CN107422004A - 葡萄糖的检测方法及其检测装置 - Google Patents

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Abstract

一种葡萄糖的检测装置，包括：信号检测器，具有用于感知信号变化的敏感单元，所述敏感单元的表面不可逆地连接有葡萄糖的特异性识别体；模拟竞争物，包括银纳米颗粒和包裹于所述银纳米颗粒表面的葡聚糖，所述模拟竞争物能够形成胶体溶液，并能够可逆地捕获于所述敏感单元的表面。本发明还提供一种葡萄糖的检测方法。本发明提供的葡萄糖检测装置和检测方法，能够实现对葡萄糖的免标记检测。

Description

葡萄糖的检测方法及其检测装置
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种葡萄糖的检测方法及其检测装置。
背景技术
基于生物分子间的特异性识别亲和作用，对半导体场效应管器件进行识别体修饰，可实现对目标被测物的特异性检测。由于场效应管传感器的信号来源于带电物质自身对器件产生的电场效应，因此具有实现无标记检测的优点，目前已成为新型传感器领域的研究热点。
但是，由于葡萄糖不可以在水中通过电离而带电，因此，葡萄糖本身无法对半导体场效应管器件产生电场效应，因此不能通过直接在场效应管传感器敏感表面亲和进行检测。
发明内容
基于此，有必要提供一种免标记的葡萄糖检测方法及其检测装置。
一种葡萄糖的检测装置，包括：信号检测器，具有用于感知信号变化的敏感单元，所述敏感单元的表面不可逆地连接有葡萄糖的特异性识别体；模拟竞争物，包括银纳米颗粒和包裹于所述银纳米颗粒的葡聚糖，所述模拟竞争物能够形成胶体溶液，并可逆地捕获于所述敏感单元的表面。
在其中一个实施例中，所述信号检测器为场效应晶体管，所述敏感单元为半导体沟道。
在其中一个实施例中，所述特异性识别体为ConA蛋白分子。
在其中一个实施例中，所述ConA蛋白分子通过连接体分子不可逆地固定至所述半导体沟道的表面。
在其中一个实施例中，所述葡聚糖的分子量为15000至150000。
在其中一个实施例中，在所述胶体溶液中，所述模拟竞争物的zeta电位的绝对值大于15mV，以保持稳定胶体形态。
一种使用上述葡萄糖的检测装置进行葡萄糖检测的方法，包括：
提供所述胶体溶液，所述胶体溶液包括水溶液和分散于所述水溶液中的所述模拟竞争物；
将所述敏感单元的表面和所述胶体溶液接触，使所述模拟竞争物可逆地捕获于所述敏感单元的表面；以及
将葡萄糖样液通入所述敏感单元的表面，对所述信号检测器的电信号进行检测。
在其中一个实施例中，所述胶体溶液的制备方法包括：
提供并混合银氨溶液和所述葡聚糖，得到混合液；以及
对所述混合液进行微波加热，得到含有所述模拟竞争物的胶体溶液；
其中，所述微波加热的功率为85瓦至100瓦，所述微波加热的时间为2分钟至4分钟。
在其中一个实施例中，进一步包括对所述胶体溶液进行除杂的步骤：将所述模拟竞争物从所述胶体溶液中分离出来，并用所述水溶液重新进行分散，得到除杂后的所述胶体溶液。
在其中一个实施例中，进一步包括提供所述葡萄糖浓度与所述信号传感器输出的电信号值的检测标准曲线的步骤，包括：
提供至少三个含有所述葡萄糖的标准液，该至少三个标准液中所述葡萄糖的浓度已知且不同；
将该至少三个标准液分别通入捕获有所述模拟竞争物的所述敏感单元的表面，并记录所述信号检测器的输出的电信号值；以及
拟合该至少三个标准液中所述葡萄糖的浓度与所述电信号值的关系方程式，即得到所述检测标准曲线。
本发明提供的葡萄糖的检测装置和检测方法，通过使用表面存在与葡萄糖类似的亲和位点葡聚糖的银纳米颗粒，并通过所述银纳米银颗粒在胶体溶液中带电的性质，而获得了所述葡萄糖的带电的模拟竞争物，该带电的模拟竞争物与所述特异性识别体进行亲和或解离的过程中，能够引发所述敏感单元的表面产生电势变化，因此，通过所述葡萄糖和所述模拟竞争物的竞争亲和作用，可使所述信号检测器激发电信号而实现对所述葡萄糖的免标记检测。
附图说明
图1为本发明提供的捕获有模拟竞争物的检测装置的结构示意图；
图2为本发明提供的对葡萄糖进行检测时的检测装置的结构示意图；
图3A为本发明实施例1提供的固定有ConA的石墨烯沟道表面的AFM(原子力显微镜)照片，图3B为本发明实施例1提供的捕获有模拟竞争物的石墨烯沟道表面的AFM照片；
图4A为本发明实施例1提供的固定有ConA的GFET的转移特性曲线图，图4B为本发明实施例1提供的捕获有模拟竞争物的GFET的转移特性曲线图；
图5为本发明实施例1提供的模拟竞争物的扫描电镜照片；
图6A至6D为本发明实施例1提供的不同浓度的葡萄糖通入石墨烯沟道表面后GFET的漏极电流及其归一化响应值随时间变化的曲线图；
图7为本发明实施例1提供的不同浓度的葡萄糖通入石墨烯沟道表面后GFET的前60s的漏极电流的归一化响应值随时间变化的曲线图；
图8为本发明实施例1提供的葡萄糖浓度和GFET漏极电流的归一化响应值的线性关系图；
图9为本发明实施例2提供的模拟竞争物的扫描电镜照片；
图10为本发明实施例2提供的模拟竞争物在暗场显微镜下的分布图；
图11为本发明实施例2提供的单个模拟竞争物在暗场显微镜下散射光谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请一并参阅图1至图2，本发明第一实施方式提供一种葡萄糖的检测方法，包括以下步骤：
S1，提供信号检测器10，所述信号检测器10具有用于感知信号变化的敏感单元12，所述敏感单元12的表面不可逆地连接有葡萄糖30的特异性识别体14；
S2，提供胶体溶液，所述胶体溶液包括水溶液和分散于所述水溶液中的模拟竞争物20，所述模拟竞争物20包括银纳米颗粒22和包裹于所述银纳米颗粒表面的葡聚糖24；
S3，将所述胶体溶液与所述敏感单元12的表面接触，使所述模拟竞争物20可逆地捕获到所述敏感单元12的表面；以及
S4，将葡萄糖样液通入捕获有所述模拟竞争物20的敏感单元12的表面，进行葡萄糖检测。
本发明提供的葡萄糖的检测方法，通过使用表面存在与葡萄糖类似的亲和位点葡聚糖的银纳米颗粒，并通过所述银纳米颗粒22在胶体溶液中带电的性质，而获得了所述葡萄糖30的带电的模拟竞争物20，该带电的模拟竞争物20与所述特异性识别体14进行亲和或解离的过程中，能够引发所述敏感单元12的表面产生电势变化。当所述模拟竞争物20被捕获于所述敏感单元12的表面时，所述葡萄糖30的出现，即可引发所述葡萄糖30与所述葡聚糖24之间和所述特异性识别体14的竞争的亲和作用，使得所述模拟竞争物20从所述敏感单元12的表面的解离，并激发电信号，从而可实现对所述葡萄糖30的检测。因此，通过所述葡萄糖30和所述模拟竞争物20的竞争亲和作用，可使所述信号检测器10激发电信号而实现对所述葡萄糖30的免标记检测。
在步骤S1中，所述信号检测器10为能够感应和检测电势变化的检测器。在一实施例中，所述信号检测器10为场效应晶体管，所述敏感单元12为半导体沟道，例如石墨烯半导体沟道。
所述特异性识别体可为ConA(concanavalin A)蛋白分子。ConA蛋白分子是一种从刀豆(Canavalia ensiformis)中提取的天然蛋白质凝集素伴刀豆球蛋白A，在存在钙离子(Ca2+)和锰离子(Mn2+)的条件下，可对吡喃糖环上的C3、C4、C6位羟基发生亲和，从而实现对葡萄糖的特异性结合。ConA蛋白分子可通过使用连接体分子例如N-羟基琥珀酰亚胺酯-1-芘丁酸，并通过氨基偶联作用和芘基吸附作用，固定到所述石墨烯半导体沟道的表面。
在步骤S2中，在所述胶体溶液中，所述银纳米颗粒22带电，从而可得到带电的所述模拟竞争物20。所述银纳米颗粒22的粒径可以为10nm至100nm。优选地，所述银纳米颗粒22具有均一的粒径，以保证所述葡萄糖检测的精确性。优选地，所述银纳米颗粒22在所述胶体溶液中的zeta电位的绝对值大于15mV，一方面保证所述银纳米颗粒22之间有足够的静电斥力来维持稳定的胶体状态，另一方面，保证在所述模拟竞争物20与所述特异性识别体14进行亲和或解离的过程中，能够产生较大的电势变化，以使所述葡萄糖具有较高的检测灵敏度。更为优选地，所述银纳米颗粒22在所述胶体溶液中的zeta电位的绝对值大于25mV。
所述葡聚糖24在此处有至少两个作用：(1)在其空间位阻作用下，防止所述银纳米颗粒22团聚，从而使所述胶体溶液更加稳定；(2)所述葡聚糖24与所述葡萄糖30具有相似的亲和位点，从而可与所述特异性识别体14进行特异性结合，进而可使所述带电的银纳米颗粒22转换为所述葡聚糖20的模拟竞争物20使用。优选地，所述葡聚糖24的分子量为15000至150000，该范围不仅能够使得所述纳米颗粒22在所述胶体溶液中具有较高的zeta电位，而且可以使所述胶体形态稳定保持。
进一步地，可通过对所述银纳米颗粒22的粒径的调控、对所述葡聚糖24分子量的调控，对所述银纳米颗粒22的zeta电位的调控，针对不同的所述信号检测器10，使所述信号检测器10产生的响应信号实现最优化。
在一实施例中，所述胶体溶液的制备方法包括：
S21，提供并混合银氨溶液和所述葡聚糖30，得到混合溶液；
S22，将所述混合溶液进行加热，使所述葡聚糖30对所述银氨溶液进行还原，从而得到所述胶体溶液。
所述葡聚糖24可同时作为还原剂和稳定剂使用。依据氧化反应理论，所述葡聚糖24在被银氨溶液氧化前不会电离，在和所述银氨溶液进行反应时，所述葡聚糖24的长链上富含的醇羟基表现出还原性，通过失取电子依次被氧化为醛基和羧基，而羧基水溶液中存在电离平衡，因此使所述葡聚糖24表现出一定的负电性，从而使银纳米颗粒22通过负电荷提供的经典斥力在水相胶体体系中稳定存在：
在所述步骤S21中，可通过混合硝酸银溶液、氢氧化钠溶液和氨水来制备所述银氨溶液。可通过控制所述银氨溶液中银元素和所述葡聚糖30的比例来得到不同粒径大小的银纳米颗粒22。
在所述步骤S22中，对所述混合溶液加热的方式不限。在一实施例中，利用微波加热的方式来加热所述混合溶液，可快速得到粒径均一的所述模拟竞争物20。优选地，所述微波加热的功率为85至100瓦，所述微波加热的时间为2～4min。
得到所述胶体溶液后，可进一步包括对所述胶体溶液进行除杂的步骤，包括：
S23，对所述胶体溶液进行分离，得到所述模拟竞争物20；以及
S24，将所述模拟竞争物20用所述水溶液重新进行分散，得到除杂后的胶体溶液。
在步骤S23中，分离出来的模拟竞争物20可单独进行保存，在下次使用时，直接将所述模拟竞争物20用所述水溶液进行重新分散即可。所述模拟竞争物20可采用离心分离的方法进行分离。所述胶体溶液可以放置在离心机中以6000～9000转离心5～10分钟，随即移去上清液中未反应的土伦试剂或游离的葡聚糖长链分子，即可将所述模拟竞争物20分离出来。
在步骤S3中，所述模拟竞争物20通过所述葡聚糖24与所述特异性识别体14的亲和作用而捕获于所述敏感单元12的表面。将所述敏感单元12的表面和所述胶体溶液接触的方法不限，例如可通过将所述敏感单元12浸入所述胶体溶液中，使所述模拟竞争物20捕获于所述敏感单元12的表面，然后再将所述敏感单元12取出，用于对所述葡萄糖样液进行检测。在这一过程中，由于所述特异性识别体14本身的电离特性，而使得所述敏感单元12的表面具有一个基础电势E1，当所述模拟竞争物20捕获于所述敏感单元12的表面后，所述敏感单元12的表面的电势变为E2。E2的大小与所述基础电势E1、所述模拟竞争物20的zeta电位以及所述胶体溶液的离子强度有关。
在步骤S4中，当所述葡萄糖样液通入所述敏感单元12的表面时，所述葡萄糖30本身的出现即可引发所述模拟竞争物20的竞争性解离，激发所述信号检测器10输出电信号，从而实现对所述葡萄糖30的检测。此时，所述敏感单元12表面的电势变化和所述电信号的变化速率与所述葡萄糖30和所述模拟竞争物20的竞争作用的强度有关，将所述信号检测器10输出的电信号与理论模型对比，即可实现对所述葡萄糖样液的定量检测。所述样液可以为水溶液，例如可以为缓冲溶液。
在一实施例中，所述葡萄糖的检测方法进一步包括提供所述葡萄糖浓度与所述信号传感器输出的电信号值的检测标准曲线的步骤，具体包括：
S41，提供至少三个含有所述葡萄糖30的标准液，该三个标准液中所述葡萄糖30的浓度已知且不同；
S42，将该至少三个标准液分别通入所述敏感单元12的表面，并记录所述信号检测器10的输出的电信号值；以及
S43，拟合该至少三个标准液的所述待测目标物30的浓度与所述电信号值的关系方程式，即得到所述检测标准曲线。
将含有所述葡萄糖样液通入所述敏感单元12的表面进行检测，将其输出的电信号值代入上述检测标准曲线中，即可得到所述样液中所述葡萄糖30的浓度。
请一并参阅图1至图2，本发明第二实施方式提供一种葡萄糖的检测装置，包括信号检测器10和模拟竞争物20。所述信号检测器10具有用于感知信号变化的敏感单元12。所述敏感单元12的表面不可逆地连接有葡萄糖的特异性识别体14。所述模拟竞争物20包括纳米颗粒22和包裹于所述纳米颗粒22表面的葡聚糖24。所述模拟竞争物24能够形成胶体溶液，并可逆地捕获于所述敏感单元12的表面。
本发明第二实施方式所提供的信号检测器10、敏感单元12、特异性识别体14、模拟竞争物20、纳米颗粒22和葡聚糖24与本发明第一实施方式基本相同，在此不再赘述。
本发明提供的葡萄糖的检测装置，可以实现对葡萄糖这种不带电的分子的免标记检测，该检测装置结构简单、容易操作，易于推广。
实施例1：
本实施例1采用ConA(concanavalin A)作为葡萄糖的特异性识别体，ConA是一种从刀豆(Canavalia ensiformis)中提取的天然蛋白质凝集素伴刀豆球蛋白A，在水溶液中存在钙离子(Ca2+)和锰离子(Mn2+)的条件下可对吡喃糖环上的C3、C4、C6位羟基发生特异性亲和，从而实现对葡萄糖的特异性结合。
【信号检测器】
选用石墨烯场效应管(Graphene field-effect transistor,GFET)作为信号检测器。使用N-羟基琥珀酰亚胺酯-1-芘丁酸连接体分子，将ConA蛋白分子通过氨基偶联作用和芘基吸附作用固定到GFET的石墨烯沟道表面。如图3A和图4A所示，完成ConA固定的GFET器件分别进行了原子力显微镜(Atomic force microscopy，AFM)观测表面形貌，以及转移特性曲线测试。
【模拟竞争物和胶体溶液】
在去离子水中加入5mM银氨溶液(即土伦溶液，硝酸银溶液加氢氧化钠后再加氨水滴定)作为银前驱，再加入300μM重均分子量为20000Da的长链葡聚糖作为还原剂和稳定剂得到一混合溶液。将所述混合溶液混匀后加热到80℃保持40分钟，得到表面吸附有葡聚糖的银纳米颗粒，即得到葡萄糖的模拟竞争物。合成完毕的模拟竞争物经离心处理(10000转/分钟，1小时)去除残余反应物后，重新分散到pH＝7.4，离子强度50mM的HEPES缓冲液(含HEPES和NaNO3各50mM)中得到胶体溶液，通过zeta电位仪测得其zeta电位约为-25mV。图5为所述模拟竞争物的扫面电镜照片。
银纳米颗粒和模拟竞争物所带负电势来源于表面包裹的葡聚糖长链。依据氧化反应理论，葡聚糖在被银氨溶液氧化前不会电离，在水热条件下，长链上富含的醇羟基表现出还原性，通过失取电子依次被氧化为醛基和羧基。羧基在pH＝7.4的水溶液中存在电离平衡，因此使长链稳定剂表现出一定的负电性，从而使银纳米颗粒通过负电荷提供的经典斥力(zeta电位约-25mV)在水相胶体体系中稳定存在：
【模拟竞争物的捕获】
向完成ConA修饰的石墨烯沟道表面通入含有所述模拟竞争物的所述胶体溶液(交替中添加钙离子和锰离子各0.1mM)，通过葡聚糖与ConA蛋白的特异性亲和，所述模拟竞争物捕获于石墨烯沟道表面。如图3B和图4B所示，捕获有所述模拟竞争物的GFET器件分别进行了原子力显微镜(Atomic force microscopy，AFM)观测表面形貌，以及转移特性曲线测试，从图3可以看出，所述模拟竞争物被证实成功捕获。
【葡萄糖的检测】
将不同浓度的葡萄糖溶液(HEPES缓冲液配制，pH＝7.4，离子强度50mM，额外添加钙离子和锰离子各0.1mM)通入捕获有所述模拟竞争物的石墨烯沟道表面。在GFET栅极电压恒定为1V条件下连续记录GFET输出电导率值，如图6A到图6D所示，并取该过程的前60秒近似线性的快速上升段作为传感器响应值，如图7所示。
请参阅图8，可以看出传感器响应值与葡萄糖浓度间存在比较理想的线性关系，证实了基于银纳米颗粒用作模拟竞争物可以实现基于场效应管传感器的葡萄糖免标记检测。
将含有葡萄糖的样液通入所述石墨烯沟道表面，得到所述样液的传感器响应值，带入上述线性关系方程，即可得到所述样液的葡萄糖浓度。
实施例2
在烧杯中加入60mL的去离子水，并将体积为6mL浓度为0.1M的硝酸银溶液，体积为6mL浓度为0.1M的氢氧化钠溶液先后加入到试管中,此时观察到烧杯中会立即产生白色不溶物。随即，向烧杯中快速逐次滴入20uL质量分数为0.25％的氨水直到沉淀溶解，得到的无色溶液即为银氨溶液。取30mg分子量为20000的葡聚糖加入到烧杯中，并超声5分钟，使混合均匀；将所得溶液放置到微波炉中加热，加热为功率为95W，加热时间为3分钟，此后得到产液；将产液分为六组，每组12mL，并将它们放置在离心机中以6000转离心5分钟，接着移去每组中的上清液并加入水使其重新分散，得到粒径分布为35.3nm的模拟竞争物，并将其放置在冰箱中保存。
从图9至图11可以看出，实施例1得到了粒径均一分布的模拟竞争物。该模拟竞争物可用于葡萄糖的免标记检测。
本发明提供的葡萄糖的检测方法和检测装置，可对不易通过在场效应管传感器表面直接亲和进行检测的不带电的葡萄糖实现免标记检测，该方法操作简单，易于推广。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种葡萄糖的检测装置，其特征在于，包括：
信号检测器，具有用于感知信号变化的敏感单元，所述敏感单元的表面不可逆地连接有葡萄糖的特异性识别体；
模拟竞争物，包括银纳米颗粒和包裹于所述银纳米颗粒表面的葡聚糖，所述模拟竞争物能够形成胶体溶液，并能够可逆地捕获于所述敏感单元的表面。
2.如权利要求1所述的葡萄糖的检测装置，其特征在于，所述信号检测器为场效应晶体管，所述敏感单元为半导体沟道。
3.如权利要求2所述的葡萄糖的检测装置，其特征在于，所述特异性识别体为ConA蛋白分子。
4.如权利要求3所述的葡萄糖的检测装置，其特征在于，所述ConA蛋白分子通过连接体分子不可逆地固定至所述半导体沟道的表面。
5.如权利要求1所述的葡萄糖的检测装置，其特征在于，所述葡聚糖的分子量为15000至150000。
6.如权利要求1所述的葡萄糖的检测装置，其特征在于，在所述胶体溶液中，所述模拟竞争物的zeta电位的绝对值大于15mV。
7.一种使用如权利要求1至权利要求6中任一项所述的葡萄糖的检测装置进行葡萄糖检测的方法，其特征在于，包括：
提供所述胶体溶液，所述胶体溶液包括水溶液和分散于所述水溶液中的所述模拟竞争物；
将所述敏感单元的表面和所述胶体溶液接触，使所述模拟竞争物可逆地捕获于所述敏感单元的表面；以及
将葡萄糖样液通入所述敏感单元的表面，对所述信号检测器的电信号进行检测。
8.根据权利要求7所述的葡萄糖检测的方法，其特征在于，所述胶体溶液的制备方法包括：
提供并混合银氨溶液和所述葡聚糖，得到混合液；以及
对所述混合液进行微波加热，得到含有所述模拟竞争物的胶体溶液；
其中，所述微波加热的功率为85瓦至100瓦，所述微波加热的时间为2分钟至4分钟。
9.根据权利要求8所述的葡萄糖检测的方法，其特征在于，进一步包括对所述胶体溶液进行除杂的步骤：将所述模拟竞争物从所述胶体溶液中分离出来，并用所述水溶液重新进行分散，得到除杂后的所述胶体溶液。
10.根据权利要求7所述的葡萄糖检测的方法，其特征在于，进一步包括提供所述葡萄糖浓度与所述信号传感器输出的电信号值的检测标准曲线的步骤，包括：
提供至少三个含有所述葡萄糖的标准液，该至少三个标准液中所述葡萄糖的浓度已知且不同；
将该至少三个标准液分别通入捕获有所述模拟竞争物的所述敏感单元的表面，并记录所述信号检测器的输出的电信号值；以及
拟合该至少三个标准液中所述葡萄糖的浓度与所述电信号值的关系方程式，即得到所述检测标准曲线。
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