CN1908669B - 血红蛋白芯片的制备及其电化学检测方法 - Google Patents
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Abstract
血红蛋白芯片的制备及其电化学检测方法涉及血红蛋白临床检测芯片的制备,尤其是结合电化学分析技术建立了血液中血红蛋白含量的测定方法。制备方法为:1).印刷碳电极制备:2).普鲁士蓝纳米粒子的制备与修饰:3).将制得的纳米粒子蒸发烘干后,溶于0.1M pH7.0磷酸盐缓冲溶液,并喷洒于印刷碳电极表面,冰箱中晾干备用。电化学检测方法为:1)测试条件的优化,a)还原态血红蛋白标准溶液制备:b)测量电位选择:c)缓冲溶液的pH值:2)标准曲线绘制:3)标准曲线校正。本发明利用电化学技术简便、易行、价廉的特点,结合纳米粒子的信号放大作用,建立了血液中血红蛋白含量检测的电化学方法,其操作简单、成本较低、分析速度快。
Description
技术领域
本发明涉及血红蛋白临床检测芯片的制备,尤其是结合电化学分析技术建立了血液中血红蛋白含量的测定方法。
背景技术
血红蛋白(Hemoglobin)是脊椎动物红细胞内的呼吸蛋白,是血液中运输氧气的主要物质,在生物体内起到传输氧气、分解H2O2、传递电子等与氧和能量代谢有关的重要活动,在一切生命活动中起着关键作用。血红蛋白的相对分子质量约为67000,其分子具有四级结构,是由两条α和两条β多肽链构成的四聚体,每个肽链上各结合有一个血红素分子,且相互接近,形成近似球形的血红蛋白分子,直径约为55nm。血红素位于肽链折叠形成的介电常数较低的疏水环境中,铁以共价键形式与卟啉的四个吡咯环中的N原子以及肽链中的组氨酸相连接,其结构非常类似于辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP),因此表现出很高的类过氧化物酶催化活性。人血中血红蛋白含量的测定是临床检测的一个重要内容,正常人血中血红蛋白的含量在100-200g/L范围之内。若血红蛋白的含量降低则有可能是各种原因造成的贫血,而其含量相对增多则主要是由子大量体液和血浆丢失,如脱水、红细胞生成素瘤等。因此对血红蛋白含量的准确测定在临床医学上具有非常重要的意义。
此外血红蛋白分子中的β-链末端氨基能与血液中的葡萄糖分子发生非酶反应生成糖化血红蛋白(HbAlc),且反应量随着血液中葡萄糖浓度的增加而增加。即血液中葡萄糖浓度越大,则红血球中HbAlc的含量就越大,因此红血球中HbAlc含量高低反映了血液中葡萄糖的水平。由于人体内红血球的寿命大约为100-120天,因此临床上测定HbAlc含量可确定过去2-3个月内糖尿病患者血糖的控制水平。保持正常或接近正常的血糖水平,有助于糖尿病患者防止由于血糖的升高引发的失明、肾、神经以及心脑血管并发症,因此快速、灵敏、准确可靠地检测血液中糖化血红蛋白的含量对糖尿病患者血糖水平的中长期控制以及糖尿病的早期预警具有重要的实践意义。通常HbAlc的含量用HbAlc占血液中血红蛋白总量的百分比来表示,临床上HbAlc含量的参考值为5-20%,并认为4-6%是正常的。因此运用先进的科学技术发展高效、灵敏、准确的分析方法,实现血红蛋白与糖化血红蛋白的定期快速检测,受到各国科学工作者的广泛关注。
目前,有很多光谱方法已被成功地用于血红蛋白的测定,其中最常用的方法为Drabkin试剂法,首先用铁氰化钾将血液中的血红蛋白全部转化为高价血红蛋白,然后高价血红蛋白与氰根络合形成有色产物并在540nm处有最大吸收。其它的光谱方法都是依据血红蛋白的类过氧化物酶特性,通过其在过氧化氢存在时催化TMB的氧化实现的。所有这些方法需要专门的试剂和光谱仪器,操作繁杂,成本高,不利于推广使用。相比较而言,电化学分析技术具有许多优越性,如测试探头可微型化,不受体系浊度和颜色影响,方法灵敏度高、速度快、花费低、危害小等。它还具有检测仪器简单、易于微型化的特点,线性范围宽、灵敏度高,因而可直接将检测信号转换为直观易读的浓度值,便于非专业人士使用等。
发明内容
技术问题:本发明目的是提供一种血红蛋白芯片的制备及其电化学检测方法,制备灵敏、价廉的一次性血红蛋白检测芯片,建立一种血液中血红蛋白含量检测的电化学方法。利用电化学分析简便、易行、价廉的特点,结合纳米粒子的信号放大作用,发展高效、灵敏、快速、准确的血红蛋白检测新技术,为疾病的筛查、临床诊断与治疗提供新途径。
技术方案:本发明首先利用丝网印刷技术在PVC基质表面制备包含工作电极、辅助电极及参比电极的一次性电极芯片。结合纳米粒子的信号放大作用,利用还原态血红蛋白与固定化电活性纳米粒子反应生成的电化学活性物质的安培响应,建立了一种血液中血红蛋白的电化学芯片检测方法。
由于纳米粒子的比表面大,且表面覆盖一薄层弱正电性聚合物膜,与还原态血红蛋白分子具有一定的相互作用,使溶液中的血红蛋白分子易于靠近电极表面,并与纳米普鲁士蓝的氧化态发生氧化-还原反应生成普鲁士蓝的还原态,根据普鲁士蓝的还原态在电极上产生的氧化电流可测定血红蛋白的含量。
利用电化学技术简便、易行、价廉的特点,结合纳米粒子的信号放大作用,制备用于血红蛋白检测的一次性电化学芯片,实现血液中血红蛋白的安培检测。
血红蛋白电化学检测芯片的制备方法为:
1).印刷碳电极制备:选用PVC材料作为基质,在其上刻出轨道,用NaOH溶液和去离子水彻底地清洗,干燥后刷上银浆作导电用,再用聚乙烯醇,超细石墨粉,纤维素二醋酸盐制成的石墨墨水印刷在上述的银浆轨道上,将电极用硅胶橡皮层覆盖,只暴露导电的终端,制成印刷碳电极,
2).普鲁士蓝纳米粒子的制备与修饰:选择表面带弱正电性的聚乙烯吡咯酮K-30为稳定剂,加入到六氰合铁酸钾溶液中,在不断搅拌的情况下缓慢滴加等量氯化亚铁溶液,滴加完成后继续搅拌得聚乙烯吡咯酮包裹的普鲁士兰纳米粒子,
3).将制得的纳米粒子蒸发烘干后,溶于溶于0.1M、pH6.5-7.4磷酸盐缓冲溶液,并喷洒于印刷碳电极表面,冰箱中晾干备用。
电化学检测方法为:
1)测试条件的优化,
a)还原态血红蛋白标准溶液制备:将氧化态的血红蛋白用化学方法将其转化为还原态血红蛋白,并用光谱方法准确测量其含量;
b)测量电位选择:同一芯片,在其上滴一滴已知浓度的还原态血红蛋白标准溶液,改变不同电位测量氧化电流的变化,寻找测定最佳电位,以获得最优的检测范围和灵敏度;
c)缓冲溶液的pH值:血红蛋白在人体正常pH条件,才具有最佳活性,因此配制血红蛋白标准液及纳米粒子稀释液应尽量选用中性或微酸性溶液;
2)标准曲线绘制:印刷碳电极上的电流响应信号与基底电极制备及纳米粒子修饰过程有关,绘制不同情况下的标准曲线并进行必要的校正,
a)用同一芯片测定不同浓度血红蛋白标准溶液的氧化电流,绘制标准曲线,确定最优的线性范围;
b)用同一批次印刷电极,同一批次或不同批次纳米粒子修饰芯片测定不同浓度血红蛋白标准溶液,绘制标准曲线;
c)用不同批次印刷电极,同一批次或不同批次纳米粒子修饰芯片测定不同浓度血红蛋白标准溶液,绘制标准曲线;
3)标准曲线校正:使用同一批次与不同批次的不同的芯片,对血液样品中的血红蛋白浓度进行检测,从相应的标准曲线读出血红蛋白浓度,通过与临床检测数值及标准方法测定的数值比较,得出相关系数并对相应的标准曲线进行校正。
有益效果:本发明利用电化学分析简便、易行、价廉的特点,以碳、银桨为导电材料,结合纳米粒子的信息放大作用,建立了一种血液中血红蛋白浓度的电化学芯片检测方法,为疾病的筛查、临床诊断与治疗提供新途径。该方法较现有的血红蛋白分析方法,具有以下优点:
(1)利用固定化普鲁士蓝纳米粒子的氧化态与还原态血红蛋白分子发生氧化-还原反应生成普鲁士蓝的还原态,并根据普鲁士蓝的还原态在电极上产生的氧化电流测定血红蛋白的含量。测试过程不需添加如何试剂,消除了Drabkin试剂、TMB的高毒性对测试人员带来的危害,具有很好的应用前景。
(2)该方法表现出很好的精确性、重复性和稳定性,制备方法简单,检测成本较现有的测定方法,要低得多。
(3)电化学检测芯片的生产成本低,利润和市场空间巨大。
(4)电化学仪器操作简便灵活、成本较低、分析速度快,适用于临床快速检测。
本发明通过合成具有电化学活性的纳米粒子并将其固定在印刷碳电极表面,该纳米粒子表面覆盖有一薄层弱正电性聚合物膜,能与还原性物质发生氧化-还原反应,并根据生成的电活性物质进行安培检测。该材料合成方法简单,且具有低毒性、水溶性以及良好的化学稳定性和生物兼容性,将它与印刷碳电极结合,构建纳米修饰电极用于血液中血红蛋白含量的测定具有高灵敏度和选择性,具有很好的应用前景。由于电化学检测操作简单、成本较低、分析速度快,可望实现临床血红蛋白的快速测定以及将糖化血红蛋白分离洗脱后进行快速测定,为糖尿病患者血糖水平的中长期控制提供依据,为疾病的临床诊断与治疗提供了新途径。
具体实施方式
普鲁士蓝纳米粒子的制备
普鲁士篮纳米粒子的大小和性质与其制备过程有关。本发明选择表面带弱正电性的聚乙烯吡咯酮K-30为稳定剂,加入到0.1mol/L的六氰合铁酸钾溶液中,并在搅拌情况下缓慢滴加等量氯化亚铁溶液,滴加完成后继续搅拌5小时得聚乙烯吡咯酮包裹的普鲁士兰纳米粒子。
印刷碳电极制备
(1)选用PVC材料作为基质,在其上刻出1mm×3cm的轨道,用NaOH溶液和去离子水彻底地清洗,干燥后刷上银浆作导电用。
(2)将用聚乙烯醇,超细石墨粉,纤维素二醋酸盐制成的石墨墨水印刷在上述的银浆轨道上,形成印刷碳电极。
(3)将电极用硅胶橡皮层覆盖,只暴露导电的终端(工作表面是9平方毫米)。其中心圆点为碳糊电极,左侧银白色部分为Ag/AgCl参比电极,右侧是辅助电极。
(4)将上述普鲁士蓝纳米粒子溶于溶于0.1M、pH6.5-7.4的磷酸盐缓冲溶液,取2微升点在印刷碳电极表面,4℃干燥备用。
血液中血红蛋白的电化学检测
(1)测试条件的优化,包括以下三个方面:
a)还原态血红蛋白标准溶液制备:人体血液中的血红蛋白99%以还原态存在,而市场上获得的血红蛋白常为氧化态,因此需要化学方法将其转化为还原态血红蛋白,并用光谱方法准确测量其含量。
b)测量电位选择:同一芯片,在其上滴一滴已知浓度的还原态血红蛋白标准溶液,改变不同电位测量氧化电流的变化,寻找测定最佳电位,以获得最优的检测范围和灵敏度。
c)缓冲溶液的pH值:血红蛋白在人体正常pH条件在才具有最佳活性,因此配制血红蛋白标准液及纳米粒子稀释液应尽量选用中性或微酸性溶液。
(2)标准曲线绘制:印刷碳电极上的电流响应信号与基底电极制备及纳米粒子修饰过程有关,不同批次制备的电极在同一血红蛋白浓度给出的电流信号并不相同。绘制不同情况下的标准曲线并进行必要的校正,可提高分析的正确性和准确性。
a)用同一芯片测定不同浓度血红蛋白标准溶液的氧化电流,绘制标准曲线,确定最优的线性范围。
b)用同一批次印刷电极,同一批次或不同批次纳米粒子修饰芯片测定不同浓度血红蛋白标准溶液,绘制标准曲线。
c)用不同批次印刷电极,同一批次或不同批次纳米粒子修饰芯片测定不同浓度血红蛋白标准溶液,绘制标准曲线。
(3)标准曲线校正:使用不同的芯片(同一批次与不同批次)对血液样品中的血红蛋白浓度进行检测,从相应的标准曲线读出血红蛋白浓度,通过与临床检测数值及标准方法测定的数值比较,得出相关系数并对相应的标准曲线进行校正,提高检测的正确性与准确性。
以下以聚乙烯吡咯酮K-30稳定的普鲁士蓝纳米粒子修饰印刷碳电极测定血液中血红蛋白为例:
1.纳米普鲁士蓝修饰印刷碳电极制备
(1)印刷碳电极制备:选用PVC材料作为基质,在其上刻出1mm×3cm的轨道,用NaOH溶液和去离子水彻底地清洗,干燥后刷上银浆作导电用。将用聚乙烯醇,超细石墨粉,纤维素二醋酸盐制成的石墨墨水印刷在上述的银浆轨道上,将电极用硅胶橡皮层覆盖,只暴露导电的终端(工作表面是9平方毫米)。
(2)普鲁士蓝纳米粒子的制备与修饰:
选择表面带弱正电性的聚乙烯吡咯酮K-30为稳定剂,加入到0.1mol/L的六氰合铁酸钾溶液中,浓度为0.1%~5%,在不断搅拌的情况下缓慢滴加等量氯化亚铁溶液,滴加完成后继续搅拌5小时得聚乙烯吡咯酮包裹的普鲁士兰纳米粒子,并用透射电子显微镜观察其形貌和粒径大小。结果表明,聚乙烯吡咯酮浓度为1%,滴加速度为20秒/滴,得到的纳米粒子形状最规则,且粒径分布90%以上为18nm。
将制得的纳米粒子蒸发烘干后,溶于0.1M pH7.0磷酸盐缓冲溶液。喷洒2微升5mg/mL纳米粒子稀释液于工作电极表面并使其完全覆盖,4℃冰箱中晾干备用。
2.测试条件的优化
a)还原态血红蛋白标准溶液制备:人体血液中的血红蛋白99%以还原态存在,而市场上获得的血红蛋白常为氧化态,因此需要化学方法将其转化为还原态血红蛋白,并用光谱方法准确测量其含量。称取一定量血红蛋白固体溶解于0.1M pH7.0磷酸盐缓冲溶液中,加入足量连二亚硫酸钠固体,静置1分钟后将溶液转移至PD-10分离柱中,收集中间部分颜色较深的液体待用。
b)测量电位选择:同一芯片,在其上滴一滴已知浓度的还原态血红蛋白标准溶液,改变不同电位测量氧化电流的变化,寻找测定最佳电位,以获得最优的检测范围和灵敏度。实验结果表明,施加电位在0.35V时有最大的电流响应。
c)缓冲溶液的pH值:血红蛋白在人体正常pH条件在才具有最佳活性,并与普鲁士蓝反应给出最大的电信号。实验结果表明,在稀释液pH6.5-7.4范围内电极给出最大响应,因此我们选用pH7.0的磷酸盐缓冲液作为稀释液。
3.标准曲线绘制
取同一批次制得的10根纳米修饰电极,测定同一血红蛋白标准溶液在0.35V的电流,验证电极的重复性。另取同一批次制得的10根纳米修饰电极,测定不同血红蛋白浓度在0.35 V的电流响应,绘制标准曲线。
实验结果表明,同一批次制得的纳米电极间具有很好的重复性,对同一血红蛋白浓度的测量误差小于7%,且在血红蛋白浓度50g/L~400g/L范围内呈线性关系。
4.血液样品中血红蛋白含量检测
在优化的实验条件下,测定全血样品的电化学响应,根据电流值从标准曲线上读出血红蛋白浓度,并与标准方法测定值比较校正。利用本发明测量的100个样品的血红蛋白值与标准方法对比,测定的结果具有良好的一致性。
Claims (1)
1.一种血红蛋白电化学检测芯片的制备方法,其特征在于制备的方法为:
1).印刷碳电极制备:选用PVC材料作为基质,在其上刻出轨道,用NaOH溶液和去离子水彻底地清洗,干燥后刷上银浆作导电用,再用聚乙烯醇,超细石墨粉,纤维素二醋酸盐制成的石墨墨水印刷在上述的银浆轨道上,将电极用硅胶橡皮层覆盖,只暴露导电的终端,制成印刷碳电极,
2).普鲁士蓝纳米粒子的制备与修饰:选择表面带弱正电性的聚乙烯吡咯酮K-30为稳定剂,加入到六氰合铁酸钾溶液中,在不断搅拌的情况下缓慢滴加等量氯化亚铁溶液,滴加完成后继续搅拌得聚乙烯吡咯酮包裹的普鲁士兰纳米粒子,
3).将制得的纳米粒子蒸发烘干后,溶于0.1M、pH 6.5-7.4磷酸盐缓冲溶液,并喷洒于印刷碳电极表面,冰箱中晾干备用。
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