CN104472877A - L-赖氨酸制品的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了含L-赖氨酸的制品及其制备方法。所述制品包括包被芯颗粒和包裹在包被芯颗粒上的包被层，其中包被层是过瘤胃脂肪，包被芯颗粒包括赖氨酸盐、填充剂和粘合剂以及任选的谷氨酸钠和任选的木聚糖酶。尤其是本发明还提供了优化的工艺在其中的应用等。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸领域，具体而言，本发明涉及含L-赖氨酸的制品及其制备方法和优化工艺等。
背景技术
L-赖氨酸是重要的氨基酸原料，可以作为调味品、食品、饲料添加剂使用，也可以作为保健品、药品中的有效或辅料成分，广泛应用于食品业、饲料业、制药业及其他化学工业中。当前，L-赖氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌生产。
然而，当赖氨酸作为饲料的时候，由于其属于小分子营养物质，很快就能释放到动物体内，尤其在大量摄取时，影响了动物吸收利用的效率。通常解决的方法是少量多次地喂食动物，但是这将增加动物饲养的工作量。因此，本发明提出了直接用赖氨酸发酵培养液制备包被的赖氨酸制品的方法，可以有效减缓赖氨酸在动物体内释放的速度。
本发明人在前的中国专利201210440083记载了一种包被的赖氨酸的制品，主要用于饲料。在此基础上，本发明人进行了深入的研究，令人意外地在多个方面，包括工艺方面、成份（包括微量添加剂）方面和酶改造方面等，均获得了能够提高包被和/或提高利用率的赖氨酸的制品。
发明简述
本发明要解决的技术问题在于提供新的含L-赖氨酸的制品及其制备方法和优化的工艺在制备其中的应用。另外，本发明还可以提供从该制品优化中获得的各分支发明，包括含L-赖氨酸的饲料添加剂，少量的谷氨酸钠在制备含L-赖氨酸的饲料添加剂中的应用，和/或，突变的木聚糖酶在制备含L-赖氨酸的饲料添加剂中的应用等。
优选地，在本发明的一个方面，本发明提供了含L-赖氨酸的制品，其包括包被芯颗粒和包裹在包被芯颗粒上的包被层，其中包被层是过瘤胃脂肪，包被芯颗粒包括赖氨酸盐、填充剂和粘合剂以及任选的谷氨酸钠和任选的木聚糖酶。
优选其中，赖氨酸盐、填充剂、谷氨酸钠和粘合剂的重量比为40~55：4~6：0~2：0.3~0.8，优选为42~50：4.5~5.5：0~1.5（如0.5~1.5）：0.4~0.5，更优选为43~48：4.8~5.2：0~1.2（如0.8~1.2）：0.45~0.55，最优选为45~46：5：0~1：0.5。
优选其中，包被芯颗粒和包被层的重量比为40~60：40~60，优选为46~56：43~53，更优选为48.5~51.5：48.5~51.5，最优选为1：1。
优选其中，赖氨酸盐是赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐或者它们的混合物，优选是赖氨酸硫酸盐。
优选其中，填充剂是微晶纤维素和/或糊精。
优选其中，粘合剂是羧甲基纤维素。
优选其中，木聚糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选其中，包被芯颗粒是能通过30目筛并被40目筛截留的颗粒。
在另一方面，本发明提供了前述方面的制品的制备方法，其包括：
（1）将赖氨酸盐和填充剂以及任选的谷氨酸钠混合均匀，形成混合物；
（2）向步骤（1）获得的混合物中加入任选含有木聚糖酶的粘合剂溶液，混合均匀，形成软材；
（3）将步骤（2）获得的软材过筛（如，30目筛），形成粗颗粒；
（4）将步骤（3）获得的粗颗粒抛丸，形成圆形微丸；
（5）干燥步骤（4）获得的圆形微丸并进行筛分，形成包被芯颗粒；和，
（6）将过瘤胃脂肪喷在步骤（5）获得的包被芯颗粒上。
优选其由步骤（1）、（2）、（3）、（4）、（5）和（6）组成。
在另一方面，本发明提供了对粗颗粒抛丸以形成圆形微丸的步骤和/或干燥圆形微丸并进行筛分（尤其是能通过30目筛并被40目筛截留）的步骤在制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法中的应用。
在另一方面，本发明提供了对粗颗粒抛丸以形成圆形微丸的步骤和/或干燥圆形微丸并进行筛分（尤其是能通过30目筛并被40目筛截留）的步骤在提高过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的抗降解能力中的应用。
优选在这些应用中，过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品是前述方面的制品。
优选在这些应用中，制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法是前述方面的制备方法。
发明详述
本发明要解决的技术问题在于提供新的含L-赖氨酸的制品。另外，本发明还可以提供该饲料添加剂的制备方法以及优化的工艺在制备含L-赖氨酸的饲料添加剂中的应用、少量的谷氨酸钠在制备含L-赖氨酸的饲料添加剂中的应用，和/或，突变的木聚糖酶及其在制备含L-赖氨酸的饲料添加剂中的应用等分支发明。
一，术语解释
在本文中，术语具有所属领域的技术人员所常规理解的含义。为了清楚起见，本文对如下术语进行特别说明。
在本文中，术语“任选”具有其词典义，即相应被限定的对象被选择或者不选择。例如，含有任选的谷氨酸钠指的是含有或者不含有谷氨酸钠。又如，任选含有木聚糖酶指的是含有或者不含有木聚糖酶。
在本文中，术语“填充剂”和“粘合剂”分别指的是对非人动物食用安全的分别起到填充和粘合作用的辅剂，优选地，本文中的“填充剂”和“粘合剂”是食用级（即人食用安全的），可以参照相应（人用）食品的指标。
在本文中，术语“包含”或“包括”是开放式的表述，即除了所列明包含或包括的成份之外，可以不再含有其他成分或步骤，但也不排除还含有其他不影响具体列明的成份或步骤发挥功用的其他成分或步骤。优选地，本文中的“包含”或“包括”优选为“由…组成”。
在本文中，如未加特别注明，术语“赖氨酸”指的是L-赖氨酸。
二，含L-赖氨酸的制品
在本发明的第二（1）方面，本发明提供了含L-赖氨酸的饲料添加剂，其包括包被芯颗粒和包裹在包被芯颗粒上的包被层，其中包被层是过瘤胃脂肪，包被芯颗粒的制备方法包括：
（1）将赖氨酸盐和填充剂以及任选的谷氨酸钠混合均匀，形成混合物；
（2）向步骤（1）获得的混合物中加入任选含有木聚糖酶的粘合剂溶液，混合均匀，形成软材；
（3）将步骤（2）获得的软材过筛，形成粗颗粒；
（4）将步骤（3）获得的粗颗粒抛丸，形成圆形微丸；和
（5）干燥步骤（4）获得的圆形微丸并进行筛分，形成包被芯颗粒。
优选其中，步骤（1）中的填充剂是微晶纤维素和/或糊精。
优选其中，步骤（2）中的粘合剂是羧甲基纤维素。
优选其中，步骤（2）中的木聚糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选其中，赖氨酸盐、填充剂、谷氨酸钠和粘合剂的重量比为40~55：4~6：0~2：0.3~0.8，优选为42~50：4.5~5.5：0~1.5（如0.5~1.5）：0.4~0.5，更优选为43~48：4.8~5.2：0~1.2（如0.8~1.2）：0.45~0.55，最优选为45~46：5：0~1：0.5。
优选其中，包被芯颗粒和包被层的重量比为40~60：40~60，优选为46~56：43~53，更优选为48.5~51.5：48.5~51.5，最优选为1：1。
优选其中，每克饲料添加剂中木聚糖酶活性为0~30IU，优选为0~15IU（如5~15IU），更优选为0~10IU（如8~10IU），最优选为0~9IU。
优选其中，步骤（2）中的筛是30目筛。
优选其中，步骤（5）中的筛分是分离获得能通过30目筛并被40目筛截留的颗粒。
在本发明的第二（2）方面，本发明提供了本发明的第二（1）方面的饲料添加剂的制备方法，其包括将过瘤胃脂肪喷在包被芯颗粒上的步骤。
优选其包括：
（1）将赖氨酸盐和填充剂以及任选的谷氨酸钠混合均匀，形成混合物；
（2）向步骤（1）获得的混合物中加入任选含有木聚糖酶的粘合剂溶液，混合均匀，形成软材；
（3）将步骤（2）获得的软材过筛，形成粗颗粒；
（4）将步骤（3）获得的粗颗粒抛丸，形成圆形微丸；
（5）干燥步骤（4）获得的圆形微丸并进行筛分，形成包被芯颗粒；和
（6）将过瘤胃脂肪喷在步骤（5）获得的包被芯颗粒上。
在本发明的第二（3）方面，本发明提供了含L-赖氨酸的制品，其包括包被芯颗粒和包裹在包被芯颗粒上的包被层，其中包被层是过瘤胃脂肪，包被芯颗粒包括赖氨酸盐、填充剂和粘合剂以及任选的谷氨酸钠和任选的木聚糖酶。
优选其中，制品是饲料添加剂。
优选其中，赖氨酸盐是赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐或者它们的混合物，优选是赖氨酸硫酸盐。
优选其中，填充剂是微晶纤维素和/或糊精。
优选其中，粘合剂是羧甲基纤维素。
优选其中，木聚糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选其中，赖氨酸盐、填充剂、谷氨酸钠和粘合剂的重量比为40~55：4~6：0~2：0.3~0.8，优选为42~50：4.5~5.5：0~1.5（如0.5~1.5）：0.4~0.5，更优选为43~48：4.8~5.2：0~1.2（如0.8~1.2）：0.45~0.55，最优选为45~46：5：0~1：0.5。
优选其中，包被芯颗粒和包被层的重量比为40~60：40~60，优选为46~56：43~53，更优选为48.5~51.5：48.5~51.5，最优选为1：1。
优选其中，每克制品中木聚糖酶活性为0~30IU，优选为0~15IU（如5~15IU），更优选为0~10IU（如8~10IU），最优选为0~9IU。
优选其中，包被芯颗粒是能通过30目筛并被40目筛截留的颗粒。
优选其中，脂肪优选是棕榈脂肪和/或卵磷脂，更优选是能通过商业途径获取的产品，如百佳能、百事美等，优选是百佳能HTL316、百事美T300等。在本发明的具体实施方式中，包被所用的脂肪是百事美T300。
如无相反或者矛盾的指示，以上各方面可以优选本方面或者本文中的其他各方面的内容。
三，制备含L-赖氨酸的制品的工艺
在本发明的第三（1）方面，本发明提供了含L-赖氨酸的制品的制备方法，其包括：
（1）将赖氨酸盐和填充剂以及任选的谷氨酸钠混合均匀，形成混合物；
（2）向步骤（1）获得的混合物中加入任选含有木聚糖酶的粘合剂溶液，混合均匀，形成软材；
（3）将步骤（2）获得的软材过筛（如，30目筛），形成粗颗粒；
（4）将步骤（3）获得的粗颗粒抛丸，形成圆形微丸；
（5）干燥步骤（4）获得的圆形微丸并进行筛分，形成包被芯颗粒粒；和，
（6）将过瘤胃脂肪喷在步骤（5）获得的包被芯颗粒上。
优选该制备方法制备的含L-赖氨酸的制品是本发明的第二（3）方面所述的制品。
优选该制备方法由如下步骤组成：
（1）将赖氨酸盐和填充剂以及任选的谷氨酸钠混合均匀，形成混合物；
（2）向步骤（1）获得的混合物中加入任选含有木聚糖酶的粘合剂溶液，混合均匀，形成软材；
（3）将步骤（2）获得的软材过筛（如，30目筛），形成粗颗粒；
（4）将步骤（3）获得的粗颗粒抛丸，形成圆形微丸；
（5）干燥步骤（4）获得的圆形微丸并进行筛分，形成包被芯颗粒；和，
（6）将过瘤胃脂肪喷在步骤（5）获得的包被芯颗粒上。
本发明人发现，对粗颗粒抛丸以形成圆形微丸的步骤和/或干燥圆形微丸并进行筛分，能够有效提高过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的抗降解能力。所以在接下来的方面，本发明提供了本发明的第三（1）方面中的步骤（4）和/或步骤（5）的应用。优选其中抛丸在抛丸机中进行；和/或，筛分用一个或多个特定孔径的筛网进行分离。
在本发明的第三（2）方面，本发明提供了对粗颗粒抛丸以形成圆形微丸的步骤在制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法中的应用。
在本发明的第三（3）方面，本发明提供了干燥圆形微丸并进行筛分在制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法中的应用。
在本发明的第三（4）方面，本发明提供了对粗颗粒抛丸以形成圆形微丸的步骤在提高过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的抗降解能力中的应用。
在本发明的第三（5）方面，本发明提供了干燥圆形微丸并进行筛分的步骤在提高过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的抗降解能力中的应用。
优选其中，对粗颗粒抛丸以形成圆形微丸的步骤处于（优选紧接于）形成粗颗粒之后。
优选其中，干燥圆形微丸并进行筛分的步骤处于（优选紧接于）将过瘤胃脂肪喷在包被芯颗粒上之前。
优选其中，过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品是本发明的第二（3）方面所述的制品。
优选其中，制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法是本发明的第三（1）方面所述的方法。
优选其中，筛分是分离获得能通过30目筛并被40目筛截留的颗粒。
如无相反或者矛盾的指示，以上各方面可以优选本方面或者本文中的其他各方面的内容。
四，谷氨酸钠在含L-赖氨酸的制品中的应用
本发明人发现，少量谷氨酸钠对含L-赖氨酸的制品的抗降解能力是有益的，而且不影响赖氨酸发挥饲料的作用。所以，本发明还提供了谷氨酸钠在含L-赖氨酸的制品中的应用和相应方法。
在本发明的第四（1）方面，本发明提供了含L-赖氨酸的制品的制备方法，其包括：
（1）将赖氨酸盐和填充剂以及谷氨酸钠混合均匀，形成混合物；
（2）向步骤（1）获得的混合物中加入任选含有木聚糖酶的粘合剂溶液，混合均匀，形成软材；
（3）将步骤（2）获得的软材过筛（如，30目筛），形成粗颗粒；
（4）将步骤（3）获得的粗颗粒抛丸，形成圆形微丸；
（5）干燥步骤（4）获得的圆形微丸并进行筛分，形成包被芯颗粒；和，
（6）将过瘤胃脂肪喷在步骤（5）获得的包被芯颗粒上。
优选其中，制品是饲料添加剂。
优选其中，步骤（1）中的填充剂是微晶纤维素和/或糊精。
优选其中，步骤（2）中的粘合剂是羧甲基纤维素。
优选其中，步骤（2）中的木聚糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选其中，赖氨酸盐、填充剂、谷氨酸钠和粘合剂的重量比为42~50：4.5~5.5：0.5~1.5：0.4~0.5，更优选为43~48：4.8~5.2：0.8~1.2：0.45~0.55，最优选为45~46：5：1：0.5。
优选其中，包被芯颗粒和包被层的重量比为40~60：40~60，优选为46~56：43~53，更优选为48.5~51.5：48.5~51.5，最优选为1：1。
优选其中，每克饲料添加剂中木聚糖酶活性为0~30IU，优选为0~15IU（如5~15IU），更优选为0~10IU（如8~10IU），最优选为0~9IU。
优选其中，每克饲料添加剂中木聚糖酶活性为0~30IU，优选为0~15IU（如5~15IU），更优选为0~10IU（如8~10IU），最优选为0~9IU。
优选其中，步骤（5）中的筛分是分离获得能通过30目筛并被40目筛截留的颗粒。
在本发明的第四（2）方面，本发明提供了本发明的第四（1）方面所述的方法制备的制品。
在本发明的第四（3）方面，本发明提供了谷氨酸钠在制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法中或者在提高过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的抗降解能力中的应用。即，本发明提供了谷氨酸钠在制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法中的应用，本发明还提供了谷氨酸钠在提高过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的抗降解能力中的应用。
优选其中，谷氨酸钠是很少的，例如谷氨酸钠的重量占过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的0.5~1.5%，优选是0.8~1.2%，最优选是1%。
优选其中，过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品是本发明的第四（2）方面所述的制品。
优选其中，制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法是本发明的第四（1）方面所述的方法。
如无相反或者矛盾的指示，以上各方面可以优选本方面或者本文中的其他各方面的内容。
五，突变的木聚糖酶及其应用
本发明人令人意外地发现了木聚糖酶突变体，其在基本保持原有耐高温特性的基础上大幅增加了酶活性，特别有益于添加入含L-赖氨酸的饲料添加剂中。
在本发明的第五（1）方面，本发明提供了突变的木聚糖酶，其包含突变Arg45Ser，即第45位氨基酸残基由Arg突变为Ser。
优选该突变的木聚糖酶的氨基酸序列
（1）如SEQ ID No:2所示；或
（2）是对SEQ ID No:2缺失、添加和/或取代一个或几个（优选不超过7个，更优选不超过5个，如不超过3个）氨基酸残基而获得的保留SEQ ID No:2活性的序列，而且其中包含突变Arg45Ser。
在本发明的第五（2）方面，本发明提供了编码本发明的第五（1）方面所述的木聚糖酶的基因。
优选该基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
在本发明的第五（3）方面，本发明提供了包含本发明的第五（2）方面所述的基因的载体。
在本发明的第五（4）方面，本发明提供了菌种，其包含本发明的第五（2）方面所述的基因，或用本发明的第五（3）方面所述的载体转化或者转染而得。
优选该菌种是分泌表达菌，如，酵母。
在本发明的第五（5）方面，本发明提供了发酵生产本发明的第五（1）方面所述的木聚糖酶的方法，其包括在发酵条件下培养本发明的第五（4）方面所述的菌种，从培养物中分离出本发明的第五（1）方面所述的木聚糖酶。
在本发明的第五（6）方面，本发明提供了本发明的第五（1）方面所述的木聚糖酶在制备含L-赖氨酸的制品中的用途。
优选其中，每克含L-赖氨酸的制品中本发明的第五（1）方面所述的木聚糖酶活性为5~15IU，更优选为8~10IU，最优选为9IU。
优选其中，制品是饲料添加剂。
优选其中，含L-赖氨酸的制品包括包被芯颗粒和包裹在包被芯颗粒上的包被层，其中包被层是过瘤胃脂肪，包被芯颗粒包括本发明的第五（1）方面所述的木聚糖酶、赖氨酸盐、填充剂和粘合剂以及任选的谷氨酸钠。
更优选其中，赖氨酸盐是赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐或者它们的混合物，优选是赖氨酸硫酸盐。
更优选其中，填充剂是微晶纤维素和/或糊精。
更优选其中，粘合剂是羧甲基纤维素。
更优选其中，木聚糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选其中，赖氨酸盐、填充剂、谷氨酸钠和粘合剂的重量比为40~55：4~6：0~2：0.3~0.8，优选为42~50：4.5~5.5：0~1.5（如0.5~1.5）：0.4~0.5，更优选为43~48：4.8~5.2：0~1.2（如0.8~1.2）：0.45~0.55，最优选为45~46：5：0~1：0.5。
优选其中，包被芯颗粒和包被层的重量比为40~60：40~60，优选为46~56：43~53，更优选为48.5~51.5：48.5~51.5，最优选为1：1。
优选其中，包被芯颗粒是能通过30目筛并被40目筛截留的颗粒。
优选其中，脂肪优选是棕榈脂肪和/或卵磷脂，更优选是能通过商业途径获取的产品，如百佳能、百事美等，优选是百佳能HTL316、百事美T300等。在本发明的具体实施方式中，包被所用的脂肪是百事美T300。
优选其中，制备的方法包括：
（1）将赖氨酸盐和填充剂以及任选的谷氨酸钠混合均匀，形成混合物；
（2）向步骤（1）获得的混合物中加入含有木聚糖酶的粘合剂溶液，混合均匀，形成软材；
（3）将步骤（2）获得的软材过筛（如，30目筛），形成粗颗粒；
（4）将步骤（3）获得的粗颗粒抛丸，形成圆形微丸；
（5）干燥步骤（4）获得的圆形微丸并进行筛分，形成包被芯颗粒；和，
（6）任选地，将过瘤胃脂肪喷在步骤（5）获得的包被芯颗粒上。
如无相反或者矛盾的指示，以上各方面可以优选本方面或者本文中的其他各方面的内容。
本发明具有以下有益效果：通过多个方面的改进，本发明的制品安全可靠，相对于现有技术，可更有效降低动物体内赖氨酸的释放速度，抗降解能力更强，更加提高饲料的利用率而促进动物的生长发育。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复而明确记载过一样。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南（第3版）》（科学出版社）、《微生物学实验（第4版）》（高等教育出版社）以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。
实施例1 突变型的木聚糖酶基因的表达构建体的制备
根据我们在前中国专利第201210185883号记载的木聚糖酶基因，将其上编码第45位的Arg突变成Ser，即将核苷酸序列第133-135位的CGC突变成TCC，突变型的木聚糖酶的核苷酸序列如序列表的SEQ ID No:1所示，所编码的木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。然后，根据《分子克隆实验指南》以及所用商品化试剂的操作指南构建分泌表达的酵母，简而言之，即将编码该木聚糖酶的基因用正向引物如序列表的SEQ ID No: 3所示（引入了EcoR I内切酶位点）、反向引物如序列表的SEQ ID No:4所示（引入了Not I内切酶位点）扩增后用EcoR I和Not I双酶切，并与经这两个内切酶酶切的pPIC3.5质粒（可购自Invitrogen公司）用T4 DNA连接酶进行连接，转化入大肠杆菌DH5α中。挑出阳性克隆，抽提出其中的质粒，经测序验证正确后，将阳性质粒用Sal I酶切线性化后，通过电转化法转化入毕氏酵母GS115株，在含G418的平板上挑出阳性酵母转化株，寄回。
实施例2 突变型的木聚糖酶的发酵制备及活性测定
将实施例1获得的阳性酵母转化株接种到50ml BMGY液体培养基（100mM磷酸钾缓冲液（pH6.0），其中含1%酵母提取物、2%蛋白胨，酵母含氮碱基1.34%，生物素4*10-5%，葡萄糖2%，甘油1%）中，于30℃、200rpm培养至OD600达到5.0。
将上述培养物转接到1L BMGY液体培养基中，于30℃、200rpm培养24小时，加入5ml甲醇，然后继续于30℃、200rpm培养8天，期间每24小时补加5ml甲醇，通气控制溶氧（DO）大于20%，并控制pH为6.0（用氨水调节）。培养完成后，用0.22μm滤膜过滤并保留上清液，该上清液经SDS-PAGE检测其中富含木聚糖酶对应的蛋白质，由此发酵得到木聚糖酶上清液。
取新鲜的上清液，分成三份，一份冷藏待用（A），一份冷冻干燥至固体后用磷酸钾缓冲液（pH6.0）重新溶解（B），一份于80℃烘箱中蒸发干燥至固体后用磷酸钾缓冲液（pH6.0）重新溶解（C）；对照采用中国专利第201210185883号发现的木聚糖酶基因，用磷酸钾缓冲液（pH6.0）溶解后分成三份，一份冷藏待用（CA），另两份分别冷冻干燥（CB）和80℃烘箱蒸发干燥（CC），然后重溶于磷酸钾缓冲液（pH6.0）。分别测定这些木聚糖酶活性，换算成原单位体积上清液或单位重量的酶活，计算由于高温脱水造成的酶活损失率，结果如表1所示，表明相对于原来我们发现的耐高温脱水的木聚糖酶，本发明的突变型的木聚糖酶，虽然耐高温脱水能力略差于原来的，但是仍旧保留了75%以上的活性，尤其令人意外的是，酶活性有了显著的提升，即便经过高温脱水，其酶活性的绝对值仍旧高于原来的木聚糖酶，甚至高于原来的木聚糖酶在未经过高温脱水时的酶活。
表1 本发明和市售的木聚糖酶的高温脱水酶活损失率
| 样品 | 酶活 | 损失率 | 样品 | 酶活 | 损失率 |
| A | 3.7*104IU/L | CA | 2.4*104IU/L | ||
| B | 3.5*104IU/L | 5.4% | CB | 2.2*104IU/L | 8.3% |
| C | 2.8*104IU/L | 24% | CC | 2.0*104IU/L | 17% |
实施例3 L-赖氨酸的包被
根据我们在前中国专利201210440083记载的方法，获得L-赖氨酸含量为63.5%（w/w）的含L-赖氨酸硫酸盐的颗粒核心（其本身为工业纯的L-赖氨酸硫酸盐），不再用低纯度的L-赖氨酸外层包裹，直接作为本发明的饲料的赖氨酸原料。
表2 本发明的饲料添加剂的配方
| 配方1 | 配方2 | 配方3 | 配方4 | |
| 赖氨酸原料 | 46kg | 45kg | 46kg | 45kg |
| 谷氨酸钠 | / | 1kg | / | 1kg |
| 微晶纤维素 | 4kg | 4kg | 4kg | 4kg |
| 糊精 | 1kg | 1kg | 1kg | 1kg |
| 羧甲基纤维素（CMC） | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 木聚糖酶 | / | / | 9*105IU | 9*105IU |
| 过瘤胃脂肪粉 | 48.5kg | 48.5kg | 48.5kg | 48.5kg |
包被所用的原料如表2所示，具体过程如下：
将配方量的赖氨酸原料、微晶纤维素和糊精以及（当配方含有谷氨酸钠的时候）谷氨酸钠倒入槽形混合机，混合均匀，获得包被芯混合物；
将配方量的羧甲基纤维素用25L水（当配方不含有木聚糖酶的时候）或者根据实施例2方法制备的木聚糖酶上清液（当配方含有木聚糖酶的时候）浸泡，配制成2%的CMC溶液，然后直接倒入上述包被芯混合物中，混合均匀，形成软材；
将上述软材倒入摇摆式造粒机中，经30目筛网（孔径为0.6mm），制成直径约为0.6mm的粗颗粒；
将上述粗颗粒倒入以2200rpm运行的球型抛丸机中抛丸3分钟，形成圆形微丸；
将上述微丸置于进风温度60℃的流化制粒包衣机中干燥45分钟，然后分别经过30目筛网（孔径为0.6mm）和40目筛网（孔径为0.425mm），保留能通过30目筛网并被40亩筛网截留的粒径为0.425-0.6mm的包被芯颗粒；
将配方量的过瘤胃脂肪粉置于油罐中加热到90℃，待完全熔化后，于80℃保温并连通流化制粒包衣机的喷头喷入流化制粒包衣机中，喷在其中的上述包被芯颗粒表面，其中流化制粒包衣机引风机转速3500rpm，进风温度60℃，最终分别得到包被芯颗粒与过瘤胃脂肪粉重量比约为1：1的上述四种配方所分别对应的包被的L-赖氨酸饲料添加剂。
另外，按照配方1的配方基本按照上述过程制备，所不同的在于省略抛丸步骤，即直接将粗颗粒置于进风温度60℃的流化制粒包衣机中干燥，获得对照工艺1的L-赖氨酸饲料添加剂；
按照配方1的配方基本按照上述过程制备，所不同的在于省略干燥后两步筛分的步骤，即在进风温度60℃的流化制粒包衣机中干燥45分钟后，不筛分，直接将所有的颗粒都继续进行下一步包被，获得对照工艺2的L-赖氨酸饲料添加剂。
实施例4 包被的L-赖氨酸饲料添加剂的降解测试
根据赵鹤等（不同比例羊草与青贮饲料在奶牛瘤胃内干物质降解率的研究. 中国牛业科学,34(2):13-16）描述的体内尼龙袋法，在成年奶牛中对根据实施例3方法制备的各种包被的饲料添加剂进行降解测试，以其中L-赖氨酸作为测定指标。在不包被的情况下，在2小时后L-赖氨酸的降解率达95%以上（即L-赖氨酸保持率不足5%），而包被的饲料添加剂的保持率如下表3所示：
表3 本发明的饲料添加剂的抗降解效果
如表3所示，但是如果相对于我们在前中国专利201210440083记载的方法，本发明的包被技术可以进一步延长L-赖氨酸在动物胃中的留存时间，其中是否添加了本发明的木聚糖酶对于包封效果影响不大，但是出人意料的是，尽管抛丸和筛分的工艺很微小，但是采用后能够提高保持率约10%，更令人意外的是，如果其中加入少量的谷氨酸钠（如果单单添加谷氨酸，效果将显著不如其钠盐），将使得包被的颗粒更加不容易破裂，使得其中的赖氨酸释放更加平滑，无论是短期（如2小时内）还是长期（如24或48小时），都显著提高了赖氨酸在瘤胃中的抗降解效果。
实施例5 包被的L-赖氨酸饲料添加剂对牛犊生长影响的效用
委托宁夏农科院畜牧研究所用根据实施例3方法制备的各种饲料添加剂喂饲3月龄的牛犊8周，以喂饲不添加本发明的饲料添加剂（即只喂基础日粮）和添加了市售的非包被的等量赖氨酸饲料添加剂为对照。结果如下表4所示：
表4 本发明的饲料添加剂对牛犊的生长影响
| 饲料 | 初始平均体重（kg） | 结束平均体重（kg） | 体重增量（kg） | 体重增量提高率（%） |
| 基础日粮 | 125.7 | 165.3 | 39.6 | / |
| 基础日粮+未包被的赖氨酸 | 126.1 | 166.9 | 40.8 | 3.0 |
| 基础日粮+配方1 | 125.6 | 169.5 | 43.9 | 10.9 |
| 基础日粮+配方2 | 126.4 | 170.5 | 44.1 | 11.4 |
| 基础日粮+配方3 | 125.8 | 171.0 | 45.2 | 14.1 |
| 基础日粮+配方4 | 124.8 | 170.3 | 45.5 | 14.9 |
如表4所示，喂饲L-赖氨酸对牛犊的生长有着一定的促进作用，但是如果直接喂饲，其促进作用非常有限，只有不到5%，而通过本发明的方法包被后添加等量赖氨酸的饲料添加剂，能够显著促进生长，提高10%以上，尤其是添加了本发明的木聚糖酶后，更能进一步促进生长约4%。由于试验中喂饲频率（每日两次）较高，因此本发明的一些配方的更长时间的包封保持率的优势在对牛犊生长的影响中体现得不是非常充分，但是仍旧有0.5%及以上的提升，预计实际饲养中会体现得更显著。另外，试验期间，没有不良反应报告，表明本发明的配方是安全的。
<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司
<120> L-赖氨酸制品的制备工艺
<130> 电子申请
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgattagcc tggcggcgag cctgccgatt ccgctggtga gcgcgctgcc gcatgcgcat 60
attagcgtga acgcgcatac ccgctttcag caggtggatg gctttggctt tagcgaagcg 120
tttcagcgcg cgtccgatat ttatggcaaa gatggcctga gcccggaaga tcgcacccgc 180
gtgctggatc tgctgtttag cgatacccgc ggcgcgggcc tgaccattgt gcgcaacggc 240
attggcagca acagcaccat taaagatttt atgaacagca ttgaaccgtt tagcccgggc 300
agcccgagcg cgccgccgca ttatgtgtgg gatcgcaacg atagcggcca ggtgtggctg 360
agccatgaag cggcgagcta tggcgtgaac accttttatg cggatgcgtg gagcgcgccg 420
ggctatatga aaaccaacga tgatgatagc aacggcggct atctgtgcgg cgtgagcaac 480
accagctgcg cgagcggcga ttggaaacag gcgtatgcga actatctggt gcagtatatt 540
catttttatc agcaggtggg cattaaagtg acccatctgg gctttctgaa cgaaccgcag 600
gaagatgtga cctatgcgag catgctgagc gatggcaccc aggcggcggc ggattttatt 660
aaagtgctgg cgccgaccgt gaaagcggcg ggcctggatg tgaaactgac ctgctgcgat 720
ggcgtgggct gggaagaaca gcgcgcgatg ctgccgggcc tgcaggcggg cggcccggaa 780
catagcgcgg aaagctatct gagcgtgatt accgcgcatg gctataacag cccgccgacc 840
accccgctgg aaaccagcct gccggtgtgg atgaccgaat gggcggatct gaacgataac 900
tataccgcgg cgtggtatga aaacggcgcg ccgggcgaag gcctgacctg ggcgaaccgc 960
attcaggatg cgtttacccg cagcaacgtg agcgcgtttc tgcattggat tggcgcggaa 1020
aacggcacca gcaacagccc gctgattaac ctgaacggcg atagctatgt ggcgagcaaa 1080
cgcctgtggg cgtttggcca gtttagccgc tttgtgcgcc cgggcgcggt gcgcattgat 1140
gcggcgagca gcgatccgct ggtgaccgtg agcgcgtttc agaacaaaga aaacggcgtg 1200
gtggcgaccc aggtgattaa caacgcggat accgattatg aagtggaagt ggatctgacc 1260
ggccgcggcc atctggtgag cgtggtgcag ccgtatctga ccaacaacga acatgatctg 1320
gaagcgagca gcccgattat taccctggcg ctgggcgcgg cgaccaaatt taccagcatt 1380
gtgccggcgc gcagcctggt gagctttgtg agcaaaaccg cgctgtaa 1428
<210> 2
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ile Ser Leu Ala Ala Ser Leu Pro Ile Pro Leu Val Ser Ala Leu
1 5 10 15
Pro His Ala His Ile Ser Val Asn Ala His Thr Arg Phe Gln Gln Val
20 25 30
Asp Gly Phe Gly Phe Ser Glu Ala Phe Gln Arg Ala Ser Asp Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asp Gly Leu Ser Pro Glu Asp Arg Thr Arg Val Leu Asp Leu
50 55 60
Leu Phe Ser Asp Thr Arg Gly Ala Gly Leu Thr Ile Val Arg Asn Gly
65 70 75 80
Ile Gly Ser Asn Ser Thr Ile Lys Asp Phe Met Asn Ser Ile Glu Pro
85 90 95
Phe Ser Pro Gly Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Tyr Val Trp Asp Arg
100 105 110
Asn Asp Ser Gly Gln Val Trp Leu Ser His Glu Ala Ala Ser Tyr Gly
115 120 125
Val Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ala Trp Ser Ala Pro Gly Tyr Met Lys
130 135 140
Thr Asn Asp Asp Asp Ser Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Gly Val Ser Asn
145 150 155 160
Thr Ser Cys Ala Ser Gly Asp Trp Lys Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu
165 170 175
Val Gln Tyr Ile His Phe Tyr Gln Gln Val Gly Ile Lys Val Thr His
180 185 190
Leu Gly Phe Leu Asn Glu Pro Gln Glu Asp Val Thr Tyr Ala Ser Met
195 200 205
Leu Ser Asp Gly Thr Gln Ala Ala Ala Asp Phe Ile Lys Val Leu Ala
210 215 220
Pro Thr Val Lys Ala Ala Gly Leu Asp Val Lys Leu Thr Cys Cys Asp
225 230 235 240
Gly Val Gly Trp Glu Glu Gln Arg Ala Met Leu Pro Gly Leu Gln Ala
245 250 255
Gly Gly Pro Glu His Ser Ala Glu Ser Tyr Leu Ser Val Ile Thr Ala
260 265 270
His Gly Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Thr Pro Leu Glu Thr Ser Leu Pro
275 280 285
Val Trp Met Thr Glu Trp Ala Asp Leu Asn Asp Asn Tyr Thr Ala Ala
290 295 300
Trp Tyr Glu Asn Gly Ala Pro Gly Glu Gly Leu Thr Trp Ala Asn Arg
305 310 315 320
Ile Gln Asp Ala Phe Thr Arg Ser Asn Val Ser Ala Phe Leu His Trp
325 330 335
Ile Gly Ala Glu Asn Gly Thr Ser Asn Ser Pro Leu Ile Asn Leu Asn
340 345 350
Gly Asp Ser Tyr Val Ala Ser Lys Arg Leu Trp Ala Phe Gly Gln Phe
355 360 365
Ser Arg Phe Val Arg Pro Gly Ala Val Arg Ile Asp Ala Ala Ser Ser
370 375 380
Asp Pro Leu Val Thr Val Ser Ala Phe Gln Asn Lys Glu Asn Gly Val
385 390 395 400
Val Ala Thr Gln Val Ile Asn Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Glu Val Glu
405 410 415
Val Asp Leu Thr Gly Arg Gly His Leu Val Ser Val Val Gln Pro Tyr
420 425 430
Leu Thr Asn Asn Glu His Asp Leu Glu Ala Ser Ser Pro Ile Ile Thr
435 440 445
Leu Ala Leu Gly Ala Ala Thr Lys Phe Thr Ser Ile Val Pro Ala Arg
450 455 460
Ser Leu Val Ser Phe Val Ser Lys Thr Ala Leu
465 470 475
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 正向引物
<400> 3
cgaattcgat gattagcctg gc 22
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 反向引物
<400> 4
agcggccgca ttacagcgcg gtttt 25
Claims (10)
1.含L-赖氨酸的制品，其包括包被芯颗粒和包裹在包被芯颗粒上的包被层，其中包被层是过瘤胃脂肪，包被芯颗粒包括赖氨酸盐、填充剂和粘合剂以及任选的谷氨酸钠和任选的木聚糖酶。
2.权利要求1所述的制品，其中赖氨酸盐、填充剂、谷氨酸钠和粘合剂的重量比为40~55：4~6：0~2：0.3~0.8，优选为42~50：4.5~5.5：0~1.5（如0.5~1.5）：0.4~0.5，更优选为43~48：4.8~5.2：0~1.2（如0.8~1.2）：0.45~0.55，最优选为45~46：5：0~1：0.5。
3.权利要求1所述的制品，其中包被芯颗粒和包被层的重量比为40~60：40~60，优选为46~56：43~53，更优选为48.5~51.5：48.5~51.5，最优选为1：1。
4.权利要求1所述的制品，其中赖氨酸盐是赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐或者它们的混合物，优选是赖氨酸硫酸盐；填充剂是微晶纤维素和/或糊精；粘合剂是羧甲基纤维素；和/或，木聚糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.权利要求1所述的制品，其中包被芯颗粒是能通过30目筛并被40目筛截留的颗粒。
6.权利要求1-5之任一所述的制品的制备方法，其包括：
（1）将赖氨酸盐和填充剂以及任选的谷氨酸钠混合均匀，形成混合物；
（2）向步骤（1）获得的混合物中加入任选含有木聚糖酶的粘合剂溶液，混合均匀，形成软材；
（3）将步骤（2）获得的软材过筛（如，30目筛），形成粗颗粒；
（4）将步骤（3）获得的粗颗粒抛丸，形成圆形微丸；
（5）干燥步骤（4）获得的圆形微丸并进行筛分，形成包被芯颗粒；和，
（6）将过瘤胃脂肪喷在步骤（5）获得的包被芯颗粒上。
7.权利要求6所述的方法，其由步骤（1）、（2）、（3）、（4）、（5）和（6）组成。
8.对粗颗粒抛丸以形成圆形微丸的步骤和/或干燥圆形微丸并进行筛分（尤其是能通过30目筛并被40目筛截留）的步骤在制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法中的应用。
9.对粗颗粒抛丸以形成圆形微丸的步骤和/或干燥圆形微丸并进行筛分（尤其是能通过30目筛并被40目筛截留）的步骤在提高过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的抗降解能力中的应用。
10.权利要求8或9所述的应用，其中过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品是权利要求1-5之任一所述的制品；和/或，制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法是权利要求6或7所述的方法。
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