TW201702261A - 一種融合多肽 - Google Patents

Abstract

一種融合多肽具有催化葡萄糖氧化還原能力，其中該融合多肽包含一胺基酸序列，該胺基酸序列中包含γ-次單元，具有SEQ ID No. 1、α-次單元，具有SEQ ID No.2 、β-次單元，具有SEQ ID No. 3以及兩個由5-15個胺基酸所組成之鍵結片段，分別連接γ-次單元、α-次單元以及β-次單元，或1至5個胺基酸殘基被取代、刪除、附加、插入或/及加成之該胺基酸序列。

Description

一種融合多肽

本發明係關於一種融合多肽。尤其，係指一種葡萄糖去氫酵素融合多肽。

葡萄糖去氫酵素〈glucose dehydrogenase, GDH〉為一常見生物酵素，其可應用於血糖偵測器，當作主要偵測元件之一，因為葡萄糖與NAD 經GDH 反應生成NADH，藉由量測NADH 可以回推換算得到血糖濃度。通常血糖偵測器中的葡萄糖去氫酵素來自真菌及細菌。

就酵素之蛋白質基本結構來說，大多數酵素是藉由共價鍵結的方式連結兩個單體而以雙體表現其蛋白質的特性。在葡萄糖去氫酵素對血糖之催化反應，過程中需聯用不同輔酶當作電子轉移之媒介，輔酶包含吡咯喹啉醌葡萄糖去氫酵素〈PQQ-GDH〉、黃素腺嘌呤二核苷酸葡萄糖去氫酶〈FAD-GDH〉及煙醯胺腺嘌呤二核苷酸葡萄糖去氫酵素〈NAD-GDH〉。血糖透過聯用輔酶以及葡萄糖去氫酵素催化脫氫，但是此機制還需要NAD+的參與，反應才能進行。如果使用quinoprotein glucose dehydrogenase 〈quinoprotein GDH〉，則不需要氧氣也不需要NAD+的參與即可測量血糖濃度。Quinoprotein GDH 是一類特別的酵素，它在鄰醌類 〈orthoquinone〉 的參與下，可以廣泛地氧化多種醇類與胺類。對quinoprotein GDH而言，可使用pyrroloquinoline quinine 〈PQQ〉 參與血糖催化反應。反應式為:葡萄糖+ PQQ(氧化)－quinoprotein–GDH →葡萄糖酸內脂 〈gluconolactone〉 + PQQ(還原)。

從催化反應機制來看，催化位置在C₁ 的羥基 。催化反應主要可分為兩種機制：一是加成離去反應，而另一種反應為氫轉移 〈hydrogen transfer〉，不過兩種反應機制皆需藉葡萄糖去氫酵素本身所擁有的輔酶或外加的輔酶負責電子轉移。已知可用來測量血糖濃度之酵素各有其優劣，例如，葡萄糖氧化酵素〈glucose oxidase, GOD〉對葡萄糖特異性高，不受其他糖類物質干擾，但是葡萄糖氧化酵素易受氧氣干擾。利用葡萄糖去氫酵素為偵測元件的血糖儀無需氧的參與，不受氧氣干擾。細菌的PQQ-GDH 不能區分麥芽糖、半乳糖等糖類物質與葡萄糖，但是PQQ-GDH之活性相對較高。真菌的FAD-GDH 不能區分木糖與葡萄糖，且活性較低。而細菌的FAD-GDH不能區分麥芽糖與葡萄糖但活性較高，且細菌的FAD-GDH可直接放出電子，不需經過電子傳導媒介。目前市售葡萄糖催化酵素是以葡萄糖氧化酵素、PQQ-GDH和真菌的FAD-GDH為主，因此會有對葡萄糖專一性不足或易受其他物質干擾測量結果的問題。

利用葡萄糖去氫酵素為偵測元件的血糖儀可不受氧氣干擾，但是去氫酵素包含至少三個單體，習知的去氫酵素合成方法先將單體各自由載體表現，再利用各單體間的凡德瓦力(Van der waals force)相互吸引，然單體在不同載體中的表現難以控制，且單體間的凡德瓦力在經過後續步驟，如純化步驟，單體間的結合狀況亦不清楚，這些不確定因素皆會影響酵素的葡萄糖氧化還原能力。

鑑於上述課題，本發明旨在提供一種融合多肽具有催化葡萄糖氧化還原能力，其中該融合多肽包含一胺基酸序列，該胺基酸序列中包含γ-次單元，具有SEQ ID No. 1、α-次單元，具有SEQ ID No.2 、β-次單元，具有SEQ ID No. 3以及兩個由5-15個胺基酸所組成之鍵結片段，分別連接γ-次單元、α-次單元以及β-次單元，或1至5個胺基酸殘基被取代、刪除、附加、插入或/及加成之該胺基酸序列。

根據本發明部分實施例，三個次單元藉由鍵結片段，融合形成一單一蛋白質，可增加酵素對葡萄糖的專一性，且在不同溫度下仍具有高度穩定性，單一蛋白質的純化製程更為簡易，使得酵素可快速大量製備，可作為血糖濃度測量儀主要偵測元件。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。以下所揭露的各實施例，在有益的情形下可相互組合或取代，也可在一實施例中附加其他的實施例，而無須進一步的記載或說明。在以下描述中，將詳細敘述許多特定細節以使讀者能夠充分理解以下的實施例。然而，可在無此等特定細節之情況下實踐本發明之實施例。

葡萄糖去氫酵素〈glucose dehydrogenase, GDH〉可用於生物感測器〈biosensors〉，屬於催化型〈catalysis〉生物辨識元件。利用葡萄糖去氫酵素之催化能力與目標物選擇性，可偵測血糖代謝所產生之變化或代謝產物，再將訊號轉換成電子信號後以數據方式呈現。根據本發明部分實施例，提供一種具有催化葡萄糖氧化還原反應之融合多肽，其原始序列來源物種為Burkholderia cepacia 。以下所提及之蛋白質、修飾蛋白質、變異體等皆以原始序列為基礎。

請參考第1圖。第1 圖係根據本發明部分實施例之一融合多肽示意圖。一融合多肽10包含三個次單元11、13及15，融合多肽10還包含兩鍵結片段17、19，各自將三個次單元11、13及15結合形成單一蛋白質，可具有催化葡萄糖去氫反應之活性。融合多肽10因鍵結片段組合不同，其平均總分子量介於121,000至126,000道爾吞之間〈121kDa – 126kDa〉。本發明之融合多肽包含一胺基酸序列，將次單元融合於單一胺基酸序列，使得去氫酵素各單體可透過一次性的表現即形成蛋白質結構，免去各個單體在載體上分開表現的不穩定性，可確保去氫酵素的功能性且增加去氫酵素於表現質體上的產量。根據本發明部分實施例，融合多肽10其中一次單元為γ-次單元11，γ-次單元11由約169個胺基酸組成，平均分子量約為18,000道爾吞〈18kDa〉。γ-次單元11具有胺基酸序列SEQ ID No. 1。γ-次單元11之較佳核苷酸序列可參考SEQ ID No. 4，但不限於此。限制酵素切點未示於胺基酸序列SEQ ID No. 1，僅以轉譯起始位置表示。γ-次單元11主要功能為幫助融合多肽10之另一次單元，也就是α-次單元13蛋白質摺疊。

融合多肽10包含另一次單元為α-次單元13，α-次單元13為催化葡萄糖氧氧化還原的主要反應中心，也可具有催化膽鹼去氫反應之活性。α-次單元13由約539個胺基酸組成，平均分子量約為60,000道爾吞〈60kDa〉。根據本發明部分實施例，α-次單元13之胺基酸序列可為SEQ ID No. 2，較佳核苷酸序列可見SEQ ID No. 5，但不限於此。根據本發明部分實施例，α-次單元13可以為膽鹼去氫酵素變異體，為了增加融合多肽10對於葡萄糖之選擇性，進一步對習知之膽鹼去氫酵素修飾，可增加融合多肽10對於葡萄糖的專一性。對於α-次單元13的修飾分別發生在SEQ ID No. 2位置326之絲胺酸轉換為榖氨醯胺〈Gln〉，以及SEQ ID No. 2位置365之絲胺酸轉換為酪胺酸〈Tyr〉。透過進一步修飾α-次單元13可有效提升融合多肽10對葡萄糖的選擇性，而不受其他糖類干擾，產生接近實際血糖濃度的電子訊號。

融合多肽10還包含另一次單元，β-次單元15。β-次單元15由約415個胺基酸組成，平均分子量約為43,000道爾吞〈43kDa〉。根據本發明部分實施例，β-次單元15之胺基酸序列表可見SEQ ID No. 3，較佳核苷酸序列表可見SEQ ID No. 6，但不限於此。β-次單元15主要功能為催化反應中的電子傳遞中心。β-次單元15於表現載體中具有6個組胺酸標記，因此由SEQ ID No. 3換算出的核苷酸序列數目會多於SEQ ID No. 6數目。

融合多肽10為γ-、α-及β-次單元11、13、15共同組成，藉由兩個鍵結片段〈linker〉17、19相連接。根據本發明部分實施例，融合多肽10之三個次單元順序為γ-次單元11、α-次單元13及β-次單元15，換言之，其胺基酸序列可由SEQ ID No. 1、鍵結片段17、SEQ ID No. 2、鍵結片段19與SEQ ID No. 3依序連接。

根據本發明部分實施例，兩個鍵結片段17、19可由5至15個胺基酸組成，α-次單元13外露的兩端鏈長可決定所使用的鍵結片段17、19的胺基酸長度或種類。透過鍵結片段17，γ-次單元11與α-次單元13結合，中間透過鍵結片段17可與數個，如5個，來自α-次單元13的胺基酸產生鍵結。α-次單元另一端的4個胺基酸與鍵結片段19結合，β-次單元再連接至鍵結片段19的自由端，形成融合多肽10同時包含三個單體的結構。由三個蛋白質單體融合成單一蛋白質形態的融合多肽10之平均分子量介於121,000至126,000道爾吞〈121-126kDa〉。

根據本發明部分實施例，鍵結片段17、19可皆為8個甘胺酸〈Gly〉所構成的鏈狀肽，核苷酸序列可為SEQ ID No. 7。鍵結片段17、19亦可具有不同長度，例如，鍵結片段17、19可為6個甘胺酸所組成。另外，鍵結片段亦可由不同胺基酸組成，例如，由甘胺酸與絲胺酸組成之(Gly)₄ -Ser結構，此片段需重複至少兩次以上。也就是說，鍵結片段17、19可具有一胺基酸序列[(Gly)₄ -Ser]₂ ，或一胺基酸序列[(Gly)₄ -Ser]₃ 。鍵結片段17、19可具有不同長度及組合之胺基酸序列，例如，鍵結片段17可以由(Gly)₆ 所組成，而鍵結片段19可以由[(Gly)₄ -Ser]₂ 所組成。產生鍵結片段17、19中之甘胺酸的核苷酸序列為GGX，X可為T、A、C或G。產生鍵結片段17、19中之絲胺酸的核苷酸序列可為TCT。

融合多肽10可透過習知之蛋白質表現方式大量生產製造。首先，合成γ-、α-、β-次單元以及兩鍵結片段的基因，將重組基因植入蛋白質表現載體，將載體植入可表現之宿主細胞，例如BL21大腸桿菌，即可大量生產融合多肽10。此蛋白質表現方式為本領域具有通常技藝者熟知，故不多作贅述。

為促使融合多肽10在宿主細胞中大量表現，γ-、α-、β-次單元之核苷酸序列可依宿主細胞特性修飾。例如，若使用大腸桿菌為宿主細胞，次單元重組基因編碼須考慮大腸桿菌密碼子出現頻率、模式等因素，以提供融合多肽10產能之最大效益。

請參考第2圖。第2圖係根據本發明實施例的一種融合多肽蛋白質轉漬法圖示。融合多肽10的合成蛋白質結構經過載體表現，形成具有6個組胺酸標籤的融合酵素，將細胞溶解之後，經過組胺酸標籤鍵結，經過兩次清洗，第一次清洗為組胺酸鍵結反應後六小時，蒐集第一溶出液。再進行第二次清洗，蒐集第二溶出液，最後進行蛋白質轉漬〈western blotting〉分析。蛋白質轉漬法圖示20上第一欄為蛋白質尺標21、第二欄為第一清洗液23、第三欄為第二清洗液25、第四欄為第一溶出液27、第五欄為第二溶出液29。由蛋白質轉漬法圖示20可以發現，第一或第二清洗液23、25中，並不包含可被偵測的融合酵素。第一、第二溶出液25、27則明顯包含分子量約為123,000道爾吞〈123kDa〉的析出物，此析出物即為組胺酸標籤之融合酵素。

溫度為影響葡萄糖去氫酵素表現之重要因素，不同溫度會影響葡萄糖去氫酵素穩定度，尤其在較高環溫下，甚至會出現偽陽性結果。請參考第3A圖與第3B圖。根據本發明部分實施例，融合多肽10與市售葡萄糖去氫酵素在不同溫度環境下比較其穩定度，第3A圖為經過市售酵素催化反應之血糖，在不同溫度，經過2分鐘及4分鐘反應後，對二氯酚靛酚〈DCPIP〉的相對吸光值(實驗組吸光值扣除對照組吸光值)實驗結果長條圖。從第3A圖可見，在環溫37°C下，相對吸光值最高，代表市售酵素對葡萄糖的催化反應效果最劇烈，當溫度降至25°C，相對吸光值大量減少。例如，在反應2分鐘後，37°C的相對吸光值約為0.24，然而在25°C的環境下，反應2分鐘後，相對吸光值降至0.15，其中差距將近四成。在其他條件不變的前提，環溫為15°C時，相對吸光值大幅降至約0.01，顯見市售葡萄糖去氫酵素對於溫度相當敏感，嚴重影響血糖濃度判讀。

請續參考第3B圖。第3B圖為經過融合多肽10催化反應之血糖，在不同溫度，經過2分鐘及4分鐘反應後，對二氯酚靛酚〈DCPIP〉的相對吸光值實驗結果長條圖。從第3B圖可見，在環溫37°C下，相對吸光值仍為最高，但是在25°C、20°C以及15°C的環溫下，相對吸光值相較於37°C變化差異不大，僅在0.04之範圍內游移。由此可見，融合多肽10不易受環溫影響其酵素功能，可準確提供血糖濃度數值。

根據本發明部分實施例，融合多肽10在木糖與葡萄糖之間的選擇性高，且對於麥芽糖的活性相較於市售酵素也降低，代表融合多肽10對葡萄糖之專一性提升，運用於生物偵測時的準確度提高。

根據本發明部分實施例，融合多肽10可用於血糖測試儀。血糖測試儀主要偵測元件包含一基板，將融合多肽10設置於基板之上，並維持其活性，將受測物放置於基板上，經過融合多肽10催化電子傳遞，葡萄糖氧化，將受測物中葡萄糖變化量轉換成電子訊號，輸出為可讀訊息，即可得知受測物之血糖濃度。

本發明提供之融合多肽為一蛋白質複合物，三個次單元經由基因重組，並分別由兩個鍵結片段連結。再透過蛋白質表現載體於宿主細胞內大量表現。且純化後所蒐集之融合多肽對葡萄糖展現高度選擇性，不受木糖或麥芽糖等其他糖類影響，在不同溫度下其葡萄糖去氫酵素功能維持穩定，可廣泛應用於生物偵測儀，不僅生產方式簡易快速，且可提供更精準的數值。

雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

10‧‧‧融合酵素
11‧‧‧γ-次單元
13‧‧‧α-次單元
15‧‧‧β-次單元
17‧‧‧鍵結片段
19‧‧‧鍵結片段
20‧‧‧蛋白質轉漬圖示
21‧‧‧蛋白質尺規
23‧‧‧第一清洗液
25‧‧‧第二清洗液
27‧‧‧第一溶出液
29‧‧‧第二溶出液

本發明之上述和其他態樣以及特徵請參照說明書內容並配合附加圖式得到更清楚的了解，其中： ﹝第1圖﹞係繪示依照本發明之實施方式的一種融合多肽示意圖。 ﹝第2圖﹞係根據本發明實施例的一種融合多肽蛋白質轉漬法圖示。 ﹝第3A圖﹞係繪示一市售酵素在不同溫度下之穩定度。 ﹝第3B圖﹞係繪示根據本發明實施例的一種融合多肽在不同溫度下之穩定度。

＜110＞ 達爾生技股份有限公司、國立中央大學   ＜120＞ 一種融合多肽   ＜141＞ 〈本案申請日〉   ＜150＞ US 62/192,074 ＜151＞ 2015/07/14   ＜160＞ 7         ＜210＞ 1 ＜211＞ 169 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工   ＜220＞   ＜400＞ 1   Met Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg His Gly Asp Ala 1                 5                      10              15 Ala Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln Gly Ala Leu Ala             20                      25              30 Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu Arg Ala Leu Ala         35                  40                  45 Asp Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met Thr Leu Ser Glu      50                   55                 60 Ser Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile Gly Glu Arg Leu 65                   70                 75                   80 Leu Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala Asp Ser Leu Pro                  85                  90                  95 Gln Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr Pro Glu Gln Glu 100                 105                 110 Ser Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu Gly Ile Val Asp         105                  120                 125 Asn Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe Gly Val Val Ser     130                 135                140 Asp Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys Pro Gly Phe Trp 145                 150                 155                 160 Ala Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala      165                        ＜210＞ 2 ＜211＞ 539 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工   ＜220＞   ＜400＞ 2   Met Ala Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser 1                 5                   10                 15 Gly Val Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys             20                  25                  30 Ala Val Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile         35                  40                  45 Val Glu Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro      50                  55                  60 Tyr Pro Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn 65                   70                  75                   80 Asp Tyr Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile                  85                  90                  95 Arg Ala Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg 100                 105                 110 Phe Ile Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg         105                  120                 125 Asp Trp Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala     130                 135                140 Glu Glu Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr 145                 150                 155                 160 Ser Pro Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe                 165                 170                175 Asn Glu Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe             180                 185                  190 His Val Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly         195                 200                 205 Arg Pro Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile 210                 215                 220 Gly Ala Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala 225                  230                 235                 240 Gly Ala Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly                 245                  250                 255 Pro Asp Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala             260                 265                 270 Glu His Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile         275                 280                 285 Glu Thr Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn      290                295                 300 Gly Val Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His 305                 310                 315                  320 Pro Gly Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly                 325                  330                 335 Arg Gly Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro             340                 345                 350 Phe Arg Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser         355                 360                365 Arg Ile Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met     370                 375                 380 Lys Pro Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr 385                 390                 395                 400 Val Gln Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg                 405                  410                 415 Ile Val Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro             420                 425                 430 Glu Ile Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His         435                 440                 435 Thr Arg Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp     450                 455                 460 Val Val Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser 465                  470                475                 480 Thr Ile Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys                 485                  490                495 Arg Thr Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met             500                 505                 510 Pro Thr Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala         515                 520                 525 Leu Arg Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val     530                 535     ＜210＞ 3 ＜211＞ 415 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工   ＜220＞   ＜400＞ 3   Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala 1                 5                  10                  15 Thr Ala Gly Asp Cys Met Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro             20                  25                 30 Tyr Ala Gly Gly Leu Gly Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys Ile Tyr         35                   40                 45 Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Ile Gly Lys Trp Thr      50                  55                  60 Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His Gly Val Ser Lys Asn Gly 65                   70                 75                   80 Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val Ser Tyr Ala Lys Ile Thr                  85                  90                  95 Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr Phe Met His Gly Val Glu          100                 95                 110 Pro Ala Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu Ile Pro Ala Leu Leu Ser         115                 120                 125 Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp Leu Phe Leu Lys Asp Gly     130                 135                140 Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala Glu Trp Asn Arg Gly Ala 145                 150                 155                 160 Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser Thr Cys His Thr Pro Arg                  165                170                 175 Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp Glu Thr Gly Gly Ser Phe             180                 185                190 Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp Gly Tyr Asn Ile Thr Ser         195                 200                205 Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr Gln Gln Gln Leu Val Gln     210                  215               220 Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val Ala Gln Ala Ala Gly Pro 225                  230                 235                 240 Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser Lys Met Thr Glu Ala Asp                 245                  250                 255 Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr Val Pro Ala Val Ala Asp             260                 265                 270 Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp Gly Lys Pro Ala Glu Asp         275                 280                 285 Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala Ser Ser Gly Ile Asp Pro      290                295                 300 Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr Cys His Gln Met Gln Gly 305                 310                 315                 320 Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser Leu Phe His Asn Ser Thr                 325                  330                 335 Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val Gln Val Ile Leu Asn Gly             340                 345                 350 Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile Gly Met Pro Ala Phe Arg         355                 360                 365 Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala Leu Thr Asn Tyr Val Thr     370                 375                 380 Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val Thr Glu Gln Asp Val Ala 385                 390                 395                 400 Lys Leu Arg Thr Ser Glu Phe Leu Glu His His His His His His 405                 410                415     ＜210＞ 4 ＜211＞ 507 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工   ＜220＞   ＜400＞ 4   atgatgcaca acgataacac ccctcatagt cgccgtcatg gtgacgcagc agccagcggc        60 attacacgcc gtcagtggct gcaaggtgcc ttagcactga cagcagcagg cctgaccggc       120 agtttaacct tacgtgccct ggccgacaat cctggtacag ccccgctgga caccttcatg       180 accctgagtg agagcttaac cggcaagaag ggtctgagtc gcgtgattgg tgagcgtctg       240 ctgcaagcct tacagaaggg cagctttaag acagcagaca gcctgccgca attagcaggc       300 gcactggcca gcggtagcct gacacctgag caggagagtc tggccttaac cattctggag       360 gcctggtacc tgggcatcgt ggacaacgtg gttatcacct acgaagaggc cttaatgttc       420 ggtgtggtga gcgatacact ggttatccgc agctactgcc cgaataaacc tggcttctgg       480 gcagacaagc cgatcgagcg ccaagca                                           507     ＜210＞ 5 ＜211＞ 1617 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工   ＜220＞   ＜400＞ 5   atggcagata cagacacaca gaaggccgac gttgttgttg tgggcagcgg cgttgccggt        60 gcaatcgttg cccatcagct ggcgatggcg ggtaaggccg ttattctgct ggaggcaggc       120 cctcgtatgc ctcgctggga gattgttgag cgctttcgca accaaccgga taagatggac       180 tttatggccc cgtacccgag tagtccttgg gcccctcatc cggagtacgg tcctccgaat       240 gactatttaa ttctgaaggg cgagcacaaa tttaacagtc agtatatccg cgccgttggt       300 ggcaccacct ggcattgggc agcaagcgcc tggcgcttca ttccgaacga cttcaagatg       360 aagagcgtgt atggcgtggg tcgcgactgg cctatccagt atgacgactt agaaccttac       420 taccagcgcg ccgaagagga actgggcgtt tggggtcctg gccctgaaga ggacttatat       480 agcccgcgta agcagcctta cccgatgcct ccgttaccgc tgagtttcaa cgagcaaacc       540 attaagaccg cactgaataa ctacgatcct aagttccacg ttgtgaccga acctgttgcc       600 cgcaacagcc gtccttacga tggtcgccct acatgctgcg gcaataacaa ctgcatgccg       660 atttgcccta tcggcgcaat gtacaatggc atcgttcacg tggagaaggc agaacgtgcc       720 ggtgccaagc tgatcgagaa cgcagtggtg tacaagttag agaccggccc tgataagcgc       780 atcgtggccg ccctgtacaa agataagaca ggcgccgaac atcgcgttga gggcaagtat       840 ttcgttctgg ccgccaacgg tattgagaca ccgaaaattc tgctgatgag cgccaaccgt       900 gacttcccta atggcgttgc caacagcagc gacatggtgg gtcgcaactt aatggatcac       960 ccgggcacag gtgttcagtt ctatgccagc gaaaaactgt ggccgggccg tggtccgcaa      1020 gagatgacaa gcttaatcgg cttccgtgat ggtccgtttc gcgcaaccga ggccgccaag      1080 aagattcatc tgtacaacct gagccgtatc gaccaggaga cccagaaaat tttcaaagcc      1140 ggtaagctga tgaagccgga cgaactggac gcacagattc gcgaccgtag cgcacgctac      1200 gtgcagttcg actgctttca cgagatcctg cctcagccgg aaaatcgcat cgtgccgagt      1260 aagacagcca cagatgcaat cggcattcct cgtccggaga ttacctacgc cattgacgac      1320 tacgtgaagc gtggcgccgc acacacacgc gaagtttacg ccaccgcagc caaggttctg      1380 ggtggcaccg atgttgtgtt taacgacgag ttcgcaccga acaaccacat cacaggcagc      1440 acaattatgg gcgcagacgc ccgtgacagt gttgtggaca aggactgccg cacatttgat      1500 catcctaacc tgttcatcag tagcagtgcc acaatgccta ccgtgggcac agtgaatgtg      1560 accctgacca tcgccgcctt agccttacgt atgagcgata cattaaagaa agaggtg         1617       ＜210＞ 6 ＜211＞ 1221 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工   ＜220＞   ＜400＞ 6   gcagacgcag cagacccggc actggtgaaa cgtggcgagt atttagccac cgccggtgac        60 tgcatggcat gccacacagt taagggcggc aaaccgtacg caggcggctt aggtatgccg       120 gttcctatgc tgggtaagat ctacaccagc aacattacac cggatccgga caccggcatt       180 ggtaagtgga ccttcgaaga cttcgaacgc gccgttcgcc acggtgttag caagaacggc       240 gacaacttat acccggccat gccgtacgtt agctacgcca agattaccga tgacgacgtt       300 cgcgcactgt acgcatactt catgcatggt gttgagccgg ccaagcaagc cccgcctaag       360 aatgaaattc ctgcactgtt aagcatgcgt tggccgctga agatttggaa ctggctgttc       420 ctgaaagacg gtccgtacca acctaaaccg agtcagagtg ccgaatggaa ccgtggcgcc       480 tacttagtgc aaggtctggc acattgcagc acatgccaca ccccgcgtgg tatcgcaatg       540 caagagaaga gcctggacga gacaggcggc agtttcttag ccggtagtgt tttagccggc       600 tgggacggct acaacattac cagcgaccct aacgccggta tcggcagttg gacccaacaa       660 cagctggttc agtacctgcg cacaggtagt gtgccgggcg ttgcccaagc agcaggtcct       720 atggccgagg ccgtggagca cagctttagc aaaatgaccg aggccgacat cggtgccatt       780 gccacctacg tgcgtaccgt tcctgccgtg gccgacagta atgcaaaaca gccgcgtagc       840 agttggggca aaccggccga agatggtctg aaactgcgcg gcgtggcatt agcaagtagc       900 ggcattgatc ctgcccgctt atacctgggc aattgcgcca cctgccacca aatgcaaggt       960 aagggcacac ctgacggcta ctaccctagt ctgttccaca acagcaccgt tggtgcaagc      1020 aatcctagca acctggtgca ggtgatctta aatggcgtgc agcgcaaaat cggcagtgaa      1080 gatatcggca tgccggcatt ccgttacgac ctgaacgatg cccagattgc cgcattaacc      1140 aactacgtga ccgcccaatt cggtaacccg gccgccaagg ttaccgaaca ggacgttgcc      1200 aagctgcgta ctagtgaatt c                                                1221   ＜210＞ 7 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工   ＜220＞   ＜400＞ 7   ggtggaggcg gtggcggagg tggc                                               24

10‧‧‧葡萄糖去氫酵素變異體

11‧‧‧γ-次單元

13‧‧‧α-次單元

15‧‧‧β-次單元

17‧‧‧第一鍵結片段

19‧‧‧第二鍵結片段

Claims (14)

1. 一種融合多肽，具有催化葡萄糖氧化還原能力，其中該融合多肽包含： 一胺基酸序列，該胺基酸序列包含： γ-次單元，具有SEQ ID No. 1； α-次單元，具有SEQ ID No. 2； β-次單元，具有SEQ ID No. 3；以及 兩個由5-15個胺基酸所組成之鍵結片段，分別連接γ-次單元、α-次單元以及β-次單元； 或1至5個胺基酸殘基被取代、刪除、附加、插入或/及加成之該胺基酸序列。
2. 如請求項1所述之融合多肽，其中該α-次單元位置326處被榖氨醯胺所取代，位置365處被酪鞍酸所取代。
3. 如請求項1所述之融合多肽，其中各該鍵結片段由8個甘胺酸所組成。
4. 如請求項1所述之融合多肽，其中各該鍵結片段由甘胺酸以及絲胺酸所組成。
5. 如請求項1所述之融合多肽，其中該兩鍵結片段之胺基酸序列不相同。
6. 如請求項1所述之融合多肽，其中該融合多肽之平均分子量介於121至126kDa之間。
7. 如請求項1所述之融合多肽，其中該胺基酸序列依序為SEQ ID No. 1、該鍵結片段、SEQ ID No. 2、該鍵結片段、SEQ ID No. 3。
8. 一種血糖檢測試片，具有一基板以及如請求項1所述之該融合多肽。
9. 一種多核苷酸，其編碼出申請專利範圍第1項之融合多肽。
10. 如請求項9所述之多核苷酸，依序包含： SEQ ID No. 4，編碼出該γ-次單元； SEQ ID No. 5，編碼出該α-次單元；以及 SEQ ID No. 6，編碼出該β-次單元。
11. 如請求項9所述之多核苷酸，其中由具有以下核苷酸序列編碼出各該鍵結片段： GGXGGXGGXGGXGGXGGXGGXGGX，其中 X為T, A, C 或 G。
12. 如請求項9所述之多核苷酸，包含SEQ ID No. 7，編碼出各該鍵結片段。
13. 一種載體，其包含如申請專利範圍第9項之多核苷酸。
14. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第13項之載體。