ES2580207T3 - Biosensor competitivo de elevada sensibilidad - Google Patents

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ES2580207T3
ES2580207T3 ES11793827.4T ES11793827T ES2580207T3 ES 2580207 T3 ES2580207 T3 ES 2580207T3 ES 11793827 T ES11793827 T ES 11793827T ES 2580207 T3 ES2580207 T3 ES 2580207T3
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Achim Müller
Peter Herbrechtsmeier
Monika Knuth
Katharina Nikolaus
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Abstract

Dispositivo que comprende un hidrogel con "una proteína que se une a la glucosa" incorporada al mismo y un ligando de "la proteína que se une a la glucosa", en donde el hidrogel comprende una primera matriz de hidrogel de alginato, y una segunda matriz de hidrogel, la cual forma dentro de la primera matriz de hidrogel una red interpenetrante.

Description

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DESCRIPCION
Biosensor competitivo de elevada sensibilidad Descripcion
La presente invencion se refiere a las medidas a tomar para la determinacion de la glucosa y para el diagnostico de enfermedades que tienen como base un metabolismo trastornado de la glucosa. En particular, la presente invencion se refiere a un dispositivo que comprende un hidrogel con una protema intercalada dentro del mismo que tiene la propiedad de unirse a la glucosa, y un ligando de dicha "proteina que se une a la glucosa", en donde el hidrogel comprende una primera matriz de hidrogel a base de alginato y una segunda matriz de hidrogel, la cual forma una red mterpenetrada dentro de la primera matriz de hidrogel. La descripcion se refiere ademas al empleo de un hidrogel de este tipo para la determinacion del contenido de glucosa de una muestra, asf como al empleo para el diagnostico de un metabolismo trastornado de la glucosa en voluntarios.
La determinacion de la concentracion de glucosa mediante una eficiente y fidedigna tecnica de medicion es de una gran importancia en muchos campos de la tecnica. No solamente en la pura analttica de laboratorio, sino tambien en la industria de la alimentacion, por ejemplo, en el campo de la enologfa, asf como en el campo de la medicina, por ejemplo, el diagnostico de enfermedades, las cuales han sido causadas por un metabolismo trastornado de la glucosa, por ejemplo, en la diabetes mellitus o el smdrome metabolico, la rapida y fidedigna determinacion de la concentracion de glucosa en soluciones preparadas, juega un papel principal. En el campo del diagnostico de enfermedades, las cuales tienen como base un metabolismo trastornado de la glucosa, los sensores de glucosa se emplean tanto en dispositivos implantados en el cuerpo, los cuales miden el contenido en glucosa de una muestra tomada dentro del cuerpo, como tambien en sensores los cuales pueden medir ex vivo el contenido de glucosa de unas muestras de voluntarios.
Para la determinacion del contenido de glucosa en una solucion se han descrito distintos sistemas de molecula sensora y ligando, en donde el sensor es una protema que tienen la propiedad de unirse a la glucosa y el ligando es un competidor de la glucosa, el cual esta unido en el sensor en primer lugar con la molecula sensora de glucosa. En la competicion con la glucosa durante el proceso de medicion, el competidor de la "protema que se une a la glucosa" esta inhibido. La inhibicion del competidor mediante la glucosa de "la protema que se une a la glucosa" puede detectarse mediante el cambio de una propiedad ffsica o qrnmica de la molecula, por ejemplo, portransferencia de la energfa de resonancia de fluorescencia (FRET). Los sistemas antes citados deben estar presentes naturalmente en una zona localizada del sensor.
Para la inclusion de los componentes del sistema, es decir, de la molecula que se une a la glucosa, y del ligando, el cual actua como competidor, se han acreditado, entre otros, los hidrogeles. A este respecto, hidrogeles adecuados pueden ser los polietilenglicoles, pero tambien los alginatos (por ejemplo, las patentes US 2007 /0105176; US 6.485.703; Russell 1999, Anal chem 71: 3126-3132). Ademas, han sido descritos sensores en los cuales los sistemas antes citados han sido incorporados en un medio acuoso mediante una membrana semipermeable. Dichas membranas pueden consistir por ejemplo en celulosa regenerada, polietilenglicol, capas "layer-by layer" ("capa a capa") (LBL) de poliuretano, polietersulfonas, capas de parileno, o sflice perforado (por ejemplo US 2007/0122829).
La patente DE 10 2007 024642 describe un implante de hidrogel para la comprobacion por lo menos de un analito en el lfquido del ojo. La publicacion de Czimerova et al. (Journal of Colloid and Interface Science, vol 320, 2008, pags 140 - 151) describe la transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia entre dos colorantes laser cationicos en presencia de una serie de montmorillonitas de carga reducida, e investiga el efecto de la carga.
Los sensores de glucosa descritos en el estado actual de la tecnica, presentan sin embargo una relativamente escasa actividad de glucosa. La actividad de glucosa y por lo tanto el rendimiento sensorial se determina decisivamente mediante las constantes de union de los complejos de la "proteina que se une a la glucosa" y del competidor, asf como de la "protema que se une a la glucosa", y de la glucosa.
En el caso de sensores ex vivo, para obtener una sensibilidad de los sensores lo mas alta posible, se puede escoger un receptor de analito con una constante de union cualquiera mas alta, puesto que el analito no debe ser liberado de nuevo, y se puede obtener mediante una constante de union muy alta, la mayor parte de las veces, de una muy alta especificidad y por lo tanto un buen rendimiento sensorial.
En el caso de los sensores in vivo, la situacion es sin embargo otra, puesto que el sensor debe reaccionar continuamente de forma reversible a los cambios de concentracion del analito. Por lo tanto, la constante de union no debe ser demasiado alta, puesto que el sensor ya en concentraciones de analito muy pequenas estana saturado y no podna mostrar los cambios de concentracion. Ademas existe otra problematica de los sensores in vivo, que consiste en que el intervalo de concentracion del analito permanece constante y no puede ser optimizado mediante dilucion o concentracion. En el estado actual de la tecnica se describen esencialmente sistemas de ligando y "protema que se une a la glucosa", en los cuales se tienen constantes de union, medias. Una adecuacion de la sensibilidad de la medicion mediante el cambio de las concentraciones, bien de la "protema que se une a la glucosa", o bien del ligando, o bien de ambos, esta generalmente limitada por la escasa solubilidad de las
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correspondientes moleculas. En los sensores descritos segun el estado actual de la tecnica citado anteriormente, tanto la sensibilidad de la medicion como tambien la exactitud de la medicion del sensor, estan limitadas (ver Rounds 2007, J. Fluorec. 17: 57-63).
El objetivo de la presente invencion es el de proporcionar un dispositivo que permita una mas eficiente determinacion del nivel de glucosa tambien in vivo y que obvie esencialmente los inconvenientes citados anteriormente. La invencion se resuelve mediante las versiones descritas en las reivindicaciones, asf como las versiones que se dan a conocer a continuacion.
La invencion se refiere por lo tanto a un dispositivo que comprende un hidrogel con una "protema que se une a la glucosa" incorporada al mismo, y un ligando de la "protema que se une a la glucosa", en donde el hidrogel comprende una primera matriz de hidrogel a base de alginato y una segunda matriz de hidrogel que esta formada dentro de la primera matriz de hidrogel por una red interpenetrada.
En el caso del dispositivo segun la invencion se trata tambien de una composicion que consta de los componentes anteriormente citados.
El concepto de "hidrogel" describe un polfmero que contiene agua cuyas moleculas estan ligadas qmmica o tisicamente a una red tridimensional. Las moleculas del potimero puede estar unidas entre sf por enlaces covalentes o ionicos o mediante un enmaranado o un entretejido a la red tridimensional. Los potimeros, los cuales forman el hidrogel, contienen de preferencia componentes polfmeros hidrofilos, los cuales hacen posible la absorcion de soluciones acuosas asf como de grupos que estan en situacion de interreaccionar con la "protema que se une a la glucosa".
Los hidrogeles segun la invencion se componen de una primera matriz de hidrogel a base de alginato, y de una segunda matriz de hidrogel, la cual esta expandida en el alginato de la primera matriz de hidrogel, formando una red interpenetrante. Esta segunda matriz de hidrogel consta de preferencia de un potimero soluble en agua con por lo menos un grupo reticulable por molecula y con un peso molecular de maximo 500.000. Es particularmente preferido un peso molecular de como maximo 250.000, 200.000, 150.000, 100.000, o 50.000. Se prefiere que la segunda matriz de hidrogel este escogida del grupo formado por: polivinilalcoholes (PVAs), polietilenglicoles (PEGs), poli(2- oxazolinas, poliacrilamidas (por ejemplo, la dimetilacrilamida), polihidroxiacrilatos (por ejemplo el polihidroximetacrilato, la polihidroxiacrilamida, la polivinilpirolinona), potimeros de (2-metil-3-etil[2-hidroxietil]), polihidroxialcanoatos (PHAs), poli(2-metil-2 oxazolinas), poli(2-etil-2 oxazolinas), poli(2-hidroxietil-2 oxazolinas), poli(2(1-(hidroximetil)-etil)-2 oxazolinas), poli-(hidroxietilmetacrilato) (PHEMA), poli-(hidroxietil-acrilato) (PHEA), polivinilpirrolidonas, poli-(dimetil) acrilamida, poli-(hidroxietil) acrilamida, polivinilalcoholes (incluidos copotimeros con acetato de vinilo y/o etileno), poli(etileno-co-vinilalcohol), poli(vinilacetato-co-vinilalcohol), poli(etileno-co-vinilacetato- co-vinilalcohol), polietilenglicoles y poli(etilenglicol-co-propilenglicol).
Una red interpenetrante segun la invencion, se obtiene de preferencia mediante la polimerizacion de monomeros del segundo potimero en presencia de un primer potimero ya existente. Con particular preferencia, esto se logra mediante procedimientos que estan descritos con mas detalle en los ejemplos de versiones. Con ello se logra que en la red existente del primer potimero pueda formarse ya una red interpenetrante del segundo potimero. Las redes de potimeros estan tambien entretejidas entre si y/o enmaranadas. Por el contrario, coexisten diferentes potimeros en mezclas como redes separadas no entretejidas entre si ni enmaranadas.
Con particular preferencia, se diferencian los mecanismos de reticulacion del primer y el segundo potimero, de manera que no aparece ningun reticulado mezclado. El alginato antes citado, el cual debe formar la primera matriz de hidrogel, se reticula mediante interacciones ionicas. Los segundos potimeros antes citados, que forman las redes interpenetrantes se reticulan todos mediante polimerizacion radical o ionica.
Con particular preferencia, la segunda matriz de hidrogel se forma a base de polivinilalcohol. Es particularmente preferido el polivinilalcohol con un peso molecular de 10.000 a 100.000, con mayor preferencia de 10.000 a 50.000, con mas preferencia de 10.000 a 20.000, con muy particular preferencia 15.000. Es particularmente preferido el polivinilalcohol que presenta un contenido en reticulacion de maximo 0,5 mmoles/gramo, 0,4 mmoles/gramo, 0,35 mmoles/gramo o 0,3 mmoles/gramo y muy particularmente preferido 0,35 mmoles/gramo. Ademas el polivinilalcohol presenta con particular preferencia un contenido en solidos del prepotimero de menos del 40 por ciento en peso.
El hidrogel segun la invencion puede contener aditivos junto a la primera matriz de hidrogel y en la segunda matriz de hidrogel, como por ejemplo, estabilizadores, emulsionantes, antioxidantes, estabilizadores de ultravioleta, detergentes, y / o iniciadores de UV.
El hidrogel empleado segun la invencion puede ademas estar recubierto por otro material de recubrimiento, de preferencia semipermeable. Mediante este sistema de contencion se evita un "sangrado" ("lixiviacion") de los componentes de los sensores a partir del hidrogel. Como material de recubrimiento entran en consideracion membranas semipermeables u otras matrices de hidrogel. Membranas semipermeables pueden ser de preferencia de celulosa regenerada, de polietilenglicol, de capas capa-a-capa de poliuretano (LBL), de polietersulfona, de capas
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de parileno, o de s^lice perforada. De preferencia, puede formarse otra matriz de hidrogel a base de un poUmero, escogido del grupo formado por los alginatos, las sefarosas, el acido hialuronico, el quitosano, los polivinilalcoholes (PVAs), los polietilenglicoles (PEGs), los carragenos y los polihidroxalcanoatos (PHAs), las poli(2-metil-2 oxazolinas), las poli(2-etil- 2 oxazolinas), las poli(2-hidroxietil-2 oxazolinas), las poli(2-(1-(hidroximetil)-etil)-2 oxazolinas), el poli- (hidroxietilmetacrilato) (PHEMA), el poli-(hidroxietilacrilato) (PHEA), las poli-vinilpirrolidonas, la poli- (dimetil)acrilamida, la poli-(hidroxietil)acrilamida, los polivinil alcoholes (incluidos los copoKmeros con acetato de vinilo y /o etileno), el poli (etileno-co-vinilalcohol), el poli(vinilacetato-co-vinilalcohol), el polietileno-co-vinilacetato-co- vinilalcohol), los polietilenglicoles y el poli(etilenglicol-co-propilenglicol).
El concepto "protema que se une a la glucosa" se refiere en el marco de la invencion, a protemas que son capaces de interreaccionar espedficamente con la glucosa. Si una protema esta en situacion de interreaccionar espedficamente con la glucosa, puede detectarse simplemente por el experto mediante un ensayo de union ya conocido en el estado actual de la tecnica. Se prefiere en particular que la "protema que se une a la glucosa" se escoja del grupo formado por las lectinas, las enzimas que se unen a la glucosa como substrato, y los anticuerpos que reconocen espedficamente a la glucosa. El concepto "protema que se une a la glucosa" incluye tambien las moleculas subrogadas, que pueden reconocer espedficamente a la glucosa, de preferencia los aptameros, los cuales reconocen espedficamente a la glucosa. Muy particularmente preferida es la "protema que se une a la glucosa", la concanavalina A.
Secuencias de acidos nucleicos y secuencias de aminoacidos, las cuales codifican a las anteriormente citadas "protemas que se unen a la glucosa", son ya conocidas en el estado actual de la tecnica (Yamauchi 1990 FEBS Letters 260 (1): 127-130). En consecuencia, las protemas anteriormente citadas pueden facilmente ser obtenidas por el experto. Las protemas mencionadas pueden por ejemplo obtenerse recombinantemente o pueden ser purificadas a partir de una fuente biologica. Ademas, dichas protemas pueden tambien sintetizarse qmmicamente. La mayor parte de las protemas anteriormente citadas pueden adquirirse comercialmente. Los anticuerpos o aptameros, los cuales reconocen espedficamente a la glucosa, pueden obtenerse facilmente por el experto mediante metodos ya conocidos en el estado actual de la tecnica para la obtencion de anticuerpos o aptameros.
Las "protemas que se unen a la glucosa" citadas anteriormente y en particular la concanavalina A pueden presentar de preferencia tambien, modificaciones qmmicas, las cuales proporcionan una mayor solubilidad en comparacion con las versiones sin modificar de la "protema que se une a glucosa". Dichas modificaciones comprenden de preferencia, la funcionalizacion con un polfmero soluble en agua, y pueden escogerse en una version particularmente preferida, a partir del grupo compuesto por: peguilacion, acetilacion, polioxazolinilacion y succinilacion.
La comprobacion de la glucosa en una muestra para analisis tiene lugar en el dispositivo segun la invencion, mediante un desplazamiento del ligando unido a la "protema que se une a la glucosa" mediante la glucosa contenida en la muestra (competicion entre el ligando y la glucosa). De preferencia, el ligando tiene una menor afinidad para la "protema que se une a la glucosa" que la glucosa. El desplazamiento puede de preferencia ser comprobado mediante el marcado del ligando con un colorante u otra molecula marcada, de comprobacion. Como particularmente adecuados para la comprobacion del desplazamiento se han acreditado ciertos colorantes u otras moleculas de marcado, las cuales cuando se aproximan a las moleculas unidas a ellas, provocan un cambio de por lo menos una propiedad ffsica o qmmicamente medible. Sistemas adecuados comprenden aquellos en los cuales mediante una transferencia de energfa entre las moleculas de colorante, o bien reprimen o bien generan una senal medible. Dichos sistemas basada en una transferencia de energfa estan descritos con mas detalle por ejemplo en la patente WO 2001/13783. De preferencia se trata a este respecto de un sistema en el cual mediante el "efecto quenching" (efecto de "extincion") se reprime una senal de fluorescencia, cuando la molecula de colorante o la molecula de marcado - y con ello "la protema que se une a la glucosa" y su ligando - estan muy cerca. Despues del desplazamiento del ligando por el analito, se cancela el "efecto quenching". Este efecto es comprobable mediante un cambio de la fluorescencia. Para la comprobacion pueden por ejemplo emplearse los fotometros de fluorescencia como se describen en la patente WO 2002/087429. Otros sistemas adecuados son los llamados sistemas de comprobacion basados en la transferencia de energfa de resonancia de la fluorescencia (FRET). A este respecto se marcan con colorantes de fluorescencia dos componentes interreaccionantes, como la "protema que se une a la glucosa" y su ligando. Un componente es acoplado con un colorante aceptor, y el otro con un colorante dador. Mediante la interaccion de los componentes, los colorantes entran en contacto, por lo cual el efecto FRET tiene lugar, y con ello es transferida la energfa de excitacion del colorante dador al colorante aceptor y con ello se mide una intensidad del colorante dador mas baja. Tan pronto la interaccion de los componentes se interrumpe, aumenta la intensidad de la fluorescencia del dador. En el caso del dispositivo segun la invencion, puede comprobarse en la glucosa un aumento de la intensidad de una senal, la cual se genera mediante el analito desde un colorante o una molecula marcadora despues de la separacion del complejo "protema que se une a la glucosa" con el ligando.. El colorante o la molecula marcadora se acopla, o bien a "la protema que se une a la glucosa", o bien al ligando. Por ejemplo un colorante dador puede ser acoplado a la "protema que se une a la glucosa" o al ligando, en donde el componente no acoplado al colorante dador se acopla con un colorante aceptor apropiado. En un dispositivo segun la invencion configurado de esta manera se observa, antes de la aplicacion a una muestra conteniendo glucosa, el efecto FRET como resultado de la union del ligando a la "protema que se une a la glucosa". Despues de la
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aplicacion, la glucosa desplaza a los ligandos, de manera que la intensidad medida de la fluorescencia del colorante dador aumenta, por cierto, proporcionalmente a la cantidad de glucosa.
Birch et al. (Birch 2001, Spectrochimica Acta Part A 57: 2245-2254) han calculado la solucion matematica del equilibrio qmmico para el caso de que la concanavalina A se emplee como "protema que se une a la glucosa", y el dextrano se emplee como ligando. Las simulaciones con concentraciones variables de concanavalina A y dextrano han demostrado que la relacion (dextrano /complejo conA-dextrano) depende solo ligeramente de las concentraciones de partida y las constantes de union Kdex y Kgluc son los principales factores para el rendimiento de los sensores.
Sorprendentemente, la estructura de los colorantes influye tambien sobre la actividad de glucosa. Asf, segun la invencion, una combinacion de un colorante de rodamina y un colorante de oxacina es claramente superior a la combinacion empleada convencionalmente de un colorante de xanteno y un colorante de rodamina (FITC-TMR).
Se prefiere que la "protema que se une a la glucosa", que se emplea en el marco de la invencion este unida a un colorante de oxacina. La manera en que se puede conseguir dicha union ya es bien conocida por el experto y esta descrita adecuadamente en el estado actual de la tecnica. Es particularmente preferido el colorante de oxacina, un aceptor de oxacina, escogido del grupo formado por el ATTO 655, el ATTO 680, el azul EVO 10, el azul EVO 30, el azul EVO 90, y el azul EVO 100. Muy particularmente preferido se emplea el ATTO 680. Los llamados colorantes de oxacina puede adquirirse comercialmente.
El grado de marcado preferido (DOL, "degree of labeling") para la "protema que se une a la glucosa", por ejemplo, la concanavalina A, es de 0,1 a 4, con mayor preferencia de 1 a 4 y con particular preferencia, de 1 a 3. En el caso de la concanavalina A le corresponde un DOL de 1, a saber, un mol de colorante por mol de concanavalina A tetramero (MW = 104.000). En el caso de un DOL alto, y empleando colorantes relativamente no polares (tfpicamente colorantes de fluorescencia de onda larga), la "protema que se une a la glucosa" esta funcionalizada de preferencia con PEG. Un grado de peguilacion preferido es de 0,1 a 5 y un peso molecular preferido, es de 200 a 10.000, con particular preferencia de 800 a 8000, con mas preferencia de 800 a 5000.
Mediante experimentos que toman como base el marco de la presente invencion, se comprobo que las modificaciones qrnmicas de "la protema que se une a la glucosa" las cuales comunican una elevada solubilidad en comparacion a las variantes sin modificar, pueden ser empleadas de manera ventajosa para conseguir un mejor grado de marcado en "las protemas que se unen a la glucosa". En el caso de "las protemas que se unen a la glucosa" modificadas segun la presente invencion, pueden lograrse mas altos grados de marcado con un colorante que para las variantes sin modificar de las mismas. Para la protema modificada concanavalina A pueden lograrse de preferencia, concentraciones mayores de 0,5 mg/(gramos de matriz), y con muy particular preferencia, entre 2 y 60 mg/(gramos de matriz). Sorprendentemente, la actividad de glucosa medida de la protema concanavalina A modificada, es comparable con la de la concanavalina A nativa en el hidrogel.
La mayor solubilidad es en particular importante cuando "las protemas que se unen a la glucosa" deben ser marcadas con colorante, puesto que las protemas que se unen a la glucosa marcada con colorante, por ejemplo una concanavalina A modificada con un colorante de oxacina anteriormente citado, posee todavfa una solubilidad reducida en solucion acuosa. Cuanto mas alto es el grado de marcado, tanto mas baja es la solubilidad en solucion acuosa. Es necesario un alto grado de marcado justamente para "las protemas que se unen a la glucosa" como componentes de los sensores en el dispositivo segun la invencion.
El concepto "ligando" de la "protema que se une a la glucosa" se refiere a una molecula que es capaz de formar un enlace espedfico con la "protema que se une a la glucosa". Para ello, dicha molecula interacciona esencialmente en el mismo lugar de union que la glucosa, de manera que la molecula unida puede ser desplazada por la glucosa del lugar de union a la "protema que se une a la glucosa". Moleculas apropiadas estan estructuralmente emparentadas con la glucosa. De preferencia el ligando de la "protema que se une a la glucosa" es un oligosacarido, una macromolecula glicosilada, por ejemplo, una protema o un peptido glicosilado, o una nanopartmula glicosilada. Las moleculas antes citadas que pueden emplearse como ligando de la "protema que se une a la glucosa", son ya conocidas en el estado actual de la tecnica y pueden obtenerse facilmente por el experto. Con particular preferencia se emplea como ligando de la "protema que se une a la glucosa", un dextrano.
De preferencia, el ligando de la "protema que se une a la glucosa" esta acoplado en el dispositivo de la presente invencion con un colorante de rodamina. Con particular preferencia pueden emplearse el ATTO 590, el ATTO 610, el ROX, el TMR, la rodamina G6, los colorantes Alexa de fluor rodamina o el Dy 590, y con muy particular preferencia el ATTO 590.
El grado de marcado preferido (DOL) para los ligandos de la "protema que se une a la glucosa", por ejemplo el dextrano, es de 0,00003 a 0,016 (moles de colorante) / (moles de subunidad), con particular preferencia de 0,00032 a 0,0065 (moles de colorante) / (moles de subunidad), y con muy particular preferencia de 0,0008 a 0,0035 (moles de colorante) / (moles de subunidad). El grado de marcado del ligando tiene igualmente una influencia sobre la
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actividad de glucosa. Un pequeno grado de marcado conduce a una peor actividad de glucosa, as^ como tambien, si es demasiado alto.
De lo anteriormente dicho se deduce que en una version preferida del dispositivo segun la invencion la "protema que se une a la glucosa", es la concanavalina A. Con particular preferencia, la concentracion de concanavalina A es superior a 0,5 mg/(gramos de matriz) y con muy particular preferencia entre 2 y 60 mg/(gramos de matriz). Tambien presenta la concanavalina A modificaciones qmmicas, de preferencia mediante la peguilacion, la acetilacion, la polmxazolinilizacion o la succinilizacion, las cuales presentan una mayor solubilidad acuosa en comparacion con la concanavalina A sin modificar. En una version preferida, la "protema que se une a la glucosa" esta unida a un colorante de oxacina y el ligando de la "protema que se une a la glucosa", a un colorante de rodamina. Con particular preferencia se emplea un sistema concanavalina A / dextrano en el dispositivo, en el cual el dextrano esta unido a un colorante dador, de rodamina, y la concanavalina A esta unida a un colorante aceptor, de oxacina. En el sistema preferido concanavalina A / dextrano, los componentes estan de preferencia en una relacion de masas (dextrano / con A) de 1:1 a 1:40, en donde la relacion de masas se prefiere que este proxima a 1:10.
Se ha comprobado en el marco de la presente invencion, que la combinacion de colorantes de oxacina con colorantes de rodamina produce una accion redproca heterodfmera entre los radicales del colorante, lo cual aumenta la actividad de glucosa. En consecuencia, se puede conseguir mediante el empleo de los colorantes aceptor oxacina y el dador rodamina, ya en solucion acuosa, de preferencia una actividad de glucosa de 2,1 veces. En el hidrogel empleado en el marco de la presente invencion se puede incluso conseguir un aumento de la actividad de glucosa de 2,6 veces.
En el marco de la presente invencion se ha comprobado ventajosamente que el empleo de un hidrogel que consta de una primera matriz de hidrogel de alginato y una segunda matriz de hidrogel la cual se forma dentro de la primera como una red interpenetrante, esta en situacion de crear un ambiente para los componentes sensores, a saber la "protema que se une a la glucosa" y los ligandos competitivos de la "protema que se une a la glucosa", lo cual permite una eficiente determinacion de la actividad de glucosa. Muchas preparaciones para la medicion de la glucosa mediante la fluorescencia tienen exito en solucion, mientras que pierden su actividad cuando los componentes del sensor estan incrustados en la matriz del hidrogel, puesto que la movilidad de los componentes del sensor estan limitados (Rounds 2007, J. Fluorec. 17: 57-63: uS 2007/0105176 A1). Sorprendentemente, en particular tambien con respecto a los calculos de Birch et al. (Birch 2001, loc cit ), se pudo comprobar en el caso presente unas soluciones acuosas comparativas de hasta 2,6 veces la actividad aumentada. Mediante la eleccion de matrices de hidrogel apropiadas se pudo lograr un enriquecimiento de la "protema que se une a la glucosa" muy por encima de sus lfmites de solubilidad en solucion acuosa. La mejora de la solubilidad encontrada en el marco de la presente invencion en las matrices de hidrogel empleadas segun la invencion, es atribuible a las particulares propiedades de la matriz de hidrogel en interaccion con los componentes del sensor y en particular con las "protemas que se unen a la glucosa", como la concanavalina A. En el caso de la concanavalina A pudo conseguirse, por ejemplo, una concentracion unas 10 veces mayor en comparacion con la concentracion que se puede conseguir en una solucion libre. Habitualmente, la solubilidad del componente receptor en una solucion libre, recibe todavfa una influencia negativa con la adicion del ligando, puesto que el complejo receptor / competidor debido a su tamano y a menudo tambien debido a las multivalencias presenta una escasa solubilidad. Cuando por ejemplo, un complejo concanavalina A/dextrano en solucion, con una relacion de masas de 1:10 empieza a dar mal resultado ya a partir de una concentracion de concanavalina A de 0,5 mg/(gramos de solucion), pueden ajustarse concentraciones de concanavalina A, por encima de los 50 mg/(gramos de matriz)en un hidrogel adecuado con la misma relacion de masas. A consecuencia de ello, el intervalo de concentraciones que pueden emplearse se amplfa unas 100 veces. Esto tiene una particular importancia para las aplicaciones, en las cuales la concentracion de analito permanece fija y no puede adecuarse mediante diluciones o por concentracion. Estas dificultades aparecen justamente en las aplicaciones in vivo, como la determinacion del nivel de glucosa en los lfquidos corporales. La concentracion del analito glucosa, en el caso in vivo, no debe adecuarse a las condiciones espedficas del ensayo sino que debe darse por sentado.
Otro problema de la disolucion aparece particularmente en las aplicaciones in vivo de sensores biologicos. Debido a la gran longitud de onda disminuye la propia fluorescencia del tejido, de manera que en las aplicaciones in vivo se emplean colorantes de fluorescencia de gran longitud de onda. Estos colorantes de fluorescencia son sin embargo tfpicamente apolares debido a su estructura molecular y tamano (sistemas conjugados),. Cuando la "protema que se une a la glucosa" se marca con un colorante de este tipo disminuye adicionalmente la solubilidad, de manera que tampoco son posibles altos grados de marcado. Como ya se ha descrito anteriormente puede ser necesario que la "protema que se une a la glucosa" se funcionalice, por ejemplo, con polietilenglicol para conseguir una mayor solubilidad y unido a ello un mayor grado de marcado. La funcionalizacion con polietilenglicol (peguilacion) conduce en solucion generalmente, a una actividad de glucosa fuertemente reducida, por ejemplo en la concanavalina A nativa (actividad relativa de glucosa de 0,4 o inferior). Sorprendentemente se comprobo en el marco de la presente invencion que en el hidrogel del dispositivo segun la invencion no aparece este empeoramiento. Mas bien pueden lograrse las actividades de glucosa para la concanavalina A funcionalizada con polietilenglicol, las cuales son comparables con las de la concanavalina A nativa (actividad relativa de glucosa = 2,2 o respectivamente 2,6). Ademas se descubrio que la actividad de glucosa mediante el aumento del grado de marcado en la concanavalina A
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puede aumentarse adicionalmente en un hidrogel como se emplea en el dispositivo de la presente invencion. De esta manera se logro sorprendentemente en el hidrogel enriquecido mediante el aumento del grado de marcado en la concanavalina A funcionalizada con polietilenglicol, incluso doblar la actividad de glucosa. En comparacion con la medicion en solucion la actividad de glucosa aumenta en el hidrogel del dispositivo segun la invencion hasta 4,3 veces. El empleo del hidrogel en el dispositivo segun prevencion permite ajustar pues la relacion de concentraciones entre la "protema que se une a la glucosa" asf como a sus ligandos, las cuales permiten actividades de glucosa en los correspondientes grados de marcado, las cuales son mayores alrededor de unas 4 veces frente a las concentraciones ajustadas en las soluciones acuosas. Esto permite de manera ventajosa tambien el empleo del dispositivo segun la invencion en condiciones, en las cuales la concentracion del analito no puede ser ajustada a las condiciones del ensayo.
Para la determinacion de la concentracion de la glucosa en condiciones in vivo, por ejemplo en los diabeticos, debe prepararse una concentracion de analito de 50 a 500 mg/dl. Dicha solucion puede lograrse facilmente con los dispositivos segun la invencion. Los dispositivos pueden a este respecto emplearse como sensores ex vivo. En el caso de las aplicaciones descritas in vivo puede colocarse el dispositivo sensorial por ejemplo subcutaneamente, en el ojo, por ejemplo debajo de la conjuntiva, o en otros lugares del cuerpo que permitan una evaluacion de las actividades de glucosa medidas.
La invencion se refiere en consecuencia tambien a un hidrogel en el que estan incorporados una "protema que se une a la glucosa", y un ligando de la "protema que se une a la glucosa", en donde el hidrogel comprende una primera matriz de hidrogel a base de alginato y una segunda matriz de hidrogel la cual forma en el interior de la primera matriz de hidrogel una red interpenetrante, para emplear en la determinacion del contenido de glucosa en una muestra.
Bajo el concepto "muestra" se comprende en el marco de la presente invencion una composicion, de preferencia una composicion acuosa, de la que se sospecha, o se sabe, que contiene glucosa. De preferencia se trata en el caso de la muestra de una muestra biologica. Con particular preferencia se trata de la muestra de un lfquido corporal, en particular de un lfquido de un tejido (por ejemplo, lfquido intersticial), sangre, plasma, suero, linfa, saliva, lfquido lacrimal, sudor u orina. Con particular preferencia se trata en el caso de la muestra, de un lfquido de un tejido, sangre, suero o plasma.
Cuando la muestra es un material biologico, por ejemplo un lfquido corporal, puede obtenerse de preferencia, a partir de un voluntario que presenta un metabolismo trastornado de la glucosa, el cual esta confirmado o bien se sospecha del mismo. El dispositivo segun la invencion puede emplearse en consecuencia para el diagnostico ex vivo de enfermedades o trastornos del metabolismo de la glucosa, en particular para el diagnostico de la diabetes mellitus o el smdrome metabolico. Ademas, el dispositivo segun la invencion se utiliza no solamente para el diagnostico sino que tambien puede emplearse para la monitorizacion del nivel de glucosa. El dispositivo permite con ello tambien el apoyo de decisiones terapeuticas, por ejemplo, un tratamiento con insulina, las cuales deben prescribirse como respuesta a un cambio en el nivel de glucosa.
El dispositivo segun la invencion puede incorporarse para el empleo ex vivo, por ejemplo a placas de microtitulacion, en las cuales se fija.. Se aplican las muestras que han de medirse, y a continuacion pueden ser medidas en un dispositivo lector. Una disposicion de este tipo permite la simultanea medicion de un gran numero de muestras y en consecuencia es economico en particular en los diagnosticos clmicos.
En el marco del empleo in vitro, la descripcion se refiere tambien a un procedimiento para la determinacion de la cantidad de glucosa en una muestra, la cual contiene efectivamente glucosa o se sospecha que la contiene, el cual procedimiento comprende los pasos siguientes:
(a) puesta en contacto del dispositivo segun la invencion con la muestra durante un tiempo y en condiciones que permiten la union de la glucosa contenida en la muestra a la "protema que se une a la glucosa" del dispositivo, y
(b) determinacion de la cantidad de ligandos desplazados por la glucosa en el dispositivo, con lo cual se determina la cantidad de glucosa.
El procedimiento descrito anteriormente puede comprender todavfa otros pasos. Por ejemplo, pueden efectuarse otros pasos para la preparacion de la muestra, como por ejemplo la obtencion del suero a partir de la sangre entera. Pueden efectuarse otros pasos para relacionar las cantidades determinadas con respecto a los cambios patologicos del metabolismo de la glucosa. Para ello, la cantidad determinada puede compararse con unas cantidades de referencia, las cuales son indicativas de determinados estados patologicos, como por ejemplo, la diabetes mellitus o el smdrome metabolico. Dichos procedimientos pueden emplearse a continuacion tambien para diagnosticos in vitro de la diabetes mellitus o del smdrome metabolico. El procedimiento, o respectivamente los pasos aislados del mismo, pueden efectuarse automatizados, como por ejemplo, mediante la implementacion por computador y / o por sistemas roboticos.
Muestras apropiadas que pueden ser analizadas mediante el procedimiento descrito anteriormente, se describen con mas detalle en otro lugar de la descripcion.
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El concepto "cantidad" se refiere tanto a la determinacion de cantidades absolutas como tambien de cantidades relativas. La determinacion de las cantidades absolutas puede efectuarse de preferencia mediante una curva de calibracion, que se obtiene con el procedimiento a partir de los valores de medicion para cantidades conocidas de glucosa. Cantidades relativas en el sentido de la invencion son cantidades, las cuales se establecen en relacion a sus parametros de normalizacion. Se comprende que en el marco del procedimiento tambien pueden determinarse parametros los cuales mediante operaciones matematicas pueden derivarse de los valores de las cantidades determinadas.
La puesta-en-contacto debe hacer posible en el marco del procedimiento, la penetracion en el dispositivo de la
muestra y con ello la glucosa contenida en la misma. Ademas, la-puesta-en-contacto debe hacer posible la
competicion de la glucosa con el ligando en la "protema que se une a la glucosa", la cual esta incrustada en el dispositivo.
La comprobacion del desplazamiento del ligando tiene lugar en el procedimiento ventajosamente, mediante la medicion del aumento de la intensidad de la fluorescencia emitida por un colorante dador, como ya se ha descrito en otra parte. El aumento resulta del desplazamiento del ligando de la "protema que se une a la glucosa", puesto que la intensidad de la fluorescencia del colorante dador en el complejo con la "protema que se une a la glucosa" esta reducida. Se comprende sin embargo, que pueden ser empleadas tambien otras tecnicas de comprobacion para la liberacion del ligando.
Junto a las aplicaciones "ex vivo" anteriormente descritas y procedimientos "ex vivo" del dispositivo de la invencion, la invencion se refiere tambien al dispositivo segun la invencion anteriormente descrito para su empleo en el
diagnostico de un metabolismo de glucosa trastornado, en un voluntario. De preferencia, el trastorno del
metabolismo de la glucosa esta causado por una diabetes mellitus o por el smdrome metabolico.
En el caso del empleo in vivo descrito del dispositivo, este se introduce en el cuerpo. A este respecto, debe tenerse en cuenta que la medicion del nivel de glucosa es tambien la base para el diagnostico, dando por supuesto que el dispositivo entra en contacto con un lfquido corporal, el cual contiene la glucosa, en donde la concentracion de glucosa en el lfquido es representativa del nivel de glucosa que hay que determinar. Los lfquidos corporales adecuados se enumeran en otro lugar de la descripcion. Particularmente preferido es el lfquido corporal, lfquido tisular. El dispositivo introducido en el cuerpo genera a continuacion una senal que puede ser evaluada para el establecimiento del diagnostico.
El dispositivo se introduce de preferencia en lugares del cuerpo, los cuales permiten la medicion optica de la senal generada por el dispositivo. Son apropiados aquellos lugares con escaso grueso del tejido entre el dispositivo y la superficie corporal o con tejidos transparentes, los cuales pueden ser bien atravesados por la senal generada. Particularmente preferido, es el dispositivo colocado debajo de la piel (subcutaneo) o en el ojo, por ejemplo, debajo de la conjuntiva. Los correspondientes procedimientos para el implante del dispositivo son ya conocidos en el estado actual de la tecnica.
Alternativamente, la senal producida por el dispositivo puede ser enviada fuera del cuerpo mediante un medio de transmision adecuado. Para ello, se emplea un material conductor de la senal como un cable flexible, por ejemplo, un cable de fibra de vidrio. La transmision de la senal puede sin embargo tambien tener lugar sin contacto, por ejemplo con rayos infrarrojos o senales de radio. Se comprende que en este caso la senal generada por el dispositivo en primer lugar debe ser lefda por un detector, el cual debe estar instalado tambien en el dispositivo o por lo menos en su proximidad, y convertida en una senal electromagnetica, por ejemplo una senal de radio. Esta senal electromagnetica puede ser recibida por un receptor situado fuera del cuerpo, y evaluada a continuacion.
Ademas, la presente invencion se refiere a un dispositivo segun la invencion, como se ha descrito mas arriba, para emplear en la determinacion de la necesidad de tomar medidas terapeuticas en un voluntario con el metabolismo de la glucosa trastornado.
En correspondencia, las medidas terapeuticas comprenden aquellas medidas que se emplean para el tratamiento de la diabetes mellitus o del smdrome metabolico. A este respecto junto a la prescripcion de medicamentos, por ejemplo, la insulina, puede tambien decidirse la ejecucion de otras medidas terapeuticas, sobre la causa del metabolismo trastornado de la glucosa que se ha determinado, como por ejemplo intervenciones terapeuticas, por ejemplo operaciones de bypass gastrico u otros habitos de vida, por ejemplo, la puesta en practica de dietas especiales.
En el marco de la aplicacion anteriormente descrita del dispositivo, puede este tambien estar acoplado a otro dispositivo mas, por ejemplo un dispositivo que controle la administracion de un medicamento. De manera preferida, el dispositivo puede en la presente invencion, a este respecto, estar acoplado a un dispositivo para la administracion de insulina. La administracion de insulina puede controlarse por la necesidad de la misma, determinada por el dispositivo segun la invencion. Un cambio determinado en el dispositivo segun la invencion del nivel de glucosa en una muestra, se traduce a este respecto, por ejemplo, en una unidad de proceso de datos en el propio dispositivo de
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administracion, en una instruccion, la cual determina la necesidad de administracion de insulina. Esta instruccion indica la administracion de insulina en sangre el tiempo que sea necesario y la cantidad necesaria.
Los empleos del dispositivo segun la invencion mas arriba descrito, permiten con ello un eficiente diagnostico ex vivo e in vivo, del nivel de azucar en sangre y con ello el temprano reconocimiento de enfermedades que se adquieren con un metabolismo trastornado, o respectivamente por el empleo en el marco de una monitorizacion clmica tambien la gestion de dichas enfermedades. Los dispositivos son en este contexto tambien apropiados para tomar decisiones terapeuticas basadas sobre los resultados diagnosticos determinados. La invencion se ilustra mediante los siguientes ejemplos de versiones.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Obtencion de sensores para la determinacion de la glucosa Obtencion de partculas de hidrogel (matriz enriquecida)
1 gramo de sal sodica del acido algmico se disuelve en 100 gramos de agua con agitacion. En un vaso de 5 litros se disuelven 66,2 gramos de CaCl2 x 2 H2O en 4931,3 gramos de agua.
La solucion de alginato se transporta mediante una bomba a una tobera de dos pasos. Al mismo tiempo se inyecta en la segunda entrada de la tobera, aire comprimido, de forma que la solucion de alginato se pulveriza en finas gotitas. Las gotitas se conducen mediante una corriente de aire a un bano con una solucion de cloruro de calcio, en donde se gelifican y se depositan en el fondo. Las bolas gelificadas son finalmente recogidas.
Obtencion de sensores en la matriz enriquecida:
Las bolas de alginato se incuban consecutivamente en una solucion de concanavalina A marcada con colorante y una solucion de dextrano marcada con colorante. A continuacion, las bolas cargadas se centrifugan y la solucion que sobrenada se separa por decantacion. Las bolas cargadas se incuban eventualmente a continuacion durante la noche en una solucion de un segundo polfmero (por ejemplo, a base de PVA, PEG), y eventualmente se separan mediante centrifugacion. A continuacion se mezclan las bolas en una solucion acuosa de un polfmero reticulado fotoqmmicamente. Esta mezcla se reticula a continuacion con luz UV, para evitar el lixiviado de los componentes del sensor de las bolas de alginato.
Las cantidades se ajustan segun la concentracion del analito a medir y el grado de marcado se elige en funcion de la intensidad deseada de la senal de fluorescencia. Como polfmero reticulado fotoqmmicamente, pueden emplearse por ejemplo el polfmero Nelfilcon, un polivinilalcohol modificado con grupos acrilamida. Para el reticulado fotoqmmico se anade todavfa un 0,1% de Irgacure 2959. La solucion acabada se dosifica en formas adecuadas y se endurece con luz UV.
Obtencion de sensores y de la matriz no enriquecida:
La solucion de concanavalina A marcada con un colorante y la solucion de dextrano marcada con un colorante, se anaden sucesivamente a una mezcla de prepolfmeros a base de agua y se agita durante 3 horas. Las cantidades se ajustan segun la concentracion del analito a medir y el grado de marcado se elige en funcion de la deseada intensidad de la senal de fluorescencia. Como prepolfmero reticulado fotoqmmicamente puede emplearse por ejemplo el polfmero Nelfilcon, un polivinilalcohol modificado con grupos acrilamida. Para el reticulado fotoqmmico se anaden todavfa 0,1% de Irgacure 2959. La solucion acabada se dosifica en formas adecuadas y se endurece con luz UV.
Ejemplo 2: Determinacion de la actividad de glucosa para los sensores Determinacion de la actividad de glucosa en los sensores:
El espectro de fluorescencia de los sensores se determina con diferentes concentraciones de glucosa. El cambio de las intensidades de la fluorescencia del dador al aumentar el contenido de glucosa sirve como medida para la eficacia del sensor de glucosa. Puesto que en un sensor de glucosa in vivo deben medirse concentraciones de glucosa entre 50 y 500 mg/dl, la actividad de glucosa se calcula de la siguiente manera:
GA = (intensidad500 mg/dl - intensidadsg mg/dl) / intensidadsg mg/dl
Como valores de respuesta y para una mejor comparacion, se normaliza con respecto a la respuesta del mismo sistema en solucion. Para la determinacion de la actividad relativa de la glucosa se divide la actividad de glucosa de los sensores (en la matriz) por la actividad de glucosa en solucion.
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GArei = GA (matriz) / GA (en solucion)
Determinacion de la actividad de glucosa en solucion:
La solucion de conA y la solucion de dextrano se diluyeron en solucion tampon y se agito durante varias horas. El espectro de fluorescencia de la solucion se determino a diferentes concentraciones de glucosa. El cambio de las intensidades de la fluorescencia del dador al aumentar el contenido de glucosa sirve como medida para la eficacia del sistema. Puesto que debe medirse una concentracion de glucosa in vivo del sensor de glucosa, entre 50 y 500 mg/decilitros, se calcula la actividad glucosa de la siguiente manera:
GA = (intensidad500mg/dl - intensidad50mg/dl) / intensidad50mg/dl)
Ejemplo 3: Determinacion de la influencia de la matriz
Segun la invencion, "la protema que se une a la glucosa" y el ligando, se incorporan a una matriz de hidrogel, la cual presenta una cierta interaccion con la "protema que se une a la glucosa". A este respecto, la matriz de hidrogel se elige de tal forma que la interaccion entre "la protema que se une a la glucosa" y la matriz de hidrogel, sea mayor que entre "la protema que se une a la glucosa" y la solucion acuosa (enriquecimiento de los componentes del sensor). Por otro lado, la interaccion entre "la protema que se une a la glucosa" y el analito (glucosa) no se puede danar sin embargo por la interaccion entre "la protema que se une a la glucosa" y la matriz de hidrogel.
Al efectuar una adecuada eleccion de la matriz de hidrogel, se produce por la interaccion entre "la protema que se une a la glucosa" y la matriz de hidrogel, un enriquecimiento de "la protema que se une a la glucosa" en la matriz muy por encima del lfmite de solubilidad de "la protema que se une a la glucosa" en solucion acuosa. En el caso de la conA pueden por ejemplo lograrse concentraciones de hasta 10 veces la de la solucion libre. Todavfa se hacen mas patentes los problemas de solubilidad despues de la adicion del ligando (por ejemplo dextrano) puesto que el complejo "protema que se une a la glucosa" y ligando, debido a su tamano y a menudo tambien debido a las multivalencias, presenta una escasa solubilidad. Cuando el complejo conA - dextrano en solucion con una relacion de masas de 1 : 10 ya a partir de una concentracion de conA de 0,5 mg/g empieza a fallar, pueden ajustarse en una matriz de hidrogel adecuada con la misma relacion de masas, concentraciones de conA - por encima de los 50 mg/g. Mediante la matriz de hidrogel, el intervalo de concentraciones utilizable de "la protema que se une a la glucosa", por ejemplo la conA, puede ser aumentado unas 100 veces.
Puesto que en la utilizacion in vivo, el intervalo de concentracion del analito permanece fijo y no puede adecuarse por ejemplo mediante una dilucion o una concentracion, las concentraciones de "protema que se une a la glucosa" y el ligando deben adecuarse al intervalo de concentraciones in vivo del analito. A menudo se presenta sin embargo la dificultad de que por lo tanto, las concentraciones de "protema que se une a la glucosa" y / o las concentraciones de ligando, sena necesario que sobrepasaran el lfmite de solubilidad.
En el sistema conA - dextrano en solucion, puede, por ejemplo, ajustarse solamente una concentracion de conA de 0,5 mg/g con una relacion de masas (dex : conA) de 1: 10, puesto que de otra manera, el complejo conA - dextrano empieza a precipitar. La actividad de glucosa alcanzada con esta concentracion (GA) se establece aqrn para la determinacion de la actividad relativa de glucosa (GA relativa) igual a 1. Como era esperado, la actividad de glucosa de la matriz no enriquecida, debido a la escasa movilidad de los componentes del sensor, disminuye hasta la mitad (GA relativa = 0,52). En la matriz enriquecida se obtiene a la misma concentracion casi la misma respuesta como en solucion (GA relativa = 0,83). En la matriz enriquecida pueden ajustarse sin embargo tambien, concentraciones de conA esencialmente mayores. A una concentracion de conA de 10 mg/g se obtiene en la matriz de hidrogel enriquecida una actividad de glucosa alrededor de 2,6 veces superior (ver tabla 1).
Tabla 1: Influencia de la matriz
En solucion En la matriz no enriquecida En la matriz enriquecida En la matriz enriquecida
Concentracion de conA
0,5 mg/g 0,5 mg/g 0,5 mg/g 10 mg/g
GA relativa
1 0,52 0,83 2,55
ConA nativo con DOL = 1, dextrano con 0,001 moles de colorante (FS) por mol de subunidad de dex (UE), relacion de masas dex : conA = 1:10
Ejemplo 4: Determinacion de la influencia de la concentracion del receptor
En la matriz enriquecida se ve claramente una dependencia de la actividad de glucosa de la concentracion de partida de la "protema que se une a la glucosa" y del ligando. Al aumentar la concentracion se obtiene un aumento de la actividad de glucosa. En concentraciones muy altas del receptor disminuye de nuevo la actividad de glucosa. La concentracion de conA optima para un ensayo in vivo esta entre 8 y 20 mg de conA / gramos de matriz (ver tabla 2).
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Tabla 2: Influencia de la concentracion del receptor
Conc de conA (mg/g)
0,5 10,0 13,3 30 52,2
Actividad relativa de glucosa (GA rel)
0,83 2,55 2,76 2,14 1,76
ConA nativo con DOL = 1, dextrano con 0,001 moles de colorante (FS) por mol de subunidad de dex
(UE),relacion de masas, dex : conA = 1:10)
Ejemplo 5: Determinacion de la influencia del grado de marcado del receptor
Debido a la propia decreciente fluorescencia de alta longitud de onda del tejido, deben emplearse en las aplicaciones in vivo, colorantes de fluorescencia de onda larga. Estos colorantes de fluorescencia son tipicamente muy no polares debido a los sistemas conjugados mas grandes. Cuando la "protema que se une a la glucosa" se marca con estos colorantes, entonces disminuye su solubilidad, de manera que como precipitan a menudo, no es posible ningun alto grado de marcado. Para aumentar la solubilidad de "la protema que se une a la glucosa", es ventajoso que esta sea funcionarizada, por ejemplo, con polietilenglicol. Con ello aumenta la solubilidad de "la protema que se une a la glucosa", con lo cual es posible conseguir mayores grados de marcado en la smtesis.
Sin embargo, la ConA peguilada conduce en solucion, solamente a menos de la mitad de la actividad de glucosa de la conA nativa (GA relativa = 0,4). Sorprendentemente, no aparece en la matriz de hidrogel este empeoramiento. Se obtiene con la PEG-conA una actividad de glucosa similar a la de la conA nativa (GA relativa = 2,2 frente a 2,6) (ver tabla 3).
Tabla 3: Influencia del grado de marcado (DOL)
DOL de conA
1 1
Tipo
Nativa peguilada
Solucion, c = 0,5 mg de conA/g
GA relativa 1 0,43
Matriz, c = 10 mg de conA/g
Ga relativa 2,55 2,22
Mediante la peguilacion es posible disponer de una conA con un alto grado de marcado de un colorante de fluorescencia de onda larga, el cual en solucion es estable por largo tiempo y no precipita. Sorprendentemente, no se ha observado en la matriz enriquecida en comparacion con la solucion, ningun empeoramiento de la actividad de glucosa debido a la peguilacion. Solamente por el efecto positivo de la matriz es posible emplear en un ensayo PEG- conA con un alto grado de marcado en altas concentraciones.
Asombrosamente, la actividad de glucosa puede aumentarse adicionalmente mediante un aumento del grado de marcado en la conA. En la matriz de hidrogel enriquecida se logra con la conA con DOL = 2,5, casi el doble de la actividad de glucosa (GA relativa = 4,3 frente a 2,6). En una comparacion directa con la medicion en solucion, la actividad de glucosa en la matriz mediante el efecto combinado de concentracion y DOL aumenta incluso unas 4,3 veces (ver tabla 4)
Tabla 4: Influencia del grado de marcado^ (DOL)
DOL de conA
1 1 2,5* 2,5
tIpo
nativa peguilada nativa* peguilada
Solucion, c = 0,5 mg de conA/g
GA relativa 1 0,43 1,03
Matriz, c = 10 mg de conA/g
GA relativa 2,55 2,22 4,28
* La ATTO680 - conA nativa con un DOL de >1,5 no es estable en solucion y precipita
Ejemplo 6: Determinacion de la influencia de los colorantes de fluorescencia
La estructura de los colorantes de fluorescencia que estan unidos a "la protema que se une a la glucosa" o respectivamente al ligando, tiene igualmente una influencia sobre la actividad de glucosa. Como particularmente adecuada se ha acreditado una combinacion de un colorante de rodamina y un colorante de oxacina. Para el sistema conA-dextrano es particularmente preferido un dador de rodamina (por ejemplo ATTO 590-dextrano o ATTO 610-dextrano, ROX-dextrano) , y un aceptor de oxacina (por ejemplo ATTO 655-conA o ATTO 680-conA, azul Evo30-conA). Al contrario del convencionalmente empleado, el sistema TMR-conA / FITC-dextrano (combinacion xanteno - rodamina), se obtiene con ello en solucion una actividad de glucosa 2,1 veces, y en la matriz enriquecida incluso una actividad de glucosa 2,6 veces. En una pareja de colorantes rodamina-oxacina puede aparecer una interaccion de heterodfmeros entre los colorantes, lo cual refuerza la actividad de glucosa (ver tabla 5 y 6).
Tabla 5: Influencia de los colorantes
Colorante conA
ATTO 680 TMR
Colorante dextrano
ATTO 590 FITC
DOL conA
2,5* 2,3
Tipo
nativo* nativo
Solucion, c = 0,5 mg de conA / GA relativa g
2,4 1,17
Actividad relativa en comparacion con el sistema convencional FITC/TMR
2,05 1
Matriz, c = 10 mg de conA / g | GA relativa
4,92 1,9
Actividad relativa en comparacion con el sistema convencional FITC/TMR
2, 59 1
Valores correspondientes extrapolados a base de los valores experimentales con PEG-conA : FITC-dextrano con 0,01 moles de FS / mol de Ue. Relacion de masas dex : conA = 1:10
Tabla 6: Influencia de los colorantes
ATTO590/ATTO680 ROX/Evoblue30
Matriz, c = 10 mg de conA/g
GA relativa 2,55 2,1
conA nativa con DOL =1, dextrano con 0,001 moles de colorante (FS) por mol de subunidad de dextrano (UE), relacion de masas dex : conA = 1:10
Ejemplo 7: Determinacion de la influencia de la constitucion de la matriz del hidrogel
5
La actividad de glucosa depende tambien de la constitucion de la matriz del hidrogel. La matriz del hidrogel puede estar constituida por un polfmero o por una mezcla de varios polfmeros. Se ha descrito como ventajosa una matriz de hidrogel a base de alginato o de una mezcla de un alginato y un hidrogel de polivinilalcohol. El hidrogel de alginato hace posible mediante su interaccion con el conA y el dextrano, el enriquecimiento de los componentes del 10 sensor a altas concentraciones.
El prepolfmero del 2° hidrogel (por ejemplo PVA) puede penetrar en las bolas de alginato y despues de su reticulacion formar una red interpenetrante con el alginato. El ancho de malla de la red interpenetrante influye en la movilidad de las moleculas de "la protema que se une a la glucosa" y del ligando y con ello tambien la actividad de 15 glucosa. Los anchos de malla pueden estar influidos por el tipo, el peso molecular, el contenido de solidos del polfmero asf como la proporcion de los grupos de reticulacion, lo cual determina el numero de puntos nodales.
Un contenido pequeno de grupos de reticulacion conduce a una mayor actividad de glucosa. Reduciendo a la mitad los grupos de reticulacion, la actividad aumenta incluso unas 1,5 veces. En comparacion con el sistema en solucion, la actividad puede incluso tener una mejora de 4,2 veces la actividad de glucosa, sin experimentar un aumento del 20 grado de marcado en la conA (ver tabla 7).
Tabla 7: Influencia del contenido de reticulacion
Contenido de reticulacion (mmoles/g)
0,486 0,33 0,26
GA relativa
2,76 4,04 4,24
conA nativa (13 mg/g) con DOL = 1, dextrano con 0,001 moles de colorante (FS) por mol de subunidad de dex (UE), relacion de masas dex : conA = 1:10
El contenido en solidos de la red tiene igualmente una influencia sobre la actividad de glucosa. Cuanto mayor es el 25 contenido en solidos tanto mas pequena es la actividad de glucosa (ver tabla 8).
Tabla 8: Influencia del contenido en solidos
Prepolfmero FG
25% 30% 35% 40%
GA relativa
2,87 2,76 2,48 1,96
conA nativa (13 mg/g) con DOL = 1 (UE), relacion de masas dex : conA
dextrano con 0,001 moles de colorante (FS) por mol de subunidad de dex = 1:10

Claims (17)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    REIVINDICACIONES
    1. Dispositivo que comprende un hidrogel con "una protema que se une a la glucosa" incorporada al mismo y un ligando de "la protema que se une a la glucosa", en donde el hidrogel comprende una primera matriz de hidrogel de alginato, y una segunda matriz de hidrogel, la cual forma dentro de la primera matriz de hidrogel una red interpenetrante.
  2. 2. Dispositivo segun la reivindicacion 1, en donde la segunda matriz de hidrogel consta de un polfmero soluble en agua con por lo menos un grupo reticulado por molecula y un peso molecular maximo de 500.000.
  3. 3. Dispositivo segun la reivindicacion 1 o 2, en donde la segunda matriz de hidrogel se escoge del grupo compuesto por polivinilalcoholes (PVAs; incluyendo los copolfmeros con vinil acetatos y / o etileno), polietilenglicoles (PEGs), y polihidroxialcanoatos (PHAs), poli (2-metil-2 oxazolinas), poli (2-etil-2 oxazolinas), poli (2-hidroxietil-2 oxazolinas), poli (2-(1-(hidroximetil)-etil)-2 oxazolinas), poli-(hidroxietilmetacrilato) (PHEMA), poli-(hidroxietilacrilato) (PHEA), poli-vinilpirrolidonas, poli-(dimetil)acrilamida, poli-(hidroxietil)acrilamida, poli(etileno-co-vinilalcohol), poli(vinilacetato-co-vinilalcohol), poli(etileno-co-vinilacetato-co-vinilalcohol), y poli(etilenglicol-co-propilenglicol).
  4. 4. Dispositivo segun una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la primera y / o la segunda matriz de hidrogel son capaces de interreaccionar con "la protema que se une a la glucosa".
  5. 5. Dispositivo segun una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde "la protema que se une a la glucosa" se escoge del grupo formado por: lectinas, enzimas, las cuales unen a la glucosa como substrato, anticuerpos, los cuales reconocen espedficamente la glucosa, y aptameros que reconocen espedficamente la glucosa.
  6. 6. Dispositivo segun una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el ligando de "la protema que se une a la glucosa" es un oligosacarido, una macromolecula glicosilada o una nanopartmula glicosilada.
  7. 7. Dispositivo segun una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde "la protema que se une a la glucosa" es la concanavalina A.
  8. 8. Dispositivo segun la reivindicacion 7, en donde la concentracion de concanavalina A es mayor de 0,5 mg /(g de matriz).
  9. 9. Dispositivo segun la reivindicacion 8 en donde la concentracion de concanavalina A esta entre 2 y 60 mg/(g de matriz).
  10. 10. Dispositivo segun una de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la concanavalina A presenta una solubilidad elevada mediante una modificacion qrnmica en comparacion con la concanavalina A sin modificar.
  11. 11. Dispositivo segun la reivindicacion 10, en donde la modificacion se escoge del grupo compuesto por:
    peguilacion, acetilacion, succinilacion y polioxazolinilacion.
  12. 12. Dispositivo segun una de las reivindicaciones 1 a 11, en donde "la protema que se une a la glucosa" esta ligada con un colorante de oxacina, y el ligando de "la protema que se une a la glucosa" esta ligado con un colorante de rodamina.
  13. 13. Hidrogel con "una protema unida a la glucosa" colocada en su interior, y un ligando de "la protema que se une a la glucosa", en donde el hidrogel comprende una primera matriz de hidrogel a base de alginato y una segunda matriz de hidrogel, la cual esta dentro de la primera matriz de hidrogel, y forma una red interpenetrante, para emplear en la determinacion del contenido de glucosa de una muestra.
  14. 14. Hidrogel para emplear en la determinacion del contenido de glucosa de una muestra segun la reivindicacion 13, en donde la muestra ha sido conseguida de un voluntario, el cual presenta un metabolismo trastornado de la glucosa, o bien se sospecha que presenta un metabolismo trastornado de la glucosa.
  15. 15. Dispositivo segun una de las reivindicaciones 1 a 12 para emplear en el diagnostico de un metabolismo trastornado de la glucosa, en un voluntario.
  16. 16. Hidrogel para emplear en la determinacion del contenido de glucosa en una muestra segun la reivindicacion 13 o 14, o dispositivo para emplear en el diagnostico de un metabolismo trastornado de glucosa en un voluntario segun la reivindicacion 15, en donde el metabolismo trastornado de la glucosa ha sido causado por la diabetes mellitus o el smdrome metabolico.
  17. 17. Dispositivo segun una de las reivindicaciones 1 a 12 para emplear en la determinacion de la necesidad de una medida terapeutica en un voluntario con el metabolismo de la glucosa trastornado.
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