KR101399727B1

KR101399727B1 - 변이 글루코오스 탈수소효소

Info

Publication number: KR101399727B1
Application number: KR1020077012683A
Authority: KR
Inventors: 히데아키 야마오카; 마사시 쓰카다
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2005-06-20
Filing date: 2006-06-12
Publication date: 2014-05-29
Also published as: EP2077321A2; KR101387240B1; DE602006011858D1; EP1860183A1; EP2077321B1; US20080206833A1; KR20080028834A; US20100086989A1; US7776575B2; JP5341312B2; EP2077321A3; CN101107353A; TW201307562A; CN101107353B; EP1860183B1; WO2006137283A1; US7604969B2; KR20130018336A; TW200726842A; ATE455848T1

Abstract

서열번호 3에 나타내는 아미노산 서열, 또는, 동아미노산 서열에 있어서 365위 이외의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며, 또한, 글루코오스 탈수소효소 활성을 가진 단백질로서, 상기 아미노산 서열의 365위에 상당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된, 글루코오스에 대한 기질 특이성이 향상한 변이 글루코오스 탈수소효소.

Description

변이 글루코오스 탈수소효소{MUTANT GLUCOSE DEHYDROGENASE}

본 발명은, 기질 특이성이 향상된 변이 글루코오스 탈수소효소에 관한 것이다. 본 발명의 변이 글루코오스 탈수소효소는, 글루코오스 감지기(sensor), 및 글루코오스 어세이 키트(assay kit) 등에 적합하게 사용할 수 있고, 생화학 분야, 임상 분야 등에서 유용하다.

근래 바이오 감지기 소자로서 여러가지 효소가 이용되고 있다. 당뇨병의 진단을 목적으로 한 혈액내의 글루코오스 농도를 측정하는 감지기 소자로서 글루코오스 옥시다아제(GOD)가 벌써 실용화되어 있지만, GOD는 샘플중의 용존 산소에 영향을 받는 것이 문제가 되고 있다. 따라서 샘플중의 용존 산소에 영향을 받지 않는 글루코오스 탈수소효소(glucose dehydrogenase;GDH)가 GOD에 대체할 만한 것으로서 주목받고 있다.

GDH로는, NAD(P)⁺을 조효소로 하는 것(E.C.1.1.1.47)이나 피롤로퀴놀린퀴논(PQQ)을 조효소로 하는 것(PQQGDH;E.C.1.1.99.17) 등이 보고되고 있다. NAD(P)⁺를 조효소로 하는 GDH는, 측정계에 NAD(P)⁺를 첨가할 필요가 있다고 하는 점에서 감지기 소자로서 문제가 있다. 한편, PQQGDH 등의 조효소 결합형 GDH는 측정계에 조효소를 첨가할 필요가 없다.

또한, 감지기 소자에는, 연속 사용이나 실온에 방치하여도 감지기로서의 기능을 잃지 않는 안정성이 요구된다.

고온하에서 생육하는 호열성 세균(thermophilic bacteria) 유래의 효소는, 일반적으로 높은 열안정성이 있으며, 장기 보존이나 연속 사용 등에도 높은 안정성을 나타내기 때문에, 감지기 소자로서의 응용이 기대되고 있다. 그러나, 호열균 유래의 내열성 GDH에 대해서는, 서모플라스마·에시도필럼(Thermoplasma acidophilum), 술포로버스·솔퍼타리커스(Sulfolobus solfataricus) 유래의 GDH가 보고되고 있지만, 모두 NAD(P)⁺를 조효소로 하는 것이다.

한편, 중도 호열성 세균(moderately thermophilic bacterium)인 버크홀데리아·세파시아(Burkholderia cepacia)가 생산하는 내열성 GDH는 FAD 결합형이며, 이미 최적반응온도, 열안정성, 기질특이성 등의 효소 학문적 성질이 명백해지고 있다 (특허 문헌 1). 이 GDH는, 통상적으로는, 높은 내열성을 가진 촉매 서브유닛(α 서브유닛), 시토크롬 C인 전자전달 서브유닛(β 서브유닛), 기능 불명의 γ 서브유닛으로 구성되는 헤테로올리고머로서 존재하고, 45℃에 최적반응온도를 갖지만, 50℃ 이상의 열처리를 실시함으로써 서브유닛의 해리가 일어나, 75℃에 최적반응온도를 가진 α 서브유닛 단량체가 된다. α 서브유닛 단량체는 열에 안정적이며, 60℃ 30분의 열처리 후에도 80% 이상의 잔존 활성을 나타낸다. 이들 서브유닛을 코드하는 유전자도 단리되어 있다(특허 문헌 1, 특허 문헌 2).

그러나, 조효소 결합형 GDH는 일반적으로 기질 특성이 넓고, 글루코오스 이외에 말토오스나 갈락토오스 등과도 반응하기 때문에, 당뇨병 환자를 위한 혈당 측정 전용의 글루코오스 감지기로서 응용할 경우에, 당뇨병 환자가 복막 투석을 실시해야 하는 위독한 증상의 경우는, 투석액에 말토오스가 대량으로 포함되어 있기 때문에, 본래의 혈당치보다 높게 측정치가 나와 버릴 위험성이 있다. 버크홀데리아·세파시아의 GDH도, 마찬가지로 글루코오스 이외에 말토오스나 갈락토오스와도 반응성을 가지고 있다.

아미노산 치환 변이를 도입하는 것에 의해서, GDH의 기질 특이성을 변화시키는 기술이 알려져 있다. 이러한 변이 GDH로서는, 예를 들면, E.coli(특허 문헌 3, 4), 아시네토박터·칼코아세티커스(Acinetobacter calcoaceticus, Gluconobacter calcoaceticus)(특허 문헌 5), 또는 아시네토박터·바우만니(Acinetobacter baumannii)(특허 문헌 6∼8) 유래의, 피롤로퀴놀린퀴논을 조효소로 하는 PQQGDH가 알려져 있다.

특허 문헌 1 : 미국 특허 출원 공개 제2004/0023330호

특허 문헌 2 : 국제 공개 제03/091430호 팸플릿

특허 문헌 3 : 일본 특개평10-243786호 공보

특허 문헌 4 : 일본 특개2001-197888호 공보

특허 문헌 5 : 일본 특개2004-173538호 공보

특허 문헌 6 : 일본 특개2004-313172호 공보

특허 문헌 7 : 일본 특개2004-313180호 공보

특허 문헌 8 : 일본 특개2004-344145호 공보

[발명의 개시]

[발명이 해결하고자 하는 과제]

본 발명은, 글루코오스에 대한 기질 특이성이 향상한 FAD 결합형 GDH를 제공하는 것을 과제로 한다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 버크홀데리아·세파시아의 FAD 결합형 GDH의 특정의 부위의 아미노산 서열을 변형함으로써, 글루코오스에 대한 반응성을 유지하면서, 다른 당에 대한 반응성을 저하시킬 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 아래와 같다.

(1) 서열번호 3에 나타내는 아미노산 서열, 또는 이 아미노산 서열의 365위(位) 이외의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며, 또한, 글루코오스 탈수소효소 활성을 가진 단백질로서, 상기 아미노산 서열의 365위에 상당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된, 글루코오스에 대한 기질 특이성이 향상한 변이 글루코오스 탈수소효소.

(2) 365위에 상당하는 위치 이외는 서열번호 3에 나타내는 아미노산 서열을 가진, (1)에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소.

(3) 365위에 상당하는 위치의 아미노산 잔기가 야생형인 글루코오스 탈수소효소와 비교하여, 이당류에 대한 반응성이 저하한 것을 특징으로 하는, (1) 또는 (2)에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소.

(4) 이당류가 말토오스인 것을 특징으로 하는 (3)에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소.

(5) 말토오스에 대한 반응성이 글루코오스에 대한 반응성의 20% 이하인 것을 특징으로 하는 (4)에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소.

(6) 상기 다른 아미노산 잔기가, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 히스티딘으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 (1)∼(5)의 어느 하나에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소.

(7) 또한, 서열번호 3의 아미노산 서열에 있어서의 324, 326, 333, 334, 368, 369, 376, 377, 418, 419, 436, 433, 448, 472, 475, 525 및 529로부터 선택되는 적어도 1개의 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된, (1)∼(6)의 어느 하나에 기재된 변이형 글루코오스 탈수소효소.

(8) 상기 위치가, 326, 472, 475 및 529로부터 선택되는 적어도 1개인 (7)에 기재된 변이형 글루코오스 탈수소효소.

(9) 상기 위치가, 472위인 (8)에 기재된 변이형 글루코오스 탈수소효소.

(10) 상기 위치가, 475위인 (8)에 기재된 변이형 글루코오스 탈수소효소.

(11) 상기 위치가, 472위 및 475위의 양쪽 모두인 (8)에 기재된 변이형 글루코오스 탈수소효소.

(12) 상기 위치가, 326위인 (8)에 기재된 변이형 글루코오스 탈수소효소.

(13) 상기 위치가, 529위인 (8)에 기재된 변이형 글루코오스 탈수소효소.

(14) 472위에 상당하는 아미노산 잔기가 아스파라긴산, 글루타민산, 페닐알라닌, 티로신, 이소루이신, 아스파라긴 및 히스티딘으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 (9)에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소.

(15) 475위에 상당하는 아미노산 잔기가 히스티딘 또는 세린으로 치환된 것을 특징으로 하는 (10)에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소.

(16) 326위의 세린에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민 또는 바린으로 치환된 것을 특징으로 하는 (12)에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소.

(17) 529위의 루이신에 상당하는 아미노산 잔기가 티로신, 히스티딘 또는 트립토판으로 치환된 것을 특징으로 하는 (13)에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소.

(18) 서열번호 3에 나타내는 아미노산 서열, 또는 이 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며, 또한, 글루코오스 탈수소효소 활성을 가진 단백질로서, (ⅰ) 상기 아미노산 서열에 있어서의 324, 326, 333, 334, 365, 368, 369, 376, 377, 418, 419, 436, 433, 448, 525 및 529로부터 선택되는 적어도 1개의 위치에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환, (ⅱ) 472위에 상당하는 위치의 아미노산 잔기를 아스파라긴산으로 치환, 및 (ⅲ) 475위에 상당하는 아미노산 잔기를 히스티딘으로 치환한 것을 포함한, 글루코오스에 대한 기질 특이성이 향상한 변이 글루코오스 탈수소효소.

(19) 상기 다른 아미노산 잔기가 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판인 것을 특징으로 하는 (18)에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소.

(20) 상기 위치가 326위이며, 동 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민 또는 바린으로 치환된 것을 특징으로 하는 (18)에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소.

(21) 상기 위치가 529위이며, 동 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 티로신, 히스티딘 또는 트립토판으로 치환된 것을 특징으로 하는 (18)에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소.

(22) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함한, FAD 결합형 변이 글루코오스 탈수소효소.

(23) (1)∼(22)의 어느 하나에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소와 전자전달 서브유닛을 적어도 포함한 변이 글루코오스 탈수소효소 복합체.

(24) 전자전달 서브유닛이 시토크롬 C인 것을 특징으로 하는 (23)에 기재된 글루코오스 탈수소효소 복합체.

(25) (1)∼(22)의 어느 하나에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소를 코드하는 DNA.

(26) (25)에 기재된 DNA를 보유하고, (1)∼(22)의 어느 하나에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소 또는 (23)에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소 복합체를 생성하는 미생물.

(27) (1)∼(22)에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소, (23)에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소 복합체, 또는 (26)에 기재된 미생물을 포함한, 글루코오스 어세이 키트.

(28) (1)∼(22)에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소, (23)에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소 복합체, 또는 (26)에 기재된 미생물을 포함한, 글루코오스 감지기.

도 1은, 글루코오스 감지기의 구조를 나타낸다.

도 2는, 글루코오스 감지기의 각 시약부를 나타낸다.

도 3은, 변이형 GDH를 이용한 글루코오스 감지기의 글루코오스에 대한 반응성을 나타낸다.

도 4는, 변이형 GDH를 이용한 글루코오스 감지기의 글루코오스 존재하에 있어서의 말토오스에 대한 반응성을 나타낸다.

도 5는, 야생형 GDH 및 변이 GDH를 이용한 글루코오스 감지기를 이용하여 측정된 겉보기 혈당치를 나타낸다.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 변이 GDH는, 야생형 GDH에 특정의 변이를 도입함으로써 제조된다. 야생형 GDH로서는, 버크홀데리아·세파시아가 생성하는 GDH를 들 수 있다. 버크홀데리아·세파시아의 GDH로서는, 버크홀데리아·세파시아 KS1주(strain), JCM 2800주 또는 JCM2801주가 생산하는 GDH를 들 수 있다. KS1주는, 2000년 9월 25일에 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터((우)305-8566일본 이바라 키현 츠쿠바시 동1가 1번지 1중앙 제 6)에, 수탁 번호 제FERM BP-7306으로서 기탁되어 있다. JCM2800주 또는 JCM2801주는, 독립 행정법인 이화학 연구소 미생물 계통 보존 시설(Japan Collection of Microorganisms, JCM)에 보존되고 있다.

KS1주의 GDH α 서브유닛 유전자, 및 β 서브유닛 유전자의 일부를 포함한 염색체 DNA 단편의 염기서열을 서열번호 1에 나타낸다(미국 특허 출원 공개 제2004/0023330호). 이 염기서열에는 3개의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 존재하고, 5'말단측으로부터 2번째 및 3번째의 ORF는, 각각 α 서브유닛(서열번호 3), 및 β 서브유닛(서열번호 4)을 코드하고 있다. 또한, 1번째의 ORF는 γ 서브유닛(서열번호 2)을 코드하고 있다고 추정된다. 또한, 서열번호 5에, 전장(full length) β 서브유닛 유전자를 포함한 단편의 염기서열을 나타낸다. 계속해서, β 서브유닛의 아미노산 서열을 서열번호 6에 나타낸다(유럽 특허 출원 공개 제 1498484호). 서열번호 6에 있어서, 아미노산 번호 1∼22는 시그널 펩티드라고 추정된다. 한편, 서열번호 5 및 6에 있어서, 제1번째의 아미노산 잔기는 Val로 기재되어 있지만, Met일 가능성이 높고, 또한, 번역후에 제거될 가능성이 있다.

본 발명의 변이 GDH는, α 서브유닛뿐이어도 좋고, α 서브유닛과 β 서브유닛의 복합체, 또는 α 서브유닛, β 서브유닛 및 γ 서브유닛으로 이루어진 복합체여도 좋다. 본 발명의 변이 GDH는, 어느 경우에나 α 서브유닛에 특정의 변이가 도입된 것이지만, 이 특정의 변이 외에, 보존적인 변이를 가지고 있어도 좋다. 또한, 다른 서브유닛은 야생형이어도 좋고, 보존적인 변이를 가진 것이어도 좋다. 한편, '보존적 변이(conservative mutation)'란, GDH 활성에 실질적으로 영향을 주 지 않는 변이를 말한다.

본 발명의 변이형 α서브유닛은, 바람직하게는, 후술하는 특정의 변이 이외는, 서열번호 13에 나타내는 아미노산 서열을 가진다. 또한, 변이형 α서브유닛은, GDH 활성을 가지는 한, 상술한 바와 같은 보존적 변이를 가지고 있어도 좋다. 즉, 서열번호 13의 아미노산 서열에 있어서, 상기 특정의 변이 이외에, 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 단백질이어도 좋다. 한편, 서열번호 13에는, 서열번호 11의 염기서열에 의해서 코드될 수 있는 아미노산 서열을 나타내고 있지만, N말단의 메티오닌잔기는, 번역후에 제거될 가능성이 있다. 상기 '1 또는 복수'란, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 특히 바람직하게는 1∼3개이다.

또한, β 서브유닛은, 전형적으로는 서열번호 16의 아미노산 서열을 가진다. 그러나, GDH의 β 서브유닛으로서 기능할 수 있는 한, 서열번호 16의 아미노산 번호 23∼425로 이루어진 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 가진 단백질이어도 좋다. 상기 '1 또는 복수'란, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼10개, 특히 바람직하게는 1∼5개이다. 한편, GDH의 β 서브유닛으로서 기능한다는 것은, α서브유닛과 함께 복합체를 형성했을 때에 동일 복합체의 GDH 활성을 손상하지 않고 시토크롬 C로서 기능하는 것을 말한다.

야생형 α서브유닛 유전자로서 구체적으로는, 서열번호 11의 염기 번호 764∼2380으로 이루어진 염기서열을 포함한 DNA를 들 수 있다. 또한, α서브유닛 유 전자는, 서열번호 11의 염기서열의 염기 번호 764∼2380으로 이루어지는 염기서열을 가진 DNA, 또는 이 서열로부터 조제될 수 있는 프로우브와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDH 활성을 가진 단백질을 코드하는 DNA여도 좋다.

또한, β 서브유닛 유전자로서 구체적으로는, 서열번호 15의 염기 번호 187∼1398로 이루어진 염기서열을 포함한 DNA를 들 수 있다. 또한 β 서브유닛 유전자는, 서열번호 15의 염기 번호 187∼1398로 이루어진 염기서열을 가진 DNA, 또는 이 서열로부터 조제될 수 있는 프로우브(probe)와 엄격한 조건하(stringent condition)에서 하이브리다이즈(혼성화)하고, 또한, β 서브유닛으로서 기능할 수 있는 단백질을 코드하는 DNA여도 좋다.

상기 엄격한 조건으로서는, 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95%이상의 상동성을 가진 DNA 끼리가 하이브리다이즈하는 조건, 구체적으로는, 1×SSC, 0.1% SDS, 60℃를 들 수 있다.

α 서브유닛 유전자 및 β 서브유닛 유전자는, 예를 들면, 버크홀데리아·세파시아 KS1주의 염색체 DNA를 주형으로 하는 PCR에 의해서, 취득할 수 있다. PCR용 프라이머는, 상기 염기서열에 기초하여 화학 합성하는 것에 의해서 조제할 수 있다. 또한, 상기 서열에 기초하여 제작한 올리고뉴클레오티드를 프로우브로 하는 하이브리다이제이션에 의해서, 버크홀데리아·세파시아 KS1주의 염색체 DNA로부터 취득할 수도 있다. 또한, 버크홀데리아·세파시아의 다른 균주로부터도, 동일하게 하여 변형을 취득할 수 있다. 다른 균주로서는, 상기 JCM2800주 및 JCM2801주를 들 수 있다. 이들 균주가 생성하는 GDH의 α 서브유닛은, KS1주의 α서브유닛과 각각 95.4% 및 93.7%의 상동성을 가지고 있다.

또한, 다른 미생물이 생산하는 GDH라 하더라도, 버크홀데리아·세파시아의 GDH와 유사한 구조 및 효소학적 성질을 가진 것이라면, 본 발명의 변이 GDH의 제조에 이용할 수 있다. 이러한 GDH로서는, 예를 들면 (ⅰ)Burkholderia pseudomallei, (ⅱ)Burkholderia mallei, (ⅲ)Ralstonia solanacearum 유래의 GDH를 들 수 있다((i),(ⅱ)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(39), 14240-14245 (2004), (ⅲ)Nature 415(6871), 497-502 (2002)).

본 발명의 변이 GDH는, 상기와 같은 야생형 GDH 또는 보존적 변이를 가진 GDH가 특정의 변이를 가진 것에 의해서, 글루코오스에 대한 기질 특이성이 향상한 것이다. '글루코오스에 대한 기질 특이성이 향상했다'는 것은, 글루코오스에 대한 반응성을 실질적으로 유지한 채로, 다른 단당류, 이당류 또는 올리고당 등의 당류, 예를 들면 말토오스, 갈락토오스, 크실로오스 등에 대한 반응성이 저하한 것, 혹은, 글루코오스에 대한 반응성이 다른 당류에 대한 반응성에 비해 향상한 것을 포함한다. 예를 들면, 글루코오스에 대한 반응성이 저하해도, 다른 당류에 대한 반응성이 그 이상으로 저하하면, 글루코오스에 대한 기질 특이성은 향상한다. 또한, 다른 당류에 대한 반응성이 상승해도, 글루코오스에 대한 기질 특이성이 그 이상으로 상승하면, 글루코오스에 대한 기질 특이성은 향상한다. 구체적으로는 예를 들면, 야생형 효소에 대한 변이형 효소의 기질 특이성(글루코오스에 대한 비활성(比活性)과 다른 당류, 예를 들면 말토오스에 대한 비활성의 비)의 향상(하기 식으로 표시된다)이, 10%이상, 바람직하게는 20%이상, 보다 바람직하게는 40%이상이면, 글 루코오스에 대한 기질 특이성은 향상하고 있다. 예를 들면, 기질 특이성이, 야생형 효소에서는 60%, 변이형 GDH에서는 40%인 경우, 글루코오스 이외의 당류에 대한 반응성은, 33% 저하되고 있다.

기질 특이성=(글루코오스 이외의 당류에 대한 비활성/글루코오스에 대한 비활성)×100

기질 특이성의 향상=(A-B)×100/A

A:야생형 효소의 기질 특이성

B:변이형 효소의 기질 특이성

또한, 변이형 GDH는, 말토오스에 대한 반응성(비활성)이 글루코오스에 대한 반응성(비활성)의 30% 이하, 바람직하게는 20% 이하인 것이 바람직하다.

상기 특정의 변이란, 구체적으로는 이하와 같다.

(1) 서열번호 3에 나타내는 아미노산 서열의 365위에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환.

(2) 서열번호 3에 나타내는 아미노산 서열의 365위에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환, 및 324, 326, 333, 334, 368, 369, 376, 377, 418, 419, 436, 433, 448, 472, 475, 525 및 529의 적어도 1개, 또는 임의의 2이상의 위치에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환.

(3) (i) 서열번호 3에 나타내는 아미노산 서열의 324, 326, 333, 334, 365, 368, 369, 376, 377, 418, 419, 436, 433, 448, 525 및 529로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 임의의 2이상의 위치에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환, (ⅱ) 472위에 상당하는 위치의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환, 및 (ⅲ) 475위에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환.

또한, 상기 특정의 변이로서는, GDH의 아미노산 서열중에, 서열번호 7에 나타내는 아미노산 서열을 포함한 변이를 들 수 있다. 서열번호 7에 나타내는 아미노산 서열은, 서열번호 3에 나타내는 GDH에 있어서는, 360위∼366위에 상당한다. 버크홀데리아·세파시아 이외의 FAD 결합형 GDH라 하더라도, 야생형 GDH가 서열번호 7에 나타내는 아미노산 서열을 포함하지 않는 경우, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함한 변이형 GDH는, 기질 특이성이 향상하고 있다고 생각할 수 있다.

상기 (1)의 변이에 있어서, 다른 아미노산 잔기로서는, 세린 이외의 아미노산, 구체적으로는 페닐알라닌, 티로신, 아스파라긴산, 히스티딘, 아르기닌, 트립토판, 리신, 아스파라긴, 루이신, 시스테인, 트레오닌, 이소루이신, 글리신, 발린, 메티오닌, 글루타민, 글루타민산, 알라닌, 프롤린을 들 수 있다. 이들 중에서는, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 히스티딘이 바람직하다.

상기 (2)의 변이에 있어서, 다른 아미노산 잔기로서는, 야생형 GDH의 각각의 위치에 있어서의 아미노산 잔기 이외의 아미노산을 들 수 있다. 상기 아미노산 치환의 위치중에서도, 326위, 472위, 475위, 및 529위가 바람직하고, 472위 및 475위가 더 바람직하다. 472위 및 475위에 상당하는 아미노산 잔기의 치환은, 각각 단독으로도 좋지만, 양쪽 모두 치환되고 있는 것이 보다 바람직하다.

472위에 있어서는, 치환후의 아미노산 잔기는, 아스파라긴산, 글루타민산, 페닐알라닌, 티로신, 이소루이신, 아스파라긴, 아스파라긴산, 또는 히스티딘이 바 람직하고, 아스파라긴산이 특히 바람직하다.

475위에 있어서는, 치환후의 아미노산 잔기는 히스티딘 또는 세린이 바람직하고, 히스티딘이 특히 바람직하다.

326위에 있어서는, 치환후의 아미노산 잔기는, 글루타민 또는 발린이 바람직하다.

529위에 있어서는, 치환후의 아미노산 잔기는, 티로신, 히스티딘 또는 트립토판이 바람직하다.

상기의 바람직한 아미노산 치환의 형태는, 상기 (3)의 변이에서도 동일하다.

상기 아미노산 치환 변이의 위치는, 서열번호 3, 즉 버크홀데리아·세파시아 KS1주의 야생형 GDHα 서브유닛의 아미노산 서열에 있어서의 위치이지만, 서열번호 3의 아미노산 서열에 있어서, 상기 특정의 변이 이외에, 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 가진 GDHα서브유닛의 호몰로그(homologue) 또는 배리언트(variant)에 있어서는, 서열번호 3의 아미노산 서열과의 얼라인먼트에 있어서, 상기 아미노산 치환의 위치에 상당하는 위치를 나타낸다. 예를 들면, 1∼364위의 영역에 있어서 1개의 아미노산 잔기의 결실을 가진 GDHα 서브유닛의 보존적 배리언트에 있어서는, 365위란, 상기 배리언트의 364위를 나타낸다.

본 발명의 변이형 GDH의 바람직한 변이의 형태를 이하에 나타낸다.

(숫자는 아미노산 서열에 있어서의 위치를, 아미노산 잔기는 상기 위치에 있어서의 치환후의 아미노산 잔기를 나타내며, '+'는 동시에 2개의 아미노산 치환을 가진 것을 나타낸다.)

(A) 365Arg, 365Asn, 365Asp, 365Cys, 365Glu, 365Gly, 365His, 365Ile, 365Leu, 365Met, 365Phe, 365Pro, 365Trp, 365Tyr, 365Val, 365Lys, 365Gln, 365Thr, 365Ala

(B) 326Gln, 326Val, 326Arg

(C) 529His, 529Tyr, 529Trp

(D) 365Tyr + 326Gln, 365Tyr + 326Val, 365Tyr + 326Arg, 365Tyr + 472Phe, 365Tyr + 472Ile, 365Tyr + 472Asn, 365Tyr + 472Asp, 365Tyr + 472His, 365Tyr + 472Leu, 365Tyr + 472Ser, 365Tyr + 475Ser, 365Tyr + 475His, 365Phe + 472Phe

(E) 472Asp + 475His + 365Phe, 472Asp + 475His + 326Gln, 472Asp + 475His + 326Thr, 472Asp + 475His + 326Val, 472Asp + 475His + 529Trp, 472Asp + 475His + 529His, 472Asp + 475His + 529Tyr, 472Tyr + 475His + 365Phe, 472Tyr + 475His + 365His, 472Tyr + 475His + 326Val, 472Ile + 475His + 326Gln

(F) 472Asp + 475His + 529His + 326Gln, 472Asp + 475His + 529Trp + 326Gln

본 발명자는, FAD를 조효소로서 가진 GMC 옥시도리덕타아제 패밀리인 글루코노박터·옥시던스의 소르비톨 탈수소효소(GenBank accession AB 039821), 에르비니아·헤르비콜라의 2-케토글루탈산 탈수소효소(GenBank accession AF068066), 파넬로케이트·크리소스포륨의 셀로비오스 탈수소효소(CDH)(J.Mol.Biol., 315(3), 421-34(2002)), 스트렙토마이세스 스피시즈의 콜레스테롤 옥시다아제(COD) (J.Struct.Biol. 116(2), 317-9(1996)), 페니실륨·아마가사키엔스의 글루코오스 옥시다아제(Eur.J.Biochem. 252, 90-99(1998))의 아미노산 서열을 비교하여, FAD 결합 도메인 및 FAD-covering lid 등의 보존된 영역, 및 단백질의 폴딩(folding)에 관여하는 아미노산 잔기인 프롤린이 보존되어 있는 영역을 발견하였다. 그리고, 이들 영역과 다른 영역과의 경계 부근의 서열을 개변함으로써, 기질 특이성을 향상할 수 있는 가능성에 대하여 검토하였다. 구체적으로는 R53∼H73, E88∼A108, N308∼G336, K362∼A377, A391∼R497, S509∼V539를 검토하였다. 그 결과, 상기 영역중에서 기질 특이성을 향상할 수 있는 장소를 몇가지 발견하였다.

소망한 변이를 가진 GDHα 서브유닛은, GDHα 서브유닛을 코드하는 DNA(α 서브유닛 유전자)에, 부위 특이적 변이법에 의해서, 소망한 아미노산 변이에 대응하는 뉴클레오티드 변이를 도입하고, 얻어지는 변이 DNA를 적당한 발현계를 이용하여 발현시키는 것에 의해서, 취득할 수 있다. 또한, 변이 GDHα 서브유닛을 코드하는 DNA를, β 서브유닛을 코드하는 DNA(β 서브유닛 유전자), 또는 β 서브유닛 유전자와 γ 서브유닛을 코드하는 DNA (γ 서브유닛 유전자)와 함께 발현시키는 것에 의해서, 변이 GDH 복합체를 취득할 수 있다. 한편, GDHα서브유닛을 코드하는 DNA에의 변이의 도입은, γ서브유닛, α서브유닛 및 β 서브유닛을 이 순서대로 코드하는 폴리시스트론 DNA 단편을 이용해도 좋다.

변이가 도입된 GDHα 서브유닛 또는 GDH 복합체의 당류에 대한 기질 특이성은, 실시예에 기재된 방법에 따라 각종 당류에 대한 반응성을 조사하여, 야생형 GDHα 서브유닛 또는 야생형 GDH 복합체의 반응성과 비교하는 것에 따라, 결정할 수 있다.

γ 서브유닛, α 서브유닛 및 β 서브유닛을 이 순서대로 코드하는 폴리시스트론 DNA 단편은, 예를 들면, 버크홀데리아·세파시아 KS1주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 8, 9의 염기서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하는 PCR에 의해서 취득할 수 있다(아래 실시예 참조).

GDH의 각 서브유닛의 유전자의 취득, 변이의 도입, 유전자의 발현 등에 이용하는 벡터로서는, 예를 들면 에쉐리히아속(Escherichia) 세균에서 기능하는 벡터, 구체적으로는 pTrc99A, pBR322, pUC18, pUC118, pUC19, pUC119, pACYC184, pBBR122 등을 들 수 있다. 유전자의 발현에 이용하는 프로모터로서는, 예를 들면 lac, trp, tac, trc, P_L, tet, PhoA 등을 들 수 있다. 또한, 프로모터를 포함한 발현 벡터의 적당한 부위에, α 서브유닛 유전자 또는 다른 서브유닛 유전자를 삽입하는 것에 의해서, 이들 유전자의 벡터에의 삽입과 프로모터의 연결을 동일한 공정으로 실시할 수 있다. 이러한 발현 벡터로서는, pTrc99A, pBluescript, pKK223-3 등을 들 수 있다.

또한, α서브유닛 유전자 또는 다른 서브유닛 유전자는, 발현 가능한 형태로 숙주 미생물의 염색체 DNA중에 들어가더라도 좋다.

재조합 벡터로 미생물을 형질 전환하려면, 예를 들면 칼슘 처리에 의한 컴피턴트 셀(competent cell)법, 프로토플래스트(protoplast)법 또는 엘렉트로포레이션 (electroporation)법 등을 들 수 있다.

숙주 미생물로서는, 바실루스·서브틸리스 등의 바실루스속 세균, 사카로마이세스·세레피시에 등의 효모, 아스페르길루스·니가 등의 사상균을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않고, 이종 단백질 생산에 적절한 숙주 미생물이면 이용할 수 있다.

본 발명의 변이 α서브유닛 혹은 변이 GDH 복합체 또는 이들을 발현하는 미생물은, 글루코오스 감지기의 효소 전극, 또는 글루코오스의 어세이 키트의 구성요소로서 이용할 수 있다. 버크홀데리아·세파시아의 야생형 GDH를 이용한 글루코오스 감지기 및 글루코오스어세이 키트는, 미국 특허 공개 제 2004/0023330 A1에 기재되어 있다. 본 발명의 변이 GDH도, 동일하게 하여 사용할 수 있다.

다음에, 실시예를 예로 들어 본 발명을 더 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

〔실시예 1〕버크홀데리아·세파시아의 GDH를 발현하는 플라스미드

버크홀데리아·세파시아의 GDH를 발현하는 플라스미드로서 GDH의 α 서브유닛 및 γ 서브유닛을 발현하는 플라스미드, 및 α 서브유닛, β 서브유닛 및 γ 서브유닛을 발현하는 플라스미드를 준비하였다.

<1> GDH의 α 서브유닛 및 γ 서브유닛을 발현하는 플라스미드

α 서브유닛 및 γ 서브유닛을 발현하는 플라스미드로서는, W002/036779(E P1331272A1, US2004023330A1, CN1484703A에 대응)에 기재된 플라스미드 pTrc99A/ γ+α를 사용했다. 동일 플라스미드는, 버크홀데리아·세파시아 KS1주(FERM BP- 7306) 염색체 DNA로부터 단리된, GDHγ 서브유닛 구조 유전자와 α 서브유닛 구조 유전자를 연속하여 포함한 DNA 단편이, 벡터 pTrc99A(Pharmacia사)의 클로닝 부위인 NcoI/HindIII에 삽입되어 이루어지는 플라스미드이다. 본 플라스미드중의 GDH γα유전자는, trc 프로모터에 의해서 제어된다. pTrc99A/γ+α는, 암피실린 내성 유전자를 보유하고 있다.

<2> GDH의 α서브유닛, β 서브유닛 및 γ 서브유닛을 발현하는 플라스미드

GDH의 α서브유닛, β 서브유닛 및 γ 서브유닛을 발현하는 플라스미드는, 이하와 같이 하여 조제하였다.

(1) 버크홀데리아·세파시아 KS1주로부터의 염색체 DNA의 조제

버크홀데리아·세파시아 KS1주로부터 염색체 유전자를 통상의 방법에 따라서 조제하였다. 즉, 동일 균주를 TL액체배지(폴리펩톤 10g, 효모 추출액 1g, NaCl 5g, KH₂PO₄ 2g, 글루코오스 5g; 1L, pH 7.2)를 이용하여, 34℃에서 하룻밤 흔들어 섞었다. 증식한 균체를 원심분리에 의해 회수하였다. 이 균체를 10mM NaCl, 20mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 0.5% SDS, 100㎍/ml의 프로테나제 K를 포함한 용액에 현탁하고, 50℃에서 6시간 처리하였다. 여기에 등량의 페놀클로로포름을 첨가하여 실온에서 10분간 교반한 후, 원심분리에 의해 상청액을 회수하였다. 여기에 최종농도 0.3M이 되도록 초산나트륨을 첨가하고, 2배량의 에탄올을 중층하여 중간층의 염색체 DNA를 석출시켰다. 이것을 유리봉을 이용하여 건져 올려, 70% 에탄올로 세정한 후, 적당량의 TE 버퍼에 용해시켜, 염색체 DNA 용액으로 하였다.

(2) GDH의 γ 서브유닛, α 서브유닛 및 β 서브유닛을 코드하는 DNA 단편의 조제

상기 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이하의 서열을 가진 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 하는 PCR에 의해, GDH의 γ 서브유닛, α 서브유닛 및 β 서브유닛을 코드하는 DNA 단편을 증폭하였다.

〔포워드 프라이머〕

5'-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3' (서열번호 8)

〔리버스 프라이머〕

5'-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3'(서열번호 9)

증폭한 단편의 C말단측을 평활 말단화한 후, N말단측을 NcoI로 소화하여, 마찬가지로 처리한 pTrc99A(Pharmacia사)에 라이게이션하였다. 얻어진 재조합 벡터로 E.coli DH5α를 형질 전환하고, 암피실린 50㎍/mL를 포함한 LB 한천 배지에서 발생하는 콜로니를 채취하였다. 얻어진 형질 전환체를 액체의 LB 배양지에서 배양하여 플라스미드를 추출하고, 그 삽입 DNA 단편을 해석한 바, 약 3.8kb의 삽입 단편이 확인되었다. 본 플라스미드를 pTrc99Aγαβ로 명명하였다. 본 플라스미드중의 GDH의 각 구조 유전자는, trc 프로모터에 의해서 제어된다. pTrc99Aγαβ은, 암피실린 내성 유전자 및 카나마이신 내성 유전자를 보유하고 있다.

〔실시예 2〕GDHα서브유닛 유전자에의 변이 도입에 의한 기질 상호작용 부위의 탐색

(1) 472위 및 475위에의 변이 도입

실시예 1에서 얻어진 pTrc99Aγαβ에 포함되는 GDHα서브유닛 유전자에, 동일 유전자가 코드하는 α 서브유닛의 472위의 알라닌 잔기를 아스파라긴산 잔기로, 및 475위의 아스파라긴 잔기를 히스티딘 잔기로 치환되는 변이를 도입하였다. 이 변이체를 472D+475H 변이체라 칭한다. 이러한 변이에 의해 기질 특성이 개선되는 것은, 본 발명자들은 이미 확인하고 있다.

구체적으로는, 시판의 부위 특이적 변이 도입 키트(Stratagene 사, Quik ChangeⅡ Site-Directed Mutagenesis Kit)을 이용하여, 실시예 1에 기재된 플라스미드 pTrc99A/γ+α 및 pTrc99Aγαβ에 포함되는 GDHα 서브유닛 유전자의 475위의 아스파라긴의 코돈(AAT)을 아스파라긴산(GAT) 또는 글루타민산(GAA)의 코돈으로 치환하였다. 프라이머에는, 아래와 같은 올리고 뉴클레오티드를 사용하였다.

〔A472D 변이 도입용 프라이머〕

포워드 프라이머: 서열번호 224

5'-CGTGTTCAACGACGAATTCGATCCGAACAATCACATCACGG-3'

리버스 프라이머: 서열번호 225

5'-CCGTGATGTGATTGTTCGGATCGAATTCGTCGTTGAACACG-3'

〔N475H 변이 도입용 프라이머〕

포워드 프라이머: 서열번호 226

5'-AATTCGCGCCGAACCACCACATCACGGGCTC-3'

리버스 프라이머: 서열번호 227

5'-GAGCCCGTGATGTGGTGGTTCGGCGCGAATT-3'

(2) 472위 및 475위 이외의 위치에의 변이 도입

상기에서 얻어진 472D+475H 변이체를 코드하는 변이 유전자를 이용하여, 이하에 나타내는 영역의 아미노산 잔기의 페닐 알라닌에의 치환을 더 실시하였다. 다만, 야생형의 아미노산 잔기가 페닐알라닌인 위치에 대해서는, 아미노산 치환은 실시하지 않았다. 한편, 하기 숫자는 아미노산 서열에 있어서의 위치를, 숫자 전의 알파벳은 아미노산의 종류를 나타낸다. 예를 들면, R53은, 53위의 아르기닌을 나타낸다.

(i)R53∼H73

(ⅱ)E88∼A108

(ⅲ)N308∼G336

(ⅳ)K362∼A377

(v)A391∼R497

(ⅵ)S509∼V539

또한, 변이를 도입하는 타겟의 α서브유닛 유전자에 관해서는, 변이의 조합에 의한 상승효과를 겨냥하여, 이미 기질 특성 개선 효과를 확인이 끝난 상태인 472D+475H 변이체를 이용하였다.

상기 아미노산 잔기 치환에 이용한 포워드 프라이머의 서열을 이하에 나타낸다. 리버스 프라이머의 서열은, 포워드 프라이머의 완전 상보쇄로 하였다.

한편, 변이를 나타내는 표기에 있어서, 숫자는 아미노산 서열에 있어서의 위치를, 숫자 앞의 알파벳은 아미노산 치환전의 아미노산 잔기를, 숫자 뒤의 알파벳 은 아미노산 치환후의 아미노산 잔기를 나타낸다. 예를 들면, R53F는, 53위의 아르기닌으로부터 페닐알라닌로의 치환을 나타낸다.

PCR 반응은, 이하의 반응 조성으로, 95℃, 30초후, 95℃ 30초, 55℃ 1분, 68℃ 8분을 15사이클 반복하고, 68℃ 30분의 반응을 실시한 후, 4℃로 유지하였다.

〔반응액조성〕

주형 DNA (5ng/μl) 2μl

(472D+475H도입 pTrc99A/γ+α 및 pTrc99Aγαβ)

10× 반응 완충액 5μl

포워드 프라이머(100ng/μl) 1.25μl

리버스 프라이머(100ng/μl) 1.25μl

dNTP 1μl

증류수 38.5μl

DNA 폴리머라제 1μl

합계 50μl

PCR 반응 후, 반응액에 DNA 폴리머라제 I를 0.5μl 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하여, 주형 플라스미드를 분해시켰다.

얻어진 반응액으로, Escherichia coli DH5α(supE44, ΔlacU169(Ø80lacZΔM15), hsdR17, recAi, endA1, gyrA96, thi-1, relA1)의 캄피턴트 셀(Competent cells)을 형질 전환하였다. 암피실린(50㎍/ml) 및 카나마이신(30㎍/ml)를 포함한 LB한천 배지(박토 트립톤 1%, 효모 엑기스 0.5%, 염화나트륨 1%, 한천 1.5%) 상에 생육해 온 콜로니 수개로부터 플라스미드 DNA를 조제하고, 서열 해석을 실시해서, GDHα서브유닛 유전자에 목적한 변이가 도입된 것을 확인하였다.

[표 1] R53∼H73 영역 치환용 프라이머

[표 2] E88∼A108 영역 치환용 프라이머

[표 3] N308∼G336 영역 치환용 프라이머

[표 4] K362∼I1377 영역 치환용 프라이머

[표 5] A391∼Y453 영역 치환용 프라이머

[표 6] I477∼R497 영역 치환용 프라이머

[표 7] S509∼V539 영역 치환용 프라이머

〔실시예 3〕변이 GDH의 기질 특이성의 해석

실시예 2에서 얻어진 변이 GDH 발현 플라스미드를 이용하여, 변이 GDH를 제조하고, 기질 특이성을 검토하였다.

(1) 배양

변이 도입한 Escherichia coli DH5α주를, 각각 2ml의 LB배양지(암피실린 50㎍/ml 및 카나마이신 30㎍/ml 함유)에서, L자 관을 이용하여 37℃에서 하룻밤 흔들어 섞어 배양하였다.

이들 배양액을, 150ml의 LB배양지(암피실린 50㎍/ml 및 카나마이신 30㎍/ml 함유)를 포함한 500ml의 사카구치(Sakaguchi) 플라스크에 균을 넣고, 37℃에서 흔들어 섞어 배양하였다. 배양 개시로부터 3시간 후에 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)를 최종농도 0.1mM가 되도록 첨가하고, 2시간 더 배양하였다.

(2) 원액효소(crude enzyme) 샘플의 조제

상기에서 배양한 배양액으로부터 균체를 모아, 세정한 후, 습균체 0.3mg당 1ml의 0.2% Triton X100를 포함한 10mM 인산칼륨 버퍼(PPB) (pH7.0)로, 균체를 현탁하고, 초음파 파쇄하였다. 이 현탁액 원심분리(10000r.p.m, 10분, 4℃)하여 잔사를 제거한 후, 상청액을 초원심분리(50000r.p.m., 60분, 4℃)하여, 얻어진 상청액(수용성화분)을, 원액효소 샘플로 하였다. 또한, 이 샘플을, 통상의 소수성 크로마토그래피(컬럼명: 옥틸세파로스(아마샴·bioscience제)) 및 이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로스(아마샴·bioscience제))에 의해 정제하고, 정제 효소 샘플을 얻었다. 목적으로 하는 효소 화분(fraction)의 결정은, GDH 활성을 지표로서 실시하였다.

(3) GDH 활성의 측정

상기 효소 샘플 8μl에, 활성 측정용 시약(12μl의 600mM 메틸페나진 메토설페이트(PMS), 120μl의 6mM 2,6-디클로로페놀인도페놀(DCIP)에, 0.2(w/v)% Triton X-100 10mM PPB를 첨가하여, 전량 480μl로 한 용액)을 8μl 첨가하였다. 이것을 알루미늄 블록 항온조를 이용하여, 각 반응 온도로 1분간 프레인큐베이트한 후, 재빨리 각 농도의 기질(글루코오스 또는 말토오스), 또는 증류수를 8μl 첨가하여 교 반하고, 분광 광도계를 이용하여 DCIP 유래의 흡수 파장인 600nm의 흡광도를 측정하였다. 각 시약의 최종농도는 DCIP;0.06mM, PMS;0.6mM. 기질의 최종농도는 5mM이다.

결과를, 표 8∼14에 나타낸다. 한편, 야생형 GDH의 반응비는 48%였다.

[표 8]

[표 9]

[표 10]

[표 11]

[표 12]

[표 13]

[표 14]

이 결과, 472D+475H+365F가, 글루코오스에 대한 반응성을 유지하면서, 말토오스와의 반응성이 1%대까지 저하하는 매우 효과가 높은 변이였다.

365위 이외의 변이에서는, G324, S326, L333, W334, S368, R369, K376, I377, V418, P419, Y436, K433, H448, A525, L529의 페닐알라닌으로의 변이가 말토오스와의 반응성에 대해 변이 도입전의 60% 이하가 되어 효과가 보였다.

[실시예 4] 365위로의 변이 도입의 검증

실시예 3에서 얻어진 결과로부터, 365위는 말토오스와의 반응성 저하에 있어서 매우 효과적인 부위인 것이 추측되었다. 따라서 이 부위를 상세히 검토하기로 하였다.

구체적으로는 α서브유닛 유전자에 대한, 365위에의 단변이 도입에 의한 기질 특성 개선 효과를 검증하였다.

pTrc99Aγαβ에 포함되는 야생형 GDHα서브유닛 유전자의 365위에 변이 도입을 실시하고, 변이 효소의 기질 특이성을 평가하였다. 변이 도입에 관해서는 실시예 2와 마찬가지로 실시하였다.

변이 도입용 포워드 프라이머는 이하와 같다. 리버스 프라이머는, 포워드 프라이머의 완전 상보쇄로 하였다.

[표 15] S365위 치환용 프라이머

〔실시예 5〕 변이 GDH의 기질 특이성의 해석

실시예 4에서 얻어진 변이 GDH 발현 플라스미드를 이용하여, 실시예 3과 동일하게 하여, 변이 GDH를 제조하고, 기질 특이성을 검토하였다. 효소 활성은, 원액 효소 샘플을 이용하여 실시하였다. 각각의 변이 GDH의 글루코오스에 대한 비활성, 말토오스에 대한 비활성, 반응비(말토오스에 대한 비활성(比活性)/글루코오스에 대한 비활성. 단위는 U/ml)를, 표 16에 나타낸다. 기질 농도에 관해서는 5mM 및 10mM으로 평가하였다.

[표 16] 단변이 도입 U/ml(배양액)

그 결과, 365위에 관해서는, 야생형에서의 세린잔기 이외의 19종류 모든 아미노산 치환으로 기질 특성 개선 효과가 인정되었다. 구체적으로는 모든 아미노산 치환으로, 야생형과 비교해서, 말토오스에 대한 반응성이 50%이상 저하되고 있었다. 특히 티로신, 트립토판으로의 치환에서는, 기질 농도 5mM, 10mM의 어느 것에 있어서나, 야생형이 반응비 40% 정도인 데 비해서, 2% 이하로, 말토오스에 대한 반 응성이 야생형의 90% 이상 저하하여, 극히 큰 기질 특성 개선 효과가 인정되었다.

〔실시예 6〕365위와 다른 부위의 조합 효과의 검증

실시예 2 및 실시예 5의 결과에 의해, 365위는 적어도 365F와 472D+475H의 조합에 있어서 효과가 확인되고, 게다가 365위만의 단변이 도입에 있어서 모든 아미노산 치환에서 효과를 볼 수 있던 것으로부터, 기질 특성 개선 효과가 매우 높은 부위인 것이 명백해졌다. 따라서, 365위의 아미노산 치환과 다른 부위와의 아미노산 치환과의 조합에 의한, 더 큰 기질 특성 개선을 목표로 하여, 더 열심히 검토하였다. 구체적으로는 365위와 326위, 529위, 472위의 어느 하나와의 조합으로 2변이 도입, 및 472및 475위의 변이의 조합에 의한 3변이 도입을 검토하였다.

[표 17] 2변이도입 U/ml(배양액)

[표 18] 3변이도입 U/ml(배양액)

검토한 모든 부위와의 조합에 있어서 상승효과적으로 기질 특성이 개선되는 것이 발견되고, 365위는 기질 특성을 개선하는 다른 부위에 있어서의 아미노산 치환과의 조합에 의해 기질 특성을 더 개선할 수 있는 것이 명백해졌다.

〔실시예 7〕472위 및 475위와, 다른 부위와의 조합 효과의 검증

실시예 6의 결과에 의해, 기질 특성 개선 효과가 있는 아미노산 치환은, 그들 부위끼리의 조합에 의해 상승효과적으로 기질 특성이 개선될 가능성이 시사되었다.

따라서, 이미 발명자들에 의해서 기질 특성 개선 효과가 확인되고 있는 부위인 472, 475위와 365위 이외의 부위와의 조합 효과를 검증하였다.

구체적으로는 472위와 475위의 조합에 있어서 가장 기질 특성 개선 효과가 높았던 472D+475H와, 326위 또는 529위와의 조합을 검증하였다. 또한, 472위 및 475위의 다른 변이에 대해서도, 마찬가지로 검증하였다.

[표 19] 3변이도입 U/ml(배양액)

[표 20] 3변이도입 U/ml(배양액)

[표 21] 4변이도입 U/ml(배양액)

472 및 475위와, 다른 부위와의 조합에 있어서도 상승효과가 확인되었다.

특히 472, 475, 326, 529위의 4변이 도입은 말토오스에 대한 반응성 저하 효과가 높고, 이 결과로부터도 기질 특성 개선 효과가 있는 아미노산 치환끼리의 조합에 의해 상승효과적으로 기질 특성을 개선할 수 있는 것이 나타났다.

〔실시예 7〕정제 효소의 조제

실시예 5 및 6에서 기질 특이성의 개선이 인정된 몇가지 변이 GDH에 대하여 정제를 실시하였다. 방법은 실시예 3에 기재된 대로 실시하였다. 각 정제 효소의 글루코오스에 대한 비활성(U/mg)을 표 8에 나타낸다.

그 결과, S365Y를 포함한 변이는, 글루코오스에 대한 비활성을 90% 가깝게 유지하고, 글루코오스 측정의 관점에서는 바람직한 변이인 것이 명백해졌다. 또한 S326Q 변이는 글루코오스에 대한 비활성을 높이는 효과가 있는 것도 판명되었다.

[표 22]

〔실시예 9〕변이 GDH를 이용한 혈당 측정용 비색식(colorimetric) 감지기의 제작

실시예 8에서 얻어진 정제 변이 효소를 이용하여 글루코오스 감지기를 제작하였다.

도 1에 나타내는 기본 구성을 가진 글루코오스 감지기를 제작하였다. 즉, 상기 글루코오스 감지기는, 투명 기판(2A)에 대해서 스페이서(3)를 통하여 투명 커버 (4A)(재질 PET)를 적층한 형태를 가지며, 각 요소 2A∼4A에 의해서 캐필러리(5A)가 규정되고 있다. 캐필러리(5A)의 치수는, 1.3mm×9mm×50㎛이다(도 1). 투명 기판 (2A) 및 투명 커버(4A)는, 두께가 250㎛인 PET에 의해 형성하고, 스페이서(3A)는 검은색의 양면 테이프에 의해 구성하였다.

글루코오스 감지기는, 도 2에 나타내는 제1 시약부∼제3 시약부를 가지며, 각각 성분 및 도포량을 표 23에 나타낸다. 표중, 「Ru」는, 헥사루테늄안민 착체 (Ru(NH₃)₆Cl₃)를, CHAPS는 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio] propanesulfonic acid를, ACES는 N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid를, MTT는 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide를, 각각 나타낸다.

[표 23]

제1 시약부

전자 전달 물질 함유 시약부용 재료액(용매는 물)

제2 시약부

효소 함유 시약부용 재료(용매는 물)

제3 시약부

발색제 함유 시약부용 재료액(용매는 물)

상기 글루코오스 감지기의 캐필러리에 측정 시료를 공급하고, 그 시점으로부터 0.1초마다 흡광도를 반복 측정하고, 흡광도의 타임 코스를 작성하였다. 각 회의 흡광도의 측정에 대해서는, 제3 시약부에 대해서, 캐필러리의 높이 방향을 따라서 빛을 조사하고, 그 때에 글루코오스 감지기를 투과한 빛을 수광하였다. 빛의 조사는, 발광 다이오드를 이용하여 630nm의 빛을 조사함으로써 실시하였다. 투과광은, 포토 다이오드에서 수광하였다.

측정 시료로서는, 글루코오스를 첨가한 혈액을 이용하였다. 헤마토크릿(hematocrit)을 42%로 조정한 혈액에, 0, 100, 200, 400, 600 또는 800mg/dl의 농도가 되도록 글루코오스를 첨가한 것을 이용하여, 글루코오스 감지기의 직선성을 평가하였다. 또한 직선성 평가는 측정 시료의 감지기에의 도입 5초후의 엔드 포인트의 흡광도를 플롯하는 것에 의해 행하였다. 결과를, 도 3에 나타낸다.

또한, 헤마토크릿값 45%, 글루코오스 농도 45mg/dl로 조정한 혈액에, 말토오스를 0, 100, 200 또는 300mg/dl가 되도록 더 첨가한 것을 이용하여, 말토오스의 영향을 평가하였다. 결과를, 도 4에 나타낸다. 이 시험도 마찬가지로 측정 시료 도입 5초후의 흡광도를 플롯하는 것에 의해 행하였다.

글루코오스를 기질로서 이용한 직선성 평가에서는, 모든 효소에 관해서 농도 의존적으로 흡광도가 증가하여, 글루코오스를 측정 가능하다는 것을 알 수 있다. 특히 365를 포함한 변이인 365Y 및 326Q365Y는 야생형보다 직선성이 증가하고 있으며, 보다 고농도영역(600mg/dl부근)까지 측정 가능하다는 것이 시사된다.

다음에 말토오스 영향에 관해서, 글루코오스 45mg/dl에 말토오스를 첨가했을 경우, 야생형에서는 말토오스 농도에 의존하여 흡광도가 크게 증가하여, 말토오스와 강하게 반응하고 있는 것이 시사된다. 한편 변이 효소를 이용한 감지기에서는, 말토오스 농도에 따른 흡광도의 증가가 억제되고 있으며, 말토오스의 영향이 적어지는 것을 알 수 있다. 이들 데이터를 외관의 혈당 상승치로 환산한 결과를 도 5 및 표 24에 나타낸다. 야생형 효소를 이용한 감지기에서는, 저혈당(45mg/dl 글루코오스)이 말토오스의 혼입에 의해서 정상영역 이상의 것(138mg/dl 글루코오스)으로 겉보기상 표시되어 버린다. 한편, 개변 GDH를 이용한 감지기에서는, 말토오스가 최대 300mg/dl 혼입하고 있는 경우에도, 겉보기의 혈당치가 최대로도 60mg/dl까지 밖에 상승하지 않고, 영향은 대폭적으로 억제할 수 있다고 할 수 있다. 결론적으로는 365를 포함한 변이가, 글루코오스에 대한 반응성(직선성)과 말토오스 영향의 관점으로부터 최적이라고 하는 것이 시사된다.

[표 24]

*단위는 mg/dl

이상의 결과로부터 명백하듯이, 변이 GDH를 이용한 글루코오스 감지기는, 직선성도 야생형과 동일한 정도 이상 확보되고 있음에도 불구하고, 말토오스와의 반응성이 크게 저하되고 있다. 이 변이 GDH를 이용한 글루코오스 감지기를 이용하면, 병원 등에서 투여되는 혈중 말토오스 농도의 상한치인 200mg/dl에서는 정오차는 없다고 할 수 있고, 상한치 이상의 300mg/dl에서도 저혈당(50mg/dl이하)이 정상치나 고혈당으로 판정되는 경우는 없고, 안전한 치료를 행할 수 있다. 또한 상술한 바와 같이 GDH는 용존 산소와도 반응하지 않기 때문에, 이 변이 GDH를 이용한 감지기를 제공함으로써, 당뇨병 환자의 정확한 진단 치료를 행할 수 있다.

〔실시예 9〕정제 효소의 SV플롯 평가

실시예 5 및 6에서 특히 기질 특이성 개선 효과가 인정된 365Y 및 326Q+365Y변이 GDH에 대해서, 정제 효소를 이용한 SV플롯을 취득하였다.

그 결과, 정제한 효소에 있어서도, 시험한 모든 기질 농도에 관해서, 반응비 (말토오스에 대한 비활성/글루코오스에 대한 비활성)가 야생형과 비교해서 대폭 낮아져서 개선되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 결과에 관해서도 원액 효소 용액에 의한 측정 결과와 거의 일치한 점에서, 원액 효소에 의한 개변 효소의 평가는 충분히 가능하다고 하는 것을 확인할 수 있었다. 더 덧붙이면, 말토오스 수액에 의한, 혈중의 말토오스 농도의 상승은 최대에서도 200mg/dl까지 밖에 상승하지 않기 때문에, 특히 기질 농도 10mM(360mg/d1)와 5mM(180mg/dl)에 있어서의 반응비에 주목하였다. 그 결과, 이 농도영역에 있어서의 S365Y변이의 말토오스/글루코오스 반응비는 0.1%로, 말토오스와는 거의 반응하지 않는 것이 시사되었다.

또한 326Q를 365Y에 부가함으로써, 글루코오스에 대한 비활성을 높여, 상대적으로 말토오스와의 반응성을 낮출 수 있는 것도 명백해졌다.

[표 25] 효소 특성 평가

[산업상 이용가능성]

본 발명의 변이 GDH는, 글루코오스에 대한 기질 특이성이 향상하고 있어, 글루코오스 감지기 등을 이용한 글루코오스의 측정에 매우 적합하게 사용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Arkray, Inc. <120> Mutant glucose dehydrogenase <130> G1017-C6142 <150> JP2005-179231 <151> 2005-06-20 <160> 227 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2467 <212> DNA <213> Burkhorderia cepacia <220> <221> CDS <222> (258)..(761) <220> <221> CDS <222> (764)..(2380) <220> <221> CDS <222> (2386)..(2466) <400> 1 aagctttctg tttgattgca cgcgattcta accgagcgtc tgtgaggcgg aacgcgacat 60 gcttcgtgtc gcacacgtgt cgcgccgacg acacaaaaat gcagcgaaat ggctgatcgt 120 tacgaatggc tgacacattg aatggactat aaaaccattg tccgttccgg aatgtgcgcg 180 tacatttcag gtccgcgccg atttttgaga aatatcaagc gtggttttcc cgaatccggt 240 gttcgagaga aggaaac atg cac aac gac aac act ccc cac tcg cgt cgc 290 Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg 1 5 10 cac ggc gac gca gcc gca tca ggc atc acg cgg cgt caa tgg ttg caa 338 His Gly Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln 15 20 25 ggc gcg ctg gcg ctg acc gca gcg ggc ctc acg ggt tcg ctg aca ttg 386 Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr 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Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met 370 375 380 Lys Pro Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr 385 390 395 400 Val Gln Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg 405 410 415 Ile Val Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro 420 425 430 Glu Ile Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His 435 440 445 Thr Arg Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp 450 455 460 Val Val Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser 465 470 475 480 Thr Ile Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys 485 490 495 Arg Thr Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met 500 505 510 Pro Thr Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala 515 520 525 Leu Arg Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val 530 535 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Burkhorderia cepacia <400> 4 Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu 1 5 10 15 Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp 20 25 <210> 5 <211> 1441 <212> DNA <213> Burkholderia cepacia <220> <221> CDS <222> (121)..(1398) <400> 5 tccgaacctg ttcatttcga gcagcgcgac gatgccgacc gtcggtaccg taaacgtgac 60 gctgacgatc gccgcgctcg cgctgcggat gtcggacacg ctgaagaagg aagtctgacc 120 gtg cgg aaa tct act ctc act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg 168 Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu 1 5 10 15 ccg ggc ttc gcg cgc gcg gcc gat gcg gcc gat ccg gcg ctg gtc aag 216 Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys 20 25 30 cgc ggc gaa tac ctc gcg acc gcc atg ccg gta ccg atg ctc ggc aag 264 Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys 35 40 45 atc tac acg agc aac atc acg ccc gat ccc gat acg ggc gac tgc atg 312 Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met 50 55 60 gcc tgc cac acc gtg aag ggc ggc aag ccg tac gcg ggc ggc ctt ggc 360 Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly 65 70 75 80 ggc atc ggc aaa tgg acg ttc gag gac ttc gag cgc gcg gtg cgg cac 408 Gly Ile Gly 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tga catagtcggg cgcgccgaca 1418 Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg 420 425 cggcgcaacc gataggacag gag 1441 <210> 6 <211> 425 <212> PRT <213> Burkholderia cepacia <400> 6 Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu 1 5 10 15 Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys 20 25 30 Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys 35 40 45 Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met 50 55 60 Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly 65 70 75 80 Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His 85 90 95 Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val 100 105 110 Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr 115 120 125 Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu 130 135 140 Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp 145 150 155 160 Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala 165 170 175 Glu 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<400> 21 acttcatggc gccgtttccg tcgagcccc 29 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 22 cttcatggcg ccgtactttt cgagcccctg ggc 33 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 23 gcgccgtacc cgtttagccc ctgggcg 27 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 24 cgccgtaccc gtcgtttccc tgggcgccg 29 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 25 ccgtacccgt cgagcttttg ggcgccgcat ccc 33 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 26 ccgtcgagcc cctttgcgcc gcatccc 27 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 27 cgtcgagccc ctggtttccg catcccgagt acg 33 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 28 cgagcccctg ggcgtttcat cccgagtacg gcc 33 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 29 ccctgggcgc cgtttcccga gtacggc 27 <210> 30 <211> 43 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 30 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tgatggacca tccgggcttt ggcgtgtcgt tctatgc 37 <210> 66 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 66 ggaccatccg ggcacctttg tgtcgttcta tgcgagc 37 <210> 67 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 67 tccgggcacc ggcttttcgt tctatgcgag c 31 <210> 68 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 68 gggcaccggc gtgtttttct atgcgagcga g 31 <210> 69 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 69 cggcgtgtcg ttctttgcga gcgagaagc 29 <210> 70 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 70 ccggcgtgtc gttctatttt agcgagaagc tgtggcc 37 <210> 71 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 71 ggcgtgtcgt tctatgcgtt tgagaagctg tggccgg 37 <210> 72 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 72 gtgtcgttct atgcgagctt taagctgtgg ccgggcc 37 <210> 73 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 73 gttctatgcg agcgagtttc tgtggccggg ccg 33 <210> 74 <211> 29 <212> DNA <213> artificial 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<211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 143 tcgacgacta cgtgaagttt ggcgccgcgc atacg 35 <210> 144 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 144 cgactacgtg aagcgctttg ccgcgcatac gcg 33 <210> 145 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 145 tacgtgaagc gcggctttgc gcatacgcgc gag 33 <210> 146 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 146 tgaagcgcgg cgcctttcat acgcgcgagg tct 33 <210> 147 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 147 gcggcgccgc gtttacgcgc gaggtct 27 <210> 148 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 148 cggcgccgcg cattttcgcg aggtctacgc g 31 <210> 149 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 149 ggcgccgcgc atacgtttga ggtctacgcg acc 33 <210> 150 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 150 gccgcgcata cgcgctttgt ctacgcgacc gcc 33 <210> 151 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 151 gcatacgcgc gagttttacg cgaccgccg 29 <210> 152 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 152 acgcgcgagg tctttgcgac cgccgcg 27 <210> 153 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 153 cgatccgaac catcacttta cgggctcgac gatca 35 <210> 154 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 154 cgatccgaac catcacatct ttggctcgac gatcatggg 39 <210> 155 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 155 tccgaaccat cacatcacgt tttcgacgat catgggcgc 39 <210> 156 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 156 catcacatca cgggctttac gatcatgggc gcc 33 <210> 157 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 157 atcacatcac gggctcgttt atcatgggcg ccgatgc 37 <210> 158 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 158 cacgggctcg acgtttatgg gcgccgatg 29 <210> 159 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 159 cgggctcgac gatctttggc gccgatgcg 29 <210> 160 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 160 gggctcgacg atcatgtttg ccgatgcgcg cga 33 <210> 161 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 161 gctcgacgat catgggcttt gatgcgcgcg actcc 35 <210> 162 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 162 cgatcatggg cgcctttgcg cgcgactcc 29 <210> 163 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 163 cgatcatggg cgccgatttt cgcgactccg tcgtc 35 <210> 164 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 164 tgggcgccga tgcgtttgac tccgtcgtcg aca 33 <210> 165 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 165 gcgccgatgc gcgcttttcc gtcgtcgaca agg 33 <210> 166 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 166 cgatgcgcgc gactttgtcg tcgacaagga c 31 <210> 167 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 167 tgcgcgcgac tcctttgtcg acaaggactg c 31 <210> 168 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 168 cgcgcgactc cgtctttgac aaggactgcc g 31 <210> 169 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 169 cgcgactccg tcgtctttaa ggactgccgc acg 33 <210> 170 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 170 cgactccgtc gtcgactttg actgccgcac gttcg 35 <210> 171 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 171 ctccgtcgtc gacaagtttt gccgcacgtt cgacc 35 <210> 172 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 172 cgtcgtcgac aaggactttc gcacgttcga ccatc 35 <210> 173 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 173 gtcgtcgaca aggactgctt tacgttcgac catccgaac 39 <210> 174 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 174 cgaacctgtt catttcgagc tttgcgacga tgccgaccg 39 <210> 175 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 175 cctgttcatt tcgagcagct ttacgatgcc gaccgtcgg 39 <210> 176 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 176 tcatttcgag cagcgcgttt atgccgaccg tcggtac 37 <210> 177 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 177 gagcagcgcg acgtttccga ccgtcggta 29 <210> 178 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 178 gagcagcgcg acgatgttta ccgtcggtac cgtaaac 37 <210> 179 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 179 cagcgcgacg atgccgtttg tcggtaccgt aaacgtg 37 <210> 180 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 180 gcgacgatgc cgacctttgg taccgtaaac gtgac 35 <210> 181 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 181 cgatgccgac cgtctttacc gtaaacgtga cgc 33 <210> 182 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 182 gatgccgacc gtcggttttg taaacgtgac gctgacg 37 <210> 183 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 183 cgaccgtcgg tacctttaac gtgacgctga cga 33 <210> 184 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 184 cgaccgtcgg taccgtattt gtgacgctga cgatcgc 37 <210> 185 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 185 cgtcggtacc gtaaacttta cgctgacgat cgccg 35 <210> 186 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 186 gtcggtaccg taaacgtgtt tctgacgatc gccgcgc 37 <210> 187 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 187 gtaccgtaaa cgtgacgttt acgatcgccg cgctc 35 <210> 188 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 188 ccgtaaacgt gacgctgttt atcgccgcgc tcgcg 35 <210> 189 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 189 acgtgacgct gacgtttgcc gcgctcgcg 29 <210> 190 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 190 cgtgacgctg acgatctttg cgctcgcgct gcg 33 <210> 191 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 191 acgctgacga tcgcctttct cgcgctgcgg atg 33 <210> 192 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 192 gacgatcgcc gcgtttgcgc tgcggatgt 29 <210> 193 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 193 cgatcgccgc gctctttctg cggatgtcgg aca 33 <210> 194 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 194 gccgcgctcg cgtttcggat gtcggacac 29 <210> 195 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 195 ccgcgctcgc gctgtttatg tcggacacgc tga 33 <210> 196 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 196 gctcgcgctg cggttttcgg acacgctgaa g 31 <210> 197 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 197 tcgcgctgcg gatgtttgac acgctgaaga agg 33 <210> 198 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 198 cgcgctgcgg atgtcgttta cgctgaagaa ggaagtc 37 <210> 199 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 199 cgcgctgcgg atgtcgatgt ttctgaagaa ggaagtc 37 <210> 200 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 200 cgcgctgcgg atgtcgatga cgtttaagaa ggaagtc 37 <210> 201 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 201 cgcgctgcgg atgtcgatga cgctgtttaa ggaagtc 37 <210> 202 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 202 cgcgctgcgg atgtcgatga cgctgaagtt tgaagtc 37 <210> 203 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 203 cgcgctgcgg atgtcgatga cgctgaagaa gtttgtc 37 <210> 204 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 204 cgcgctgcgg atgtcgatga cgctgaagaa ggaattt 37 <210> 205 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 205 gaagaagatc cacctgggca acctgtcgcg catcg 35 <210> 206 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 206 aagatccacc tggcgaacct gtcgcgc 27 <210> 207 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 207 gaagaagatc cacctggtga acctgtcgcg catcg 35 <210> 208 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 208 gaagaagatc cacctgctga acctgtcgcg cat 33 <210> 209 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 209 gcgaagaaga tccacctgat taacctgtcg cgcatcgac 39 <210> 210 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 210 gaagaagatc cacctgatga acctgtcgcg catcg 35 <210> 211 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 211 aagatccacc tgccgaacct gtcgcgc 27 <210> 212 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 212 gcgaagaaga tccacctgtt taacctgtcg cgcatcg 37 <210> 213 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 213 agaagatcca cctgtggaac ctgtcgcgc 29 <210> 214 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 214 gaagaagatc cacctgacca acctgtcgcg catcg 35 <210> 215 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 215 gcgaagaaga tccacctgaa caacctgtcg cgcatcg 37 <210> 216 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 216 gaagaagatc cacctgcaga acctgtcgcg catcg 35 <210> 217 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 217 gcgaagaaga tccacctgta taacctgtcg cgcatcg 37 <210> 218 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 218 gaagaagatc cacctgtgca acctgtcgcg catcg 35 <210> 219 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 219 gcgaagaaga tccacctgaa aaacctgtcg cgcatcgac 39 <210> 220 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 220 gaagaagatc cacctgcgca acctgtcgcg catcg 35 <210> 221 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 221 gcgaagaaga tccacctgca taacctgtcg cgcatcg 37 <210> 222 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 222 gcgaagaaga tccacctgga taacctgtcg cgcatcg 37 <210> 223 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 223 gcgaagaaga tccacctgga aaacctgtcg cgcatcg 37 <210> 224 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 224 cgtgttcaac gacgaattcg atccgaacaa tcacatcacg g 41 <210> 225 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 225 ccgtgatgtg attgttcgga tcgaattcgt cgttgaacac g 41 <210> 226 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 226 aattcgcgcc gaaccaccac atcacgggct c 31 <210> 227 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 227 gagcccgtga tgtggtggtt cggcgcgaat t 31

Claims

서열번호 3에 나타내는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 365위 이외의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환된 아미노산 서열을 포함하며, 또한, 글루코오스 탈수소효소 활성을 가진 단백질로서, 상기 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 치환은 324F, 326F, 326C, 326Q, 326T, 326V, 326G, 326L, 326E, 326I, 326K, 333F, 334F, 368F, 369F, 376F, 377F, 418F, 419F, 436F, 433F, 448F, 525F, 529F, 529Y, 529H, 또는 529W이고, 상기 아미노산 서열의 365위에 상당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된, 글루코오스에 대한 기질 특이성이 향상한 변이 글루코오스 탈수소효소.
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제 1 항에 있어서, 365위에 상당하는 위치의 아미노산 잔기가 야생형인 글루코오스 탈수소효소와 비교해서, 이당류에 대한 반응성이 저하한 것을 특징으로 하는, 변이 글루코오스 탈수소효소.
제 3 항에 있어서, 이당류가 말토오스인 것을 특징으로 하는 변이 글루코오스 탈수소효소.
제 4 항에 있어서, 말토오스에 대한 반응성이 글루코오스에 대한 반응성의 20% 이하인 것을 특징으로 하는 변이 글루코오스 탈수소효소.
제 1 항에 있어서, 상기 다른 아미노산 잔기가, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 히스티딘으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 변이 글루코오스 탈수소효소.
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제 1 항에 있어서, 서열번호 3에 나타내는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환된 아미노산 서열을 포함하며, 또한 글루코오스 탈수소효소 활성을 가진 단백질로서, (i) 상기 아미노산 서열에 있어서의 324, 326, 333, 334, 368, 369, 376, 377, 418, 419, 436, 433, 448, 525 및 529로부터 선택되는 적어도 1개의 위치에 상당하는 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 치환, (ⅱ) 472위에 상당하는 위치의 아미노산 잔기의 아스파라긴산으로의 치환, 및 (ⅲ) 475위에 상당하는 아미노산 잔기의 히스티딘으로의 치환을 포함하되, 상기 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 치환은 324F, 326F, 326C, 326Q, 326T, 326V, 326G, 326L, 326E, 326I, 326K, 333F, 334F, 368F, 369F, 376F, 377F, 418F, 419F, 436F, 433F, 448F, 525F, 529F, 529Y, 529H, 또는 529W이고; 상기 다른 아미노산 잔기가 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판인, 변이 글루코오스 탈수소효소.
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제 18 항에 있어서, 상기 위치가 326위이고, 이 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민 또는 발린으로 치환된 것을 특징으로 하는 변이 글루코오스 탈수소효소.
제 18 항에 있어서, 상기 위치가 529위이고, 이 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 티로신, 히스티딘 또는 트립토판으로 치환된 것을 특징으로 하는 변이 글루코오스 탈수소효소.
서열번호 7의 아미노산 서열을 포함한 FAD 결합형 변이 글루코오스 탈수소효 소.
제 1 항, 제 3 항 내지 제 6 항, 제 18 항 및 제 20 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소와, 전자전달 서브유닛을 적어도 포함한 변이 글루코오스 탈수소효소 복합체.
제 23 항에 있어서, 전자전달 서브유닛이 시토크롬 C인 것을 특징으로 하는 글루코오스 탈수소효소 복합체.
제 1 항, 제 3 항 내지 제 6 항, 제 18 항 및 제 20 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소를 코드하는 DNA.
제 1 항, 제 3 항 내지 제 6 항, 제 18 항 및 제 20 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소를 생성하는 미생물.
제 1 항, 제 3 항 내지 제 6 항, 제 18 항 및 제 20 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소를 포함한, 글루코오스 어세이 키트.
제 1 항, 제 3 항 내지 제 6 항, 제 18 항 및 제 20 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소를 포함한, 글루코오스 감지기(sensor).