CN104777157A - 一种无酶ecl葡萄糖传感器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及葡萄糖传感器领域，特别涉及一种无酶ECL葡萄糖传感器，主要由类石墨相氮化碳、苝四甲酸、苯环化右旋糖酐和刀豆凝集素蛋白A制成。本发明提供的无酶ECL葡萄糖传感器，基于ConA与葡萄糖优良的特异性结合性能和g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料优良的ECL性能，该传感器能在生理条件下灵敏地测定葡萄糖，构建的无酶ECL葡萄糖传感器显示出较高的选择性、稳定性和重现性，并且检测更为灵敏。

Description

一种无酶ECL葡萄糖传感器

技术领域

本发明涉及葡萄糖传感器领域，具体而言，涉及一种无酶ECL葡萄糖传感器。

背景技术

葡萄糖是细胞新陈代谢的主要能量来源，然而血糖的增高可能会引发患糖尿病的风险，从而诱发肾衰竭或心脏疾病。因此，葡萄糖检测在临床以及生物化学采样中日益受到重视，在提高生活质量中扮演着越来越重要的角色。常见的葡萄糖检测方法有高效液相色谱法、分光光度法、偏振测定法、气相色谱分析法以及电化学方法。

自从Clark和Lyons在1962年报道了第一只酶电极以来，酶生物传感器就因其高的灵敏度，快速的响应和低耗费而广泛地应用于葡萄糖检测中。然而，众所周知，酶是对温度、pH、有毒物质、湿度都很敏感的物质。例如，葡萄糖氧化酶在pH低于2或者高于8，温度超过40℃时就很容易失活。所以差的稳定性和重现性是酶传感器的共同缺点。无酶传感器可较好克服上述酶传感器的缺陷，因此吸引了大量的关注。比如，Ci等利用氧化镍空心微球在碱性溶液中可以电催化氧化葡萄糖而构建了无酶的电化学葡萄糖传感器。但是在碱性溶液中的这种检测方法在人血液实际样品的检测中是受限的。为此，非碱性体系的无酶葡萄糖传感器备受关注。如Cella等构建了一基于葡萄糖-刀豆凝集素蛋白A(ConA)-右旋糖酐(glucose-ConA-dextran)竞争体系的无酶葡萄糖传感器。由于葡萄糖与ConA的结合力强于右旋糖酐与ConA的结合力，葡萄糖将与右旋糖酐竞争ConA的结合位点，从而将ConA带走。由于ConA的屏蔽效应被有效地阻止，从而引起电化学隧道中电导的改变。基于电导的变化实现葡萄糖的检测。该传感器的检测限达皮摩尔级，显示出高的灵敏度和选择性。此外，黄静等也基于此竞争反应构建了一开关型电化学生物传感器。由于pH＝8时ConA带负电，当葡萄糖与右旋糖酐竞争ConA的结合位点而将ConA从电极上带走时，电极表面的负电荷就会减少，根据电荷的变化以实现葡萄糖的检测。目前，无酶葡萄糖传感器的报道很多，但关于无酶的电致化学发光(ECL)传感器的研究很少。

ECL阴极发光体，如luminol，Ru(bpy)₃ ²⁺，量子点(CdS，CdSe，CdTe and ZnS)等已被广泛研究。类石墨相氮化碳g-C₃N₄，作为新型的碳材料，因其具有无毒、便宜、高的热稳定性和化学稳定性、易于功能化等特点而引起了很大的关注。特别是具有较好水溶性的超薄g-C₃N₄纳米片，已被广泛地应用于光化学和电化学催化中。如Cheng等利用微量的Cu²⁺对g-C₃N₄纳米片的发光具有猝灭作用而构建了一个检测Cu²⁺的ECL传感器。

现有无酶葡萄糖传感器的灵敏性、选择性、稳定性仍需进一步提升。鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无酶ECL葡萄糖传感器。g-C₃N₄良好的ECL性能与glucose-ConA-dextran竞争体系的结合，使得该传感器具有高的灵敏度，较好的选择性，稳定性和重现性。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种无酶ECL葡萄糖传感器，主要由类石墨相氮化碳(简称为g-C₃N₄)、苝四甲酸(简称为PTCA)、苯环化右旋糖酐(简称为DexP)和刀豆凝集素蛋白A(简称为ConA)制成。

本发明提供的无酶ECL葡萄糖传感器，主要由g-C₃N₄、PTCA、DexP和ConA这四种物质制成，基于ConA与葡萄糖优良的特异性结合性能和g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料优良的ECL性能，该传感器能在生理条件下灵敏地测定葡萄糖。

优选地，所述g-C₃N₄为g-C₃N₄纳米片；

所述无酶ECL葡萄糖传感器通过以下方法制备：

先将g-C₃N₄纳米片与PTCA通过π–π堆积，制成g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料，修饰于玻碳电极上；

再依次修饰DexP和ConA。

本发明将具有优良特性的g-C₃N₄纳米片与PTCA通过π–π堆积以制成g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料，以其作为ECL信号探针修饰于电极上；再通过π–π堆积修饰DexP。借助于DexP与ConA的特异性结合进一步修饰ConA，得到无酶ECL葡萄糖传感器。将该传感器浸入pH 7.4的葡萄糖溶液中，葡萄糖将与DexP竞争ConA的结合位点，由于葡萄糖与ConA显示出更好的亲和力，从而将ConA从电极上带走，ConA的阻碍作用减弱，导致ECL信号增强。构建的无酶ECL葡萄糖传感器显示出较高的选择性、稳定性和重现性，并且检测更为灵敏。

其中，芳香族化合物苝四甲酸PTCA，作为一种有机苝系染料，具有大的π电子系统，良好成膜特性，并且，它还可以促进过硫酸根体系的发光。

优选地，所述g-C₃N₄纳米片与PTCA以重量比为1:0.9-1.1进行堆积。更优选为所述g-C₃N₄纳米片与PTCA以重量比为1:0.98-1.05进行堆积。最优选为所述g-C₃N₄纳米片与PTCA以重量比为1:1进行堆积。堆积得到的g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料集g-C₃N₄和PTCA的优良性能于一体，不但具有好的ECL性能，而且还具有好的成膜性，是构建ECL传感器的理想材料。该材料用扫描电子显微镜(SEM)进行了观察。SEM图像中观察到的不规则方形结构为PTCA，且此方形结构边缘模糊化，是因为覆盖上了一层g-C₃N₄纳米薄片，表明g-C₃N₄-PTCA复合材料成功合成。

进一步地，所述g-C₃N₄-PTCA的制备方法具体为：将g-C₃N₄纳米片与PTCA分散在水中，超声7-9h，得到g-C₃N₄-PTCA复合材料。

为了使g-C₃N₄纳米片与PTCA更均一的分散于水中，以利于复合过程的发生，优选地，所述g-C₃N₄纳米片与PTCA的总重量与所述水的重量比为1:950-1050。

进一步地，所述g-C₃N₄纳米片与PTCA堆积后得到g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料，滴涂于预处理后的玻碳电极表面，于室温下晾干，然后修饰DexP；

所述DexP的体积与所述g-C₃N₄-PTCA的体积比为1:0.9-1.1。

优选地，玻碳电极的预处理方法为：将玻碳电极分别经0.25-0.35μm和0.04-0.06μm的Al₂O₃粉末抛光；

然后依次在蒸馏水、乙醇和二次蒸馏水中超声清洗，将清洗干净的玻碳电极置于室温下晾干即可；

优选地，所述玻碳电极的直径为3.5-4.5mm。

进一步地，电极修饰DexP 1h后，修饰上Tween20，所述Tween20的体积与所述g-C₃N₄-PTCA的体积比为1:0.9-1.1。Tween20用于封闭g-C₃N₄-PTCA上的活性位点以消除非特异性结合。

进一步地，修饰ConA的具体方法为：将所述ConA滴涂在电极上，静置35-45min；

优选地，所述ConA的浓度为2.5-3.5mg/mL，所述ConA的体积与所述g-C₃N₄-PTCA复合材料的体积比为1:0.9-1.1。

优选地，将三聚氰胺粉末以升温速率为2.5-3.5℃/min升温至595-605℃煅烧，煅烧的时间为1.5-2.5h，自然冷却至室温，生成黄色块状g-C₃N₄粉末；

取所述g-C₃N₄粉末分散于水中，超声9.5-10.5h，得到悬浊液；

将所述悬浊液离心，以4900-5200rpm的速率离心4-8min，去除还未剥落的块状g-C₃N₄粉末，上层清液烘干即得所述g-C₃N₄纳米片。

本发明构建了一基于葡萄糖-右旋糖酐(dextran)-伴刀豆凝集素A(ConA)竞争体系的新型无酶电致化学发光(ECL)葡萄糖传感器。该传感器是以类石墨相氮化碳(g-C₃N₄)和苝四甲酸(PTCA)制得纳米复合材料(g-C₃N₄-PTCA)，以此作为信号探针修饰于玻碳电极(GCE)上，进而通过π–π作用修饰上苯环化的右旋糖酐DexP；然后再通过DexP特异性吸附ConA。当修饰好的电极浸入葡萄糖溶液中时，葡萄糖与DexP竞争ConA的结合位点，由于葡萄糖显示出比DexP更强的结合ConA的亲和力，随葡萄糖浓度的增加，更多的ConA将被葡萄糖从电极上带走，导致ECL信号的增强，从而实现葡萄糖的检测。传感器响应葡萄糖的线性范围为1×10^-10mol/L到5.2×10^-5mol/L，检测限为4.0×10^-11mol/L(S/N＝3)。此外，此传感器还具有较高的选择性，较好的稳定性和重现性，表明该无酶ECL葡萄糖传感器具有较好的发展前景。

其中，g-C₃N₄与共反应试剂S₂O₈ ^2▁可能的发光机理如下：

g-C₃N₄+e^▁→g-C₃N₄ ^■▁

S₂O₈ ^2▁+e_▁→SO₄ ^2▁+SO₄ ^■▁

g-C₃N₄ ^■▁+SO₄ ^■▁→g-C₃N₄*+SO₄ ^2▁

and/or

g-C₃N₄+SO4^■▁→g-C₃N₄ ⁺+SO₄ ^2▁

g-C₃N₄ ⁺+g-C₃N₄ ^■▁→g-C₃N₄*+g-C₃N₄

finally,

g-C₃N₄*→g-C₃N₄+hν

简单来说，g-C₃N₄得到一个电子生成g-C₃N₄ ^■▁，S₂O₈ ^2▁得到一个电子生成SO₄ ^2▁和SO₄ ^■▁。具有强氧化性的SO₄ ^■▁与g-C₃N₄ ^■▁反应生成激发态的g-C₃N₄。或者，SO₄ ^■▁氧化g-C₃N₄生成g-C₃N₄ ⁺，然后g-C₃N₄ ⁺和g-C₃N₄ ^■▁反应生成基态和激发态的g-C₃N₄。最终，激发态的g-C₃N₄回到基态，从而产生ECL信号。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的无酶ECL葡萄糖传感器，特定选用g-C₃N₄、PTCA、DexP和ConA这四种物质制成。由于g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料优良的ECL性能与glucose-ConA-dextran竞争体系的结合，使得葡萄糖检测更为灵敏；

(2)本发明将具有优良特性的g-C₃N₄纳米片和PTCA通过π–π堆积以制得纳米复合材料g-C₃N₄-PTCA，以此作为ECL信号探针修饰于电极上；再通过π–π堆积作用修饰上DexP；利用DexP与ConA的特异性结合进一步修饰上ConA，以制得无酶ECL葡萄糖传感器。由于葡萄糖与ConA强的亲和力和g-C₃N₄-PTCA优良的ECL性能，该传感器显示出优良的性能，如较高的选择性，较好的稳定性和重现性，并且检测更为灵敏；

(3)本发明还限定了g-C₃N₄纳米片、PTCA、DexP和ConA之间的用量比例关系，该新型的无酶ECL葡萄糖传感器比一般的无酶葡萄糖传感器显示出更高的灵敏度和更低的检测限；

(4)本发明还改进了g-C₃N₄纳米片的制备方法，制得的g-C₃N₄纳米片能更好的符合制备无酶ECL葡萄糖传感器的需求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中g-C₃N₄纳米片，PTCA和g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料的SEM图；

图2为本发明实施例1中g-C₃N₄纳米片，PTCA和g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料的红外光谱图(2A)、X射线衍射图(2B)、紫外可见吸收光谱图(2C)；

图3为本发明实施例1中电极修饰过程的ECL和循环伏安(CV)表征图；

图4为本发明实施例1中传感器工作条件的优化：K₂S₂O₈浓度(4A)，缓冲液PBS的pH值(4B)和葡萄糖的孵育时间(4C)；

图5为本发明实施例1中传感器对葡萄糖的ECL响应；

图6为本发明实施例1中传感器的稳定性图；

图7为本发明实施例中无酶ECL葡萄糖传感器的制备过程和葡萄糖的检测原理示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。

以下实施例中，所用试剂和仪器具体信息如下所示。

1试剂

三聚氰胺购自Aladdin公司(中国，上海)；1,2-环氧基-3-苯氧丙烷Epoxy和Tween20购自Sigma公司(St.Louis，MO，USA)；苝四甲酸二酐购自连港燃料公司；葡萄糖储备液由二次蒸馏水制备；尿酸，抗坏血酸，多巴胺购于重庆化学试剂公司；右旋糖酐dextran购自国药化学试剂公司(中国，上海)。苯环化右旋糖酐DexP参照之前的文献由Epoxy和dextran合成(P.W.Barone,M.S.Strano,Reversible control of carbon nanotube aggregation for a glucose affinitysensor,Angew.Chem.Int.Ed.45(2006)8138-8141)。不同pH的磷酸缓冲溶液(PBS，0.10mol/L)用0.10mol/L K₂HPO₄和0.10mol/LKH₂PO₄配制，支持电解质为0.10mol/L KCl。所有实验用水均为二次蒸馏水。

2仪器

MPI-A型电化学发光分析仪(西安瑞迈分析仪器有限公司)，扫描电子显微镜(SEM，S4800，日本HITACHI公司)；CHI 660D型电化学工作站(上海辰华仪器公司)；紫外-可见分光光度计(UV-Vis2450，天美科学仪器有限公司)；所有电化学实验都采用三电极体系:修饰的玻碳电极为工作电极，Pt电极为对电极，饱和甘汞电极或Ag/AgCl电极为参比电极；傅立叶变换红外光光度计(美国Nicolet仪器公司)。

实施例1

1、制备g-C₃N₄纳米片

取20g三聚氰胺粉末于陶瓷坩埚中，加盖，以升温速率为3℃/min升温至600℃，煅烧2h，自然冷却至室温，得到黄色块状g-C₃N₄粉末。取250mg块状g-C₃N₄粉末分散于250mL水中，超声10h。将得到的悬浊液以5000rpm的速率离心5min，去除还未剥落的块状g-C₃N₄粉末。上层清液烘干后得到g-C₃N₄纳米片。

2、制备传感器

玻碳电极(GCE,Φ＝4mm)分别经0.3和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光后，在蒸馏水、乙醇和二次蒸馏水中超声洗净，置于室温下晾干。1mg g-C₃N₄纳米片和1mg PTCA分散在2mL水中，超声8小时，得到粉红色的g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料的分散液。10μL该分散液滴涂于预处理后的GCE表面，于室温下晾干。再依次修饰上10μLDexP和Tween20(0.1％,10μL)。Tween20用于封闭g-C₃N₄-PTCA上的活性位点以消除非特异性结合。最后，10μL 3mg/mL ConA滴涂于电极上，放置40min，即得无酶ECL葡萄糖传感器。

3、将g-C₃N₄纳米片、PTCA和g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料用扫描电子显微镜(SEM)观察，得到的结果如图1所示。图1中，A为g-C₃N₄纳米片的SEM图；B为PTCA的SEM图；C为g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料的SEM图。

从图1A中可以观察到分层的薄片状结构的g-C₃N₄纳米片；而图1B中显示了PTCA的不规则方形结构；图1C中可同时观察到薄片状结构的g-C₃N₄纳米片，和不规则方形结构的PTCA，并且不规则的方形结构边缘模糊化，覆盖上了一层薄片。g-C₃N₄-PTCA复合物的SEM图像表明了g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料的成功合成。

4、将g-C₃N₄纳米片、PTCA和g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料用红外光谱(FTIR)，X射线衍射(XRD)和紫外光谱(UV-vis)进行表征。

4.1用FTIR方法对g-C₃N₄纳米片、PTCA和g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料进行了表征，结果如图2A所示。图2A中，曲线a为g-C₃N₄的红外吸收曲线，可以看出，在波数810cm^-1和1200～1700cm^-1处存在明显的红外吸收带，这些吸收带是含有C₃N₃三嗪芳环结构分子的典型红外吸收带。其中1646cm^-1和1576cm^-1处为g-C₃N₄的C(sp2)＝N伸缩振动，1319cm^-1处为C(sp2)-N的伸缩振动。曲线b为PTCA的红外吸收曲线，吸收峰在3123cm^-1和1773cm^-1处分别是PTCA的C-H振动和-COOH的C＝O伸缩振动，1594cm^-1是PTCA芳香族C＝C伸缩处的吸收峰。上述的g-C₃N₄纳米片和PTCA的特征峰都能在两者复合物的红外光谱(曲线c)中观察到，表明g-C₃N₄片被成功的功能化，合成了g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料。

4.2将g-C₃N₄纳米片、PTCA和g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料进行XRD表征，各物质的X射线衍射峰呈现在图2B中。g-C₃N₄纳米片(曲线a)在002晶面衍射峰的位置在2θ＝27.34°，与现有报道一致，表明g-C₃N₄纳米片被成功制备。苝四甲酸PTCA是由苝四甲酸二酐PTCDA水解制得的，所以PTCA的XRD衍射峰与PTCDA的类似。与Karl等报道的PTCDA的XRD衍射峰类似，本发明中合成的PTCA(曲线b)在9.04°(011),12.06°(012),24.42°(024)和27.18°(102)处观察到四个特征衍射峰。而g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料(曲线c)同时显示出g-C₃N₄纳米片和PTCA的特征衍射峰。在大约27°处，g-C₃N₄纳米片的特征峰与PTCA的一特征峰重合了。

4.3将g-C₃N₄纳米片，PTCA和g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料进行UV-vis表征，各物质的紫外可见光谱吸收曲线见图2C。g-C₃N₄纳米片(曲线a)在320nm显示出一特征峰，与之前文献报道的g-C₃N₄纳米片的特征吸收峰一致。曲线b为PTCA的UV-vis吸收曲线，在513nm处(属于PTCAπ-π*跃迁)和224nm处各有一个强吸收峰，均属于PTCA的特征吸收峰。对g-C₃N₄-PTCA复合物(曲线c)，g-C₃N₄纳米片的特征峰从320nm红移到了325nm，表明了g-C₃N₄纳米片与PTCA通过π-π作用成功地堆积了。

5、电极修饰过程的ECL和循环伏安(CV)表征

图3A为不同修饰电极在含有0.10mol/L K₂S₂O₈的缓冲溶液中，在0.0～-1.3V电位范围内，以300mV/s的扫速进行扫描时得到的ECL曲线。如图所示，裸电极(曲线a)显示出微弱的ECL信号。当g-C₃N₄-PTCA作为信号探针修饰于GCE上时，显示出一很强的ECL信号(曲线b)。当DexP、Tween20和ConA依次修饰于电极上，相应的ECL信号依次降低，如曲线c-e所示。

图3B是不同修饰电极在[Fe(CN)₆]^4-/3-中的循环伏安图谱。裸电极呈现出一对可逆的氧化还原峰(曲线a)。修饰g-C₃N₄-PTCA后(曲线b)，峰电流减小。随着DexP、Tween20和ConA的进一步修饰，峰电流依次减小，如曲线c-e所示。ECL和CV表征结果均表明了电极成功被修饰。

6、传感器工作条件的优化：K₂S₂O₈浓度(4A)，PBS的pH值(4B)和葡萄糖的孵育时间(4C)

将在5.0×10^-8mol/L的葡萄糖中孵育过的传感器，置于不同浓度的K₂S₂O₈的PBS溶液中测试其ECL响应。结果示于图4A中。随着K₂S₂O₈浓度从0.05mol/L增加0.10mol/L，ECL信号值明显增强。当K₂S₂O₈的浓度超过0.10mol/L之后，ECL的信号值达到了一个相对稳定的平台。因此优化的K₂S₂O₈浓度为0.10mol/L。

图4B呈现了不同pH对传感器ECL信号的影响。从图中可以看到，在pH 7.0的时候，ECL信号值达到最大。但考虑到此传感器的实际应用，我们选择了生理pH值7.4作为优化的pH值。

研究了葡萄糖孵育时间对传感器ECL响应的影响。传感器于5.0×10^-8mol/L的葡萄糖溶液中孵育不同的时间，然后测试其ECL响应。如图4C所示，随孵育时间从1min增加至5min，ECL信号明显增加。当孵育时间超过5min，ECL信号变化很小，增加不再明显。因此，葡萄糖优化的孵育时间为5min。

7、葡萄糖的检测

在最优的实验条件下用制备的传感器测定葡萄糖。如图5所示，ECL强度随葡萄糖浓度的增加而增加。以ECL响应信号的差值(ΔI＝I_t-I₀)对葡萄糖浓度的对数作图，线性关系示于图5中。在此，I₀和I_t分别为传感器孵育葡萄糖前后的ECL响应信号。线性范围为1.0×10^-10～5.2×10^-5mol/L，检测限为4.0×10^-11mol/L，线性回归方程为ΔI＝12246.44+1125.94log c，相关系数0.994。对比了该传感器与别的非酶葡萄糖传感器的性能，结果示于表1中。相比于大多数传感器而言，我们所构建的非酶ECL传感器在线性范围与检测限方面表现出更优的结果。

表1 不同无酶传感器的比较

注：NiO-HMS^a:nickel oxide hollow microspheres；

SWNTs^b:single-walled carbon nanotubes；

GE^c:gold electrode；

GO^d:grapheme oxide；

PdNPs-FCNTs^e:palladium nanoparticles-functional carbonnanotubes；

Cys^f:L-Cysteine；

CuONPs-CNFs^g:cupric oxide nanoparticles-carbon nanofibers。

参考文献：

[1]S.Q.Ci,T.Z.Huang,Z.H.Wen,S.M.Cui,S.Mao,D.A.Steeber,J.H.Chen,Nickel oxide hollow microsphere for non-enzymeglucose detection,Biosens.Bioelectron.54(2014)251-257；

[2]L.N.Cella,W.Chen,N.V.Myung,A.Mulchandani,Single-walled carbon nanotube-based chemiresistive affinity biosensorsfor small molecules:utrasensitive glucose detection,J.Am.Chem.Soc.132(2010)5024-5026；

[3]J.Huang,L.Zhang,R.P.Liang,J.D.Qiu,“On-off”switchableelectrochemical affinity nanobiosensor based on graphene oxide forultrasensitive glucose sensing,Biosens.Bioelectron.41(2013)430-435；

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[5]X.Zhong,R.Yuan,Y.Q.Chai,In situ spontaneous reductionsynthesis of spherical PdCys-C60nanoparticles and its application innonenzymatic glucose biosensors,Chem.Commun.48(2012)597-599；

[6]J.Zhang,X.L.Zhu,H.F.Dong,X.J Zhang,W.C.Wang,Z.D.Chen,In situ growth cupric oxide nanoparticles on carbon nanofibersfor sensitive nonenzymatic sensing of glucose,Electrochim.Acta 105(2013)433-438。

8、传感器的选择性

选择性是衡量传感器性能的重要指标。选择0.10mM抗坏血酸、0.10mM酪氨酸、0.10mM KCl、0.10mM Na₂SO₄、0.10mM柠檬酸、0.10mM MgCl₂、0.10mM多巴胺、0.10mM尿酸、0.10μM麦芽糖或0.10μM乳糖为干扰物，比较了传感器在有和没有上述干扰物质存在时的ECL响应信号，得知上述干扰物对5.0×10^-8M的葡萄糖的响应无明显干扰，表明传感器具有良好的选择性。

9、传感器的稳定性和重现性

一方面，对传感器的储存稳定性进行了测试。如图6A所示，每天对传感器进行测试，15天后，ECL强度下降了19.3％，表明传感器具有较好的储存稳定性。另一方面，该传感器在同一葡萄糖溶液中连续扫描10圈，其ECL响应信号的相对标准偏差值为1.1％，如图6B所示，表明该传感器具有良好操作稳定性。传感器的重现性也得到论证：同一批次的5支传感器，其ECL响应信号的相对标准偏差值为4.1％。

10、回收实验

采用加标回收方法测试了传感器的实用性。将不同浓度的葡萄糖溶液加入到人血清样品中，测定其回收率，结果如表2所示。从表2中可知，回收率为93％-108％，表明了传感器具有较好的实际应用潜能。

表2加标回收

Sample	CAdded(M)	CDetected(M)	Recovery(％)
				1	1.70×10-9	1.80×10-9	106
2	1.70×10-8	1.73×10-8	102
				3	1.70×10-7	1.84×10-7	108
4	1.00×10-6	9.30×10-7	93.0

实施例2

1、制备g-C₃N₄纳米片

取20g三聚氰胺粉末于陶瓷坩埚，加盖，以升温速率为2.5℃/min升温至595℃，煅烧2.5h，自然冷却至室温，生成黄色块状g-C₃N₄粉末。取250mg块状g-C₃N₄粉末分散于250mL水中，超声9.5h。将得到的悬浊液以4900rpm的速率离心8min，去除还未剥落的块状g-C₃N₄粉末。上层清液烘干后得到g-C₃N₄纳米片。

2、制备传感器

玻碳电极(GCE,Φ＝4mm)分别经0.3和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光后，在蒸馏水、乙醇和二次蒸馏水中超声洗净，置于室温下晾干。1mg g-C₃N₄纳米片和0.9mg PTCA分散在1.995mL水中，超声7小时，得到粉红色的g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料的分散液。10μL该分散液滴涂于预处理后的GCE表面，于室温下晾干。再依次修饰上9μL DexP和Tween20(0.1％,9μL)。Tween20用于封闭g-C₃N₄-PTCA上的活性位点以消除非特异性结合。最后，11μL 2.5mg/mL ConA滴涂在电极上35min，即得无酶ECL葡萄糖传感器。

3、将g-C₃N₄纳米片、PTCA和g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料用扫描电子显微镜(SEM)观察，得到的结果与实施例1一致。

4、将g-C₃N₄纳米片、PTCA和g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料进行FTIR，XRD，UV-vis表征，结果与实施例1一致。

5、电极修饰过程的ECL和循环伏安(CV)表征，结果与实施例1一致。

6、传感器工作条件的优化：K₂S₂O₈浓度，PBS的pH值和葡萄糖的孵育时间，结果与实施例1一致。

7、葡萄糖的检测，检测范围以及检测限与实施例1一致。

8、传感器的选择性，用与实施例1相同的方法进行检测，干扰物质并没有对测定5.0×10^-8mol/L的葡萄糖产生明显的干扰，这表明传感器具有良好的抗干扰性与高选择性。

9、传感器的稳定性和重现性，与实施例1结果一致。

10、回收实验，结果与实施例1一致。

实施例3

1、制备g-C₃N₄纳米片

取20g三聚氰胺粉末于陶瓷坩埚，加盖，以升温速率为3.5℃/min升温至605℃，煅烧1.5h，自然冷却至室温，生成黄色块状g-C₃N₄粉末。取250mg块状g-C₃N₄粉末分散于250mL水中，超声10.5h。将得到的悬浊液以5200rpm的速率离心4min，去除还未剥落的块状g-C₃N₄粉末。上层清液烘干后得到g-C₃N₄纳米片。

2、制备传感器

玻碳电极(GCE,Φ＝4mm)分别经0.3和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光后，在蒸馏水、乙醇和二次蒸馏水中超声洗净，置于室温下晾干。1mg g-C₃N₄纳米片和1.1mg PTCA分散在1.995mL水中，超声9h，得到粉红色的g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料的分散液。10μL该分散液滴涂于预处理后的GCE表面，于室温下晾干。再依次修饰上11μLDexP和Tween20(0.1％，11μL)。Tween20用于封闭g-C₃N₄-PTCA上的活性位点以消除非特异性结合。最后，9μl 3.5mg/mL ConA滴涂在电极上45min，即得无酶ECL葡萄糖传感器。

3、将g-C₃N₄纳米片、PTCA和g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料用扫描电子显微镜(SEM)观察，得到的结果与实施例1一致。

4、将g-C₃N₄纳米片、PTCA和g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料进行FTIR，XRD，UV-vis表征，结果与实施例1一致。

5、电极修饰过程的ECL和循环伏安(CV)表征，结果与实施例1一致。

6、传感器工作条件的优化：K₂S₂O₈浓度，PBS的pH值和葡萄糖的孵育时间，结果与实施例1一致。

7、葡萄糖的检测，检测范围以及检测限与实施例1一致。

8、传感器的选择性，用与实施例1相同的方法进行检测，干扰物质并没有对测定5.0×10^-8mol/L的葡萄糖产生明显的干扰，这表明传感器具有良好的抗干扰性与高选择性。

9、传感器的稳定性和重现性，与实施例1结果一致。

10、回收实验，结果与实施例1一致。

综上，本发明以g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料作为ECL信号探针，利用葡萄糖和苯环化的右旋糖酐竞争ConA结合位点的竞争反应构建了一种新型无酶ECL葡萄糖传感器。传感器的制备及葡萄糖的检测原理示意于图7所示。此基于g-C₃N₄-PTCA纳米复合为ECL信号探针的无酶传感器，相比绝大多数无酶葡萄糖传感器而言，展现出了更低的检测限与更宽的线性范围。此外，此传感器还具有简易性、高灵敏性、良好的稳定性与重现性等优点。基于g-C₃N₄-PTCA优良的ECL性能与glucose-ConA-dextran竞争体系的结合，构建的非酶ECL葡萄糖传感器提供了一个有潜力的应用平台。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种无酶ECL葡萄糖传感器，其特征在于，主要由g-C₃N₄、PTCA、DexP和ConA制成。

2.根据权利要求1所述的无酶ECL葡萄糖传感器，其特征在于，所述g-C₃N₄为g-C₃N₄纳米片；

所述无酶ECL葡萄糖传感器通过以下方法制备：

先将g-C₃N₄纳米片与PTCA通过π–π堆积，制得g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料，并修饰于玻碳电极上；

再依次修饰DexP和ConA。

3.根据权利要求2所述的无酶ECL葡萄糖传感器，其特征在于，所述g-C₃N₄纳米片与PTCA以1:0.9-1.1的重量比进行堆积。

4.根据权利要求2所述的无酶ECL葡萄糖传感器，其特征在于，所述g-C₃N₄-PTCA的制备方法具体为：

将g-C₃N₄纳米片与PTCA分散在水中，超声7-9h，得到g-C₃N₄-PTCA复合材料。

5.根据权利要求4所述的无酶ECL葡萄糖传感器，其特征在于，

所述g-C₃N₄纳米片与PTCA的总重量与所述水的重量比为1:950-1050。

6.根据权利要求2所述的无酶ECL葡萄糖传感器，其特征在于，所述g-C₃N₄纳米片与PTCA堆积后得到g-C₃N₄-PTCA纳米复合材料，滴涂于预处理后的玻碳电极表面，于室温下晾干，然后修饰DexP；

所述DexP的体积与所述g-C₃N₄-PTCA的体积比为1:0.9-1.1。

7.根据权利要求6所述的无酶ECL葡萄糖传感器，其特征在于，修饰DexP 1h后修饰上Tween20，所述Tween20的体积与所述g-C₃N₄-PTCA的体积比为1:0.9-1.1。

8.根据权利要求6所述的无酶ECL葡萄糖传感器，其特征在于，玻碳电极的预处理方法为：将玻碳电极分别经0.25-0.35μm和0.04-0.06μm的Al₂O₃粉末抛光；

然后依次在蒸馏水、乙醇和二次蒸馏水中超声清洗，将清洗干净的玻碳电极置于室温下晾干即可；

优选地，所述玻碳电极的直径为3.5-4.5mm。

9.根据权利要求2所述的无酶ECL葡萄糖传感器，其特征在于，修饰ConA的具体方法为：将所述ConA滴涂在电极上，静置35-45min；

优选地，所述ConA的浓度为2.5-3.5mg/mL，所述ConA的体积与所述g-C₃N₄-PTCA复合材料的体积比为1:0.9-1.1。

10.根据权利要求1-9任一项所述的无酶ECL葡萄糖传感器，其特征在于，所述g-C₃N₄纳米片通过以下方法制备：

将三聚氰胺粉末以2.5-3.5℃/min的升温速率升温至595-605℃煅烧，煅烧的时间为2h，自然冷却至室温，生成黄色块状g-C₃N₄粉末；

取所述g-C₃N₄粉末分散于水中，超声9.5-10.5h，得到悬浊液；

将所述悬浊液离心，去除还未剥落的块状g-C₃N₄粉末，上层清液烘干即得所述g-C₃N₄纳米片。