辅酶A、辛酰辅酶A、癸酰辅酶A、月桂酰辅酶A、肉豆蔻酰辅酶A、棕榈酰辅酶A、硬脂酰辅酶A、油酰辅酶A、花生酰(arachidoyl)辅酶A、花生四烯酰(arachidonoyl)辅酶A、山嵛酰辅酶A、二十三酰辅酶A、二十四酰辅酶A、二十四烯酰辅酶A、二十六酰辅酶A，
iii)鞘脂类，即D-赤式(C-18)衍生物(鞘氨醇，如：D-赤式鞘氨醇(合成的)、鞘氨醇-1-磷酸酯、N，N二甲基鞘氨醇、N，N，N-三甲基鞘氨醇、鞘氨酰磷酸胆碱、鞘磷脂及糖基化鞘氨醇)、神经酰胺衍生物(神经酰胺、D-赤式神经酰胺-1-磷酸酯、糖基化神经酰胺)、二氢鞘氨醇(sphinganine)(二氢鞘氨醇(dihydrosphingosine))(二氢鞘氨醇-1-磷酸酯、二氢鞘氨醇(C20)、D-赤式二氢鞘氨醇、N-酰基-二氢鞘氨醇C2、N-酰基-二氢鞘氨醇C8、N-酰基-二氢鞘氨醇C16、N-酰基-二氢鞘氨醇C18、N-酰基-二氢鞘氨醇C24、N-酰基-二氢鞘氨醇C24:1)、糖基化(C18)鞘氨醇和磷脂衍生物(糖基化-鞘氨醇)(鞘氨醇、βD-葡萄糖基、鞘氨醇、βD-半乳糖基、鞘氨醇、βD-乳糖基)、糖基化-神经酰胺(D-葡萄糖基-β1-1’神经酰胺(C8)、D-半乳糖-β1-1’神经酰胺(C8)、D-乳糖基-β1-1’神经酰胺(C8)、D-葡萄糖基-β1-1’神经酰胺(C12)、D-半乳糖-β1-1’神经酰胺(C12)、D-乳糖基-β1-1’神经酰胺(C12))、糖基化-磷脂酰乙醇胺(1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N乳糖)、D-赤式(C17)衍生物(D-赤式鞘氨醇、D-赤式鞘氨醇-1-磷酸酯)、D-赤式(C20)衍生物(D-赤式鞘氨醇)、L-苏(C18)衍生物(L-苏鞘氨醇、沙芬戈(L-苏二氢鞘氨醇))、鞘氨醇衍生物(卵、脑及奶衍生)(D-赤式-鞘氨醇、鞘磷脂、神经酰胺、脑苷脂、脑硫脂类)、神经节苷脂(神经节苷脂结构、神经节苷脂-羊脑、神经节苷脂-猪脑)、鞘氨醇衍生物(大豆)(葡萄糖神经酰胺)、植物鞘氨醇衍生物(酵母)(植物鞘氨醇、D-核-植物鞘氨醇-1-磷酸酯、N-酰基植物鞘氨醇C2、N-酰基植物鞘氨醇C8、N-酰基植物鞘氨醇C18，
iv)酰基辅酶A，即乙酰辅酶A(铵盐)、丁酰辅酶A(铵盐)、巴豆酰(crotanoyl)辅酶A(铵盐)、己酰基辅酶A(铵盐)、辛酰辅酶A(铵盐)、癸酰辅酶A(铵盐)、月桂酰辅酶A(铵盐)、肉豆蔻酰辅酶A(铵盐)、棕榈辅酶A(铵盐)、硬脂辅酶A(铵盐)、油酰辅酶A(铵盐)、花生酰(arachidoyl)辅酶A(铵盐)、花生四烯酰辅酶A(铵盐)、山嵛酰辅酶A(铵盐)、二十三酰辅酶A(铵盐)、二十四酰辅酶A(铵盐)、二十四烯酰(nervonoyl)辅酶A(铵盐)、二十六酰辅酶A(铵盐)、二十二碳六烯酰(docosahexaenoyl)辅酶A(铵盐)，
v)氧化脂质，即1-棕榈酰-2-壬二酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-O-十六烷基-2-壬二酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-棕榈酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PGPC)、1-棕榈酰-2-(9′-氧-壬酰)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-棕榈酰-2-(5′-氧-戊酰)-sn-甘油-3-磷酸胆碱，
vi)醚脂，即：二醚脂(二烃基磷脂酰胆碱，二植烷酰醚脂)、烃基磷酸胆碱(十二烷基磷酸胆碱(dodedylphosphocholine))、O-烃基二酰基磷脂酰胆碱(diacylphosphatidylcholinium)(1，2-二酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱)、合成PAF&衍生物(1-烃基-2-酰基-甘油-3-磷酸胆碱&衍生物)，
vii)荧光脂，即：基于甘油的荧光脂(磷脂酰胆碱(NBD)、磷脂酸(NBD)、磷脂酰乙醇胺(NBD)、磷脂酰甘油(NBD)、磷脂酰丝氨酸(NBD))、基于鞘氨醇的荧光脂(神经酰胺(NBD)、鞘磷脂(NBD)、植物鞘氨醇(NBD)、半乳糖脑苷(NBD))、头基标记脂质(基于甘油的)(磷脂酰乙醇胺(NBD)、磷脂酰乙醇胺(丽丝胺罗丹明B)、二油酰磷脂酰乙醇胺(丹酰、芘、荧光素)、磷脂酰丝氨酸(NBD)、磷脂酰丝氨酸(丹酰))、25-NBD-胆固醇，
viii)其他脂，包括但不限于卵磷脂，Ultralec-P(ADM)、大豆粉，
ix)表面活性剂，包括但不限于聚乙二醇400；十二烷基硫酸钠；失水山梨醇月桂酸酯，失水山梨醇棕榈酸酯，失水山梨醇硬脂酸酯(在Span
Figure GPA00001066848501061
20-40-60等商标名下可获得)；聚山梨醇酯，如聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯，聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯，聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯(在吐温20-40-60等商品名下可获得)；苯扎氯铵。
在某些实施方案中，使用的磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、混合链的磷脂、溶血磷脂、氢化磷脂、部分氢化磷脂、及其混合物。
在某些实施方案中，表面活性剂选自聚山梨醇酯-80、卵磷脂和磷脂酰胆碱。表面活性剂以足够使混合溶液和/或所得微球稳定的量存在。
表面活性剂的量可凭经验确定，且为所选试剂和所得微球组合物的期望的形式的函数。包含的量可以从按重量计少于0.1％直至35％或更高。在某些实施方案中，表面活性剂以按重量计约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％直至按重量计约30％的组合物总重的浓度存在。在某些实施方案中，表面活性剂以组合物总重的约1重量％直至约20重量％的浓度存在。在某些实施方案中，表面活性剂以组合物总重的约1重量％直至约15重量％的浓度存在。在其它实施方案中，表面活性剂以组合物总重的约1％重量直至约10重量％的浓度存在。在其它实施方案中，表面活性剂以组合物总重的约1重量％直至约8重量％的浓度存在。在其它实施方案中，表面活性剂以组合物总重的约1重量％直至约6重量％的浓度存在。在其它实施方案中，表面活性剂以组合物总重的约1重量％直至约4重量％的浓度存在。在其它实施方案中，表面活性剂以组合物总重的约20重量％的浓度存在。在其它实施方案中，表面活性剂以组合物总重的约15重量％的浓度存在。在其它实施方案中，表面活性剂以组合物总重的约13重量％的浓度存在。在其它实施方案中，表面活性剂以组合物总重的约11重量％的浓度存在。在其它实施方案中，表面活性剂以组合物总重的约8重量％的浓度存在。在其它实施方案中，表面活性剂以组合物总重的约6重量％的浓度存在。在其它实施方案中，表面活性剂以组合物总重约4重量％的浓度存在。在其它实施方案中，表面活性剂以组合物总重的约2重量％的浓度存在。在其它实施方案中，表面活性剂以组合物总重的约1重量％的浓度存在。
任选的另外的试剂
除了感兴趣的化合物，本文提供的组合物可任选包含一种或多种药物或营养或诊断或化妆品的活性剂或用于施用于受治疗者的其它此类活性剂。通常，所述试剂为在宿主中具有功能的试剂，所述功能例如免疫调节、生化过程调节或酶活性。可如本文所述配制的任何试剂可以本文提供的组合物施用。如果所述试剂是治疗剂，则所述组合物包含待递送的治疗有效量的试剂。在一个剂量中活性剂的特定的量将根据所述活性剂的性质、受治疗病症的性质、受治疗者的年龄和体型和其他参数而宽泛地变化。此外，形成微球的化合物自身也可以是活性剂。
通常，组合物中除了所述化合物的另外的活性剂或营养物的量从所述组合物的少于按重量计约0.01％至按重量计约20％或更多而变化，且通常配制成单剂量施用。单剂量可从约0.01μg至10mg试剂每千克宿主体重而变化，通常采用从0.1μg到1mg/kg的剂量。然而，这些浓度只是通常的标准，并且可基于施用的活性剂、治疗的病症而选择特定的量和剂量，且采用的治疗方案意味着具有如下特点的药物或活性剂的量：该量足够以合理的益处/风险比对参加任何医学治疗的受治疗者提供期望的局部或系统效果和性能。
试剂可选自无机药物和有机药物，包括但不限于作用于如下的药物：周围神经、肾上腺素能受体、胆碱能受体、神经系统、骨骼肌、心血管系统、平滑肌、血液循环系统、突触位点、神经效应器连接的位点、内分泌系统、激素系统、免疫系统、生殖系统、骨骼系统、内分泌物系统、消化系统和排泄系统、组胺系统等。可使用本文提供的组合物递送的活性剂包括但不限于：抗惊厥药、镇痛药、抗帕金森病药、抗炎剂、钙拮抗剂、麻醉剂、抗微生物剂、抗疟药、抗寄生虫药、抗高血压药、抗组胺剂、解热药、α-肾上腺素能激动剂、α-阻断剂、杀生物剂、杀细菌剂、支气管扩张药、β-肾上腺素能阻断药、避孕药、心血管药、钙通道抑制剂、镇静剂、诊断剂、利尿剂、电解质、酶、催眠药、激素、降血糖药、促血糖增高药、肌肉收缩药、肌肉松弛药、造形术、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、眼药、心理兴奋剂、镇静药、类固醇、拟交感神经药、拟副交感神经药、安定药、泌尿道药、疫苗、阴道药、维生素、矿物质、非类固醇类抗炎药、血管紧张素转换酶、多核苷酸、多肽、多糖、和包括草药补剂的营养补剂。
待递送的试剂水平为所述组合物的按重量计从约0.01％直至约50％、从约0.1％直至约40％、从约0.1％直至约30％、从约0.1％直到约20％、从约0.1％直到约10％、从约0.1％直至约9％、从约0.1％直至约8％、从约0.1％直至约7％、从约0.1％直至约6％、从约0.1％直至约5％、从约0.1％直到约4％、从约0.1％直至约3％、从约0.1％直至约2％、从约0.1％直至约1％。待递送的试剂可为水溶性的，微溶于水的或溶于有机溶剂或油的。在某些实施方案中，待递送的试剂选自：抗生素、化学治疗剂、抗病毒剂、抗惊厥药、镇痛药、抗帕金森病药、抗炎剂、钙拮抗剂、麻醉剂、抗微生物剂、抗疟药、抗寄生虫药、抗高血压药、抗组胺剂、解热药、α-肾上腺素能激动剂、α-阻断剂、杀生物剂、杀细菌剂、支气管扩张药、β-肾上腺素能阻断药、避孕药、心血管药、钙通道抑制剂、镇静剂、诊断剂、利尿剂、电解质、酶、催眠药、激素、降血糖药、促血糖增高药、肌肉收缩药、肌肉松弛药、造形术、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、非变性乳清蛋白、眼药、心理兴奋剂、镇静药、类固醇、拟交感神经药、拟副交感神经药、安定药、泌尿道药、疫苗、阴道药、维生素、矿物质、非类固醇类抗炎药、血管紧张素转换酶、多核苷酸、多肽、多糖和包括草药补剂的营养补剂。
示例性的活性剂与作为用于制备微粒的合适的化合物所列出的化合物种类相同，并且它们在本文的“大分子和小分子”部分作为“用于大分子和小分子的示例性的活性剂类别”提出。
E.组合物的用途
微球的治疗和诊断应用包括药物递送、疫苗接种、基因治疗、和体内组织或肿瘤成像。施用途径包括口服或肠胃外施用；粘膜施用；眼科施用；静脉内的、皮下的、关节内的或肌肉内的注射；吸入施用；和局部施用。
所述疾病和疾患可包括但不限于神经疾患、呼吸疾患、免疫系统疾患、肌肉疾患、生殖疾患、胃肠疾患、肺部疾患、消化疾患、代谢疾患、心血管疾患、肾疾患、增殖疾患、癌症和炎症。
本文提供的微粒可用来治疗传染病，如虫媒病毒感染、肉毒中毒、布氏菌病、念珠菌病、弯曲菌病、水痘、衣原体、霍乱、冠状病毒感染、葡萄球菌感染、柯萨奇病毒、克罗伊茨费尔特-雅各布病、隐孢子虫病、环孢子虫感染、巨细胞病毒感染、爱波斯坦-巴尔病毒感染、登革热、白喉、耳朵感染、脑炎、流行性感冒病毒感染、副流行性感冒病毒感染、贾第虫病、淋病、流行性感冒嗜血杆菌感染、汉坦病毒感染、病毒性肝炎、单纯疱疹病毒感染、HIV/AIDS、螺杆菌感染、人乳头状瘤病毒(HPV)感染、传染性单核细胞增多症、军团杆菌病、麻风病、钩端螺旋体病、利斯特菌病、莱姆病、淋巴细胞脉络丛脑膜炎、疟疾、麻疹、马尔堡病毒出血热、脑膜炎、猴痘、腮腺炎、分枝杆菌感染、支原体感染、诺瓦克病毒感染、百日咳、蛲虫感染、肺炎球菌疾病、肺炎链球菌感染、肺炎支原体感染、粘膜炎莫拉菌感染、绿脓假单胞菌感染、轮状病毒感染、鹦鹉热、狂犬病、呼吸道合胞病毒感染(RSV)、癣、落矶山斑疹热、风疹、沙门氏菌病、SARS、疥疮、性传播疾病、志贺菌病、带状疱疹、孢子丝菌病、链球菌感染、梅毒、破伤风、旋毛虫病、结核病、土拉菌病、伤寒、病毒性脑膜炎、细菌性脑膜炎、西尼罗河病毒感染、黄热病、腺病毒介导的感染和疾病、反转录病毒介导的传染病、耶尔森菌人畜共患病和任何其他的传染性呼吸疾病、肺部疾病、皮肤病、胃肠疾病和尿道疾病。
其它的疾病和病症包括：关节炎、哮喘、过敏性病症、阿尔茨海默病、癌症、心血管疾病、多发性硬化(MS)、帕金森病、囊性纤维化(CF)、糖尿病、非病毒性肝炎、血友病、出血障碍、血液疾患、遗传病、激素失调、肾病、肝病、神经学疾患、代谢病、皮肤病、甲状腺疾病、骨质疏松、肥胖、中风、贫血、炎性疾病和自身免疫性疾病。
F.组合、试剂盒、制造的物品
本文提供了组合和包含该组合的试剂盒，其包括微粒或用于形成微粒的成分如感兴趣的小分子或大分子、抗衡离子、溶剂、缓冲液或盐并任选地包括用于施用的说明书。所述组合包括，例如，如本文提供的组合物和用于稀释所述组合物到期望浓度以施用于包括人类的宿主受治疗者的试剂或溶液。所述组合还可包括如本文提供的组合物和如本文提供的另外的营养剂和/或包括药物的治疗剂。
另外，本文提供了包括上述的组合和任选的用于施用的说明书的试剂盒，所述施用是通过口服、皮下的、透皮的、静脉内的、肌肉内的、眼的或其他的途径，取决于蛋白和任选的待递送的另外的试剂。
本文提供的组合物可包装成包括包装材料、本文提供的组合物和标签的制造的物品，所述标签指示组合物，例如DAS181制剂或万古霉素制剂，是配制用于口服、肺部或其它的递送。
本文提供的制造的物品可包括包装材料。用于包装药品的包装材料对本领域技术人员是熟知的。见，例如，美国专利第5,323,907，5,052,558和5,033,252号。药学包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、试管、吸入器、泵、袋、管型瓶、容器、瓶，和适于选定制剂和预期的施用及治疗方式的任何包装材料。
包括以下的实施例仅为了示例性的目的，并非有意用来限定本发明的范围。
实施例1
唾液酸酶融合蛋白DAS181微球的制备
A.DAS181的纯化
DAS181是包含通过其N端融合到粘性放线菌催化域的C端的来自人双调蛋白的肝素(糖胺聚糖或GAG)结合域的融合蛋白(SEQ ID NO：17中提出的氨基酸序列)。DAS181蛋白如在Malakhov等，Antimicrob.AgentsChemother.，1470-1479，2006中所述而纯化，其在此以其整体通过引用并入。简言之，编码DAS181的DNA片段被克隆进质粒载体pTrc99a(Pharmacia；SEQ ID NO：16)置于IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导型启动子控制下。所得构建体在大肠杆菌(E.coli)BL21菌株中表达。
通过在50mM的磷酸盐缓冲液，pH 8.0；0.3M NaCl和10％的甘油中的超声波降解法而使包含表达构建体的大肠杆菌细胞裂解。澄清的裂解液通过SP-琼脂糖柱。使用包含0.8M NaCl的裂解缓冲液从柱上洗脱蛋白。将从SP-琼脂糖上洗脱的级分调节到1.9M硫酸铵((NH4)2SO4)，通过离心使澄清，然后装载到丁基-琼脂糖柱上。用两倍体积的1.3M(NH4)2SO4清洗所述柱，然后用0.65M(NH4)2SO4洗脱DAS181融合蛋白。
对于最后一步，在用磷酸盐缓冲盐水(PBS)平衡的Sephacryl S-200上进行尺寸排阻色谱法。蛋白纯度通过如下方法评估而确定为大于98％：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、反相高压液相色谱和利用产生的抗大肠杆菌细胞蛋白的抗体的酶联免疫吸附测定。纯化的DAS181，分子量为44,800Da，以2mM，pH5.0的乙酸钠缓冲液透析。
B.DAS181的活性
利用荧光底物4-甲基伞形酮-N-乙酰-α-D-神经氨酸(4-MU-NANA；Sigma)测量DAS181的唾液酸酶活性。一个单位的唾液酸酶定义为，在包含0.2ml体积的20nmol 4-MU-NANA的反应中，在37℃下、10min内(50mM CH3COOH-NaOH缓冲液，pH5.5)从4-MU-NANA中释放10nmolMU的酶量(Potier等，Anal.Biochem.，94：287-296，1979)。DAS181的比活性经确定为1,300U/mg蛋白(0.77μg DAS181蛋白每单位活性)。
C.利用纯化的DAS181制备微球
如以上部分A的描述所纯化和制备的DAS181(10mg/ml)用来形成如下显示的200μl混合物。该混合物包含作为抗衡离子的甘氨酸或柠檬酸盐和作为有机溶剂的异丙醇，如下所述：
1)DAS181+5mM甘氨酸，pH 5.0；
2)DAS181+5mM甘氨酸，pH 5.0+10％异丙醇；
3)DAS181+5mM柠檬酸钠，pH 5.0；
4)DAS 181+5mM柠檬酸钠，pH 5.0+10％异丙醇；
将包含具有以上1)-4)描述的成分的混合物的塑料微量离心管按照以下步骤逐渐冷却：
(a)通过将所述混合物置于致冷器中而从环境温度(约25℃)冷却到4℃，接着：
(b)通过将来自(a)的所得混合物置于冷冻机中而冷却到-20℃，接着：
(c)通过将来自(b)的所得混合物置于冷冻机中而冷却到-80℃。
在最佳的条件下，可预期在约4℃至约-20℃之间(通常在约-2℃至约-15℃范围内)形成微球。进行冷却到-80℃而通过冷冻干燥除去微球以外的来自混合物的成分(如，溶剂等)。混合物4)制备成三等份，两等份在塑料管，一等份在玻璃管。一等份(在塑料管)如上述冷却，而其它两等份(一等份在塑料管，一等份在玻璃管)通过将试管浸入到液氮中而经受快速冷却/冷冻。
在冷冻后，将所有的试管置于冷冻干燥机内，且挥发物(水和异丙醇)通过升华去除，剩下干燥小球(pellet)。
结果：自如上述处理的混合物回收的干燥小球被测试微球的存在。在上述的样品中，只有包含柠檬酸盐抗衡离子和异丙醇且经受逐渐冷却的混合物4)观察到具有良好分散特性、约2微米(μm)尺寸的微球。抗衡离子甘氨酸证明对DAS181蛋白不是最佳的(混合物2)，显示玻璃样晶体和附聚物的混合物，只有很少微球。当不存在有机溶剂时，获得了冻干的DAS181蛋白的玻璃样团块，且没有观察到微球(混合物1)和3))。快速冷冻玻璃管中的混合物4)产生玻璃样晶体且没有微球，然而塑料管中的混合物4)的快速冷冻(因为通过塑料比通过玻璃稍慢的热扩散，冷却速度稍慢)产生附聚的微球。
本实施例表明，具有窄的尺寸分布和良好分散性(附聚最少)的微球可使用本文提供的方法通过合适的蛋白、抗衡离子、有机溶剂和逐渐冷却的组合而产生。
实施例2
DAS181微球的尺寸作为有机溶剂浓度的函数
利用DAS181蛋白(10mg/ml)、柠檬酸盐抗衡离子(柠檬酸钠，5mM)和异丙醇有机溶剂(10％、20％或30％)的组合，如以上实施例1中所述(见混合物4))纯化DAS181并用于制备微球。所产生的混合溶液如实施例1所述从环境温度(约25℃)冷却到4℃，接着冷却到-20℃，接着冷冻到-80℃。在冷冻到-80℃时，将所述试管置于冷冻干燥机中，挥发物(水和异丙醇)通过升华去除，剩下包含微球的干粉。
结果：对于所有三个浓度：10％、20％或30％的有机溶剂异丙醇均观察到微球形成。然而，取决于有机溶剂的浓度，微球尺寸是不同的。通过比较颗粒与在血细胞计数器上的网格而确定的微球尺寸估计为，使用10％异丙醇为2微米；使用20％异丙醇为4微米；使用30％异丙醇为5-6微米。这些结果表明使用合适浓度的有机溶剂可设计所期望的微粒尺寸。
实施例3
DAS181微球的尺寸作为蛋白浓度的函数
利用DAS181蛋白(5mg/ml或10mg/ml)、柠檬酸盐抗衡离子(柠檬酸钠，5mM)和异丙醇(5％或20％)的组合，如以上实施例1中所述(见混合物4))纯化DAS181并用于制备微球。所产生的混合溶液如实施例1所述从环境温度(约25℃)冷却到4℃，接着冷却到-20℃，接着冷冻到-80℃。在冷冻到-80℃时，将所述试管置于冷冻干燥机中，然后挥发物(水和异丙醇)通过升华去除，剩下包含微球的干粉。
结果：在两个蛋白浓度(5mg/ml和10mg/ml)和有机溶剂的两个浓度(5％或20％)下观察到微球形成。然而，所述微球尺寸是不同的。包含5mg/ml或10mg/ml蛋白和5％异丙醇的混合物产生估计为约1.5微米尺寸的微球。包含5mg/ml蛋白和20％异丙醇的混合物产生估计为约3微米尺寸的微球，而含10mg/ml蛋白和20％异丙醇的混合物产生估计为约4微米尺寸的微球。这些结果表明，利用合适浓度的蛋白或有机溶剂浓度和蛋白浓度的合适的组合可设计所期望的微粒尺寸。
实施例4
DAS181微球的尺寸作为抗衡离子浓度的函数
利用DAS181蛋白(10mg/ml)、柠檬酸盐抗衡离子(柠檬酸钠，2mM，3mM或6mM)和异丙醇(20％)的组合，如以上实施例1中所述(见混合物4))纯化DAS181并用于制备微球。混合溶液在玻璃管状瓶中混合，并以1℃每分钟的冷冻梯度在Millrock Lab Series冷冻干燥机中从+20℃冷却到-40℃。挥发物(水和异丙醇)在100mTorr通过升华去除，在-30℃初次干燥12小时和在30℃第二次干燥3小时，剩下包含微球的干粉。
结果：在所有三个试验的柠檬酸盐抗衡离子浓度下观察到微球形成。微球的尺寸从2mM柠檬酸盐下的1微米增加到3mM柠檬酸盐下的3微米，到6mM柠檬酸盐下的5微米。将1mM的乙酸钠或1mM的氯化钠加入到含2mM柠檬酸盐的混合物中并不影响由柠檬酸盐抗衡离子引发的微球形成。这些结果表明，利用合适浓度的抗衡离子可设计所期望的微粒尺寸。
实施例5
在表面活性剂存在时形成的DAS181微球
将表面活性剂加入大分子(如蛋白)微球中经常可改进微球的特性使其适合施用于受治疗者，所述特性例如流动性、分散性和用于特定施用途径例如鼻内或口腔吸入的配置。为了测试表面活性剂是否可并入本文提供的生产微球的方法，如上文实施例1所述进行DAS181微球的生产，除了另外将表面活性剂加入到溶液中之外。
将表面活性剂(3.5％w/w卵磷脂、0.7％w/w Span-85
Figure GPA00001066848501151
(失水山梨醇三油酸酯)或3.5％w/w油酸)加入到包含5mg/ml DAS181、5mM柠檬酸钠和20％异丙醇的混合溶液中。通过冷却所述溶液到4℃，接着冷却到-20℃，接着冷冻到-80℃用于冻干而形成微球，如以上实施例1中描述。在冷冻后，将试管置于冷冻干燥机内，且通过升华除去挥发物(水和异丙醇)，剩下包含微球的干粉。
结果：自如以上描述的每种上述混合物的处理产生的微球使用以环形移动摩擦的盖玻片在载玻片上展开。在所有情况下都观察到有效的微球形成。当包含表面活性剂的样品与包含所有其余成分而没有添加表面活性剂的样品相比较时，注意到在表面活性剂存在时形成的微球具有提高的分散性(更少的附聚或聚集)。
实施例6
通过选择合适种类和浓度的有机溶剂和抗衡离子制备牛血清白蛋白(BSA)的微球
如本文描述的，可以高通量的方式凭经验优化本文提供的方法来获得具有期望特性的微球，所述特性包括尺寸、流动性和分散性。本实验的目的是为了表明通过改变有机溶剂和抗衡离子的种类和浓度以及混合物的pH，可以调节感兴趣的蛋白微球的尺寸和质量，在此例中感兴趣的蛋白为牛血清白蛋白(BSA)。
将包含5mg/ml的BSA和指定的pH和浓度下(见表1)的不同有机溶剂和抗衡离子的混合溶液置于微量滴定板(最终体积每孔0.1ml)中。在Millrock Lab Series冷冻干燥机中以1℃每分钟的冷冻梯度从+20℃冷却所述混合物到-40℃。挥发物通过在100mTorr下升华去除，在-30℃初次干燥12小时和在30℃第二次干燥3小时。
结果：结果如下表1所示。对于BSA蛋白，产生具有最少结晶或聚集的最均匀的微球的组合(分别是抗衡离子和有机溶剂)包括：
(1)柠檬酸盐+异丙醇
(2)柠檬酸盐+丙酮
(3)衣康酸+1-丙醇
(4)甘氨酸+二噁烷
(5)甘氨酸+1-丙醇
(6)铷+1-丙醇
(7)高氯酸盐+1-丙醇
表1：在不同条件下形成的BSA微球的高通量筛选
  抗衡离子   pH   有机溶剂   产物描述
  5mM特戊酸   4.0   5％环己醇   偶尔具有晶体的0.5-1微米微球
  5mM特戊酸   4.0   5％1-丙醇   具有一些聚集体的0.5-1微米微球
  5mM特戊酸   4.0   5％丁醇   聚集的微球
  5mM特戊酸   4.0   5％对二噁烷   聚集的微球
  5mM氯化铷   9.0   5％环己醇   0.5-1微米微球。聚集体和偶尔的晶体
  5mM氯化铷   9.0   5％1-丙醇   0.5-1微米微球
  5mM氯化铷   9.0   5％丁醇   很少的微球(0.5-1微米)。多数为聚集体和晶体
  5mM氯化铷   9.0   5％对二噁烷   具有一些聚集体的1-2微米微球
  5mM溴化钠   4.0   5％环己醇   具有一些聚集体的1-2微米微球
  5mM溴化钠   4.0   5％1-丙醇   很少的微球(0.5-2微米)。多数为聚集体和晶体
  5mM溴化钠   4.0   5％丁醇   很少的微球(0.5-1微米)。多数为聚集体和晶体
  5mM溴化钠   4.0   5％对二噁烷   具有一些聚集体的1-2微米微球
  5mM高氯酸钠   4.0   5％环己醇   具有一些晶体和聚集体的0.5-2微米的微球
  5mM高氯酸钠   4.0   5％1-丙醇   0.5-1微米微球
  5mM高氯酸钠   4.0   5％丁醇   很少的1-2微米微球。多数为晶体和聚集体
  5mM高氯酸钠   4.0   5％对二噁烷   聚集的微球
  5mM磷酸钙   4.0   5％环己醇   很少的1-2微米微球。多数为聚集体
  抗衡离子   pH   有机溶剂   产物描述
  5mM磷酸钙   4.0   5％1-丙醇   具有一些聚集体的1-2微米微球
  抗衡离子   pH   有机溶剂   产物描述
  5mM磷酸钙   4.0   5％丁醇   很少的1-2微米微球。多数为晶体和聚集体
  5mM磷酸钙   4.0   5％对二噁烷   聚集的微球
  5mM三乙胺   9.0   5％环己醇   具有一些晶体和聚集体的0.5-1微米的微球
  5mM三乙胺   9.0   5％1-丙醇   具有一些聚集体的1-2微米微球
  5mM三乙胺   9.0   5％丁醇   很少的1-2微米微球。多数为晶体和聚集体
  5mM三乙胺   9.0   5％对二噁烷   聚集的微球
  5mM甘氨酸   9.0   5％环己醇   具有一些晶体和聚集体的0.5-1微米的微球
  5mM甘氨酸   9.0   5％1-丙醇   偶尔具有聚集体的0.5-2微米微球
  5mM甘氨酸   9.0   5％丁醇   很少的1-2微米微球。多数为晶体和聚集体
  5mM甘氨酸   9.0   5％对二噁烷   1-2微米微球
  5mM柠檬酸钠   4.0   15％异丙醇   1-2微米微球
  5mM柠檬酸钠   4.0   15％丙酮   0.5-1微米微球
  5mM衣康酸   4.0   15％1-丙醇   1-2微米微球
这些结果显示对每种蛋白，可以高通量的方式容易地筛选用于形成最好的微球(期望的尺寸、均匀性、分散性、最少聚集体和晶体形成等)的多种配方。然后，从最初的筛选选择的试剂和条件的组合(抗衡离子、有机溶剂、pH、浓度)可进一步按需要微调。
实施例7
利用多种蛋白制备微球
本文提供的方法可用于利用多种蛋白来制备微球。除了上面举例的DAS181和BSA，所述方法用来从胰蛋白酶、血红蛋白、DNA酶I、溶菌酶、卵白蛋白、RNA酶A、六组氨酸标签化的人蛋白酶抑制剂8(PI8，具有如SEQ ID NO：15提出的氨基酸序列)、红色荧光蛋白(RFP)和绿色荧光蛋白(GFP)而制备微球。
DNA酶I、胰蛋白酶和血红蛋白购自Worthington。溶菌酶、卵白蛋白和RNA酶A购自Sigma。6×His标签化的PI8、GFP和RFP的纯化：6×His标签化的PI8、GFP和RFP基本上如以上实施例1中对于DAS181所描述而表达和纯化，其中具有如下改动：
6×His标签化的GFP和6×His标签化的RFP的纯化：编码具有N端His6标签的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的构建体在大肠杆菌中表达为6×His标签化的蛋白。允许红色荧光蛋白的表达在具有1mM IPTG的LB培养基中过夜进行。在具有1mM IPTG的TB培养基中诱导绿色荧光蛋白3个小时。通过离心使来自4升诱导培养物的细胞裂解液澄清，并通过在Fast-Flow螯合树脂(GE Healthcare)上的金属螯合亲和色谱纯化所述蛋白，所述树脂含有镍并装载到C-10柱(GE Healthcare)上。
通过在以磷酸盐缓冲盐水平衡的0.5cm×70cm Sephacryl 200柱上的凝胶过滤色谱进一步纯化蛋白。该蛋白在2mM的乙酸钠缓冲液，pH 5.0下透析，并在Centriprep(Amicon)上浓缩。
6×His标签化的PI8的纯化：编码具有N端His6标签的PI8的构建体在大肠杆菌中表达为6×His标签化的PI8。如上文对6×His RFP和6×HisGFP描述的进行纯化，除了在不同色谱纯化步骤中使用的所有缓冲液包含1mM TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐)。
微球的制备：如以上实施例6中描述在微量滴定板上制备包含5mg/ml的蛋白和下列各种抗衡离子、有机溶剂和pH的混合溶液。
表2：用来生产不同蛋白微球的组合
  蛋白   抗衡离子   pH   有机溶剂  微球尺寸(微米)
  胰蛋白酶   5mM精氨酸   8.0   5％异丙醇  0.5-1
  溶菌酶   5mM柠檬酸盐   8.0   5％异丙醇  4-5
  PIN 168(PI8)   5mM柠檬酸盐   5.0   7％异丙醇  2-5
  DNA酶I   5mM柠檬酸盐   4.0   5％异丙醇  0.4-1
  RNA酶A   5mM柠檬酸盐   4.0   5％异丙醇  0.4-1
  血红蛋白   5mM甘氨酸   5.0   10％异丙醇  0.4-0.7
  卵白蛋白   5mM特戊酸   4.0   10％异丙醇  0.5-1
  红色荧光蛋白   5mM特戊酸   7.0   10％1-丙醇  1-4(偶尔的聚集体)
  绿色荧光蛋白   5mM特戊酸   7.0   10％1-丙醇  0.5-1.5
在Millrock Lab Series冷冻干燥机中以1℃每分钟的冷冻梯度从+20℃冷却所述微量滴定板到-40℃。挥发物(水和异丙醇)通过在100mTorr下升华除去，在-30℃初次干燥12小时和在30℃第二次干燥3小时，剩下包含微球的干粉。
将所述干粉在载玻片上展开并通过32×或100×物镜进行显微照相。上表2中所列的所有组合产生良好质量(均匀的尺寸分布、分散性，很少聚集体和/或晶体)的微球。取决于蛋白，微球的尺寸从约0.4-1微米(RNA酶A、DNA酶I)至约2-5微米(6×His PI8、溶菌酶)之间变化。本实施例证明本文提供的方法可用于从多种蛋白生产微球。
实施例8
用于吸入的DAS181微球的气动粒径分布：本文提供的方法与喷雾干燥的比较
如本文描述的，本文提供的方法可用来生产任何期望尺寸范围的微球，包括用于通过吸入递送的约0.5微米至约6-8微米的范围。
A.微球的制备
为了测试配制用于吸入递送的DAS181干粉(微球)的气动粒径分布，用如下两种方法制备DAS181微球：
(a)包含14mg/ml DAS181、5mM柠檬酸钠，pH 5.0的DAS181水溶液在55℃的空气流中喷雾干燥来生产微球。
(b)可选择地，根据本文提供的方法生产DAS181微球。将作为有机溶剂的5％的异丙醇加入到包含14mg/ml DAS181、5mM柠檬酸钠，pH5.0的DAS181水溶液。在Millrock Lab Series冷冻干燥机中以1℃每分钟的冷冻梯度从+20℃冷却所得溶液到-40℃。挥发物(水和异丙醇)通过在100mTorr下升华去除，且在-30℃下初次干燥12小时和在30℃下第二次干燥3小时，剩下包含微球的干粉。
B.微球的气动粒径分布
通过Anderson级联冲击(Cascade Impaction)测试如在实施例8A中所述制备的微球。呼吸道中的药物沉积作用可通过在级联冲击器的载物台/收集碟上的颗粒(微球)的空气动力学行为预测。
使用通过如下方法制备的DAS181微球进行级联冲击实验：以上部分A中描述的两种可选择的方法中一种，即通过喷雾干燥或通过本文提供的方法。将微球(10mg)装载到明胶胶囊中。将明胶胶囊置于CycloHaler(PharmaChemie)干粉吸入器中，然后经受级联冲击。使用8载物台的、不能活动的(non-viable)Andersen级联冲击器(Thermo Electron，Boston)，其经改装以在每分钟90升气流下使用，并装有USP喉部、诱导锥体且没有预分离器。代表吸入后沉积的不同区域/阶段(气管、主支气管和次级支气管、终端支气管、肺泡等)的冲击器的收集碟用硅喷雾来涂覆以防止微球跳动。来自载物台和收集碟的微球回收到包含0.1％吐温的磷酸盐缓冲盐水中，且通过测量280nm处吸光度量化回收自每一个载物台和收集碟的沉积的DAS181的量。
结果：通过所述两种方法生产的微球的几何尺寸通过光学显微术评估，且发现对于两种方法基本上是相同的(1.5-3.0微米的范围)。然而如下表3中所示，所述两种制品的气动粒径分布在这两种方法间显著地不同。对于根据如本文提供的方法生产的微球(即，上面部分A中提出的方法(b))，少于25％保持陷在口中(冲击器装置的喉部/锥体)，而大于70％的微球递送到气管和肺部(大于40％的在终端支气管和肺泡中)。相比较，少于50％的通过喷雾干燥(上面部分A中所列的方法(a))形成的DAS181微球递送到气管和肺部(少于20％在终端支气管和肺泡中)。所述结果表明本文提供的方法可生产用于递送到肺部深处的微球，且相比通过喷雾干燥方法生产的微球，通过本文提供的方法生产的微球具有出众的脱附聚和流动性质(提供更高的递送剂量)。
表3：DAS181微球的级联冲击分析结果
Figure GPA00001066848501201
Figure GPA00001066848501211
实施例9
微球的大规模生产
本实施例表明本文提供的方法可放大规模用于生产大量的DAS181。本文所述的成批过程适于生产从例如几毫克至约1千克范围的量的高质量的干粉微球，并且受混合罐和/或冷冻干燥机架空间的容量的限制。本文所述的可选择的“连续”过程可用于生产从例如几百克至一百千克或更多(100克至100kg及以上)范围的量。连续过程的另外的优点是更好控制混合物的致冷。
通过成批过程或连续过程的大规模生产可以按照例如以下描述的一个或多个步骤的任何组合或特定的可选择的方法进行：
●蛋白沉淀为微球：该步骤可以成批方式、通过如下方法进行：将包含期望浓度的蛋白、有机溶剂和抗衡离子的混合溶液置于冷冻干燥托盘中，并将所述托盘置于冷冻干燥机架上。可选择地，托盘可在致冷的平台或其它种类的设备(例如，冷冻机)中致冷并冷冻，然后冷冻贮存一段时间而后冻干。可选择地，微球可通过在搅拌的容器中沉淀而形成，其中所述容器放置于冷表面上，或将冷却管浸入到液体中，或当使用蠕动泵使混合物通过热交换器再循环时。可选择地，可通过使用蠕动泵使所述混合溶液经过热交换器一次以连续方式沉淀而形成微球。
●大量液体的去除：微球的悬浮液可利用标准离心、连续流动离心(如，CARR ViaFuge Pilot)、或过滤(如，在玻璃纤维、烧结玻璃、聚合物过滤器、中空纤维滤柱(如由GE Healthcare制造的那些)或切向流过滤盒(TFF盒，如由Millipore或Sartorius制造的TFF盒))来浓缩。大量液体(50％或更高)的去除可产生更快的干燥循环和更高的效率和通量。
●干燥微球：通过任何方式形成的回收的微球可通过常规冷冻干燥来干燥。可选择地，所述微球可在环境温度和大气压下干燥，不使用冷冻干燥机。
结果：DAS181蛋白通过本文描述的连续方式成功地处理成干粉(微球)。利用蠕动泵使包含10mg/ml DAS181、20％异丙醇、2mM硫酸钠的混合物通过连接NESLAB循环式低温恒温器的35SERIES热交换器(Exergy，Garden City，NY)，以便在通过期间使所述混合物从约25℃冷却至约-12℃。将离开热交换器的所得微球悬浮液泵送至预冷的冷冻干燥托盘(-40℃)中、冷冻和冻干或可选择地，直接泵送至液氮中然后冻干。通过显微镜和级联冲击分析的所得微球显示为具有最小聚集和良好分散性的均匀的微球，且在尺寸和气动粒径分布上与成批方式生产的微球相似。当配制的DAS181混合溶液没有致冷(不通过热交换器，因此不诱导微球沉淀)而直接倒入液氮中时，没有观察到微球，相反，在冷冻干燥后观察到玻璃样晶体。
实施例10
用于递送到上部和中部呼吸道的DAS181微球的成批方式过程和配制
本实施例描述配方和生产DAS181微球的过程。DAS181混合溶液内含物和它们相对的量在下表4中显示。
表4：DAS181微球的批次生产配方
Figure GPA00001066848501221
(1)批量大小：配制的混合物的最终体积为5.38L。理论产量为74g的大批DAS181干粉。
(2)DAS181蛋白(API)储备溶液的组分。
A.原料药物物质的生产
术语药物物质、活性药物成分和API在本实施例中可互换使用，并且是指DAS181蛋白。大批的DAS181蛋白的生产如下进行。首先，将大批量(bulk amount)的DAS181大致按实施例1中描述的在大肠杆菌(BL21菌株)中表达。表达DAS181蛋白的大肠杆菌细胞通过如下方法清洗：利用Toyopearl缓冲液1、UFP-500-E55中空纤维滤柱(GE Healthcare)和Watson-Marlow蠕动泵在发酵收获清洗步骤中渗滤。
然后将重组DAS181蛋白从细胞中大批纯化。在下表5和表6中提供在DAS181大批纯化中使用的组分和缓冲液的具体规格。所收获和清洗的细胞在匀浆步骤中通过使细胞通过Niro-Soave Panda细胞破碎仪两次而裂解。这样获得的匀浆物通过使用Toyopearl缓冲液1、Hydrosart 0.2微米TFF盒和Watson Marlow泵的微过滤来澄清。然后澄清的匀浆物通过允许裂解物再循环而不加入新鲜缓冲液来浓缩。接着，在Toyopearl SP-550C树脂上捕获来自澄清的匀浆物的DAS181蛋白，所述树脂在DAS181蛋白从树脂洗脱前在一系列缓冲液(见表5)中清洗。洗脱物的氯化钠浓度在pH 8.0的50mM磷酸盐最终缓冲液中调节到1.0M。然后包含DAS181的洗脱液利用Toyopearl缓冲液4通过Toyopearl己基(Hexyl)-650C树脂而进一步纯化。然后包含DAS181蛋白的树脂洗脱液在渗滤步骤(见表5步骤8)中经缓冲液交换到5mM乙酸钠中。接着，浓缩的蛋白通过Sartorius QSingleSep过滤器以便以流经方式除去DNA。将异丙醇加入Q SingleSep滤液中至20％v/v的最终浓度。使缓冲液中的DAS181蛋白通过用Amberchrom缓冲液平衡的Amberchrome CG300M树脂(见表5步骤11)。然后纯化的大批的DAS181蛋白经缓冲液交换到配制缓冲液中并通过渗滤浓缩(见表5的步骤12)。
表5：大批DAS181药物物质的纯化
Figure GPA00001066848501231
Figure GPA00001066848501241
Figure GPA00001066848501251
*体积以升计，除了4×表示渗余物体积的倍数
CV＝柱体积
NR＝未记录
NS＝未指定
表6：在DAS181纯化过程中使用的缓冲液
  缓冲液名称   缓冲液组成
  Toyopearl缓冲液1   50mM磷酸钾，0.3M NaCl，pH 8.0
  Toyopearl缓冲液2   1.1mM磷酸钾，2.9mM磷酸钠，154mM NaCl，pH 7.4
  Toyopearl缓冲液3   1.1mM磷酸钾，2.9mM磷酸钠，154mM NaCl，1％TritonX-100，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸钠，pH 7.4
  Toyopearl缓冲液4   50mM磷酸钾，1.0M NaCl，pH 8.0
  Toyopearl缓冲液5   50mM磷酸钾，0.5M NaCl，pH 8.0
  Toyopearl缓冲液6   5mM乙酸钠，pH 5.0
  Toyopearl缓冲液7   5mM乙酸钠，60％异丙醇，pH 5.0
  配制缓冲液   1.75mM乙酸钠，pH 5.0
  3％异丙醇   3％异丙醇
  Amberchrom缓冲液   5mM乙酸钠，20％异丙醇，用乙酸调节为pH 5.0
  1.0N NaOH 3％异丙醇   1.0N NaOH，3％异丙醇
  1.0N NaOH   1.0N NaOH
  缓冲液名称   缓冲液组成
  0.5N NaOH   0.5N NaOH
  0.1N NaOH   0.1N NaOH
  70％异丙醇   70％异丙醇
  20％EtOH   20％乙醇
B.成批生产过程
在如下描述的大规模成批方式中组合上表4中所列的成分来形成DAS181微球。
步骤I：原料药物物质的解冻
在塑料瓶中的冷冻的0.2μm过滤的原料药物物质在环境温度(25±3℃)下过夜解冻。
步骤II：赋形剂的称量和溶液的制备
称量35.51g无水硫酸钠粉末，并用冲洗用水定容(Q.S.)到500mL，然后搅拌来获得澄清溶液。称量18.38克二水氯化钙粉末，并用冲洗用水定容到250mL，然后搅拌来获得澄清溶液。
步骤III：DAS181混合溶液的制备
在搅拌下将1.79L冲洗用水缓慢加入到3.3L浓缩的药物物质(19.55g/L)，接着加入0.0215L硫酸钠溶液、0.0028L氯化钙溶液和0.269L异丙醇。搅拌所述溶液来确保组分的完全混合。
步骤IV：通过0.2μm过滤器过滤配制的混合溶液
通过0.2μm过滤器将步骤III配制的混合溶液过滤到消毒的培养基袋子来控制微粒和污染菌(bioburden)。
步骤V：填进冷冻干燥托盘
配制的过滤溶液分配到高温高压灭菌的Lyoguard冷冻干燥托盘上。为了确保所述溶液均匀冷却和高质量微球的形成，6个托盘的每一个填有0.9L或更少的混合溶液。
步骤VI：冷冻和冻干
将所述托盘置于预冷到-45±5℃冷冻干燥机(Hull 120FSX200)架上，并允许所述溶液致冷和冷冻。当所述溶液正冷冻时发生了微球的形成。允许冷冻继续进行1-2小时来确保完全固化。产物温度通过阅读连接到所述6个托盘中的2个托盘的热电偶来确定。
冷冻干燥循环步骤如下
a)设置真空到160微米并允许抽空到100-200微米；
b)架温度在3小时内梯度上升到+10℃；
c)架温度在+10℃保持36小时(初次干燥)；
d)检查热电偶迹线以判定完成初次干燥阶段并且产物温度已经在+10℃±5℃稳定了15-30h。
e)架温度在1小时内梯度上升到+30℃并保持3-5小时(第二次干燥)。
步骤VII：转移大批的DAS181微球到容器并混合
使用清洁擦清洁在每个Lyoguard冷冻干燥托盘底部薄膜上的部分并用手术刀做成3×3cm的开口。将干燥的微球转移到塑料瓶中。盖上所述瓶并上下翻滚40次，每次反转都改变方向。翻滚是为确保瓶内含物的均匀性。取出用于分析试验的样品，然后重新盖上所述瓶并密封到塑料袋子中贮存。
在以上描述的DAS181微球大批的生产过程中，硫酸盐被证明是用作抗衡离子的安全物质，并可重复生产具有窄尺寸分布的微球。此外，有机溶剂异丙醇是好的溶剂选择，因为(1)第3类溶剂，(2)其可在宽范围(2-30％，v/v)浓度内生产微球，和(3)其具有相对高的冰点，所以其蒸汽在冻干中可被有效地截留。
可改变在最终制剂中的蛋白浓度(10-14mg/ml)，也可改变抗衡离子的浓度(1-5mM)和异丙醇的浓度(2-30％v/v)，而不会对微球的物理性质或在微球中DAS181蛋白的活性有显著的影响。在较高浓度的异丙醇(15-30％)下，微球在混合物仍完全是液体时形成。在较低浓度(2-15％)下，冰晶首先开始形成，接着沉淀而形成微球。
C.微球中DAS181的产量
根据下式计算干燥的微球中DAS181的理论产量：
理论产量＝DAS181蛋白，g÷在干粉(微球)中的蛋白分数
通过分析DAS181微球的几个生产批次凭经验确定蛋白分数值(0.866)。对于表2中所列的量的理论产量为64.56g÷0.866＝74.55g。发现DAS181干粉的实际产量为64克。
结果：通过Andersen级联冲击测试如以上部分B中描述制备的微球用于通过口腔吸入施用的适合性。结果在下表7中总结。药物在呼吸道中的沉积可通过颗粒(微球)在级联冲击器载物台/收集碟上的沉积而预测。对于施用以预防或治疗在呼吸道中起始的病毒感染如流行性感冒的药物，如DAS181微球，将药物沉积在喉、气管和支气管(上部和中部呼吸道)是所期望的。递送到上部和中部呼吸道的DAS181融合蛋白从粘膜切去受体唾液酸，这样防止在这些位点的病毒结合和感染。为了DAS181微球最佳地递送到呼吸病毒感染可能起始的位点，即喉、气管或支气管，所述微球必须不能(a)太大以致其在嘴的前端被捕获(即，微球太大，约8微米或更大)；或(b)太小以致其沉积在肺深部且系统地吸收进血流(即，0.5微米或更小)。为了所述DAS181微球递送到喉、气管和支气管，约1微米至约5.5-6微米尺寸范围通常是合适的。
如上所述生产的DAS181微球由Andersen级联冲击表征，并发现适合递送到上部和中部呼吸道且以足够低百分率(＜5％)沉积在肺泡。
表7：在60升每分钟下DAS181干粉的气动粒径分布
  Andersen级联冲击器的组件   相应的尺寸截留，微米   在呼吸道期望的沉积   沉积的DAS181蛋白(以mg计)   回收的总DAS181蛋白的百分比
  吸入器(Cyclohaler)   1.57±0.11   20.13％
  喉部/锥体   ＞10   口腔   0.93±0.19   11.92％
  -1(载物台+收集碟)   8.6-10   口腔   0.50±0.10   6.41％
  -0(载物台+收集碟)   6.5-8.6   口咽的   0.40±0.03   5.13％
  1(载物台+收集碟)   4.4-6.5   咽   0.58±0.03   7.44％
  2(载物台+收集碟)   3.3-4.4   气管/支气管   0.83±0.07   10.64％
  3(载物台+收集碟)   2.0-3.3   次级支气管   1.80±0.09   23.08％
  4(载物台+收集碟)   1.1-2.0   终端支气管   0.82±0.08   10.51％
  5(载物台+收集碟)   0.54-1.1   肺泡   0.23±0.03   2.95％
  6(载物台+收集碟)   0.25-0.54   肺泡   0.14±0.03   1.79％
  ∑ACI(发射)   6.24±0.10   80.00％
将10±1.0mg的DAS181干粉(8.5mg±10％DAS181蛋白)填入HPMC胶囊
∑ACI(发射)分数为从USP喉部、诱导锥体和载物台-1至6回收的所有材料的总和。
DAS181微球通过激光衍射进一步表征，激光衍射表明，与级联冲击结果一致，通过在本实施例中描述的方法生产的大多数微球在尺寸为1微米和5微米间的尺寸范围内。根据本实施例中描述的方法制备的DAS181微球的扫描电子显微镜检术(FEI Quanta 200扫描电子显微镜，EverhartThornley(ET)检测器)显示微球作为上百和上千的约0.5-3微米尺寸的单独颗粒的附聚物而存在。然而所述附聚物容易被启动中产生的穿过干粉吸入器的气体湍流分散(如通过Andersen级联冲击或激光衍射所表明)。分散在不溶解微球的液体表面活性剂(如，Triton X-100或Tween 20)或非极性溶剂(如，醇、丙酮或乙腈)中的微球的光学显微术证实聚集体容易分散为单独均匀的微球。
实施例11
使用非钠盐的硫酸盐制备DAS181微球
研究显示在一些实例中，如在一些哮喘病人中，在用于肺部施用的制剂中钠的存在会带来诱导气道高反应性(airways hyperresponsiveness)的风险(Agrawal等，Lung，183：375-387(2005))。因而本实施例测试了备选的盐，例如，诸如钾、镁和钙的其他金属的盐。
如以上实施例1中所描述生产DAS181微球。包含12mg/ml DAS181和5％(v/v)异丙醇的混合溶液包含作为抗衡离子的在2mM的浓度、pH4.5-5.0的指示的硫酸盐。通过从+25℃冷却溶液到-45℃形成微球。在冷冻后，挥发物(水和异丙醇)通过升华除去，剩下包含微球的干粉。
干粉的气动粒径分布通过Andersen级联冲击评估，且每载物台的DAS181的量通过在226nm的UV测量(A226)来测定。结果在下表8中显示。所述结果表明，非钠盐的硫酸盐可用作抗衡离子来获得一定尺寸范围的DAS181微球，所述尺寸范围使大多数微球以与当硫酸钠用作抗衡离子时递送的量相当的量递送到喉、气管和支气管。
表8：有或无钠时配制的DAS181微球的气动粒径分布
Figure GPA00001066848501311
所述干粉还在+37℃或+53℃下培养如表9中指示的持续时间，且使用如在实施例1中描述并在此通过引用并入的4-MU-NANA测定来测试唾液酸酶活性。与贮存于-80℃非冻干的DAS181微球相比的相对活性在表9中显示。所述结果表示，使用多种金属硫酸盐作为抗衡离子制备的微球的稳定性与硫酸钠的稳定性是相当的，在37℃下超过2个月保留了几乎全部或全部的活性，并且在53℃下超过10天保留了几乎全部(硫酸钠和硫酸钾)或超过85％(硫酸镁和硫酸锌)的活性。本实验表明多种不含钠的抗衡离子可产生具有期望特性的微球。
表9：DAS181微球制剂的唾液酸酶活性：加速的稳定性研究
Figure GPA00001066848501321
实施例12
DAS181微球的稳定性
通过使用如以上实施例1中描述的和通过引用并入本文的4-MU-NANA活性测定而随时间测量唾液酸酶活性来评价DAS181蛋白在微球中的稳定性。在包含10mg/ml DAS181、2mM硫酸钠、5％v/v异丙醇的混合溶液中进行干燥DAS181微球的生产。将0.01％w/v糖(山梨醇、甘露醇、海藻糖或蔗糖)加入到一些溶液中。通过从+25℃冷却溶液到-45℃形成微球。在冷冻后，挥发物(水和异丙醇)通过升华除去，剩下包含微球的干粉。
A.没有糖的DAS181微球的稳定性
在室温下(25℃)将没有糖的情况下配制的DAS181干粉微球贮存在临近Drierite干燥剂(Hammond Drierite，Xenia，OH)的容器中。所述干粉保持其原来的效能(如通过使用根据实施例1和通过引用并入本文的4-MU-NANA的唾液酸酶活性测量；结果在表10中显示)和气动粒径分布(如通过Andersen级联冲击测量；表11)至少8个月。
表10：DAS181干粉的比活性
 试验  时间0   三个月   八个月
 相对于时间0的唾液酸酶活性  100％   102.0％   99.9％
表11：DAS181干粉的气动粒径分布
 ACI组件   相应的尺寸截留，微米   呼吸道中预期的沉积   时间0   三个月   八个月
 喉部+锥体   ＞10   口腔   19.57±2.43   26.00±0.30   18.57±4.14
 载物台-1   8.6-10   口腔   17.87±0.51   12.87±1.56   15.13±2.41
 载物台-0   6.5-8.6   口咽的   10.27±0.93   7.07±0.32   9.80±1.80
 载物台1   4.4-6.5   咽   8.57±0.49   8.80±0.26   7.73±0.57
 载物台2   3.3-4.4   气管/支气管   10.67±0.23   10.70±0.35   9.30±0.82
 载物台3   2.0-3.3   次级支气管   21.10±0.75   21.80±0.52   21.90±0.87
 载物台4   1.1-2.0   终端支气管   10.10±0.75   10.63±0.80   14.50±3.22
 载物台5   0.54-1.1   肺泡   1.47±0.23   1.73±0.06   2.37±0.06
 载物台6   0.25-0.54   肺泡   0.33±0.06   0.40±0.10   0.73±0.06
表11：通过Andersen级联冲击来评估气动粒径分布，且表示为回收的总DAS181蛋白的百分比(％)。将10mg DAS181干粉填入胶囊，且使用Cyclohaler干粉吸入器作为递送设备来启动。空气流动速率为60升每分钟。分三等份进行测定，显示了平均和标准偏差。
B.在有糖情况下配制的DAS181微球的稳定性
在包含糖的干粉微球制剂和在-80℃贮存未冻干的微球制剂中的DAS181唾液酸酶活性使用如在实施例1中描述和通过引用并入本文的荧光底物4-MU-NANA测量。将如下表12指示的不包含糖或包含各种糖的干粉制剂在+42℃贮存4周(强制降解)。结果在表12中表示。相对贮存于-80℃的未冻干的制剂，不包含糖的制剂保持其差不多80％的活性。各种糖的加入增加稳定性以至保持了约88-98％的活性，这取决于所述的糖。
表12
  糖   在42℃四周后剩余的唾液酸酶活性百分比
  不含糖   79.82
  山梨醇   91.23
  甘露醇   89.47
  海藻糖   97.37
  蔗糖   88.60
研究了较高百分比的糖对DAS181微球的稳定效应。在反应混合物中存在甘氨酸用于防止糖在制造DAS181微球期间的结晶。本研究显示，高至15％的海藻糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇在与5％甘氨酸组合时可并入DAS181微球形成反应物而不在冻干期间形成晶体。所述微球基于它们在光学显微术和扫描电子显微术(SEM)下的外观，与在没有糖的情况下产生的微球无差别。微球的气动粒径分布也保持未受影响。
将5mg所得DAS181干粉置于透明的尺寸3HPMC胶囊中并在37℃下贮存。通过尺寸排阻HPLC定量分析高分子量DAS181寡聚物(降解产物)的百分量。表12A中的结果证明糖的保护作用，海藻糖和蔗糖提供最佳保护。结果是以0个月、1个月、2个月或3个月的％寡聚物来表示的。
表12A
Figure GPA00001066848501341
蔗糖和海藻糖对DAS181微球制剂的稳定效应通过以下试验进一步证实。制备包含糖的制剂和不含糖的对照制剂并保留为原料粉末(未装入胶囊的)或置于透明的尺寸3HPMC胶囊中。在37℃下贮存该样品。通过尺寸排阻HPLC定量分析高分子量DAS181寡聚物(降解产物)的百分比。表12B(下面)中的结果再次证明海藻糖和蔗糖提供明显的保护作用。结果是以0个月、1个月、2个月或8个月的％寡聚物来表示的。
表12B
Figure GPA00001066848501342
制剂包含15％w/w糖、5％w/w甘氨酸、2mM乙酸盐pH 6.0和2mM MgSO4
实施例13
使用多种化合物制备微球
本文提供的方法可用于使用多种类别的化合物制备微球。除了以上实施例中描述的诸如DAS181、BSA、胰蛋白酶、血红蛋白、DNA酶I、溶菌酶、卵白蛋白、RNA酶A、六组氨酸标签化的人蛋白酶抑制剂8(PI8，具有如SEQ ID NO：15提出的氨基酸序列)、红色荧光蛋白(RFP)和绿色荧光蛋白(GFP)的蛋白以外，本实施例证明所述方法可用于制备以下微球：
A.抗生素-万古霉素、妥布拉霉素、卡那霉素和氨苄西林
B.核酸-siRNA
C.病毒-烟草花叶病毒
D.肽-亮丙立得和生长抑素
从以上A-D制备的微球与蛋白(DAS181)微球进行比较。
微球的制备：对于以上A-D中列出的每个化合物以及对于DAS181，在室温下、96-孔微量滴定板(0.1ml混合物/孔)中制备包含溶解于水溶液中的2mg/ml化合物和以下列出的多种抗衡离子、抗溶剂和pH的混合溶液。对照溶液包含单独的溶剂或抗溶剂，有或没有抗衡离子。通过放置于致冷器中而将混合物冷却。将致冷的板转移至预冷(-45℃)的MillrockLab Series冷冻干燥机架上，然后应用真空。允许冷冻的混合溶液冻干16小时。
来自孔底部的冻干的粉末被转移至盖玻片上并通过光学显微术分析外观。产物微球的质量基于微球的均匀性、不存在不希望的非微球颗粒(玻璃样晶体形式)和不存在聚集体而评分。下表13提供了基于外观的示例性评分系统。
表13：用于评价微球质量的评分系统
  分数   存在/微球的质量   存在玻璃样晶体和/或聚集体
  0   不存在   独占的
  1   几乎不存在   几乎独占的
  2   稀少   高度主导的
  3   可观察到的   主导的
  4   相对于玻璃样晶体或聚集体大量存在   相对于微球以较少量存在
  5   主导的   稀少
  6   几乎是均匀的   可观察到的，但极微小的
  7   均匀的   可观察到的，但非常极微小的
  8   均匀的   非常少
  9   很均匀   几乎不存在
  10   完美的且均匀的   不存在
下表14显示用于产生微球的化合物、溶剂、抗溶剂和抗衡离子的多种组合和所得微球的质量。
表14：用于产生不同化合物的微球的组合
A.抗生素
化合物：妥布拉霉素
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mM柠檬酸钠   5％异丙醇   5.0   4
  2mM谷氨酸钠   5％异丙醇   4.0   2
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％异丙醇   7.0   5
  2mM衣康酸钠   5％异丙醇   4.0   9
  2mM柠檬酸钠   15％异丙醇   5.0   3
  2mM谷氨酸钠   15％异丙醇   4.0   2
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   7.0   3
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   9.0   5
  2mM衣康酸钠   15％异丙醇   4.0   8
  2mM衣康酸钠   15％正丙醇   4.0   8
化合物：卡那霉素
  抗衡离子  抗溶剂   pH   微球质量
  2mM柠檬酸钠  5％异丙醇   5.0   8
  2mM谷氨酸钠  5％异丙醇   4.0   3
  2mM衣康酸钠  5％异丙醇   4.0   8
  2mM衣康酸钠   5％异丙醇   7.0   8
  2mM柠檬酸钠   15％异丙醇   5.0   9
  2mM谷氨酸钠   15％异丙醇   4.0   4
  2mM谷氨酸钠   15％异丙醇   7.0   4
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   7.0   4
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   9.0   0
  2mM衣康酸钠   15％异丙醇   4.0   9
  抗衡离子  抗溶剂   pH   微球质量
  2mM衣康酸钠   15％异丙醇   7.0   7
  2mM柠檬酸钠   5％正丙醇   5.0   7
  2mM谷氨酸钠   5％正丙醇   4.0   5
  2mM衣康酸钠   5％正丙醇   7.0   9
  2mM衣康酸钠   15％正丙醇   4.0   8
化合物：氨苄西林
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mM柠檬酸钠   5％异丙醇   5.0   5
  2mM谷氨酸钠   5％异丙醇   4.0   4
  2mM衣康酸钠   5％异丙醇   4.0   3
  2mM柠檬酸钠   15％异丙醇   5.0   2
  2mM谷氨酸钠   15％异丙醇   4.0   3
  2mM衣康酸钠   15％异丙醇   4.0   7
  2mM柠檬酸钠   5％正丙醇   5.0   3/4
  2mM谷氨酸钠   5％正丙醇   4.0   3-5
  2mM谷氨酸钠   15％正丙醇   4.0   4
  2mM衣康酸钠   15％正丙醇   4.0   3
  2mM衣康酸钠   15％正丙醇   7.0   7
化合物：万古霉素
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mM柠檬酸钠   5％异丙醇   5.0   4
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mM谷氨酸钠   5％异丙醇   4.0   4
  2mM谷氨酸钠   5％异丙醇   7.0   7
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％异丙醇   7.0   7
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％异丙醇   9.0   6
  2mM衣康酸钠   5％异丙醇   4.0   8
  2mM衣康酸钠   5％异丙醇   7.0   8
  2mM柠檬酸钠   15％异丙醇   5.0   4
  2mM谷氨酸钠   15％异丙醇   4.0   4
  2mM谷氨酸钠   15％异丙醇   7.0   3
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   7.0   4
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   9.0   4
  2mM衣康酸钠   15％异丙醇   4.0   7
  2mM衣康酸钠   15％异丙醇   7.0   3
  2mM柠檬酸钠   5％正丙醇   5.0   9
  2mM谷氨酸钠   5％正丙醇   4.0   6
  2mM谷氨酸钠   5％正丙醇   7.0   8
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％正丙醇   7.0   3
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％正丙醇   9.0   4
  2mM衣康酸钠   5％正丙醇   4.0   5
  2mM衣康酸钠   5％正丙醇   7.0   2
  2mM柠檬酸钠   15％正丙醇   5.0   9
  2mM谷氨酸钠   15％正丙醇   4.0   7
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mM谷氨酸钠   15％正丙醇   7.0   4
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％正丙醇   9.0   4
  2mM衣康酸钠   5％正丙醇   7.0   5
对于万古霉素的试验还以更大规模(20mg万古霉素)进行，即，以在5ml总体积中2mg/ml万古霉素；和在2ml总体积中10mg/ml万古霉素。所有测试的混合物产生很高质量的万古霉素微球，如下所示：
20mg万古霉素
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  5mM柠檬酸钠   15％正丙醇   5.0   9
  5mM谷氨酸钠   5％正丙醇   7.0   9
  5mM柠檬酸钠   15％正丙醇   5.0   10
  5mM谷氨酸钠   5％正丙醇   7.0   9
B.核酸-siRNA
化合物：siRNA
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mM柠檬酸钠   5％异丙醇   4.0   2
  2mM柠檬酸钠   5％异丙醇   5.0   2
  2mM柠檬酸钠   5％异丙醇   7.0   2
  2mM谷氨酸钠   5％异丙醇   4.0   3
  2mM谷氨酸钠   5％异丙醇   7.0   1
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％异丙醇   7.0   1
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％异丙醇   9.0   1
  2mM衣康酸钠   5％异丙醇   4.0   3
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mM衣康酸钠   5％异丙醇   7.0   0
  2mM特戊酸   5％异丙醇   4.0   1
  2mM特戊酸   5％异丙醇   5.0   2
  2mM PEI 750000   5％异丙醇   7
  2mM PEI 25000   5％异丙醇   7
  2mM PEI 2000   5％异丙醇   3
  2mM硫酸钠/乙酸钠   5％异丙醇   4.0   1
  2mM硫酸钠/乙酸钠   5％异丙醇   6.0   1
  2mM柠檬酸钠   15％异丙醇   4.0   2
  2mM柠檬酸钠   15％异丙醇   5.0   1
  2mM柠檬酸钠   15％异丙醇   7.0   0
  2mM谷氨酸钠   15％异丙醇   7.0   1
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   7.0   4/5
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   9.0   4
  2mM衣康酸钠   15％异丙醇   4.0   4
  2mM特戊酸   15％异丙醇   4.0   3
  2mM特戊酸   15％异丙醇   5.0   3
  2mM PEI 750000   15％异丙醇   6
  2mM PEI 25000   15％异丙醇   6
  2mM硫酸钠/乙酸钠   15％异丙醇   4.0   1
  2mM硫酸钠/乙酸钠   15％异丙醇   6.0   3
化合物：siRNA(2mg/ml)
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  无   15％异丙醇   10
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   7.0   7/8
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   9.0   4
  2mM衣康酸钠   15％异丙醇   4.0   3
  2mM PEI 25000   15％异丙醇   8
  1mM PEI 25000   15％异丙醇   7
  0.5mM PEI 25000   15％异丙醇   7
  0.1mM PEI 25000   15％异丙醇   7
  2mM精氨酸HCl/NaOH   30％异丙醇   7.0   5
  2mM精氨酸HCl/NaOH   30％异丙醇   9.0   5/6
  2mM衣康酸钠   30％异丙醇   4.0   8
  2mM PEI 25000   30％异丙醇   7
  1mM PEI 25000   30％异丙醇   8
  0.5mM PEI 25000   30％异丙醇   9
  0.1mM PEI 25000   30％异丙醇   6
化合物：siRNA(0.25mg/ml)
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   7.0   0
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   9.0   0
  2mM精氨酸HCl/NaOH   30％异丙醇   7.0   6
  2mM精氨酸HCl/NaOH   30％异丙醇   9.0   3
化合物：siRNA(5mg/ml)
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   7.0   3
  2mM衣康酸钠   15％异丙醇   4.0   5
  2mM精氨酸HCl/NaOH   30％异丙醇   7.0   4
  2mM精氨酸HCl/NaOH   30％异丙醇   4.0   4
C.病毒-烟草花叶病毒
化合物：烟草花叶病毒(0.5mg/ml)
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  无   5％异丙醇   8
  2mM柠檬酸钠   5％异丙醇   4.0   9
  2mM柠檬酸钠   5％异丙醇   5.0   4
  2mM特戊酸钠   5％异丙醇   4.0   6
  2mM谷氨酸钠   5％异丙醇   7.0   7
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％异丙醇   7.0   8
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％异丙醇   9.0   8
  2mM硫酸钠/乙酸钠   5％异丙醇   4.0   10
  2mM硫酸钠/乙酸钠   5％异丙醇   6.0   7
  2mM柠檬酸钠   无**   4.0   5
  2mM柠檬酸钠   无   5.0   2
  2mM特戊酸钠   无   5.0   8
  2mM谷氨酸钠   无   7.0   3
  2mM精氨酸HCl/NaOH   无   7.0   6
  2mM精氨酸HCl/NaOH   无   9.0   2
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mM硫酸钠/乙酸钠   无   4.0   4
  2mM硫酸钠/乙酸钠   无   6.0   6
**如上可知，即使不存在抗溶剂，烟草花叶病毒也能形成具有良好质量的微球。观察到一些结晶，但取决于对抗衡离子的选择(例如，特戊酸)，可在不添加抗溶剂的情况下获得均一的微球。
D.肽-生长抑素和亮丙立得
化合物：生长抑素
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mM柠檬酸钠   5％异丙醇   4.0   5
  2mM柠檬酸钠   5％异丙醇   5.0   5
  2mM柠檬酸钠   5％异丙醇   7.0   5
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％异丙醇   7.0   5
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％异丙醇   9.0   5
  2mM衣康酸钠   5％异丙醇   4.0   5
  2mM衣康酸钠   5％异丙醇   7.0   3
  2mM特戊酸钠   5％异丙醇   4.0   5
  2mM特戊酸钠   5％异丙醇   7.0   6
  2mM谷氨酸钠   5％异丙醇   4.0   6
  2mM谷氨酸钠   5％异丙醇   7.0   4
  2mM PEI 750000   4
  2mM PEI 25000   4
  2mM PEI 2000   3
  2mM硫酸钠/乙酸钠   5％异丙醇   4.0   8
  2mM硫酸钠/乙酸钠   5％异丙醇   6.0   5
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mM柠檬酸钠   15％异丙醇   4.0   5
  2mM柠檬酸钠   15％异丙醇   5.0   5
  2mM柠檬酸钠   15％异丙醇   7.0   4
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   7.0   5
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   9.0   7
  2mM衣康酸钠   15％异丙醇   4.0   5
  2mM衣康酸钠   15％异丙醇   7.0   6
  2mM特戊酸钠   15％异丙醇   4.0   6
  2mM特戊酸钠   15％异丙醇   7.0   6
  2mM谷氨酸钠   15％异丙醇   4.0   7
  2mM谷氨酸钠   15％异丙醇   7.0   3
  2mM PEI 750000   3
  2mM PEI 25000   4
  2mM PEI 2000   4
  2mM硫酸钠/乙酸钠   15％异丙醇   4.0   4
  2mM硫酸钠/乙酸钠   15％异丙醇   6.0   6
化合物：亮丙立得
  抗衡离子  抗溶剂   pH   微球质量
  2mM柠檬酸钠  5％异丙醇   4.0   7
  2mM柠檬酸钠  5％异丙醇   5.0   7
  2mM柠檬酸钠  5％异丙醇   7.0   7
  抗衡离子  抗溶剂   pH   微球质量
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％异丙醇   7.0   5
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％异丙醇   9.0   6
  2mM衣康酸钠   5％异丙醇   4.0   5
  2mM衣康酸钠   5％异丙醇   7.0   5
  2mM特戊酸钠   5％异丙醇   4.0   7
  2mM特戊酸钠   5％异丙醇   7.0   6
  2mM谷氨酸钠   5％异丙醇   4.0   7
  2mM谷氨酸钠   5％异丙醇   7.0   4
  2mM PEI 750000   4
  2mM PEI 25000   6
  2mM PEI 2000   3
  2mM硫酸钠/乙酸钠   5％异丙醇   4.0   8
  2mM硫酸钠/乙酸钠   5％异丙醇   6.0   5
  2mM柠檬酸钠   15％异丙醇   4.0   5/6
  2mM柠檬酸钠   15％异丙醇   5.0   7
  2mM柠檬酸钠   15％异丙醇   7.0   4
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   7.0   4
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   9.0   5
  2mM衣康酸钠   15％异丙醇   4.0   5
  2mM衣康酸钠   15％异丙醇   7.0   5
  2mM特戊酸钠   15％异丙醇   4.0   7
  2mM特戊酸钠   15％异丙醇   7.0   7
  抗衡离子  抗溶剂   pH   微球质量
  2mM谷氨酸钠   15％异丙醇   4.0   7
  2mM谷氨酸钠   15％异丙醇   7.0   8
  2mM PEI 750000   8
  2mM PEI 25000   4
  2mM PEI 2000   4
  2mM硫酸钠/乙酸钠   15％异丙醇   4.0   7
  2mM硫酸钠/乙酸钠   15％异丙醇   6.0   5
E.DAS181蛋白
化合物：DAS181
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mM柠檬酸钠   5％异丙醇   4.0   7
  2mM柠檬酸钠   5％异丙醇   5.0   7
  2mM柠檬酸钠   5％异丙醇   7.0   5
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％异丙醇   7.0   4
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％异丙醇   9.0   5
  2mM衣康酸钠   5％异丙醇   4.0   5
  2mM衣康酸钠   5％异丙醇   7.0   5
  2mM特戊酸钠   5％异丙醇   4.0   5
  2mM特戊酸钠   5％异丙醇   7.0   7
  2mM谷氨酸钠   5％异丙醇   4.0   6
  2mM谷氨酸钠   5％异丙醇   7.0   6
  2mM PEI 750000   8
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mM PEI 25000   10
  2mM PEI 2000   7
  2mM硫酸钠/乙酸钠   5％异丙醇   4.0   8
  2mM硫酸钠/乙酸钠   5％异丙醇   6.0   7
  2mM柠檬酸钠   15％异丙醇   4.0   5/6
  2mM柠檬酸钠   15％异丙醇   5.0   7
  2mM柠檬酸钠   15％异丙醇   7.0   6
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   7.0   4
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％异丙醇   9.0   7
  2mM衣康酸钠   15％异丙醇   4.0   7
2mM衣康酸钠 15％异丙醇 7.0 7
  2mM特戊酸钠   15％异丙醇   4.0   6
  2mM特戊酸钠   15％异丙醇   7.0   7
  2mM谷氨酸钠   15％异丙醇   4.0   6
  2mM谷氨酸钠   15％异丙醇   7.0   5
  2mM PEI 750000   8
  2mM PEI 25000   9
  2mM PEI 2000   6
  2mM硫酸钠/乙酸钠   15％异丙醇   4.0   7
  2mM硫酸钠/乙酸钠   15％异丙醇   6.0   8
  2mM柠檬酸钠   5％正丙醇   5.0   10
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％正丙醇   7.0   3
  抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mM精氨酸HCl/NaOH   5％正丙醇   9.0   7
  2mM衣康酸钠   5％正丙醇   4.0   5
  2mM衣康酸钠   5％正丙醇   7.0   2
  2mM谷氨酸钠   5％正丙醇   4.0   6
  2mM谷氨酸钠   5％正丙醇   7.0   4
  2mM柠檬酸钠   15％正丙醇   5.0   8/9
  2mM精氨酸HCl/NaOH   15％正丙醇   9.0   6
  2mM衣康酸钠   15％正丙醇   4.0   4
  2mM衣康酸钠   15％正丙醇   7.0   2
  2mM谷氨酸钠   15％正丙醇   4.0   6/7
  2mM谷氨酸钠   15％正丙醇   7.0   4
结果：这些试验表明，通过选择化合物、抗衡离子和抗溶剂的(a)类型和(b)浓度的合适组合，可使用多种大分子和小分子获得具有良好质量(至少6，高至10)的微球。取决于化合物、抗衡离子和抗溶剂的特定组合，在可比较的条件下，微球的质量通常与使用唾液酸酶融合蛋白(DAS181)所获得的微球的质量相当或更好。
在不含化合物的对照混合反应物(cocktail reaction)中，注意到某些抗衡离子，例如聚乙烯亚胺(PEI)和乙酸钠/硫酸盐，可在某些条件下形成微球。不受限于任何理论，取决于感兴趣的化合物，这样的抗衡离子可能能够作为有助于成核和/或促进相对于采用“非成核的”抗衡离子更高质量的微球的形成的“引物”或“载体”。例如，化合物的形成(见，例如，在上表14中，从siRNA和DAS181、使用PEI作为抗衡离子形成的微球)。
所述结果进一步表明，在某些情况下，微球可在不存在抗衡离子和/或抗溶剂的情况下形成。例如，对于siRNA的情况，当不添加抗衡离子时获得很高质量(级别10)的微球。类似地，在不存在抗衡离子时，以及在某些情况下不存在抗溶剂时，烟草花叶病毒形成微球。
实施例14
微球的尺寸和质量作为混合物组分(化合物、抗衡离子、抗溶剂)的浓度的函数
本实施例表明，小分子化合物的微球的尺寸和质量，如同大分子的微球的尺寸和质量一样(见实施例2-4)，可通过以高通量的方式以多种排列改变诸如化合物、抗衡离子和/或抗溶剂的浓度的参数而易于优化。通过以高通量的方式进行这些反应，可快速确定对于任何化合物的微球形成的最佳条件。
如实施例1中所述准备包含多种浓度条件下的四环素、卡那霉素或氨苄西林的96-孔板。精氨酸用作抗衡离子而异丙醇用作抗溶剂。如下表15中所示改变每种混合物组分-化合物、抗衡离子和抗溶剂-的浓度，并评价对微球质量的影响。
表15
  四环素浓度(mg/ml)   精氨酸浓度(mg/ml)   异丙醇(％)   微球质量
  25   60   0   1
  25   60   10   3
  25   60   20   4
  25   60   30   7
  25   60   40   5
  25   60   50   6
  20   48   60   6
  15   36   70   1
  25   60   50   5
  25   50   50   9
  25   40   50   9
  25   30   50   9
  25   20   50   7
  25   10   50   7
  25   5   50   7
  25   0   50   9
  四环素浓度(mg/ml)   精氨酸浓度(mg/ml)   异丙醇(％)   微球质量
  0   15   25   7
  5   15   25   9
  10   15   25   8/9
  15   15   25   8/9
  20   15   25   7
  25   15   25   8
  30   15   25   9
  31.25   15   25   7
  卡那霉素浓度(mg/ml)   精氨酸浓度(mg/ml)   异丙醇(％)   微球质量
  25   60   0   0
  25   60   10   0
  25   60   20   0
  25   60   30   3
  25   60   40   0
  25   60   50   0
  20   48   60   6
  25   60   50   0
  25   50   50   0
  四环素浓度(mg/ml)   精氨酸浓度(mg/ml)   异丙醇(％)   微球质量
  25   40   50   2
  25   30   50   4
  25   20   50   7
  25   10   50   10
  25   5   50   7
  25   0   50   8
  0   15   25   0
  5   15   25   4
  10   15   25   8
  15   15   25   7
  20   15   25   7
  25   15   25   8
  30   15   25   7
  31.25   15   25   9
  氨苄西林浓度(mg/ml)   精氨酸浓度(mg/ml)   异丙醇(％)   微球质量
  25   60   0   0
  25   60   10   3
  25   60   20   0
  氨苄西林浓度(mg/ml)   精氨酸浓度(mg/ml)   异丙醇(％)   微球质量
  25   60   30   0
  25   60   40   0
  25   60   50   6
  15   36   70   0
  25   60   50   2
  25   20   50   0
  25   10   50   1
  25   5   50   1
  25   0   50   2
结果：
四环素：对于四环素，抗溶剂的不存在导致很少，如果有，微球形成。随着抗溶剂的浓度增加，微球的质量增加，在约30％异丙醇时达到最大。超过30％后增加异丙醇的浓度导致总体微球质量降低和形成微球较大的块状附聚和晶体固体。在60％和70％的异丙醇浓度，发现混合物在冷冻前沉淀，导致大量聚集体和晶体。在最高异丙醇浓度形成一些微球，但它们不具有均匀的尺寸。
然后，微球质量作为抗衡离子(精氨酸)浓度的函数而评价。发现在恒定的抗溶剂和四环素浓度下，随着精氨酸浓度降低，微球尺寸分布降低且其总体质量增加，30mg/ml精氨酸给出最小的尺寸分布，通过光学显微术可见。有趣地注意到，不存在抗衡离子时观察到具有很小尺寸变化的小微球。它们的总体质量是高的，尽管存在一定量的聚集。
微球质量还通过在恒定的抗溶剂和精氨酸浓度下增加四环素浓度而评价。不存在四环素时形成吸湿性的精氨酸微球。增加四环素浓度时发现，微球尺寸在25-30mg/ml四环素浓度时增加到最大值，然后随着四环素浓度进一步增加而又降低。在25-30mg/ml四环素下，聚集也是最小的；聚集随着四环素浓度进一步增加而增加。
卡那霉素：从卡那霉素形成微球需要至少25-30％抗溶剂(异丙醇)；此浓度以下，形成吸湿性的晶体。在60％异丙醇下获得更好的结果，尽管在冷冻前存在损害微球质量的沉淀。
当作为改变的精氨酸浓度的函数而研究卡那霉素微球时，发现降低精氨酸浓度导致更高的质量，较小的微球。然后，在小于10mg/ml精氨酸下，微球变得更大并且倾向于附聚更多。不存在精氨酸时，再次获得高质量的微球，尽管存在一定的聚集。
当改变卡那霉素的浓度时，发现随着卡那霉素的浓度的增加，微球的质量增加并且尺寸降低。
氨苄西林：虽然使用氨苄西林获得了微球，但其吸湿特性使得难于清楚地指定其质量。通常，几种条件产生明显的微球，最好质量的微球在高(50％)抗溶剂浓度下观察到。
本实施例表明，多种小分子抗生素可通过本文提供的方法产生微球。本实施例还表明，在某些条件下，添加抗衡离子对微粒形成可能不是必须的。这在测试的所有三种抗生素中观察到。不受限于任何理论，化合物自身作为抗衡离子或者在试验中使用的制剂包含作为抗衡离子的赋形剂/杂质/填充剂，是可能的。
实施例15
从不溶于水的分子紫杉醇制备微球
化学治疗剂紫杉醇具有高于3的log P值(辛醇/水分配系数的log)(Bombuwala等人，Beilstein J.Org.Chem.2006，2：13)，该值是表示目前市场上很大比例的小分子药物的值。因此，确定用于紫杉醇微球形成的条件应当可应用于大量治疗相关的化合物。
不溶于水的紫杉醇溶解于以下有机溶剂之一：异丙醇、叔丁醇或DMSO。使用紫杉醇在每种有机溶剂中的20mg/ml储备溶液在96-孔板中产生混合溶液，其中紫杉醇在每个孔(即，反应)中的净浓度为2mg/ml紫杉醇。对于异丙醇，获得了20mg/ml的浆料且其用作储备溶液，因为紫杉醇在异丙醇中的溶解度低于在叔丁醇和DMSO中的溶解度。2mM柠檬酸钠缓冲液，pH 5.0，用作抗溶剂和抗衡离子。多种试验条件在下表16中列出。然后将包含具有相对于有机溶剂的浓度的不同浓度的抗溶剂/缓冲液的混合溶液的板置于-80℃的冷冻机中用于冻干。
表16
化合物：紫杉醇(2mg/ml)
  柠檬酸盐缓冲液(mM)   溶剂(％)
  2   90％异丙醇
  2   75％异丙醇
  2   50％异丙醇
  2   25％异丙醇
  2   10％异丙醇
  0   100％异丙醇
  0   50％异丙醇
  柠檬酸盐缓冲液(mM)   溶剂(％)
  2   90％叔丁醇
  2   75％叔丁醇
  2   50％叔丁醇
  2   25％叔丁醇
  2   10％叔丁醇
  0   100％叔丁醇
  0   50％叔丁醇
  2   90％DMSO
  2   75％DMSO
  2   50％DMSO
  2   25％DMSO
  2   10％DMSO
  0   100％DMSO
  0   50％DMSO
结果：
对于所有三种有机溶剂，发现如果溶剂浓度为25％或更低，则紫杉醇沉淀。冻干样品的光学显微术显示，对于有机溶剂异丙醇，微粒质量随着异丙醇浓度从90％降低而增加，最好的微球在50％异丙醇中形成。当异丙醇的浓度降低至50％以下时观察到晶体，可能由于紫杉醇在冷冻前的沉淀。当使用50％异丙醇而没有柠檬酸盐抗衡离子时，微球显示比在2mM柠檬酸盐存在下更高的聚集倾向。对于100％异丙醇且没有柠檬酸盐抗衡离子，样品看起来具有高结晶度并且聚集，尽管还观察到许多小微粒。
对于叔丁醇，最适宜的溶剂浓度是高于异丙醇，在90％叔丁醇时观察到最好的结果，并且随着溶剂浓度的降低，聚集和棒状形成增加。在25％和10％叔丁醇下观察到显著的结晶，很可能由于紫杉醇在冷冻前的沉淀。在100％叔丁醇而没有柠檬酸盐抗衡离子下，微球的质量几乎与以上讨论的在90％叔丁醇和2mM柠檬酸盐下观察到的最佳质量的微球一样高。当叔丁醇的浓度降低至50％时，在不存在柠檬酸盐抗衡离子的情况下，尽管聚集增加了，但仍存在高质量的微球。
相对于异丙醇和叔丁醇，采用有机溶剂DMSO获得的结果通常显示较大量的结晶连同较低质量的聚集的微球。这可能是由于DMSO的高沸点，因为在溶液中的水可能在冻干时首先蒸发/升华，导致紫杉醇从接近纯的DMSO溶液中结晶。然而光学显微术数据确实揭示微球的存在，最好的微球在使用50％DMSO时观察到。
实施例16
药物、抗溶剂和抗衡离子的比例对微球质量的影响
进行试验以评价抗溶剂和抗衡离子浓度变化对微球形成的影响。在多种形成微球的条件下测试肽亮丙立得和生长抑素以及抗生素万古霉素和妥布拉霉素。表17描述了进行反应的条件。如在先前的实施例中所描述，在96-孔板中分析样品。
表17
化合物：亮丙立得(2mg/ml)
  谷氨酸钠，pH7.0(mM)   异丙醇(％)   微球质量
  2   50   9
  2   40   7
  2   30   8
  2   20   9
  2   10   5
  2   5   7
  2   2.5   8
  2   0   3
  17   5   5
  15   5   5
  12.5   5   7
  谷氨酸钠，pH7.0(mM)   异丙醇(％)   微球质量
  10   5   7
  7.5   5   7
  5   5   6
  2.5   5   7
  0   5   6
化合物：生长抑素(2mg/ml)
  硫酸钠/乙酸钠，pH4.0(mM)   异丙醇(％)   微球质量
  2   50   9
  2   40   8
  2   30   9
  2   20   7
  2   10   6/7
  2   5   6
  2   2.5   3/4
  2   0   3
  17   5   6
  15   5   8
  12.5   5   9
  硫酸钠/乙酸钠，pH4.0(mM)   异丙醇(％)   微球质量
  10   5   7
  7.5   5   7
  5   5   6/7
  2.5   5   6
  0   5   7
化合物：万古霉素(2mg/ml)
  柠檬酸钠，pH 5.0(mM)   异丙醇(％)   微球质量
  2   50   7
  2   40   9
  2   30   8
  2   20   10
  2   10   7
  2   5   9
  2   2.5   7
  2   0   7
  17   5   6
  15   5   7
  12.5   5   7
  柠檬酸钠，pH 5.0(mM)   异丙醇(％)   微球质量
  10   5   8
  7.5   5   9/8
  5   5   9
  2.5   5   9/8
  0   5   7
化合物：妥布拉霉素(2mg/ml)
  衣康酸钠，pH4.0(mM)   异丙醇(％)   微球质量
  2   50   7
  2   40   6/7
  2   30   8/9
  2   20   8
  2   10   9
  2   5   7/8
  2   2.5   7/8
  2   0   4/5
  17   5   晶体
  15   5   晶体
  12.5   5   晶体
  衣康酸钠，pH4.0(mM)   异丙醇(％)   微球质量
  10   5   晶体
  7.5   5   晶体
  5   5   晶体
  2.5   5   7
  0   5   8
结果：
在亮丙立得组中，降低抗溶剂的浓度减少了微球的聚集，在10％异丙醇时最佳，并且随着异丙醇浓度进一步降低至0％，聚集再次增加。当在恒定的抗溶剂浓度(5％)下改变抗衡离子浓度时，17mM抗衡离子显示高度的晶体形成。晶体形成随着抗衡离子(缓冲液)浓度的降低而减少，直到10mM，微球的大小均匀并且良好地分开。随着缓冲液浓度超过10mM进一步降低，聚集开始再次增加，在0mM谷氨酸盐时观察到中度的结晶度。
在生长抑素的情况下，在50％异丙醇时观察到大小均匀的、良好分开的微球。聚集的水平随着抗溶剂降低而增加，到10％异丙醇时最佳。10％异丙醇以下时晶体开始出现，并且随着抗溶剂浓度降低直至0％异丙醇而继续增加，0％异丙醇时，大部分样品是晶体，仅有很少聚集的微球。当在恒定的抗溶剂浓度(5％)改变抗衡离子浓度时，在17mM硫酸盐/乙酸盐和5％异丙醇下出现微球，但还观察到高度的结晶。随着抗衡离子浓度降低，存在的晶体的量降低，直到在12.5mM抗衡离子浓度检测到良好分开的微球。随着硫酸盐/乙酸盐浓度进一步降低，聚集再次增加并且微球尺寸降低。还发现生长抑素在不存在抗衡离子的情况下形成微球，但它们聚集并具有变化的(不均匀的)尺寸。
在万古霉素的情况下，改变抗溶剂的浓度，从50％直到2.5％产生了小但轮廓分明的微球。当溶剂浓度进一步降低至0％异丙醇，出现了高度的结晶，有一些聚集的微球。当改变抗衡离子浓度时，发现微球在17mM柠檬酸盐时高度聚集，并且聚集的量随着抗衡离子浓度降低而降低。在7.5mM柠檬酸盐以下形成最好的微球，但随着抗衡离子浓度进一步降低至零，聚集的量再次增加。
在妥布拉霉素的情况下，随着抗溶剂浓度变化，50％异丙醇时出现显著量的结晶和聚集，尽管也检测到微球。随着抗溶剂浓度从40％降低至10％，发现形成的微球是良好分开的并且具有高质量。当抗溶剂浓度从5％进一步降低至0％，聚集的量再次增加并且在0％时出现高度结晶连同显著量的聚集的微球。
实施例17
用于吸入的万古霉素微球的气动粒径分布
如本文所述，本文提供的方法可用于生产任何期望尺寸范围的微球，包括用于通过吸入递送的约0.5微米至约6-8微米的范围。
A.微球的制备
将万古霉素溶解于含水缓冲液中，最终浓度为10mg/ml。该混合物包含作为抗衡离子的5mM柠檬酸钠pH 5.0和作为抗溶剂的15％v/v正丙醇。将混合物的2ml等份在置于-80℃冷冻机中的10ml冻干瓶中冷冻1小时。将冷冻的瓶转移至-45℃的冷冻干燥机架上并冷冻干燥36小时。
B.微球的气动粒径分布
如实施例5中所述制备的微球通过使用新一代冲击器(New GenerationImpactor)的级联冲击(Cascade Impaction)测试如实施例5中所述制备的微球。呼吸道中的药物沉积可通过在级联冲击器的载物台/收集碟上的颗粒(微球)的空气动力学行为预测。
将微球(10mg)装载到HPMC(羟丙基甲基纤维素)胶囊。将该胶囊置于CycloHaler(PharmaChemie)干粉吸入器中并经受级联冲击。代表吸入后沉积的不同区域/阶段(气管、主支气管和次级支气管、终端支气管、肺泡等)的冲击器的收集碟用硅喷雾来涂覆以防止微球跳动。来自载物台和收集碟的微球回收到包含0.1％吐温的磷酸盐缓冲盐水中，且通过测量280nm处吸光度量化回收自每一个载物台和收集碟的沉积的万古霉素的量。
结果：微球的几何尺寸通过光学显微术评估，且发现微球的几何尺寸在1.0-3.0微米的范围。如下表18中所示，气动粒径与观察到的几何尺寸一致。结果表明本文提供的方法可生产用于递送到肺部深处的微球，且通过本文提供的方法生产的微球具有出众的脱附聚和流动性质(提供更高的递送剂量)。
表18：万古霉素微球的级联冲击分析结果
  级联冲击器的组件   相应的尺寸截留(微米)   呼吸道中预期的沉积   万古霉素的沉积百分比
  胶囊+设备   不适用   不适用   37.57
  喉部   ＞10   口腔   10.48
  1   ＞8.06   口腔/咽   3.33
  2   4.46-8.06   咽   7.71
  3   2.82-4.46   气管/支气管   15.47
  4   1.66-2.82   次级支气管   16.69
  5   0.94-1.66   终端支气管/肺泡   6.38
  6   0.55-0.94   肺泡   1.59
  级联冲击器的组件   相应的尺寸截留(微米)   呼吸道中预期的沉积   万古霉素的沉积百分比
  7   0.34-0.55   肺泡   0.51
  8   ＜0.34   肺泡   0.27
实施例18
使用前列腺素制备微球
前列腺素是在多种生理过程中涉及的一组类激素化合物，并因此具有临床应用。前列腺素之一，前列环素PGI2，是目前市场化用于肺动脉高压的药物。该药物在生理pH中的API半衰期是在分钟级别，这要求药物通过连续输注施用以具有明显效果。因此，制造可吸入的并直接对肺中的作用靶位点起作用的PGI2制剂是所期望的，以避免与血流中的清除速率和稳定性相关的药代动力学影响。本实施例表明，本文提供的方法可用于制备前列腺素的高质量、可吸入的微球。
使用PGI2和PGI2的类似物西前列烯以2mg/ml的浓度进行试验。混合溶液在室温下混合，然后通过置于冷冻机中而冷却。将致冷的板转移至预冷的(-45℃)Millrock Lab Series冷冻干燥机架上，然后应用真空。允许冷冻的混合溶液冻干16小时。
因为所得前列腺素微球是吸湿性的，在微球开始后，在试验期间使用连接到冷冻机上的回填系统的氮气罐将湿度维持在低水平。每个反应管用N2冲刷。此外，将冷冻机上的回填阀置于打开以使低湿度气氛连续冲刷经过样品。用于显示所得微球的显微镜包含在用干燥N2连续净化的塑料袋内。将样品管置于所述袋之下以在打开并展开到盖玻片上之前平衡约30秒。
前列腺素在低于8的pH值下是不稳定的；因此，在本试验中使用以下的碱性缓冲液：聚乙烯亚胺(PEI)、三乙胺(TEA)和精氨酸。西前列烯在水溶液中不是高度可溶的，因此将使该化合物可溶的量的正丙醇加入缓冲液。用于前列腺素的溶剂/抗溶剂系统是水/正丙醇/叔丁醇(对于在水中具有差的溶解度的西前列烯，水/含水缓冲液更多地是“抗溶剂”组分，而对于在水中具有较高溶解度的PGI2，正丙醇/叔丁醇(叔丁醇，tBA)更多地是“抗溶剂”组分)。结果在下表19中总结：
表19
化合物：前列腺素I2
  缓冲液/抗衡离子   pH   (％正丙醇)   (％叔丁醇)   微球质量
  2mM精氨酸   9   20   0   7
  2mM精氨酸   9   30   0   5
  2mM精氨酸   9   20   5   7/8
  缓冲液/抗衡离子   pH   (％正丙醇)   (％叔丁醇)   微球质量
  2mM精氨酸   9   20   30   5
  2mM精氨酸   9   20   55   5/6
  2mM精氨酸   9   20   70   4
  2mM TEA   11   20   0   0
  2mM TEA   11   30   0   2/3
  2mM TEA   11   20   5   7/8
  2mM TEA   11   20   30   8
  2mM TEA   11   20   55   7
  2mM TEA   11   20   70   8
  2mM PEI   10.75   20   0   7
  2mM PEI   10.75   30   0   8
  2mM PEI   10.75   20   5   7
  2mM PEI   10.75   20   30   5
  2mM PEI   10.75   20   55   7
  2mM PEI   10.75   20   70   6
化合物：西前列烯
  缓冲液/抗衡离子   pH   (％正丙醇)   (％叔丁醇)   微球质量
  2mM精氨酸   9   20   0   7/8
  2mM精氨酸   9   30   0   6
  2mM精氨酸   9   20   5   8
  2mM精氨酸   9   20   30   6/7
  2mM精氨酸   9   20   55   8
  缓冲液/抗衡离子   pH   (％正丙醇)   (％叔丁醇)   微球质量
  2mM精氨酸   9   20   70   7
  2mM TEA   11   20   0   4/5
  2mM TEA   11   30   0   3/4
  2mM TEA   11   20   5   8/7
  2mM TEA   11   20   30   7
  2mM TEA   11   20   55   6/7
  2mM TEA   11   20   70   5/6
  2mM PEI   10.75   20   0   6
  2mM PEI   10.75   30   0   6/7
  2mM PEI   10.75   20   5   9
  2mM PEI   10.75   20   30   8
  2mM PEI   10.75   20   55   7
  2mM PEI   10.75   20   70   6
结果：
对于PGI2，确定了良好质量的微球形成的几种条件，几个等级为大于6且最大的等级为8。当缓冲液/抗衡离子是精氨酸时，较低浓度的正丙醇和叔丁醇，有利于更好的微球形成的醇浓度，观察到晶体形成。另一方面，当缓冲液/抗衡离子是TEA时，较高浓度的叔丁醇有利于较高质量的微球形成。当缓冲液/抗衡离子是PEI时，在较高浓度的正丙醇(30％)和不存在叔丁醇下获得最佳质量的微球。
西前列烯是PGI2的更稳定的类似物，且其还表现出较低的吸湿性。采用精氨酸缓冲液，未观察到特别的浓度依赖的趋势，但几种溶剂条件产生具有级别为8的高质量微球(见，例如20％正丙醇/5％叔丁醇和20％正丙醇/55％叔丁醇)。采用TEA，用正丙醇、不存在叔丁醇的情况下获得的微球的质量是低的。微球质量随着叔丁醇加入混合溶液而增加，最大值在约5％叔丁醇。随着叔丁醇浓度进一步增加，观察到增加量的聚集。PEI证明是用于西前列烯的最佳抗衡离子，在20％正丙醇/5％叔丁醇具有级别为9的最大微球质量。随着叔丁醇浓度的进一步增加，观察到增加量的聚集。
结果表明，前列腺素的高质量微球可在多种条件下形成，这应该方便用于肺部递送的稳定制剂。
实施例19
冷却速度对微球质量的影响
本实施例表明，与闪冻相反，控制的冷却速度产生具有期望特性的较高质量的微球，在控制冷却期间，产生微球的混合溶液在规定的一段时间内被维持在特定温度。采用先前在根据本文提供的方法进行的标准冷冻条件下产生优秀的微球的5种不同的混合物进行闪冻试验。化合物/抗衡离子/抗溶剂条件如下：
1)紫杉醇/柠檬酸盐pH 5.0/90％叔丁醇(见实施例15)
2)DAS181/柠檬酸盐pH 5/5％正丙醇(见实施例13)
3)烟草花叶病毒/硫酸钠-乙酸钠pH 4/5％异丙醇(见实施例13)
4)万古霉素/柠檬酸盐pH 5/5％正丙醇(见实施例13)
5)四环素/精氨酸/25％-30％异丙醇(见实施例14)
采用在2mL冻干瓶中的200μl每种以上的混合溶液(第一闪冻条件)和在PCR管中的25μl每种以上的混合溶液(第二闪冻条件)进行试验。在冻干瓶中的样品经过约15秒冻结。在PCR管中的样品经过3秒或更少冻结。
结果：
样品的显微分析显示，冷冻速度在大多数情况下对微球形成具有显著影响。紫杉醇样品在闪冻后的两种情况下主要是晶体，尽管存在微球开始形成的迹象。DAS181混合物在冻干瓶中闪冻时显示高质量的微球，级别为9。然而在更快冷冻的PCR管试验中，DAS181微球的质量降低至级别5；观察到显著量的棒状晶体，尽管存在一些微粒。对于烟草花叶病毒，在两种闪冻情况下形成级别为9的高质量微球。由此看来，烟草花叶病毒微球的形成在试验条件下未受冷冻速度的高度影响。
另一方面，对于万古霉素，微球质量随着冷冻速度的增加而降低。虽然万古霉素混合物在正常冷冻条件下产生级别为9/10的微球，如实施例13所描述，但200μl闪冻样品提供了级别为7的较低质量的微球并观察到聚集。PCR管闪冻产生级别为5的更低质量的微球、较大量的聚集和显著量的棒状晶体。因此，在万古霉素的情况下，较快的冷冻速度导致较低质量的微球。类似地，对于四环素，虽然在正常冷冻条件下获得级别为8/9的微球(见实施例14)，但两种闪冻条件都产生级别为5/6的较低质量的微球还有显著的聚集。
结果表明，冷的速度可能对根据本文提供的方法产生的微球的质量有影响。然而，所述影响依赖于形成微球的化合物。如本实施例中所示，对于诸如紫杉醇、DAS181、万古霉素和四环素的某些化合物，如果冷冻速度太快，则微球可能在有机会生长为合理尺寸之前陷入晶相或聚集。
实施例20
核酸并入微球的效率
为了评价核酸并入微球的过程收率(process yield)进行以下试验。将在0.5ml体积中的1mg酵母tRNA(Sigma，X-SA型)(在混合物中的最终浓度为2mg/ml)与异丙醇(IPA；40％最终浓度)和柠檬酸钠(100mM最终浓度)在pH 8.0下合并。通过将混合物置于冰上而诱导从所得混合物形成微粒。通过加入10ml(20体积)IPA使微球固定，然后通过在5000rpm下离心分离3min做成小球。将小球在真空中干燥。显微分析证实1-2微米尺寸的高质量微球的形成，并且不存在聚集的物质或晶体。
通过在260nm的UV吸收测定在小球和上清液中回收的tRNA的量。发现78％的tRNA被包裹到微粒中而22％的tRNA保留在上清液中。这个结果表明，tRNA以及可能的其他核酸，例如DNA和siDNA，可被有效压缩和包裹到微球制剂中。
实施例21
并入微球的siRNA保持其活性
进行试验以确定如本文提供的生产微球的方法是否抑制了并入微球的分子的活性。
siRNA微球的制备
用于本试验的示例性的分子是双链的GAPDH siRNA(正义序列5’-UGGUUUACAUGUUCCAAUAUU-3’(SEQ ID NO：27)；反义序列5’-UAUUGGAACAUGUAAACCAUU-3’(SEQ ID NO：28)；在每个3’-端具有两个“UU”突出)。产生了在多种混合物制剂中包含GAPDH siRNA的微球，如下所述：
1：2mM精氨酸，pH 7.0，15％IPA，2mg/ml siRNA
2：2mM PEI(25,000mol wt，分支的，Sigma)，pH 10，15％IPA，2mg/mlsiRNA
3：2mM衣康酸，pH 8.0，15％IPA，2mg/ml siRNA
4：10mM(谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸，3∶2∶5摩尔比)，5％IPA，1mg/ml，
5：10mM(赖氨酸、柠檬酸，1∶4摩尔比)，15％IPA，1mg/ml siRNA，
6：10mM(赖氨酸、柠檬酸，1∶1摩尔比)，15％IPA，1mg/ml siRNA
7：10mM丙氨酸，15％IPA，1mg/ml siRNA
对照制剂包含除了siRNA以外的所有混合物成分。冻干的siRNA对照不包含赋形剂和15％IPA。
将所得混合物致冷以形成微球然后通过将瓶置于-80℃冷冻机架上而以单步冷冻该混合物。冻干在架温度为+10℃和150mTorr的真空中过夜进行。
微球制剂中的siRNA的活性
然后，从冻干中分离的siRNA微球被重建并转染至Hep-2细胞。作为正对照，将在初始缓冲液中相同量的GAPDH siRNA冻干、重建并转染，不形成微球。在转染后48h使用荧光酶法测定Hep-2细胞中的GAPDH水平。结果(表20)表明，处理成微球的siRNA具有基因沉默活性，所述活性等于或在某些情况下甚至大于相应的正对照的活性(即，100％或更大的基因沉默活性)。显微分析证实了高质量微球的形成。
表20.当单独使用或当并入微球时siRNA的基因沉默活性
  样品号   制剂混合物   ％活性
  冻干的siRNA正对照(没有微球)   100±20
  1   2mM精氨酸，pH 7.0，15％IPA，2mg/ml siRNA   75±25
  2   2mM PEI(25,000mol wt，分支的，Sigma)，pH 10，15％IPA，2mg/ml siRNA   115±15
  3   2mM衣康酸，pH 8.0，15％IPA，2mg/ml siRNA   110±2
  样品号   制剂混合物   ％活性
  1负   与1相同，但没有siRNA(负对照)   0
  2负   与2相同，但没有siRNA(负对照)   0
  3负   与3相同，但没有siRNA(负对照)   0
  4   10mM(谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸，3∶2∶5摩尔比)，5％IPA，1mg/mlsiRNA   135±25
  5   10mM(赖氨酸、柠檬酸，1∶4摩尔比)，15％IPA，1mg/ml siRNA   125±25
  6   10mM(赖氨酸、柠檬酸，1∶1摩尔比)，15％IPA，1mg/ml siRNA   130±20
  7   10mM丙氨酸，15％IPA，1mg/ml siRNA   125±20
  4负   与4相同，但没有siRNA(负对照)   3±5
  5负   与5相同，但没有siRNA(负对照)   11±12
  6负   与6相同，但没有siRNA(负对照)   30±35
  #7负   与7相同，但没有siRNA(负对照)   31±34
通过本文所述的方法产生的包含GAPDH siRNA的微球在水中重建为10uM的siRNA。负对照包括不含siRNA的每种制剂。对于正对照，冻干的GAPDH siRNA重建为10uM siRNA。使用基于脂质的siPORTTM NeoFXTM转染试剂(Applied Biosystems#AM4510)将每种siRNA样品转染至Hep-2细胞中。在转染后48hr，使用KDalertTMGAPDH测定试剂盒(Applied Biosystems#AM1639)来测量GAPDH酶活性。在负对照(转染中未使用siRNA)中的荧光读数用于设定基线。在正对照(siRNA不经受冻干)中的荧光读数的变化设定为siRNA的100％活性。
实施例22
包含作为活性剂的核酸和作为载体的明胶的微球
本实施例表明，本文提供的方法可用于制备包含明胶的微球，并且所述明胶可作为微球中其他活性剂的载体。包含明胶的微球是稳定的，并且当核酸连同明胶一起并入时，它们保持其稳定性。制备的微球包含来自多种如下来源的明胶：
A.来自牛的皮肤的明胶，类型B(Sigma，G9382)
B.来自猪的皮肤的明胶，类型A(Sigma，G2500)
C.来自冷水鱼类的皮肤的明胶(Sigma，G7041)
包含明胶的微球的制备：对于以上A-C中列出的每种明胶化合物，在室温下、96-孔微量滴定板(0.1ml混合物/孔)中制备混合溶液，该混合溶液包含溶解于含水溶剂中的从2.5mg/ml至25mg/ml的明胶、不同pH的抗衡离子和作为抗溶剂的不同浓度的IPA，如下所列。通过置于冷冻机中而将96孔板中的混合物冷却。将致冷冻的板转移至预冷(-45℃)的Millrock Lab Series冷冻干燥机架上，然后应用真空。允许冷冻的混合溶液冻干16小时。
来自孔底部的冻干的粉末被转移至盖玻片上并通过光学显微术分析外观。产物微球的质量基于微球的均匀性、不存在不希望的非微球颗粒(玻璃样晶体形式)和不存在聚集体而评分。使用如表13中描述的评分系统。
下表21显示用于产生微球的化合物、溶剂、抗溶剂和抗衡离子的多种组合和所得微球的质量。
表21：明胶微球
化合物：来自牛的皮肤的明胶，类型B
  化合物浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2.5mg/ml   20mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   2
  2.5mg/ml   20mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   3
  2.5mg/ml   20mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   8
  10mg/ml   20mM柠檬酸   5％异丙醇   3.5   6
  10mg/ml   20mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   5
  10mg/ml   20mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   2
  10mg/ml   20mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   2
  25mg/ml   20mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   1
化合物：来自猪的皮肤的明胶，类型A
  化合物浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2.5mg/ml   20mM柠檬酸   5％异丙醇   3.5   1
  2.5mg/ml   20mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   2
  2.5mg/ml   20mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   2
  5mg/ml   20mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   6
  5mg/ml   20mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   5
  化合物浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  5mg/ml   20mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   2
  10mg/ml   20mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   1
  10mg/ml   20mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   1
化合物：来自冷水鱼类的皮肤的明胶
  化合物浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2.5mg/ml   20mM柠檬酸   5％异丙醇   3.5   3
  2.5mg/ml   20mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   2
  2.5mg/ml   20mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   2
  2.5mg/ml   20mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   5
  5mg/ml   20mM柠檬酸   5％异丙醇   3.5   6
  5mg/ml   20mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   6
  5mg/ml   20mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   8
  5mg/ml   20mM柠檬酸   30％正丙醇   3.5   9
  10mg/ml   20mM柠檬酸   5％异丙醇   3.5   1
  10mg/ml   20mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   7
  10mg/ml   20mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   5
  25mg/ml   20mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   8
  25mg/ml   20mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   6
  2.5mg/ml   20mM Tris   5％异丙醇   8   1
  2.5mg/ml   20mM Tris   10％异丙醇   8   1
  2.5mg/ml   20mM Tris   20％异丙醇   8   8
  化合物浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2.5mg/ml   20mM Tris   30％异丙醇   8   7
  5mg/ml   20mM Tris   10％异丙醇   8   5
  5mg/ml   20mM Tris   30％异丙醇   8   5
  10mg/ml   20mM Tris   10％异丙醇   8   1
  10mg/ml   20mM Tris   20％异丙醇   8   5
  10mg/ml   20mM Tris   30％异丙醇   8   1
  25mg/ml   20mM Tris   20％异丙醇   8   9
  25mg/ml   20mM Tris   30％异丙醇   8   9
包含明胶和核酸的微球的制备：对于以上A-C中列出的三种明胶化合物中的每一种，在室温下、96-孔微量滴定板(0.1ml混合物/孔)中制备混合溶液，该混合溶液包含溶解于含水溶剂中的15mg/ml的明胶和多种浓度的tRNA以及不同pH的抗衡离子和作为抗溶剂的不同浓度的IPA，如下所列。用于本试验的tRNA是来自Bakers Yeast的X-SA型(Sigma，R8759)。通过置于冷冻机中而冷却该混合溶液。将致冷的板转移至预冷(-45℃)的Millrock Lab Series冷冻干燥机架上，然后应用真空。允许冷冻的混合溶液冻干16小时。
来自孔底部的冻干的粉末被转移至盖玻片上并通过光学显微术分析外观。产物微球的质量基于微球的均匀性、不存在不希望的非微球颗粒(玻璃样晶体形式)和不存在聚集体而评分。
化合物：来自牛的皮肤的明胶，类型B，与tRNA
  tRNA浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mg/ml   10mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   7
  2mg/ml   10mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   5
  2mg/ml   10mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   4
  2mg/ml   10mM柠檬酸   40％异丙醇   3.5   5
  1mg/ml   10mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   1
  tRNA浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  1mg/ml   10mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   3
  1mg/ml   10mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   5
  1mg/ml   10mM柠檬酸   40％异丙醇   3.5   5
0.5mg/ml 10mM柠檬酸 10％异丙醇 3.5 3
  0.5mg/ml   10mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   2
  0.5mg/ml   10mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   3
0.5mg/ml 10mM柠檬酸 40％异丙醇 3.5 3
0.1mg/ml 10mM柠檬酸 30％异丙醇 3.5 2
0.1mg/ml 10mM柠檬酸 40％异丙醇 3.5 4
  2mg/ml   10mM Tris   30％异丙醇   8   2
  2mg/ml   10mM Tris   40％异丙醇   8   1
  1mg/ml   10mM Tris   40％异丙醇   8   2
  0.5mg/ml   10mM Tris   40％异丙醇   8   1
化合物：来自猪的皮肤的明胶，类型A，与tRNA
  tRNA浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mg/ml   10mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   4
  2mg/ml   10mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   6
  2mg/ml   10mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   2
  2mg/ml   10mM柠檬酸   40％异丙醇   3.5   5
  tRNA浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  1mg/ml   10mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   2
  1mg/ml   10mM柠檬酸   40％异丙醇   3.5   2
  0.5mg/ml   10mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   3
  0.5mg/ml   10mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   1
  0.5mg/ml   10mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   5
  0.5mg/ml   10mM柠檬酸   40％异丙醇   3.5   1
  0.1mg/ml   10mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   8
  0.1mg/ml   10mM柠檬酸   40％异丙醇   3.5   3
  2mg/ml   10mM Tris   30％异丙醇   8   1
2mg/ml 10mM Tris 40％异丙醇 8 2
1mg/ml 10mM Tris 30％异丙醇 8 3
  1mg/ml   10mM Tris   40％异丙醇   8   3
0.5mg/ml 10mM Tris 30％异丙醇 8 3
0.5mg/ml 10mM Tris 40％异丙醇 8 3
0.1mg/ml 10mM Tris 40％异丙醇 8 2
化合物：来自冷水鱼类的皮肤的明胶，与tRNA
  tRNA浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mg/ml   10mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   5
  tRNA浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  2mg/ml   10mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   5
  2mg/ml   10mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   4
  2mg/ml   10mM柠檬酸   40％异丙醇   3.5   5
  1mg/ml   10mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   4
  1mg/ml   10mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   4
  1mg/ml   10mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   6
  1mg/ml   10mM柠檬酸   40％异丙醇   3.5   4
  0.5mg/ml   10mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   10
  0.5mg/ml   10mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   8
  0.5mg/ml   10mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   8
  0.5mg/ml   10mM柠檬酸   40％异丙醇   3.5   7
  0.1mg/ml   10mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   7
0.1mg/ml 10mM柠檬酸 30％异丙醇 3.5 7
  0.1mg/ml   10mM柠檬酸   40％异丙醇   3.5   7
  2mg/ml   10mM Tris   20％异丙醇   8   6
  2mg/ml   10mM Tris   30％异丙醇   8   5
  2mg/ml   10mM Tris   40％异丙醇  8   6
  1mg/ml   10mM Tris   10％异丙醇  8   4
  1mg/ml   10mM Tris   20％异丙醇  8   5
  1mg/ml   10mM Tris   30％异丙醇  8   7
  1mg/ml   10mM Tris   40％异丙醇  8   4
  tRNA浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  0.5mg/ml   10mM Tris   10％异丙醇  8   2
  0.5mg/ml   10mM Tris   20％异丙醇  8   8
  0.5mg/ml   10mM Tris   30％异丙醇  8   8
  0.5mg/ml   10mM Tris   40％异丙醇  8   4
  0.1mg/ml   10mM Tris   10％异丙醇  8   2
  0.1mg/ml   10mM Tris   20％异丙醇  8   4
  0.1mg/ml   10mM Tris   30％异丙醇  8   3
  0.1mg/ml   10mM Tris   40％异丙醇  8   5
结果：这些试验表明，通过选择合适的参数可获得稳定的明胶微球。此外，诸如核酸的活性剂可并入明胶基质以产生具有规定功效的药品。
实施例23
使用多糖作为载体制备微球
本实施例表明本文提供的方法可用于制备包含多糖的微球。多糖又可以是用于并入微球的治疗剂或活性剂的载体。测试了以下化合物：
A)硫酸葡聚糖钠盐(Sigma，D 6924)
B)羟丙基-B-环糊精(Tokyo Chemical Industry Co，Ltd，H0979)
微球的制备：对于以上化合物A)和B)，在室温下、96-孔微量滴定板(0.1ml混合物/孔)中制备混合溶液，该混合溶液包含从0.5mg/ml至10mg/ml的化合物以及不同pH的抗衡离子和作为抗溶剂的不同浓度的IPA，如下所列。通过放置于致冷器中而将混合物冷却。将致冷的板转移至预冷(-45℃)的Millrock Lab Series冷冻干燥机架上，然后应用真空。允许冷冻的混合溶液冻干16小时。
来自孔底部的冻干的粉末被转移至盖玻片上并通过光学显微术分析外观。产物微球的质量基于微球的均匀性、不存在不希望的非微球颗粒(玻璃样晶体形式)和不存在聚集体而评分。
化合物：硫酸葡聚糖
  化合物浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  5mg/ml   10mM柠檬酸   5％异丙醇   3.5   4
  5mg/ml   10mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   5
  化合物浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  5mg/ml   10mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   2
  5mg/ml   10mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   6
  1mg/ml   10mM柠檬酸   5％异丙醇   3.5   2
  1mg/ml   10mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   4
  1mg/ml   10mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   3
  5mg/ml   10mM Tris   5％异丙醇   8   2
  5mg/ml   10mM Tris   10％异丙醇   8   2
  5mg/ml   10mM Tris   20％异丙醇   8   2
  10mg/ml   30mM柠檬酸   5％异丙醇   3.5   2
  10mg/ml   30mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   3
  10mg/ml   30mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   2
  5mg/ml   30mM柠檬酸   5％异丙醇   3.5   2
  5mg/ml   30mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   3
  5mg/ml   30mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   2
  5mg/ml   30mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   2
  1mg/ml   30mM柠檬酸   5％异丙醇   3.5   2
  1mg/ml   30mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   1
  10mg/ml   10mM柠檬酸   5％异丙醇   5.2   1
  10mg/ml   10mM柠檬酸   10％异丙醇   5.2   4
  10mg/ml   10mM柠檬酸   20％异丙醇   5.2   2
  10mg/ml   10mM柠檬酸   30％异丙醇   5.2   1
  5mg/ml   10mM柠檬酸   5％异丙醇   5.2   2
  化合物浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  5mg/ml   10mM柠檬酸   10％异丙醇   5.2   3
  5mg/ml   10mM柠檬酸   20％异丙醇   5.2   1
  10mg/ml   30mM柠檬酸   20％异丙醇   5.2   1
  10mg/ml   30mM柠檬酸   30％异丙醇   5.2   1
  5mg/ml   30mM柠檬酸   5％异丙醇   5.2   3
  5mg/ml   30mM柠檬酸   10％异丙醇   5.2   1
  5mg/ml   30mM柠檬酸   20％异丙醇   8   1
  5mg/ml   30mM柠檬酸   30％异丙醇   5.2   3
  10mg/ml   30mM Tris   5％异丙醇   8   3
  10mg/ml   30mM Tris   10％异丙醇   8   1
  10mg/ml   30mM Tris   20％异丙醇   8   3
  10mg/ml   30mM Tris   30％异丙醇   8   4
  5mg/ml   30mM Tris   5％异丙醇   8   3
  5mg/ml   30mM Tris   20％异丙醇   8   4
  5mg/ml   30mM Tris   30％异丙醇   8   2
  10mg/ml   10mM Tris   5％异丙醇   11   2
  10mg/ml   10mM Tris   30％异丙醇   11   1
  5mg/ml   10mM Tris   5％异丙醇   11   2
  5mg/ml   10mM Tris   10％异丙醇   11   5
  5mg/ml   10mM Tris   20％异丙醇   11   5
  5mg/ml   10mM Tris   30％异丙醇   11   2
  1mg/ml   10mM Tris   5％异丙醇   11   5
  化合物浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  1mg/ml   10mM Tris   10％异丙醇   11   4
  1mg/ml   10mM Tris   20％异丙醇   11   4
  1mg/ml   10mM Tris   30％异丙醇   11   3
  10mg/ml   30mM Tris   10％异丙醇   11   1
  10mg/ml   30mM Tris   30％异丙醇   11   5
  5mg/ml   30mM Tris   5％异丙醇   11   1
  5mg/ml   30mM Tris   30％异丙醇   11   2
化合物：羟丙基-B-环糊精
  化合物浓度   抗衡离子   抗溶剂   pH   微球质量
  5mg/ml   10mM柠檬酸   5％异丙醇   3.5   1
  5mg/ml   10mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   2
  5mg/ml   10mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   1
  1mg/ml   10mM柠檬酸   10％异丙醇   3.5   1
  1mg/ml   10mM柠檬酸   20％异丙醇   3.5   4
  1mg/ml   10mM柠檬酸   30％异丙醇   3.5   5
  0.5mg/ml   10mM柠檬酸   5％异丙醇   3.5   2
  5mg/ml   10mM Tris   20％异丙醇   8   1
结果：这些试验表明，通过选择化合物、抗衡离子和抗溶剂的(a)类型和(b)浓度的合适组合可获得多糖微球。
实施例24
氨基酸微球
本实施例表明，本文提供的方法可用于制备包含多种氨基酸的微球，所述氨基酸自身可以是活性剂或治疗剂或者作为用于其他活性剂和治疗剂的载体。制备了以下氨基酸的微球：
A.丙氨酸
B.谷氨酸
C.色氨酸
D.甲硫氨酸
E.苯丙氨酸
F.甘氨酸
G.赖氨酸(Lycine)
氨基酸微球的制备：对于以上A-G列出的每种化合物，在室温下、96-孔微量滴定板(0.1ml混合物/孔)中制备混合溶液，该混合溶液包含在不同pH下溶解于含水溶剂的20mM氨基酸和作为抗溶剂的不同浓度的异丙醇(IPA)，如下所列。通过放置于致冷器中而将混合物冷却.将致冷的板转移至预冷(-45℃)的Millrock Lab Series冷冻干燥机架上，然后应用真空。允许冷冻的混合溶液冻干16小时。
来自孔底部的冻干的粉末被转移至盖玻片上并通过光学显微术分析外观。产物微球的质量基于微球的均匀性、不存在不希望的非微球颗粒(玻璃样晶体形式)和不存在聚集体而评分。使用如表13中所述的评分系统。
下表24显示用于产生微球的化合物、溶剂和抗溶剂的多种组合以及所得微球的质量。
表24：氨基酸微球
氨基酸：
化合物：丙氨酸
  抗溶剂   pH   微球质量
  5％异丙醇   7   9
  10％异丙醇   7   2
  20％异丙醇   7   8
  30％异丙醇   7   5
  5％异丙醇   6   7
化合物：谷氨酸
  抗溶剂   pH   微球质量
  5％异丙醇   3.2   6
  10％异丙醇   3.2   3
  抗溶剂   pH   微球质量
  20％异丙醇   3.2   6
化合物：色氨酸
  抗溶剂   pH   微球质量
  5％异丙醇   7   5
  10％异丙醇   7   4
  20％异丙醇   7   7
  30％异丙醇   7   4
  20％异丙醇   6   2
  30％异丙醇   6   7
化合物：甲硫氨酸
  抗溶剂   pH   微球质量
  5％异丙醇   7   3
  10％异丙醇   7   4
  20％异丙醇   7   1
  30％异丙醇   7   2
  5％异丙醇   5.7   2
  10％异丙醇   5.7   7
  30％异丙醇   5.7   1
化合物：苯丙氨酸
  抗溶剂   pH   微球质量
  10％异丙醇   7   6
  抗溶剂   pH   微球质量
  20％异丙醇   7   8
  30％异丙醇   7   5
  5％异丙醇   5.5   6
  10％异丙醇   5.5   5
  20％异丙醇   5.5   3
  30％异丙醇   5.5   7
化合物：甘氨酸
  抗溶剂   pH   微球质量
  5％异丙醇   7   7
  10％异丙醇   7   6
  20％异丙醇   7   4
  30％异丙醇   7   4
  5％异丙醇   6   5
  10％异丙醇   6   5
  20％异丙醇   6   3
  30％异丙醇   6   6
化合物：赖氨酸
  抗溶剂   pH   微球质量
  5％异丙醇   7   3
  20％异丙醇   7   7
  30％异丙醇   7   3
  抗溶剂   pH   微球质量
  5％异丙醇   5.5   4
  10％异丙醇   5.5   5
  30％异丙醇   5.5   7
结果：这些试验表明，通过选择氨基酸、抗衡离子和抗溶剂的(a)类型和(b)浓度的合适组合可获得由氨基酸组成的微球。
因为修改对本领域技术人员是明显的，因此，意图是本发明仅由所附权利要求书的范围限制。
序列表
<110>耐百生物制药有限公司
 
<120>治疗性微球的制备和用途
 
<130>21865-005WO1
 
<150>US 60/961,872
<151>2007-07-24
 
<160>28
 
<170>用于Windows的FastSEQ版本4.0
 
<210>1
<211>901
<212>PRT
<213>粘性放线菌
 
<400>1
Met Thr Ser His Ser Pro Phe Ser Arg Arg Arg Leu Pro Ala Leu Leu
 1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Pro Leu Ala Ala Thr Gly Leu Ile Ala Ala Ala Pro Pro
            20                  25                  30
Ala His Ala Val Pro Thr Ser Asp Gly Leu Ala Asp Val Thr Ile Thr
        35                  40                  45
Gln Val Asn Ala Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Ser Val Gly Asp Val Met
    50                  55                  60
Thr Phe Asn Ile Thr Leu Thr Asn Thr Ser Gly Glu Ala His Ser Tyr
65                  70                  75                  80
Ala Pro Ala Set Thr Asn Leu Ser Gly Asn Val Ser Lys Cys Arg Trp
                85                  90                  95
Arg Asn Val Pro Ala Gly Thr Thr Lys Thr Asp Cys Thr Gly Leu Ala
            100                 105                 110
Thr His Thr Val Thr Ala Glu Asp Leu Lys Ala Gly Gly Phe Thr Pro
        115                 120                 125
Gln Ile Ala Tyr Glu Val Lys Ala Val Glu Tyr Ala Gly Lys Ala Leu
    130                 135                 140
Ser Thr Pro Glu Thr Ile Lys Gly Ala Thr Ser Pro Val Lys Ala Asn
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Val Glu Set Ile Thr Pro Ser Ser Ser Gln Glu Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Leu Gly Asp Thr Val Ser Tyr Thr Val Arg Val Arg Ser Val Ser
            180                 185                 190
Asp Lys Thr Ile Asn Val Ala Ala Thr Glu Ser Ser Phe Asp Asp Leu
        195                 200                 205
Gly Arg Gln Cys His Trp Gly Gly Leu Lys Pro Gly Lys Gly Ala Val
    210                 215                 220
Tyr Asn Cys Lys Pro Leu Thr His Thr Ile Thr Gln Ala Asp Val Asp
225                 230                 235                 240
Ala Gly Arg Trp Thr Pro Ser Ile Thr Leu Thr Ala Thr Gly Thr Asp
                245                 250                 255
Gly Ala Thr Leu Gln Thr Leu Thr Ala Thr Gly Asn Pro Ile Asn Val
            260                 265                 270
Val Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser
        275                 280                 285
Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala Asn
    290                 295                 300
Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn
305                 310                 315                 320
Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn
                325                 330                 335
Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser
            340                 345                 350
Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly
        355                 360                 365
Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val
    370                 375                 380
Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp
385                 390                 395                 400
Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly
                405                 410                 415
Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp
            420                 425                 430
Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr
        435                 440                 445
Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro
    450                 455                 460
His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly
465                 470                 475                 480
Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp
                485                 490                 495
Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val
            500                 505                 510
Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly
        515                 520                 525
Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp
    530                 535                 540
Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala
545                 550                 555                 560
Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala
                565                 570                 575
Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg
            580                 585                 590
Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr
        595                 600                 605
Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala
    610                 615                 620
Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn
625                 630                 635                 640
Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp
                645                 650                 655
Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Glu Pro Ser Pro Ala Pro
            660                 665                 670
Ser Pro Thr Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Thr Glu Lys Pro Ala Pro
        675                 680                 685
Ser Ala Ala Pro Ser Ala Glu Pro Thr Gln Ala Pro Ala Pro Ser Ser
    690                 695                 700
Ala Pro Glu Pro Ser Ala Ala Pro Glu Pro Ser Ser Ala Pro Ala Pro
705                 710                 715                 720
Glu Pro Thr Thr Ala Pro Ser Thr Glu Pro Thr Pro Ala Pro Ala Pro
                725                 730                 735
Ser Ser Ala Pro Glu Gln Thr Asp Gly Pro Thr Ala Ala Pro Ala Pro
            740                 745                 750
Glu Thr Ser Ser Ala Pro Ala Ala Glu Pro Thr Gln Ala Pro Thr Val
        755                 760                 765
Ala Pro Ser Val Glu Pro Thr Gln Ala Pro Gly Ala Gln Pro Ser Ser
    770                 775                 780
Ala Pro Lys Pro Gly Ala Thr Gly Arg Ala Pro Ser Val Val Asn Pro
785                 790                 795                 800
Lys Ala Thr Gly Ala Ala Thr Glu Pro Gly Thr Pro Ser Ser Ser Ala
                805                 810                 815
Ser Pro Ala Pro Ser Arg Asn Ala Ala Pro Thr Pro Lys Pro Gly Met
            820                 825                 830
Glu Pro Asp Glu Ile Asp Arg Pro Ser Asp Gly Thr Met Ala Gln Pro
        835                 840                 845
Thr Gly Gly Ala Ser Ala Pro Ser Ala Ala Pro Thr Gln Ala Ala Lys
    850                 855                 860
Ala Gly Ser Arg Leu Ser Arg Thr Gly Thr Asn Ala Leu Leu Ile Leu
865                 870                 875                 880
Gly Leu Ala Gly Val Ala Val Val Gly Gly Tyr Leu Leu Leu Arg Ala
                885                 890                 895
Arg Arg Ser Lys Asn
            900
 
<210>2
<211>394
<212>PRT
<213>粘性放线菌
 
<400>2
Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser Thr
 1               5                  10                  15
Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala Asn Thr
            20                  25                  30
Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn Gly
        35                  40                  45
Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn Gly
    50                  55                  60
Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser Thr
65                  70                  75                  80
Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly Thr
                85                  90                  95
Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val Asp
            100                 105                 110
His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp Gln
        115                 120                 125
Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly Ile
    130                 135                 140
Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp Thr
145                 150                 155                 160
His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr Ala
                165                 170                 175
Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro His
            180                 185                 190
Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly Ala
        195                 200                 205
Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp Gln
    210                 215                 220
Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val Glu
225                 230                 235                 240
Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly Ser
                245                 250                 255
Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp Ser
            260                 265                 270
Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala Gln
        275                 280                 285
Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala Lys
    290                 295                 300
Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg Asp
305                 310                 315                 320
Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr Thr
                325                 330                 335
Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala Val
            340                 345                 350
Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn Gly
        355                 360                 365
Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp Leu
    370                 375                 380
Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Glu
385                 390
<210>3
<211>24
<212>PRT
<213>人类
 
<400>3
Asn Gly Arg Arg Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys Lys
 1               5                  10                  15
Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser
            20
<210>4
<211>27
<212>PRT
<213>人类
 
<400>4
Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val
 1               5                  10                  15
Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser
            20                  25
<210>5
<211>34
<212>PRT
<213>人类
 
<400>5
Gln Ile His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn Cys Arg Leu Tyr Arg Lys
 1               5                  10                  15
Ala Asn Lys Ser Ser Lys Leu Val SerAla Asn Arg Leu Phe Gly Asp
            20                  25                  30
Lys Ser
 
<210>6
<211>34
<212>PRT
<213>人类
 
<400>6
Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg
 1               5                  10                  15
Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala Val Tyr Gln
            20                  25                  30
Ala Gly
 
<210>7
<211>12
<212>PRT
<213>人类
 
<400>7
Arg Arg Leu Arg Arg Met Glu Ser Glu Ser Glu Ser
1                5                  10
 
<210>8
<211>21
<212>PRT
<213>人类
 
<400>8
Lys Arg Lys Lys Lys Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn Arg
1               5                   10                  15
Lys Lys Lys Asn Pro
            20
<210>9
<211>400
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>9
Met Gly Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala
 1               5                  10                  15
Asn Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro
            20                  25                  30
Asn Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly
        35                  40                  45
Asn Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg
    50                  55                  60
Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln
65                  70                  75                  80
Gly Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val
                85                  90                  95
Val Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr
            100                 105                 110
Asp Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg
        115                 120                 125
Gly Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr
    130                 135                 140
Trp Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp
145                 150                 155                 160
Thr Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly
                165                 170                 175
Pro His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly
            180                 185                 190
Gly Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr
        195                 200                 205
Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val
    210                 215                 220
Val Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp
225                 230                 235                 240
Gly Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr
                245                 250                 255
Trp Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn
            260                 265                 270
Ala Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg
        275                 280                 285
Ala Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser
    290                 295                 300
Arg Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp
305                 310                 315                 320
Thr Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile
                325                 330                 335
Ala Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His
            340                 345                 350
Asn Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn
        355                 360                 365
Trp Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Lys Arg Lys Lys Lys
    370                 375                 380
Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn Arg Lys Lys Lys Asn Pro
385                 390                 395                 400
 
<210>10
<211>422
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>10
Met Val Lys Arg Lys Lys Lys Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg
 1               5                  10                  15
Asn Arg Lys Lys Lys Asn Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp His Pro
            20                  25                  30
Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser Thr Glu Leu Pro Ala
        35                  40                  45
Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala Asn Thr Ala Thr Asp Asn
    50                  55                  60
Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn Gly Asp Leu Leu Ile
65                  70                  75                  80
Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn Gly Gly Ser Asp Ala
                85                  90                  95
Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys
            100                 105                 110
Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly Thr Glu Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val Asp His Gln Thr Gly
    130                 135                 140
Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp Gln Gly Trp Gly Gly
145                 150                 155                 160
Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly Ile Ile Gln Ala Glu
                165                 170                 175
Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp Thr His Arg Thr Ile
            180                 185                 190
Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr Ala Arg Phe Ala Ala
        195                 200                 205
Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro His Ala Gly Arg Leu
    210                 215                 220
Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly Ala Val Gln Ala Val
225                 230                 235                 240
Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp Gln Ala Gly Thr Pro
                 245                 250                 255
Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val Glu Leu Ser Asp Gly
            260                 265                 270
Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly Ser Gly Phe Arg Lys
        275                 280                 285
Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp Ser Glu Pro Val Ser
    290                 295                 300
Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala GlnIle Ile Arg Ala
305                310                 315                 320
Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala Lys Val Leu Leu Leu
                325                  30                 335
Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg Asp Arg Gly Thr Ile
            340                 345                 350
Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr Thr Ser Lys Val Phe
        355                 360                 365
His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala Val Gln Ser Asp Gly
    370                 375                 380
Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn Gly Ala Asp Tyr Gly
385                 390                 395                 400
Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp Leu Gly Glu Gln Cys
                405                 410                 415
Gly Gln Lys Pro Ala Glu
            420
 
<210>11
<211>415
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>11
Met Gly Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala
 1               5                  10                  15
Asn Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro
            20                  25                  30
Asn Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly
        35                  40                  45
Asn Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg
    50                  55                  60
Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln
65                  70                  75                  80
Gly Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val
                85                  90                  95
Val Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr
            100                 105                 110
Asp Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg
        115                 120                 125
Gly Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr
    130                 135                 140
Trp Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp
145                 150                 155                 160
Thr Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly
                165                 170                 175
Pro His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly
            180                 185                 190
Gly Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr
        195                 200                 205
Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val
    210                 215                 220
Val Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp
225                 230                 235                 240
Gly Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr
                245                 250                 255
Trp Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn
            260                 265                 270
Ala Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg
        275                 280                 285
Ala Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser
     290                 295                 300
Arg Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp
305                 310                 315                 320
Thr Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile
                325                 330                 335
Ala Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His
            340                 345                 350
Asn Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn
        355                 360                 365
Trp Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Glu Pro Ser Pro Ala
    370                 375                 380
Pro Ser Pro Thr Ala Ala Pro Ser Ala Ala Lys Arg Lys Lys Lys Gly
385                 390                 395                 400
Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn Arg Lys Lys Lys Asn Pro
                405                 410                 415
 
<210>12
<211>404
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>12
Met Gly His His His His His His Leu Glu Gly Asp His Pro Gln Ala
 1               5                  10                  15
Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met
            20                  25                  30
Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala Asn Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg
        35                  40                  45
Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr
    50                  55                  60
Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn
65                  70                  75                  80
Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp
                 85                  90                  95
Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val
            100                 105                 110
Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val Asp His Gln Thr Gly Thr Ile
        115                 120                 125
Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg
    130                 135                 140
Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser
145                 150                 155                 160
Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp Thr His Arg Thr Ile Thr Ala
                165                 170                 175
Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly
            180                 185                 190
Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Val Gln
        195                 200                 205
Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly Ala Val Gln Ala Val Ser Val
    210                 215                 220
Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly
225                 230                 235                 240
Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu
                245                 250                 255
Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala
            260                 265                 270
His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys
        275                 280                 285
Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro
    290                 295                 300
Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala Lys Val Leu Leu Leu Ser His
305                 310                 315                 320
Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met
                325                 330                 335
Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr Thr Ser Lys Val Phe His Glu
            340                 345                 350
Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile
        355                 360                 365
Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile
    370                 375                 380
Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln
385                 390                 395                 400
Lys Pro Ala Glu
 
<210>13
<211>416
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>13
Met Lys Arg Lys Lys Lys Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn
 1               5                  10                  15
Arg Lys Lys Lys Asn Pro Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro
            20                  25                  30
Ala Pro Asp Ala Ser Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln
        35                  40                  45
His Leu Ala Ala Asn Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile
    50                  55                  60
Thr Thr Ala Pro Asn Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro
65                  70                  75                  80
Lys Asp Asn Gly Asn Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile
                85                  90                  95
Val Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr
            100                 105                 110
Tyr Ile His Gln Gly Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp
        115                 120                 125
Pro Ser Tyr Val Val Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His
    130                 135                 140
Val Lys Ser Tyr Asp Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp
145                 150                 155                 160
Pro Glu Asn Arg Gly Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp
                165                 170                 175
Asn Gly Trp Thr Trp Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys
            180                 185                 190
Asp Lys Pro Trp Thr Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln
        195                 200                 205
Ile Gln His Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile
    210                 215                 220
Arg Thr Ala Gly Gly Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp
225                 230                 235                 240
His Gly Lys Thr Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp
                245                 250                 255
Glu Asn Lys Val Val Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser
            260                 265                 270
Arg Ala Ser Asp Gly Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp
        275                 280                 285
Gly Gly Gln Thr Trp Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp
    290                 295                 300
Ser Val Asp Asn Ala Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro
305                 310                 315                 320
Asp Asp Pro Arg Ala Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro
                325                 330                 335
Arg Pro Trp Ser Arg Asp Arg Gly ThrIle Ser Met Ser Cys Asp Asp
            340                 345                 350
Gly Ala Ser Trp Thr Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly
        355                 360                 365
Tyr Thr Thr Ile Ala Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser
    370                 375                 380
Glu Asp Ala His Asn Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn
385                 390                 395                 400
Phe Thr Met Asn Trp Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Glu
                405                 410                 415
<210>14
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>用于N-端优化的随机引物序列
     (aa)
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(1)...(10)
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<400>14
Met Xaa Xaa Lys Arg Lys Lys Lys Gly Gly
 1               5                  10
 
<210>15
<211>374
<212>PRT
<213>人类
 
<220>
<223>蛋白酶抑制剂8(PI8)(丝氨酸蛋白酶抑制剂B8)
 
<400>15
Met Asp Asp Leu Cys GluAla Asn Gly Thr Phe Ala Ile Ser Leu Phe
 1               5                 10                  15
Lys Ile Leu Gly Glu Glu Asp Asn Ser Arg Asn Val Phe Phe Ser Pro
            20                  25                  30
Met Ser Ile Ser Ser Ala Leu Ala Met Val Phe Met Gly Ala Lys Gly
        35                  40                  45
Ser Thr Ala Ala Gln Met Ser Gln Ala Leu Cys Leu Tyr Lys Asp Gly
    50                  55                  60
Asp Ile His Arg Gly Phe Gln Ser Leu Leu Ser Glu Val Asn Arg Thr
65                  70                  75                  80
Gly Thr Gln Tyr Leu Leu Arg Thr Ala Asn Arg Leu Phe Gly Glu Lys
                85                  90                  95
Thr Cys Asp Phe Leu Pro Asp Phe Lys Glu Tyr Cys Gln Lys Phe Tyr
            100                 105                 110
Gln Ala Glu Leu Glu Glu Leu Ser Phe Ala Glu Asp Thr Glu Glu Cys
        115                 120                 125
Arg Lys His Ile Asn Asp Trp Val Ala Glu Lys Thr Glu Gly Lys Ile
    130                 135                 140
Ser Glu Val Leu Asp Ala Gly Thr Val Asp Pro Leu Thr Lys Leu Val
145                 150                 155                 160
Leu Val Asn Ala Ile Tyr Phe Lys Gly Lys Trp Asn Glu Gln Phe Asp
                165                 170                 175
Arg Lys Tyr Thr Arg Gly Met Leu Phe Lys Thr Asn Glu Glu Lys Lys
            180                 185                 190
Thr Val Gln Met Met Phe Lys Glu Ala Lys Phe Lys Met Gly Tyr Ala
        195                 200                 205
Asp Glu Val His Thr Gln Val Leu Glu Leu Pro Tyr Val Glu Glu Glu
    210                 215                 220
Leu Ser Met Val Ile Leu Leu Pro Asp Asp Asn Thr Asp Leu Ala Val
225                 230                 235                 240
Val Glu Lys Ala Leu Thr Tyr Glu Lys Phe Lys Ala Trp Thr Asn Ser
                245                 250                 255
Glu Lys Leu Thr Lys Ser Lys Val Gln Val Phe Leu Pro Arg Leu Lys
            260                 265                 270
Leu Glu Glu Ser Tyr Asp Leu Glu Pro Phe Leu Arg Arg Leu Gly Met
        275                 280                 285
Ile Asp Ala Phe Asp Glu Ala Lys Ala Asp Phe Ser Gly Met Ser Thr
    290                 295                 300
Glu Lys Asn Val Pro Leu Ser Lys Val Ala His Lys Cys Phe Val Glu
305                 310                 315                 320
Val Asn Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ala Ala Ala Thr Ala Val Val Arg
                325                 330                 335
Asn Ser Arg Cys Ser Arg Met Glu Pro Arg Phe Cys Ala Asp His Pro
            340                 345                 350
Phe Leu Phe Phe Ile Arg Arg His Lys Thr Asn Cys Ile Leu Phe Cys
        355                 360                 365
Gly Arg Phe Ser Ser Pro
    370
<210>16
<211>4176
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>质粒载体PTrc99A
 
<400>16
gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc 60
ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc 120
gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 180
tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga 240
taacaatttc acacaggaaa cagaccatgg aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta 300
gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc 360
tgatacagat taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca 420
gtagcgcggt ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg 480
atggtagtgt ggggtctccc catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga 540
aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc 600
ctgagtagga caaatccgcc gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg 660
tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg 720
acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact ctttttgttt atttttctaa atacattcaa 780
atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 840
agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 900
ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 960
gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 1020
gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 1080
tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 1140
acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 1200
aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 1260
cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 1320
gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 1380
cgatgcctac agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 1440
tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 1500
tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 1560
ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 1620
tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 1680
gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1740
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1800
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1860
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1920
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1980
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 2040
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 2100
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 2160
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 2220
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 2280
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 2340
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 2400
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 2460
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 2520
acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 2580
gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 2640
cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 2700
tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc 2760
gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc 2820
gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg 2880
gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agcagatcaa 2940
ttcgcgcgcg aaggcgaagc ggcatgcatt tacgttgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc 3000
tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa 3060
ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc 3120
gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg 3180
gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg 3240
ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg 3300
attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc 3360
ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggctg 3420
atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat 3480
gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat tattttctcc 3540
catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc 3600
gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat 3660
aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc 3720
atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg 3780
ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg 3840
cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat 3900
atcccgccgt taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac 3960
cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca 4020
ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 4080
gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg 4140
caacgcaatt aatgtgagtt agcgcgaatt gatctg                           4176
 
<210>17
<211>415
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>DAS181
<400>17
Met Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser
 1               5                  10                  15
Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala Asn
            20                  25                  30
Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn
        35                  40                  45
Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn
    50                  55                  60
Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser
65                  70                  75                  80
Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly
                85                  90                  95
Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val
            100                 105                 110
Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp
        115                 120                 125
Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly
    130                 135                 140
Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp
145                 150                 155                 160
Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr
                165                 170                 175
Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro
            180                 185                 190
His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly
        195                 200                 205
Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp
    210                 215                 220
Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val
225                 230                 235                 240
Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly
                245                 250                 255
Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp
            260                 265                 270
Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala
        275                 280                 285
Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala
    290                 295                 300
Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg
305                 310                 315                 320
Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr
                325                 330                 335
Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala
            340                 345                 350
Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn
        355                 360                 365
Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp
    370                 375                 380
Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Lys Arg Lys Lys Lys Gly
385                 390                 395                 400
Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn Arg Lys Lys Lys Asn Pro
                405                 410                 415
<210>18
<211>116
<212>PRT
<213>人类
 
<220>
<223>前生长抑素原
 
<400>18
Met Leu Ser Cys Arg Leu Gln Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ile Val
1               5                   10                  15
Leu Ala Leu Gly Cys Val Thr Gly Ala Pro Ser Asp Pro Arg Leu Arg
            20                  25                  30
Gln Phe Leu Gln Lys Ser Leu Ala Ala Ala Ala Gly Lys Gln Glu Leu
        35                  40                  45
Ala Lys Tyr Phe Leu Ala Glu Leu Leu Ser Glu Pro Asn Gln Thr Glu
    50                  55                  60
Asn Asp Ala Leu Glu Pro Glu Asp Leu Ser Gln Ala Ala Glu Gln Asp
65                  70                  75                  80
Glu Met Arg Leu Glu Leu Gln Arg Ser Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met
                85                  90                  95
Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr
            100                 105                 110
Phe Thr Ser Cys
        115
 
<210>19
<211>92
<212>PRT
<213>人类
<220>
<223>生长抑素原
 
<400>19
Ala Pro Ser Asp Pro Arg Leu Arg Gln Phe Leu Gln Lys Ser Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Ala Ala Gly Lys Gln Glu Leu Ala Lys Tyr Phe Leu Ala Glu Leu
            20                  25                  30
Leu Ser Glu Pro Asn Gln Thr Glu Asn Asp Ala Leu Glu Pro Glu Asp
        35                  40                  45
Leu Ser Gln Ala Ala Glu Gln Asp Glu Met Arg Leu Glu Leu Gln Arg
    50                  55                  60
Ser Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly
65                  70                  75                  80
Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys
                85                  90
<210>20
<211>28
<212>PRT
<213>人类
 
<220>
<223>生长抑素28(SS-28)
 
<400>20
Ser Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly
1               5                   10                  15
Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys
            20                  25
 
<210>21
<211>14
<212>PRT
<213>人类
 
<220>
<223>生长抑素14(SS-14)
 
<400>21
Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys
1               5                   10
<210>22
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亮丙立得
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>1
<223>焦谷氨酸
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>6
<223>d-亮氨酸
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>10
<223>结合至乙酰胺(NHEt)的脯氨酸残基
 
<400>22
Glu His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro
1               5
 
<210>23
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>siRNA NP1496有义链
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(21)
<223>n＝dT
 
<400>23
ggaucuuauu ucuucggagn n    21
 
<210>24
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>siRNA NP-1496反义链
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(21)
<223>n＝dt
 
<400>24
cuccgaagaa auaagauccn n    21
 
<210>25
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>siRNA PA-2087有义链
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(21)
<223>n＝dT
 
<400>25
gcaauugagg agugccugan n    21
 
<210>26
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>siRNA PA-2087反义链
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(21)
<223>n＝dT
 
<400>26
ucaggcacuc cucaauugcn n    21
 
<210>27
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>siRNA GAPDH有义链
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(21)
<223>
 
<400>27
ugguuuacau guucc aauau u    21
 
<210>28
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>siRNA GAPDH反义链
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(21)
<223>
 
<400>28
uauuggaaca uguaaaccau u    21

Claims (257)

1.一种制备化合物微粒的方法，所述方法包括：
a)将抗衡离子加入包含溶于溶剂的所述化合物的溶液中；
b)将抗溶剂加入所述溶液；和
c)将所述溶液逐渐冷却至低于约25℃的温度，由此形成包含含有所述化合物的微粒的组合物，其中步骤a)、b)和c)同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗衡离子不是聚合物。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述抗溶剂不是聚合物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在步骤a)之前，所述化合物在约或等于30℃或以下的温度下溶解于所述溶剂中。
5.如权利要求4所述的方法，其中在步骤a)之前，所述化合物在约或等于25℃或以下的温度下溶解于所述溶剂中。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤a)和b)在环境温度下进行。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤a)-c)的溶液都没有加热和/或都没有维持在约或等于30℃以上的温度。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述化合物不是蛋白或多肽。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤a)和b)同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行，然后进行步骤c)。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤b)和c)在步骤a)之后同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。
11.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤a)和c)同时进行。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述抗衡离子和所述化合物是彼此相同的。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述化合物和所述抗衡离子是彼此不同的。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述抗衡离子和所述抗溶剂是彼此相同的。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于50亿或50亿道尔顿的大分子。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于10亿或10亿道尔顿的大分子。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于5000万或5000万道尔顿的大分子。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于2000万或2000万道尔顿的大分子。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于1500万或1500万道尔顿的大分子。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于1000万或1000万道尔顿的大分子。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于500万或500万道尔顿的大分子。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于100万或100万道尔顿的大分子。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于500,000或500,000道尔顿的大分子。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于300,000或300,000道尔顿的大分子。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于200,000或200,000道尔顿的大分子。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于100,000或100,000道尔顿的大分子。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于50,000或50,000道尔顿的大分子。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于25,000或25,000道尔顿的大分子。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于15,000或15,000道尔顿的大分子。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于10,000或10,000道尔顿的大分子。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于5,000或5,000道尔顿的大分子。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于3,000或3000道尔顿的大分子。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于2,000或2000道尔顿的大分子。
34.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述化合物是小分子。
35.如权利要求15-33中任一项所述的方法，其中所述大分子选自多核苷酸、核酸、多肽、糖肽、蛋白、碳水化合物、脂质、脂肪酸、多糖、碳水化合物-蛋白或多糖-蛋白轭合物、病毒、病毒颗粒、类病毒、朊病毒及其混合物。
36.如权利要求2所述的方法，其中所述化合物是大分子，并且所述大分子选自多核苷酸、核酸、多肽、糖肽、蛋白、碳水化合物、脂质、脂肪酸、多糖、碳水化合物-蛋白或多糖-蛋白轭合物、病毒、病毒颗粒、类病毒、朊病毒及其混合物。
37.如权利要求15-33、35和36中任一项所述的方法，其中所述大分子选自激素、前列腺素、抗生素、化学治疗剂、造血药、抗感染药、抗溃疡剂、抗过敏药、解热药、镇痛药、抗炎剂、抗痴呆剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗抑郁药、精神药物、强心剂、利尿剂、抗心律不齐药、血管舒张药、抗高血压药、抗糖尿病药、抗凝血药和降胆固醇剂。
38.如权利要求35所述的方法，其中所述大分子与小分子轭合。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述小分子选自半抗原、激素、前列腺素、抗生素、化学治疗剂、造血药、抗感染药、抗溃疡剂、抗过敏剂、解热药、镇痛药、抗炎剂、抗痴呆剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗抑郁药、精神药物、强心剂、利尿剂、抗心律不齐药、血管舒张药、抗高血压药、抗糖尿病药、抗凝血药和降胆固醇剂。
40.如权利要求34或权利要求38所述的方法，其中所述小分子的分子量为约或等于50至约或等于1000道尔顿。
41.如权利要求34或权利要求40所述的方法，其中所述小分子选自半抗原、激素、前列腺素、抗生素、化学治疗剂、造血药、抗感染药、抗溃疡剂、抗过敏药、解热药、镇痛药、抗炎剂、抗痴呆剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗抑郁药、精神药物、强心剂、利尿剂、抗心律不齐药、血管舒张药、抗高血压药、抗糖尿病药、抗凝血药和降胆固醇剂。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述小分子是抗生素。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述抗生素选自氨基糖苷类、安莎霉素类、碳头孢烯、碳青霉烯类、头孢菌素类、大环内酯类、青霉素类、喹诺酮类、磺胺类和四环素类。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述抗生素是青霉素或四环素。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述抗生素是氨基糖苷。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述氨基糖苷是卡那霉素或妥布拉霉素。
47.如权利要求41所述的方法，其中所述小分子是抗病毒剂。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述抗病毒剂用于治疗流行性感冒、副流行性感冒或呼吸道合胞病毒介导的感染。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述抗病毒剂是扎那米韦或磷酸奥塞米韦。
50.如权利要求41所述的方法，其中所述小分子是化学治疗剂。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述化学治疗剂选自烷化剂、蒽环类抗生素、细胞骨架干扰剂、埃博霉素、拓扑异构酶II的抑制剂、核苷酸类似物、铂基试剂、类视黄醇和长春花生物碱。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述化学治疗剂是细胞骨架干扰剂。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述细胞骨架干扰剂是紫杉醇。
54.如权利要求41所述的方法，其中所述小分子是前列腺素。
55.如权利要求35所述的方法，其中所述大分子是核酸。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述核酸选自DNA、RNA和PNA。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述核酸是RNA。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述RNA选自siRNA、tRNA、snRNA和核酶。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述RNA是siRNA。
60.如权利要求35所述的方法，其中所述大分子是病毒。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述病毒是烟草花叶病毒。
62.如权利要求35所述的方法，其中所述大分子是糖肽。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述糖肽是万古霉素。
64.如权利要求35所述的方法，其中所述大分子是肽。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述肽是亮丙立得。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述肽是生长抑素。
67.如权利要求15或权利要求34所述的方法，其中所述化合物是不溶于水的。
68.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤a)、b)和c)以如下顺序顺次进行：a)，然后b)，然后c)。
69.如权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述溶剂是与所述抗溶剂混溶的或部分混溶的。
70.如权利要求1-69中任一项所述的方法，所述方法还包括，在步骤c)之后从所述溶液中分离所述微粒以除去不同于微粒的组分。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述组合物主要由含有所述化合物的微粒组成。
72.如权利要求70所述的方法，其中所述分离是通过沉降或通过过滤实现的。
73.如权利要求70所述的方法，其中所述分离是通过冷冻干燥实现的。
74.如权利要求1-73中任一项所述的方法，其中所述抗溶剂选自水、缓冲溶液、脂族醇、芳族醇、氯仿、多元糖醇、芳烃、醛、酮、酯、醚、二噁烷类、烷、烯、共轭二烯、二氯甲烷、四氯化碳、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、乙腈、乙酸乙酯、多元醇、聚酰亚胺、聚亚胺、聚酯、聚醛及其混合物。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述抗溶剂是脂族醇或芳族醇。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述抗溶剂是脂族醇。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述脂肪醇是异丙醇。
78.如权利要求1-77中任一项所述的方法，其中所述抗衡离子选自阴离子化合物、阳离子化合物和两性离子化合物。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述抗衡离子是阴离子化合物。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述阴离子化合物选自柠檬酸钠、硫酸钠、硫酸锌、硫酸镁、硫酸钾和硫酸钙。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述阴离子化合物是硫酸钠。
82.如权利要求1-11和13-77中任一项所述的方法，其中所述抗衡离子选自柠檬酸、衣康酸和新戊酸。
83.如权利要求1-11和13-77中任一项所述的方法，其中所述抗衡离子是氨基酸。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述化合物是甘氨酸或精氨酸。
85.如权利要求35所述的方法，其中所述抗衡离子是聚合物，并且所述大分子选自多核苷酸、核酸、碳水化合物、脂质、脂肪酸、多糖、碳水化合物-蛋白或多糖-蛋白轭合物、病毒、病毒颗粒、类病毒、朊病毒及其混合物。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述聚合物是所述抗衡离子和所述抗溶剂。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)或聚乙烯亚胺(PEI)。
88.如权利要求34或权利要求40所述的方法，其中所述抗衡离子是聚合物。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述聚合物是所述抗衡离子和所述抗溶剂。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)或聚乙烯亚胺(PEI)。
91.如权利要求1-90中任一项所述的方法，其中所述微粒通过沉淀、通过相分离或通过胶体形成而获得。
92.如权利要求1-91中任一项所述的方法，其中所述溶液的为从约4.0或4.0至约9.0或9.0。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述溶液的pH为从约4.0或4.0至约8.0或8.0。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述溶液的pH为从约4.5或4.5至约7.5或7.5。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述溶液的pH为从约5.0或5.0至约7.0或7.0。
96.如权利要求1-95中任一项所述的方法，其中所得微粒组合物还包含耐酸包衣剂、耐蛋白酶包衣剂、肠溶包衣剂、填充剂、赋形剂、非活性成分、稳定性增强剂、味道和/或气味改性剂或掩蔽剂、维生素、糖类、治疗剂、抗氧化剂、免疫调节剂、跨膜运输改性剂、抗结块剂、壳聚糖或流动性增强剂。
97.如权利要求1-96中任一项所述的方法，其中在所述微粒中的化合物的量相对于步骤a)的所述溶液中的化合物的总量为约5％或5％至大于约99％或99％，w/w。
98.如权利要求97所述的方法，其中在所述微粒中的化合物的量相对于步骤a)的所述溶液中的化合物的总量为约5％或5％至约20％或20％，w/w。
99.如权利要求97所述的方法，其中在所述微粒中的化合物的量相对于步骤a)的所述溶液中的化合物的总量为约10％或10％至约85％或85％，w/w。
100.如权利要求99所述的方法，其中在所述微粒中的化合物的量相对于步骤a)的所述溶液中的化合物的总量为约20％或20％至约60％或60％，w/w。
101.如权利要求100所述的方法，其中在所述微粒中的化合物的量相对于步骤a)的所述溶液中的化合物的总量为约25％或25％至约55％或55％，w/w。
102.如权利要求101所述的方法，其中在所述微粒中的化合物的量相对于步骤a)的所述溶液中的化合物的总量为约30％或30％至约50％或50％，w/w。
103.如权利要求97所述的方法，其中在所述微粒中的化合物的量相对于步骤a)的所述溶液中的化合物的总量为约80％或80％至大于约99％或99％，w/w。
104.如权利要求1-103中任一项所述的方法，其中所述温度为约或等于4℃至约或等于-200℃。
105.如权利要求104所述的方法，其中所述温度为约或等于2℃至约或等于-180℃。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述温度为约或等于2℃至约或等于-170℃。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述温度为约0℃或0℃至约-2℃或-2℃至从约-150℃或-150℃至约-165℃或-165℃。
108.如权利要求1-107中任一项所述的方法，其中所得组合物具有从约或等于1周至约或等于1个月、从约或等于1个月至约或等于6个月、从约或等于6个月至约或等于1年、从约或等于1年至约或等于2年、或从约或等于2年至约或等于5年的贮藏寿命。
109.如权利要求1-108中任一项所述的方法，其中所述溶液和/或所得组合物还包括活性剂。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述活性剂选自抗生素、化学治疗剂、抗糖尿病药、抗惊厥药、镇痛药、抗帕金森病药、抗炎剂、钙拮抗剂、麻醉剂、抗微生物剂、抗疟药、抗寄生虫药、抗高血压药、抗组胺剂、解热药、α-肾上腺素能激动剂、α-阻断剂、杀生物剂、杀细菌剂、支气管扩张药、β-肾上腺素能阻断药、避孕药、心血管药、钙通道抑制剂、镇静剂、诊断剂、利尿剂、电解质、酶、催眠药、激素、降血糖药、促血糖增高药、肌肉收缩药、肌肉松弛药、造形术、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、眼药、心理兴奋剂、镇静药、类固醇、拟交感神经药、拟副交感神经药、安定药、泌尿道药、疫苗、阴道药、非类固醇类抗炎药、血管紧张素转换酶、多核苷酸、多肽、多糖、酶、激素、维生素、矿物质和营养补剂。
111.如权利要求1-110中任一项所述的方法，其中调节所述微粒的含湿量，由此在约25℃的温度下储存约6个月至约1年后保持了至少约90％或90％的所述化合物活性。
112.如权利要求1-111中任一项所述的方法，其中所述微粒的含湿量为从约或等于0.01％至约或等于20％。
113.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物是微载体。
114.如权利要求1所述的方法，其中所得微粒还包含不同于所述化合物的微载体。
115.如权利要求113或114所述的方法，其中所述微载体选自氨基酸、羧酸、蛋白、核酸、多糖和能够形成水凝胶的物质。
116.如权利要求115所述的方法，其中所述化合物是核酸或蛋白，并且所述微载体是能够形成水凝胶的物质。
117.如权利要求113或权利要求116所述的方法，其中所述微载体是明胶或葡聚糖。
118.如权利要求117所述的方法，其中所述化合物是siRNA并且所述微载体是明胶。
119.如权利要求1-118中任一项所述的方法，其中添加至所述溶液的所述抗衡离子的浓度为从约或等于0mM或0mM至约或等于100mM或100mM。
120.如权利要求119所述的方法，其中添加至所述溶液的所述抗衡离子的浓度为从约或等于0mM或0mM至约或等于50mM或50mM。
121.如权利要求120所述的方法，其中添加至所述溶液的所述抗衡离子的浓度为从约或等于0mM或0mM至约或等于20mM或20mM。
122.如权利要求121所述的方法，其中添加至所述溶液的所述抗衡离子的浓度为从约或等于0mM或0mM至约或等于10mM或10mM。
123.如权利要求122所述的方法，其中添加至所述溶液的所述抗衡离子的浓度为从约或等于1mM或1mM至约或等于5mM或5mM。
124.如权利要求123所述的方法，其中添加至所述溶液的所述抗衡离子的浓度为约或等于2mM。
125.如权利要求1-124中任一项所述的方法，其中所述逐渐冷却是通过致冷。
126.如权利要求1-124中任一项所述的方法，其中所述逐渐冷却是通过吸热反应。
127.如权利要求125或权利要求126所述的方法，其中所述逐渐冷却的速度为从约或等于0.01℃/min或0.01℃/min至约或等于20℃/min或20℃/min。
128.如权利要求127所述的方法，其中所述逐渐冷却的速度为从约或等于0.05℃/min或约或等于0.1℃/min至约或等于10℃/min或约或等于15℃/min。
129.如权利要求128所述的方法，其中所述逐渐冷却的速度为约或等于0.2℃/min至约或等于5℃/min。
130.如权利要求129所述的方法，其中所述逐渐冷却的速度为约或等于0.5℃/min至约或等于2℃/min。
131.如权利要求130所述的方法，其中所述逐渐冷却的速度为约或等于1℃/min。
132.如权利要求1-131中任一项所述的方法，其中所述微粒的尺寸为从约或等于0.001μm或0.001μm至约或等于50μm或50μm。
133.如权利要求132所述的方法，其中所述微粒的尺寸为从约或等于0.3μm或0.3μm至约或等于30μm或30μm。
134.如权利要求133所述的方法，其中所述微粒的尺寸为从约或等于0.5μm或0.5μm至约或等于10μm或10μm。
135.如权利要求134所述的方法，其中所述微粒的尺寸为从约或等于0.5μm或0.5μm至约或等于5.0μm或5.0μm。
136.如权利要求135所述的方法，其中所述微粒的尺寸为从约或等于1.0μm或1.0μm至约或等于5.0μm或5.0μm。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述微粒的尺寸为从约或等于1.0μm至约或等于2.0μm、3.0μm、4.0μm或5.0μm。
138.一种组合物，所述组合物包含化合物和抗衡离子的微粒，其中所述化合物和所述抗衡离子是彼此不同的。
139.如权利要求138所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于50亿或50亿道尔顿的大分子。
140.如权利要求139所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于10亿或10亿道尔顿的大分子。
141.如权利要求140所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于5000万或5000万道尔顿的大分子。
142.如权利要求141所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于2000万或2000万道尔顿的大分子。
143.如权利要求142所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于1500万或1500万道尔顿的大分子。
144.如权利要求143所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于1000万或1000万道尔顿的大分子。
145.如权利要求144所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于500万或500万道尔顿的大分子。
146.如权利要求145所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于100万或100万道尔顿的大分子。
147.如权利要求146所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于500,000或500,000道尔顿的大分子。
148.如权利要求147所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于300,000或300,000道尔顿的大分子。
149.如权利要求148所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于200,000或200,000道尔顿的大分子。
150.如权利要求149所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于100,000或100,000道尔顿的大分子。
151.如权利要求150所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于50,000或50,000道尔顿的大分子。
152.如权利要求151所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于25,000或25,000道尔顿的大分子。
153.如权利要求152所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于15,000或15,000道尔顿的大分子。
154.如权利要求153所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于10,000或10,000道尔顿的大分子。
155.如权利要求154所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于5,000或5,000道尔顿的大分子。
156.如权利要求155所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于3,000或3000道尔顿的大分子。
157.如权利要求156所述的组合物，其中所述化合物是分子量为约或等于1000或1000至约或等于2,000或2000道尔顿的大分子。
158.如权利要求138所述的组合物，其中所述化合物是小分子。
159.如权利要求139-157中任一项所述的组合物，其中所述大分子选自多核苷酸、核酸、多肽、糖肽、蛋白、碳水化合物、脂质、脂肪酸、多糖、碳水化合物-蛋白或多糖-蛋白轭合物、病毒、病毒颗粒、类病毒、朊病毒及其混合物。
160.如权利要求139-157和159中任一项所述的组合物，其中所述大分子选自激素、前列腺素、抗生素、化学治疗剂、造血药、抗感染药、抗溃疡剂、抗过敏药、解热药、镇痛药、抗炎剂、抗痴呆剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗抑郁药、精神药物、强心剂、利尿剂、抗心律不齐药、血管舒张药、抗高血压药、抗糖尿病药、抗凝血药和降胆固醇剂。
161.如权利要求159或权利要求160所述的组合物，其中所述大分子与小分子轭合。
162.如权利要求161所述的组合物，其中所述小分子选自半抗原、激素、前列腺素、抗生素、化学治疗剂、造血药、抗感染药、抗溃疡剂、抗过敏药、解热药、镇痛药、抗炎剂、抗痴呆剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗抑郁药、精神药物、强心剂、利尿剂、抗心律不齐药、血管舒张药、抗高血压药、抗糖尿病药、抗凝血药和降胆固醇剂。
163.如权利要求158所述的组合物，其中所述小分子的分子量为约或等于50至约或等于1000道尔顿。
164.如权利要求158或权利要求163所述的组合物，其中所述小分子选自半抗原、激素、前列腺素、抗生素、化学治疗剂、造血药、抗感染药、抗溃疡剂、抗过敏剂、解热药、镇痛药、抗炎剂、抗痴呆剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗抑郁药、精神药物、强心剂、利尿剂、抗心律不齐药、血管舒张药、抗高血压药、抗糖尿病药、抗凝血药和降胆固醇剂。
165.如权利要求164所述的组合物，其中所述小分子是抗生素。
166.如权利要求165所述的组合物，其中所述抗生素选自氨基糖苷类、安莎霉素类、碳头孢烯、碳青霉烯类、头孢菌素类、大环内酯类、青霉素类、喹诺酮类、磺胺类和四环素类。
167.如权利要求165所述的组合物，其中所述抗生素是青霉素或四环素。
168.如权利要求165所述的组合物，其中所述抗生素是氨基糖苷。
169.如权利要求168所述的组合物，其中所述氨基糖苷是卡那霉素或妥布拉霉素。
170.如权利要求164所述的组合物，其中所述化合物是抗病毒剂。
171.如权利要求170所述的组合物，其中所述抗病毒剂用于治疗流行性感冒、副流行性感冒或呼吸道合胞病毒介导的感染。
172.如权利要求171所述的组合物，其中所述抗病毒剂是扎那米韦或磷酸奥塞米韦。
173.如权利要求164所述的组合物，其中所述化合物是化学治疗剂。
174.如权利要求173所述的组合物，其中所述化学治疗剂选自烷化剂、蒽环类抗生素、细胞骨架干扰剂、埃博霉素、拓扑异构酶II的抑制剂、核苷酸类似物、铂基试剂、类视黄醇和长春花生物碱。
175.如权利要求174所述的组合物，其中所述化学治疗剂是细胞骨架干扰剂。
176.如权利要求175所述的组合物，其中所述细胞骨架干扰剂是紫杉醇。
177.如权利要求164所述的组合物，其中所述组合物是前列腺素。
178.如权利要求159所述的组合物，其中所述大分子是核酸。
179.如权利要求178所述的组合物，其中所述核酸选自DNA、RNA和PNA。
180.如权利要求179所述的组合物，其中所述核酸是RNA。
181.如权利要求180所述的组合物，其中所述RNA选自siRNA、tRNA、snRNA和核酶。
182.如权利要求181所述的组合物，其中所述RNA是siRNA。
183.如权利要求159所述的组合物，其中所述大分子是病毒。
184.如权利要求183所述的组合物，其中所述病毒是烟草花叶病毒。
185.如权利要求159所述的组合物，其中所述大分子是糖肽。
186.如权利要求185所述的组合物，其中所述糖肽是万古霉素。
187.如权利要求159所述的组合物，其中所述大分子是肽。
188.如权利要求187所述的组合物，其中所述肽是亮丙立得。
189.如权利要求187所述的组合物，其中所述肽是生长抑素。
190.如权利要求139或权利要求158所述的组合物，其中所述化合物是不溶于水的。
191.如权利要求138-190中任一项所述的组合物，其中所述抗衡离子选自阴离子化合物、阳离子化合物和两性离子化合物。
192.如权利要求191所述的组合物，其中所述抗衡离子是阴离子化合物。
193.如权利要求192所述的组合物，其中所述阴离子化合物选自柠檬酸钠、硫酸钠、硫酸锌、硫酸镁、硫酸钾和硫酸钙。
194.如权利要求193所述的组合物，其中所述阴离子化合物是硫酸钠。
195.如权利要求138-190中任一项所述的组合物，其中所述抗衡离子选自柠檬酸、衣康酸和新戊酸。
196.如权利要求138-195中任一项所述的组合物，其中所述抗衡离子是氨基酸。
197.如权利要求196所述的组合物，其中所述抗衡离子是甘氨酸或精氨酸。
198.如权利要求158和163-177中任一项所述的组合物，其中所述抗衡离子是聚乙二醇(PEG)或聚乙烯亚胺(PEI)。
199.如权利要求138-198中任一项所述的组合物，其中所得微粒组合物还包含耐酸包衣剂、耐蛋白酶包衣剂、肠溶包衣剂、填充剂、赋形剂、非活性成分、稳定性增强剂、味道和/或气味改性剂或掩蔽剂、维生素、糖类、治疗剂、抗氧化剂、免疫调节剂、跨膜运输改性剂、抗结块剂、壳聚糖或流动性增强剂。
200.如权利要求138-199中任一项所述的组合物具有从约或等于1周至约或等于1个月、从约或等于1个月至约或等于6个月、从约或等于6个月至约或等于1年、从约或等于1年至约或等于2年、或从约或等于2年至约或等于5年的贮藏寿命。
201.如权利要求138-200中任一项所述的组合物还包含活性剂。
202.如权利要求202所述的组合物，其中所述活性剂选自抗生素、化学治疗剂、抗糖尿病药、抗惊厥药、镇痛药、抗帕金森病药、抗炎剂、钙拮抗剂、麻醉剂、抗微生物剂、抗疟药、抗寄生虫药、抗高血压药、抗组胺剂、解热药、α-肾上腺素能激动剂、α-阻断剂、杀生物剂、杀细菌剂、支气管扩张药、β-肾上腺素能阻断药、避孕药、心血管药、钙通道抑制剂、镇静剂、诊断剂、利尿剂、电解质、酶、催眠药、激素、降血糖药、促血糖增高药、肌肉收缩药、肌肉松弛药、造形术、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、眼药、心理兴奋剂、镇静药、类固醇、拟交感神经药、拟副交感神经药、安定药、泌尿道药、疫苗、阴道药、非类固醇类抗炎药、血管紧张素转换酶、多核苷酸、多肽、多糖、酶、激素、维生素、矿物质和营养补剂。
203.如权利要求138-202中任一项所述的组合物，其中在所述微粒中的化合物的量为从约或等于0.1％至约或等于99％或更高，w/w。
204.如权利要求203所述的组合物，其中在所述微粒中的化合物的量为从约或等于0.2％至约或等于95％或更高，w/w。
205.如权利要求204所述的组合物，其中在所述微粒中的化合物的量为从约或等于0.5％至约或等于90％或更高，w/w。
206.如权利要求205所述的组合物，其中在所述微粒中的化合物的量为从约或等于1％至约或等于85％或更高，w/w。
207.如权利要求206所述的组合物，其中在所述微粒中的化合物的量为从约或等于2％至约或等于80％或更高，w/w。
208.如权利要求207所述的组合物，其中在所述微粒中的化合物的量为从约或等于5％至约或等于75％或更高，w/w。
209.如权利要求208所述的组合物，其中在所述微粒中的化合物的量为从约65％至约90％w/w。
210.如权利要求209所述的组合物，其中在所述微粒中的化合物的量为从约70％至约85％、86％、87％、88％、89％或90％w/w。
211.如权利要求210所述的组合物，其中在所述微粒中的化合物的量为从约90％至约99％w/w。
212.如权利要求138-211中任一项所述的组合物，其中调节所述微粒的含湿量，由此在约25℃的温度下储存约或等于6个月至约或等于1年后保持了至少约90％或90％的所述化合物活性。
213.如权利要求138-212中任一项所述的组合物，其中在所述微粒中的抗衡离子的量为从约0.01％或0.01％至约60％或60％w/w。
214.如权利要求213所述的组合物，其中在所述微粒中的抗衡离子的量为从约0.5％或0.5％至约50％或50％w/w。
215.如权利要求214所述的组合物，其中在所述微粒中的抗衡离子的量为从约1％或1％至约2％或2％w/w。
216.如权利要求213所述的组合物，其中在所述微粒中的抗衡离子的量为从约0.01％或0.01％至约20％或20％w/w。
217.如权利要求216所述的组合物，其中在所述微粒中的抗衡离子的量为从约0.05％或0.05％至约15％或15％w/w。
218.如权利要求217所述的组合物，其中在所述微粒中的抗衡离子的量为从约0.1％或0.1％至约10％或10％w/w。
219.如权利要求218所述的组合物，其中在所述微粒中的抗衡离子的量为从约0.2％或0.2％至约5％或5％w/w。
220.如权利要求217所述的组合物，其中所述微粒的含湿量为从约6％或6％至约12％或12％。
221.如权利要求220所述的组合物，其中所述微粒的含湿量为从约7％或7％至约10.5％或10.5％。
222.如权利要求138-221中任一项所述的组合物，所述组合物用于口服施用。
223.如权利要求138-222中任一项所述的组合物，所述组合物用于食入。
224.如权利要求138-221中任一项所述的组合物，所述组合物用于静脉内施用、鼻内施用、肠胃外施用、肺部施用、皮下施用、眼施用或肌肉内施用。
225.如权利要求138-222中任一项所述的组合物，所述组合物用于吸入。
226.如权利要求138-225中任一项所述的组合物，其中所述微粒的尺寸为从约0.001μm或0.001μm至约50μm或50μm。
227.如权利要求226所述的组合物，其中所述微粒的尺寸为从约0.3μm或0.3μm至约30μm或30μm。
228.如权利要求227所述的组合物，其中所述微粒的尺寸为从约0.5μm或0.5μm至约10μm或10μm。
229.如权利要求228所述的组合物，其中所述微粒的尺寸为从约0.5μm或0.5μm至约5.0μm或5.0μm。
230.如权利要求229所述的组合物，其中所述微粒的尺寸为从约1.0μm或1.0μm至约5.0μm或5.0μm。
231.如权利要求230所述的组合物，其中所述微粒的尺寸为从约1.0μm至约2.0μm、3.0μm、4.0μm或5.0μm。
232.一种制造的物品，所述物品包含权利要求138-231中任一项所述的组合物、用于所述组合物的包装材料和指明所述组合物是用于治疗适应症、营养适应症或化妆适应症的标签。
233.如权利要求232所述的物品，其中所述组合物是用于治疗适应症。
234.如权利要求233所述的物品，其中所述治疗适应症是癌症。
235.如权利要求233所述的物品，其中所述治疗适应症是流行性感冒、副流行性感冒或呼吸疾患。
236.如权利要求235所述的物品，所述物品还包含用于所述组合物的肺部施用的吸入器。
237.如权利要求236所述的物品，其中所述吸入器为干粉吸入器、计量吸入器或静电递送设备。
238.一种防止或治疗传染病的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求138-231中任一项所述的组合物施用于受治疗者。
239.如权利要求238所述的方法，其中所述传染病选自虫媒病毒感染、肉毒中毒、布氏菌病、念珠菌病、弯曲菌病、水痘、衣原体病、霍乱、冠状病毒感染、葡萄球菌感染、柯萨奇病毒感染、克罗伊茨费尔特-雅各布病、隐孢子虫病、环孢子虫感染、巨细胞病毒感染、爱波斯坦-巴尔病毒感染、登革热、白喉、耳朵感染、脑炎、流行性感冒病毒感染、副流行性感冒病毒感染、贾第虫病、淋病、流行性感冒嗜血杆菌感染、汉坦病毒感染、病毒性肝炎、单纯疱疹病毒感染、HIV/AIDS、螺杆菌感染、人乳头状瘤病毒(HPV)感染、传染性单核细胞增多症、军团杆菌病、麻风病、钩端螺旋体病、利斯特菌病、莱姆病、淋巴细胞脉络丛脑膜炎、疟疾、麻疹、马尔堡出血热、脑膜炎、猴痘、腮腺炎、分枝杆菌感染、支原体感染、诺瓦克病毒感染、百日咳、蛲虫感染、肺炎球菌疾病、链球菌肺炎感染、肺炎支原体感染、粘膜炎莫拉菌感染、绿脓假单胞菌感染、轮状病毒感染、鹦鹉热、狂犬病、呼吸道合胞病毒感染(RSV)、癣、落矶山斑疹热、风疹、沙门氏菌病、SARS、疥疮、性传播疾病、志贺菌病、带状疱疹、孢子丝菌病、链球菌感染、梅毒、破伤风、旋毛虫病、结核病、土拉菌病、伤寒、病毒性脑膜炎、细菌性脑膜炎、西尼罗河病毒感染、黄热病、腺病毒介导的感染和疾病、反转录病毒介导的传染病和耶尔森菌人畜共患病。
240.如权利要求239所述的方法，其中所述传染病选自流行性感冒、副流行性感冒、呼吸道合胞病毒。
241.如权利要求238-240中任一项所述的方法，其中所述施用为通过口服、静脉内、鼻内、肠胃外、皮下、透皮、局部、关节内、肌肉内或通过吸入而进行。
242.一种制备siRNA微粒的方法，所述方法包括：
(a)将抗溶剂加入溶于含水溶剂中的siRNA的溶液；和
(b)将所述溶液逐渐冷却至低于约25℃的温度，由此形成包含含有siRNA的微粒的组合物，并且步骤(a)和(b)同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。
243.如权利要求242所述的方法，所述方法还包括：
(c)加入抗衡离子，其中步骤(a)、(b)和(c)同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。
244.如权利要求242或权利要求243所述的方法，其中所述抗溶剂是异丙醇。
245.如权利要求242-244中任一项所述的方法，其中所述溶剂是水。
246.一种组合物，所述组合物包含siRNA微粒。
247.如权利要求246所述的组合物，所述组合物还包含抗衡离子。
248.一种制备病毒微粒的方法，所述方法包括：
(a)将抗溶剂加入溶于含水溶剂中的病毒的溶液；和
(b)将所述溶液逐渐冷却至低于约25℃的温度，由此形成包含含有病毒的微粒的组合物，其中步骤(a)和(b)同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。
249.如权利要求248所述的方法，所述方法还包括：
(c)加入抗衡离子，其中步骤(a)、(b)和(c)同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。
250.如权利要求248或权利要求249所述的方法，其中所述抗溶剂是异丙醇。
251.一种制备病毒微粒的方法，所述方法包括：
(a)将抗衡离子加入溶于含水溶剂中的病毒的溶液；和
(b)将所述溶液逐渐冷却至低于约25℃的温度，由此形成包含含有病毒的微粒的组合物，其中步骤(a)和(b)同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。
252.如权利要求251所述的方法，所述方法还包括：
(c)加入抗溶剂，其中步骤(a)、(b)和(c)同时地、顺次地、间歇地或以任何顺序进行。
253.如权利要求252所述的方法，其中所述抗溶剂是异丙醇。
254.如权利要求251-253中任一项所述的方法，其中所述溶剂是水。
255.一种组合物，所述组合物包含病毒微粒。
256.如权利要求255所述的组合物，所述组合物还包含抗衡离子。
257.如权利要求255或权利要求256所述的组合物，其中所述病毒是烟草花叶病毒。
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