KR20030055293A

KR20030055293A - 신규 글루코오스 탈수소효소 및 해당 탈수소효소의제조방법

Info

Publication number: KR20030055293A
Application number: KR10-2003-7005980A
Authority: KR
Inventors: 고지 소데
Original assignee: 고지 소데
Priority date: 2000-10-31
Filing date: 2001-10-31
Publication date: 2003-07-02
Also published as: JP4107386B2; CA2427031A1; PL207576B1; US8715989B2; US20100193355A1; NZ525576A; US20090029437A1; CA2427031C; CN100482798C; EP1331272A1; AU2002210991B2; US20040023330A1; US20100285566A1; US20140220657A1; US20110250671A1; US20100291655A1; JPWO2002036779A1; DE60128824D1; CN1484703A; WO2002036779A1

Abstract

버크호르데리아속에 속하고, 글루코오스 탈수소효소를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배지에서 배양하고, 상기 배지 및/또는 상기 미생물 균체로부터 글루코오스 탈수소효소를 채취함에 의해, 기질특이성이 높고, 염가에 생산할 수 있고, 측정샘플 내의 용존산소의 영향을 받지 않은 효소로서, 특히 열안정성이 뛰어난 신규 글루코오스 탈수소효소를 얻는다.

Description

신규 글루코오스 탈수소효소 및 해당 탈수소효소의 제조방법{NOVEL GLUCOSE DEHYDROGENASE AND PROCESS FOR PRODUCING THE DEHYDROGENASE}

특정한 기질에 대하여 특이적으로 반응하는 효소를 사용한 바이오센서의 개발은, 산업의 분야를 막론하고 활발히 행하여지고 있다. 그 중에서도 특히 바이오센서의 하나인 글루코오스 센서는, 주로 의료분야에서 측정방법이나 그 방법을 이용한 장치의 개발이 활발히 행하여지고 있다.

글루코오스 센서는, 1962년에 Clark와 Lyons에 의해서 글루코오스 옥시다제와 산소전극을 조합한 바이오센서(L.c. Clark, J. and Lyonas, C." Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery." Ann, n. y. Acad. Sci., 105: 20-45)에 대해 최초로 보고된 이래, 약 40년 정도의 역사를 갖고 있다.

이와 같이, 글루코오스 센서에, 효소로서 글루코오스 옥시다제를 채용한 역사는 길다. 왜냐하면 글루코오스 옥시다제는, 글루코오스에 대한 기질특이성이 높고, 열안정성이 뛰어나고, 또한 효소의 양산화가 가능하고, 생산비용이 다른 효소와 비교해서 염가이기 때문이다.

기질특이성이 높다는 것은, 이 효소가 글루코오스 이외의 당과는 반응하지 않기 때문에, 측정치에 오차 없이, 정확한 측정을 행할 수 있다고 하는 이점이 있다.

또한, 열안정성이 우수하다는 것은, 효소가 열에 의해 변성하여 효소활성이 불활성화되는 문제를 방지할 수가 있고, 이로써 장기간 정확한 측정을 할 수 있다고 하는 이점이 있다.

그러나, 글루코오스 옥시다제는, 기질특이성이 높고, 열안정성이 뛰어나고, 염가에 생산할 수 있는 한편, 이하에서 설명하는 것과 같은 용존산소의 영향을 받아, 측정결과에 영향이 있다는 문제를 갖는다.

한편, 글루코오스 옥시다제 이외에, 글루코오스 탈수소효소(glucose dehydrogenase: 이하 '글루코오스 디히드로지나제'라고도 한다)를 이용한 글루코오스 센서의 개발도 행하여져 왔다. 이 효소는 또한 미생물 내에서 발견된다.

예를 들면, 바실러스 박테리아(Bacillusbacteria) 유래의 글루코오스 디히드로지나제(EC 1.1.1.47) 및 크립토코커스 박테리아(CryptococcusBacteria) 유래의 글루코오스 디히드로지나제(EC 1.1.1.119)가 알려져 있다.

전자의 글루코오스 디히드로지나제(EC 1.1.1.47)는, β-D-글루코오스 +NAD(P)⁺→D-δ-글루코노락톤 + NAD(P)H + H⁺의 반응을 촉매하는 효소이고, 후자의 글루코오스 디히드로지나제(EC 1.1.1.119)는, D-글루코오스 + NADP⁺→ D-δ-글루코노락톤 + NADPH + H⁺의 반응을 촉매하는 효소이다. 상술한 미생물 유래의 글루코오스 디히드로지나제는, 이미 시판도 되어 있다.

이들 글루코오스 디히드로지나제는, 측정샘플의 용존산소의 영향을 받지 않는다고 하는 이점을 갖는다. 이것은, 산소분압이 낮은 환경 하에서 측정을 하거나, 산소량이 많이 요구되는 고농도 샘플을 측정하는 경우이더라도, 측정결과에 오차를 미치게 하지 않고 정확히 측정할 수 있다는 이점에 이르게 한다.

그러나, 글루코오스 디히드로지나제는, 용존산소의 영향을 받지 않는 한편, 열안정성이 나쁘고, 기질특이성이 글루코오스 옥시다제보다도 뒤떨어진다고 하는 문제점을 갖는다.

그래서, 글루코오스 옥시다제나 글루코오스 디히드로지나제의 양 결점을 보충하는 효소의 제공이 요구되어져 왔다.

본 발명자는 Sode K., Tsugawa W., Yamazaki T., Watanabe M., Ogasawara N., and Tanaka M., Enzyme Microb. Technol. 19, 82-85(1996); Yamazaki T., Tsugawa W. and Sode K., Appli. Biochemi. and Biotec., 77-79/0325(1999); 및 Yamazaki T., Tsugawa W. and Sode K., Biotec. Lett., 21, 199-202(1999)에서, 온천근처의 토양으로부터 채취한 시료를 사용하여, 글루코오스 탈수소효소에 대한 연구결과를 보고하였다.

그러나, 해당 산소를 생산하는 능력을 갖는 균주의 확인은 해당 연구단계에서는 행하여지지 않았다.

[발명의 개시]

본 발명의 목적은, 종래의 알려진 글루코오스 옥시다제 및 글루코오스 디히드로지나제 양자의 결점을 각각 보충하는 효소, 즉, 기질특이성이 높고, 열안정성이 뛰어나고, 염가에 생산할 수 있고, 측정 샘플의 용존산소의 영향을 받지 않는 효소를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은, 상기 효소의 제조방법, 해당 효소의 특성을 살린 단백질 및 해당 효소를 생산하는 신규 미생물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 상기 효소를 코딩하는 DNA, 동일효소를 코딩하는 DNA를 함유하는 재조합 벡터, 동일 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 상기 효소, 형질전환체 또는 상기 미생물을 포함하는 효소전극을 사용한 글루코오스 센서, 및 상기효소를 포함하는 글루코오스 어세이 키트를 제공하는 것이다.

본 발명자는, 온천근처의 토양으로부터 상기의 목적에 맞은 효소를 생산하는 버크호르데리아 세파시아(Burkhorderia cepacia)를 단리하는 것에 성공하여, 본 발명에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 버크호르데리아속(genusBurkhorderia)에 속하고, 글루코오스 탈수소효소를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배지에서 배양하고, 상기 배지 및/또는 상기 미생물의 세포로부터 글루코오스 탈수소효소를 채취하는 단계를 포함하는 글루코오스 탈수소효소의 제조방법.

(2) 상기 미생물이 버크호르데리아 세파시아인 (1)의 글루코오스 탈수소효소의 제조방법.

(3) 상기 글루코오스 탈수소효소가 하기 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (2)의 글루코오스 탈수소효소의 제조방법:

(ⅰ) 상기 효소는 글루코오스의 탈수소반응을 촉매하는 작용을 하고;

(ⅱ) 상기 효소는 환원조건 하에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서, 분자량 약 60kDa와 분자량 약 43kDa를 나타내는 서브유닛으로 이루어지고;

(ⅲ) 상기 효소는 TSK Gel G3000SW(Tosoh Corporation)를 사용한 겔 여과 크로마토그래피에서, 분자량 약 380kDa를 나타내고; 그리고

(ⅳ) 상기 효소는 약 45℃에서 적당한 반응온도를 나타낸다(Tris-HCl 완충액, pH 8.0).

(4) 상기 분자량 약 43kDa의 서브유닛이 전자전달 단백질인 것을 특징으로 하는 (3)의 글루코오스 탈수소효소의 제조방법.

(5) 상기 전자전달 단백질이 시토크롬 C인 것을 특징으로 하는 (4)의 글루코오스 탈수소효소의 제조방법.

(6) 버크호르데리아속에 속하는 미생물에 의해서 생산될 수 있는 글루코오스 탈수소효소.

(7) 상기 미생물이 버크호르데리아 세파시아인 (6)의 글루코오스 탈수소효소.

(8) 상기 글루코오스 탈수소효소가 하기 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 (6) 또는 (7)의 글루코오스 탈수소효소:

(ⅱ) 상기 효소는 환원조건 하에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서, 분자량 약 60kDa와 분자량 약 43kDa를 나타내는 서브유닛으로 이루어지고;

(9) 상기 분자량 약 43kDa의 서브유닛이 전자전달 단백질인 것을 특징으로 하는 (8)의 글루코오스 탈수소효소.

(10) 상기 전자전달 단백질이 시토크롬 C인 것을 특징으로 하는 (9)의 글루코오스 탈수소효소.

(11) 상기 분자량 약 60kDa의 서브유닛이, 서열번호: 3의 아미노산 번호 2∼ 12의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (8)∼(10) 중 어느 하나의 글루코오스 탈수소효소.

(12) 상기 43kDa의 서브유닛의 N-말단이 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 (8)∼(11) 중 어느 하나의 글루코오스 탈수소효소.

(13) 상기 분자량 약 60kDa의 서브유닛이 이하의 (A) 또는 (B)에 나타내는 단백질인 (11)의 글루코오스 탈수소효소:

(A) 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(B) 서열번호: 3의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 갖고, 글루코오스 탈수소효소 활성을 갖는 단백질.

(14) 45℃ 부근과 75℃ 부근에 활성피크를 갖는 것을 특징으로 하는 (6)의 글루코오스 탈수소효소.

(15) (10)의 글루코오스 탈수소효소의 서브유닛으로서, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 시토크롬 C.

(16) (15)의 시토크롬 C의 일부를 코딩하고, 서열번호: 8에 기재된 핵산염기 서열을 갖는 DNA.

(17) (15)의 시토크롬 C의 일부를 코딩하고, 서열번호: 1에 기재된 핵산염기 서열 중 핵산염기번호 2386∼2467의 핵산염기 서열을 갖는 DNA.

(18) (15)의 시토크롬 C의 시그널 펩티드를 코딩하고, 서열번호: 1의 핵산염기 서열 중 핵산염기번호 2386∼2451의 핵산염기 서열을 포함하는 DNA.

(19) 시토크롬 C의 시그널 펩티드로서, 서열번호: 4의 아미노산 서열 중 아미노산번호 1∼22의 아미노산 서열을 갖는 펩티드.

(20) 하기 성질을 갖는 단백질:

(ⅰ) 상기 단백질은 서브유닛으로서 (6)의 글루코오스 탈수소효소를 구성할수 있고;

(ⅱ) 상기 단백질은 글루코오스 탈수소효소 활성을 갖고;

(ⅲ) 상기 단백질은 환원조건 하에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서, 분자량 약 60kDa를 나타내고; 그리고

(ⅳ) 상기 단백질은 약 75℃에서 적당한 반응온도를 나타낸다(Tris-HCl 완충액, pH 8.0).

(21) 서열번호: 3에 아미노산번호 2∼12의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (20)의 단백질.

(22) 상기 단백질이 이하의 (A) 또는 (B)에 나타내는 단백질인 (21)의 글루코오스 탈수소효소:

(A) 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(23) 이하의 (A) 또는 (B)에 나타내는 단백질:

(A) 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(24) 이하의 (A) 또는 (B)에 나타내는 단백질을 코딩하는 DNA:

(A) 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(25) 이하의 (a) 또는 (b)에 나타내는 DNA인 (24)의 DNA:

(a) 서열번호: 1의 핵산염기 서열 중, 핵산염기번호 764∼2380의 핵산염기 서열을 포함하는 DNA;

(b) 서열번호: 1에서 핵산염기번호 764∼2380의 서열을 포함하는 핵산염기 서열 또는 이 서열로부터 조제될 수 있는 프로브(probe)와 엄격한 조건 하에서 교배하여, 글루코오스 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.

(26) (24) 또는 (25)의 DNA를 포함하는 재조합 벡터.

(27) (18)의 시그널 펩티드 및 β-서브유닛을 코딩하는 핵산염기 서열을 포함하는 (26)의 재조합 벡터.

(28) (24) 또는 (25)의 DNA, 또는 (26) 또는 (27)의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.

(29) (28)의 형질전환체를 배양하여, 상기 DNA의 발현산물로서 글루코오스 탈수소효소를 생산하고, 이것을 채취하는 단계를 포함하는 글루코오스 탈수소효소의 제조방법.

(30) 버크호르데리아 세파시아 KS1 균주(strain)(FERM BP-7306).

(31) (6)∼(14) 중 어느 하나의 글루코오스 탈수소효소, (20)∼(23)중 어느하나의 단백질, (27)의 형질전환체, 또는 (30)의 균주를 포함하는 효소전극을 사용한 글루코오스 센서.

(32) (6)∼(14) 중 어느 하나의 글루코오스 탈수소효소, 또는 (20)∼(23) 중 어느 하나의 단백질을 포함하는 글루코오스 어세이 키트.

(33) 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질.

(34) 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.

(35) 서열번호: 1의 핵산염기 서열 중, 핵산염기번호 258∼761의 핵산염기 서열을 포함하는 (34)의 DNA.

(36) (34) 또는 (35)의 DNA와, (24) 또는 (25)의 DNA를 이 순차로 포함하는 DNA.

(37) 서열번호: 1의 핵산염기 서열 중, 핵산염기번호 258∼2380의 핵산염기 서열을 포함하는 (36)의 DNA.

(38) (36) 또는 (37)의 DNA를 포함하는 재조합 벡터.

(39) (18)의 시그널 펩티드 및 β-서브유닛을 코딩하는 핵산염기 서열을 포함하는 (38)의 재조합 벡터.

(40) (36) 또는 (37)의 DNA 또는 (38) 또는 (39)의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.

(41) (40)의 형질전환체를 배양하여, (36) 또는 (37)의 DNA의 발현물질로서 글루코오스 탈수소효소를 생산하고, 이것을 채취하는 단계를 포함하는 글루코오스 탈수소효소의 제조방법.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

<1> 본 발명의 글루코오스 탈수소효소를 생산하는 신규 균주

본 발명의 효소(이하, '본 효소' 또는 'GDH' 라고 하는 경우가 있다)는, 버크호르데리아속에 속하는 세균에 의해서 생산될 수 있다. 본 발명에 사용되는 버크호르데리아속 세균은, 본 효소의 생산기능을 갖는 버크호르데리아속 세균이면 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 버크호르데리아 세파시아, 특히 버크호르데리아 세파시아 KS1 균주가 바람직하다. 이 균주는, 하기 실시예에 나타내는 바와 같이, 본 발명자가 온천부근의 토양으로부터 분리한 신규 균주이고, 그 균학적 성질로부터 버크호르데리아 세파시아와 동일하게 정의되었다. 전통적으로, 버크호르데리아속에 속하는 미생물이 글루코오스 탈수소효소를 생산할 수 있는 것은 알려져 있지 않다. 이 균주는, KS1 균주로 명명되었다. 이 균주는, 2000년 9월 25일에 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센타(International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(일본국 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1-1 츠쿠바 중앙 6, 우: 305-8566)에 미생물 수탁번호 제 FERM BP-7306으로서 기탁되어 있다.

또, 본 발명자는 버크호르데리아 세파시아 KS1 균주 이외에 재단법인 발효연구소(Institute for Fermentation, 0saka, IF0) 또는 이화학연구소 미생물계통보존시설(Japan Collection of Microorganisms, JCM)에 기탁되어 있는 버크호르데리아 세파시아의 몇 개의 균주를 가져와서, 글루코오스 탈수소효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 이들 균주 모두에 활성이 있는 것을 확인하였다.

<2> 본 발명의 글루코오스 탈수소효소

글루코오스 탈수소효소 생산기능을 갖는 버크호르데리아속 세균, 예를 들면 버크호르데리아 세파시아 KS1 균주를, 미생물의 배양에 통상 사용되는 영양배지, 바람직하게는 효소생산 기능을 높이기 위해서 글루코오스 혹은 글루코오스를 포함하는 물질을 포함하는 배지에서 배양하면, 본 발명의 글루코오스 탈수소효소가 배양생성물 중 또는 균체 내에 생산되고 축적된다. 따라서, 공지의 방법으로 채취할 수가 있다. 본 효소의 제조방법을 버크호르데리아 세파시아 KS1 균주를 예로 하여 구체적으로 설명한다. 우선, 버크호르데리아 세파시아 KS1 균주를 적당한 영양배지, 예를 들면 적당한 탄소원, 질소원, 무기염류, 글루코오스 혹은 이들을 포함하는 물질 등을 포함하는 배지에서 배양하여, 본 효소를 배양생성물 또는 균체 내에 생산축적시킨다.

탄소원으로서는, 동화(assimilation)될 수 있는 것은 어떤 물질도 이용할 수 있고, 예를 들면, D-글루코오스, L-아라비노오스, D-크실로오스, D-매노오스, 전분, 각종 펩톤류 등을 들 수 있다. 질소원으로서는, 효모 엑기스, 맥아 엑기스, 각종 펩톤류, 각종 고기 엑기스류, 옥수수 전분 침출폐액(corn steep liquor), 아미노산 용액, 암모늄염 등 유기, 무기의 질소화합물 또는 이들을 함유한 물질을 이용할 수 있다. 무기염으로서는, 각종 인산염, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 칼슘 등의 염류가 사용된다. 또한, 필요에 따라서, 균의 생육 혹은 효소생산에 필요한 각종의 무기물이나 유기물, 예를 들면 실리콘유, 참깨유, 각종 계면활성제 등의 소포제(defoaming agent)나 비타민류를 배지에 첨가할 수가 있다.

배양의 형태로는, 액체배양 또는 고체배양의 어느 쪽도 사용 가능하지만, 액체배양이 대개 바람직하다.

이렇게 해서 얻어진 배양물의 배지 및/또는 균체로부터 본 발명의 효소를 얻을 수 있다. 균체 안에 있는 효소는, 균체를 파쇄 혹은 용해(lysing)함으로써, 균체추출액으로서 얻을 수 있다.

배양생성물 중 혹은 균체추출액 중의 글루코오스 탈수소효소는, 이온교환체, 겔 여과 담체(gel filtration carrier), 소수성 담체 등을 사용한 크로마토그래피 기술을 적절히 조합하는 것에 의해 정제할 수가 있다.

본 효소의 활성은, 공지의 글루코오스 탈수소효소의 활성측정과 같은 방법으로 측정할 수가 있다. 구체적으로는, 예를 들면 하기 실시예에 나타내는 방법에 의해서 측정할 수 있다.

다음에 본 발명의 신규 글루코오스 탈수소효소의 이화학적 성질을 나타낸다:

상기 글루코오스 탈수소효소는, 상기 조건 하에서 45℃ 부근에서 활성피크를갖고, 또한, 75℃ 부근에서도 활성피크를 갖는다(도 3(a) 참조). 이와 같이, 2개의 온도영역에서 활성피크를 나타내는 GDH는 알려져 있지 않다.

분자량 및 적절한 온도는 하기 실시예에 기재된 방법으로 측정할 수 있다.

상기, 본 발명의 글루코오스 탈수소효소는 분자량 약 60kDa의 α-서브유닛과 분자량 약 43kDa의 β-서브유닛의 2개의 별개의 폴리펩티드로 구성된다(이하, 이 글루코오스 탈수소효소를 '다량체 효소(multimer enzyme)'라고 하는 경우가 있다). 본 발명자는 또한 이들 2개의 서브유닛에 관하여 상세히 검토하였다.

β-서브유닛은 시토크롬 C인 것을 알 수 있다(하기 실시예에서 나타낸다). α-서브유닛만을 포함하는 단백질은 이하의 이화학적 성질을 나타낸다:

(ⅰ) 상기 단백질은 서브유닛으로서 상기 글루코오스 탈수소효소를 구성할 수 있고;

(ⅱ) 상기 단백질은 글루코오스 탈수소효소 활성을 갖고;

적당한 온도는 하기 실시예에 기재된 방법으로 측정할 수 있다.

이 단백질은 그 자신이 효소활성을 갖고 있기 때문에, 설명의 내용에 따라서, 적절하게 상기 단백질을 "펩티드효소" 또는 "효소"라고 하여 바꿔 사용하는 것으로 한다.

본 발명의 펩티드효소의 구체적 형태로서, 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 들 수 있다. 또한, 이 펩티드효소는, GDH 활성을 갖는 한, 서열번호: 3의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질이더라도 좋다. 서열번호: 1의 핵산염기 서열에 의해서 코딩될 수 있는 아미노산 서열이 서열번호: 3으로 나타나지만, N-말단의 메티오닌 잔기는 번역 후에 탈락할 가능성이 있다.

또한, 본 발명의 다량체효소의 구체적 형태로서, α-서브유닛이 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함하는 다량체를 들 수 있다. 또한, 상기 다량체효소는, GHD 활성을 갖는 한, α-서브유닛이 서열번호: 3의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함하는 다량체이더라도 좋다.

본 발명에 있어서 "1 또는 복수"는, 1∼10개, 바람직하게는 1∼5개, 특히 바람직하게는 1∼3개 이다.

본 발명자들은 상기 α-서브유닛 및 상기 β-서브유닛 이외에도, γ-서브유닛의 존재를 확인하였다.

후술하는 실시예에서, 상기 γ-서브유닛은 배양상청(culture supernatant) 혹은 균체추출액으로부터 본 발명의 효소를 정제하는 단계에서 제거되고, 따라서, 정제 후의 효소에서는 γ-서브유닛이 확인되지 않았다. 그러나, 실시예에 나타낸 바와 같이, α-서브유닛과 동시에 γ-서브유닛을 발현시키면, α-서브유닛만을 발현시킨 경우에 비교해서 높은 효소활성을 얻을 수 있었다. 이 때문에, γ-서브유닛이 미생물체내에 있어서 α-서브유닛이 생성될 때에 어떠한 관계가 있는 단백질인 것이 시사되었다. 어느 쪽의 경우도 α-서브유닛의 특정 활성(단백질당 효소활성)이 같다면, 효소활성은 효소량을 반영하기 때문에, 효소활성이 낮은 것은 효소로서의 α-서브유닛의 양이 적은 것을 나타내고 있다. 한편, 생성된 α-서브유닛이 γ-서브유닛에 의해서 어떤 보호를 받고 있는 것이거나, 그렇지 않으면 단백질로서의 α-서브유닛의 충분히 발현되고 있지만, γ-서브유닛이 존재하지 않기 때문에 효소활성을 나타낼 수 있는 3차 구조를 취할 수 없어, 결과적으로 효소활성이 낮아진 것일 수도 있다. 어는 경우이든, γ-서브유닛을 α-서브유닛과 동시에 발현시킴으로써, 높은 효소활성을 얻을 수 있다.

<3> 본 발명의 DNA

본 발명의 DNA는, 본 발명의 DNA를 함유하는 미생물, 예를 들면 버크호르데리아 세파시아로부터 취득할 수가 있다. 본 발명의 DNA는, 본 발명을 완성하는 과정에서 버크호르데리아 세파시아의 염색체(chromosomal) DNA로부터 단리되었다. 그러나, 본 발명에 의해 그의 핵산염기 서열 및 이 핵산염기 서열에 의해서 코드되는 아미노산 서열이 분명해졌기 때문에, 이들의 서열에 따라서 화학합성하는 것에 의해서도 상기 DNA를 취득할 수 있다. 또한, 상기 서열에 따라서 제작한 올리고뉴클레오티드를 프로브 또는 프라이머로 하는 하이브리디제이션(hybridization) 또는 PCR에 의해서, 버크호르데리아 세파시아 등의 염색체 DNA로부터 취득할 수도 있다.

본 발명의 DNA는, 서열번호: 3에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 것 이외, 서열번호: 3의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 갖고, 또한, GDH 활성을 갖는 단백질을 코드하는 것이라도 좋다.

본 발명의 DNA는, 구체적으로는 서열번호: 1의 핵산염기 서열 중, 염기번호 764∼2380으로 이루어지는 핵산염기 서열을 포함하는 DNA를 들 수 있다. 서열번호: 1의 핵산염기 서열 중, 핵산염기번호 764∼2380의 핵산염기 서열은, 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 GDH의 α-서브유닛을 코드하고 있다.

또한, 본 발명의 DNA는, 서열번호: 1의 핵산염기 서열 중, 핵산염기번호 764∼2380의 핵산염기 서열 또는 이 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건 하에서 교배가능하고, GDH 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA이더라도 좋다.

서열번호: 1의 핵산염기 서열 중, 핵산염기번호 258∼761의 핵산염기 서열은, γ-서브유닛을 코드하고 있다고 추정된다. 그 아미노산 서열을 서열번호: 2에 나타낸다. α-서브유닛의 상류지역에 γ-서브유닛의 구조유전자가 포함되고, 그로 인해 미생물에 의해서 α-서브유닛을 생산할 때에, 우선 γ-서브유닛이 발현되어 단백질로서 존재함으로써, 미생물체 내에서 효율적으로 α-서브유닛이 생산될 수 있다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 DNA는, 상기 DNA 이외에도, 서열번호: 2의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 포함하고 있더라도 좋다.

서열번호: 3에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동일한 단백질을 코딩하는 DNA는, 예를 들면 부위특이적 변이법 또는 돌연 변이처리 등의 방법에 의해서 취득할 수 있다. 변이가 도입된 DNA가 코드하는 단백질의 GDH 활성은, 예를 들면 다음과 같이 하여 측정할 수가 있다.

594μM의 메틸페나진 메토설페이트(mPMS) 및 5.94μM의 2,6-디클로로 페놀-인도페놀(DCIP)을 포함하는 10mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에, 효소시료 및 기질로서 글루코오스를 가하고, 37℃에서 인큐베이트한다. DCIP의 600nm에서의 흡광도 변화를 분광광도계를 사용하여 추적하고, 그 흡광도의 감소속도를 효소반응속도로서 측정한다.

또한, 서열번호: 1의 핵산염기 서열 중, y핵산염기번호 2386의 핵산 및 핵산염기번호 2386 이후의 핵산염기 서열로 이루어진 핵산염기 서열은, β-서브유닛을 코드하고 있다고 추정된다. 또한, 핵산염기번호 2386∼2451의 핵산염기 서열은, β-서브유닛의 시그널 펩티드를 코드하고 있다고 추측된다. 이 시그널 펩티드의 추정되는 아미노산 서열은, 서열번호: 4의 아미노산번호 1∼22의 아미노산 서열이다. 시그널 펩티드는, 리보솜에서 합성된 단백질이 막을 통하여 분비될 때에 필요한 펩티드이고, 15∼30의 소수성 아미노산 잔기를 포함하여 이루어지는 것이 판명되어 있다. 따라서, 시그널 펩티드의 존재에 의해서, 배양상청 중의 단백질량이 증가하기 때문에, 단백질의 제조방법에 있어서 효율적으로 작용하는 펩티드이다.

이하에, 본 발명의 DNA를 취득하는 방법을 예시한다.

버크호르데리아 세파시아 등의 미생물로부터 염색체 DNA를 분리, 정제한 후, 염색체 DNA를 초음파처리, 제한효소처리 등을 사용하여 절단한 것과, 선형(linear) 발현벡터를 DNA 리가제 등에 의해 결합폐쇄시켜 재조합 벡터를 구축한다. 얻어진 재조합 벡터를, 상기 벡터가 자율복제 가능한 숙주 미생물에 이입한 후, 형질전환체를 벡터마커와 효소활성의 발현을 지표로서 스크리닝하여, GDH를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 유지하는 미생물을 얻는다. 얻어진 미생물이 가지는 재조합 벡터에는, 적어도 α-서브유닛을 코딩하는 핵산염기 서열이 포함되고 있다고 예상된다. 또한, 클론화 단편이 충분한 크기를 갖고 있으면, γ-서브유닛을 코딩하는 핵산염기 서열도 포함되고 있는 가능성이 높다.

이어서, 상기 재조합 벡터를 갖는 미생물을 배양하고, 해당 배양미생물의 균체로부터 해당 재조합 벡터를 분리, 정제하여, 해당 발현벡터로부터 GDH를 코딩하는 유전자를 채취할 수가 있다. 예를 들면, 유전자 공급체(donor)인 염색체 DNA는, 구체적으로는 아래와 같이 하여 채취된다.

상기 유전자 공급 미생물을, 예를 들면 1∼3일간 교반배양하여 얻어진 배양액을 원심분리에 의해 집균하고, 이어서, 이것을 용균시키는 것에 의해 GDH 유전자 함유 용균물(cell lysate)을 조제할 수가 있다. 용균의 방법으로서는, 예를 들면 리소자임 등의 용균효소(bacteriolytic enzyme)에 의해 처리되고, 필요에 따라서 프로티아제와 같은 기타 효소나 소디움 도데실설페이트(SDS) 등의 계면활성제가 병용된다. 또한, 동결융해나 프렌치프레스 처리와 같은 물리적 파쇄방법과 조합하더라도 좋다.

상기 DNA는, 전통적인 방법, 예를 들면 페놀처리나 프로티아제처리에 의해 제단백처리(deproteinization)나, 리보뉴클리아제처리, 알코올 침전처리 등의 방법을 적절히 조합하는 것에 의해 상기한 바와 같이 얻어진 용균물로부터 분리정제 될 수 있다.

미생물로부터 분리, 정제된 DNA를 절단하는 방법은, 예를 들면 초음파처리,제한효소처리 등에 의해 할 수 있다. 바람직하게는 특정한 핵산염기 서열에 작용하는 Ⅱ형 제한효소가 적합하다. 제한효소는, 벡터의 절단말단과 적합한 말단을 발생시키는 것을 사용하더라도 좋고, 혹은 임의의 제한효소를 사용하여, 절단말단을 평활-말단화(blunt-ended)하여 벡터와 연결하더라도 좋다.

쿨로닝할 때의 벡터로서는, 숙주 미생물 내에서 자율적으로 증식할 수 있는 파지(phase) 또는 유전자재조합용으로 구축된 플라스미드(plasmid)가 적합하다. 파지로서는, 예를 들면 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)를 숙주 미생물로 하는 경우에는, Lambda gt10, Lambda gt11 등이 예시된다. 또한, 플라스미드로서는, 예를 들면, 에스케리키아 콜리를 숙주 미생물로 하는 경우에는, pBR322, pUC18, pUC118, pUC19, pUCll9, pTrc99A, 및 pBluescript 혹은 코스미드(cosmid)인 SuperCosI 등이 예시된다.

클로닝에 있어서, 상기와 같은 벡터를, 상술한 GDH를 코딩하는 유전자 공여체인 미생물 DNA의 절단에 사용한 제한효소로 절단하여 벡터 단편을 얻을 수 있다. 그러나, 반드시 해당미생물 DNA의 절단에 사용한 제한효소와 동일한 제한효소를 사용할 필요는 없다. 미생물 DNA 단편과 벡터 DNA 단편을 결합시키는 방법은, 공지의 DNA 리가제를 사용하는 방법이면 좋다. 예를 들면, 미생물 DNA 단편의 부착말단과 벡터 단편의 부착말단을 라이게이션 한 후, 적당한 DNA 리가제의 사용에 의해 미생물 DNA 단편과 벡터 DNA 단편을 포함하는 재조합 벡터를 제작한다. 필요에 따라서, 라이게이션 후, 단편을 숙주 미생물에 이입하여, 미생물 내의 DNA 리가제를 이용하여 재조합 벡터를 제작할 수도 있다.

클로닝에 사용하는 숙주 미생물로서는, 재조합 벡터가 안정하고, 또한 숙주 내에서 자율증식이 가능하고, 외래 유전자의 형질이 발현될 수 있으면, 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로는, 에스케리키아 콜리 DH5α, XL-l BlueMR 등을 사용할 수 있다.

숙주 미생물에 재조합 벡터를 이입하는 방법으로서는, 예를 들면 숙주 미생물이 에스케리키아 콜리인 경우에는, 칼슘처리에 의한 컴피텐트 셀법(competent cell method) 또는 일렉트로포레이션(electroporation) 등을 사용할 수 있다.

상기의 방법에 의해 얻어진 클론화 단편이 GDH를 코드하고 있는지 여부는, 이 단편의 핵산염기 서열을 통상의 방법으로 해독함으로써 확인할 수가 있다.

상기한 바와 같이 얻어진 형질전환체로부터, 재조합 벡터를 회수하면, 본 발명의 DNA를 얻을 수 있다.

본 발명의 DNA 또는 이 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체를 배양하여, 이 DNA의 발현산물로서 GDH를 생산하고, 이것을 균체 또는 배양액으로부터 채취함에 의해, GDH를 제조할 수가 있다. 이 때, 본 발명의 DNA는, α-서브유닛을 코딩하는 DNA이더라도 좋지만, α-서브유닛과 동시에 γ-서브유닛을 더욱 발현시키는 것에 의해, 발현효율을 높일 수 있다.

GDH를 생산하는 미생물로서는, 대장균을 비롯하는 장내 세균군, 슈도모너스 (Pseudomonas)속이나 글루코노박터(Gluconobacter)속 등의 그램-음성 세균, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 등의 바실러스속 세균을 포함하는 그램-양성 세균, 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 등의 효모, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 등의 실형상 균(filamentous fungi)을 들 수 있다. 그러나, 상기 미생물은 이들 미생물에 한정되지 않고, 이종 단백질 생산에 알맞은 어떤 숙주 미생물도 사용할 수 있다.

한번 선택된 GDH 유전자를 보유하는 재조합 벡터에 포함된 GDH 유전자는, GDH 유전자를 포함하는 재조합 벡터로부터 제한효소나 PCR법에 의해 GDH 유전자인 DNA를 회수하고, 다른 벡터 단편과 결합시킴으로써 미생물 내에서 복제할 수 있는 재조합 벡터로 쉽게 이입될 수 있다. 또한, 상기 미생물은 이들 벡터에 의해 쉽게 형질전환되고, 예를 들면 에세리히아속 세균에서는 칼슘처리에 의한 컴피턴트 셀법, 바실러스속 세균에서는 프로토플라스트(protoplast)법, 효모에서는 KU법이나 KUR법, 실형상 균에서는 마이크로매니퓰레이션(micromanipulation)법 등에 의해서 할 수 있다. 또한, 일렉트로포레이션법도 널리 사용할 수 있다.

목적 재조합 벡터가 이입되는 숙주 미생물은, 목적으로 하는 DNA를 유지하는 벡터의 약제내성 마커와 GDH 활성을 동시에 발현하는 미생물을 검색함으로써 선택될 수 있다. 예를 들면, 약제내성 마커에 근거하는 선택배지에서 생육하고, 또한 GDH를 생성하는 미생물을 선택하면 좋다.

형질전환체의 배양형태는, 숙주의 영양생리적 성질을 고려하여 배양조건을 선택할 수 있다. 대부분의 경우, 액체배양으로 한다. 공업적으로는 통기 (aerobic) 교반배양을 하는 것이 유리하다.

배지의 영양원으로서는, 미생물의 배양에 통상 사용되는 것이 널리 사용될 수 있다. 탄소원으로서는 동화가능한 어떠한 탄소화합물도 사용 가능하며, 예를들면, 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 말토오스, 락토오스, 당밀(molasses), 피루브산(pyruvic acid) 등이 사용된다. 또한, 질소원으로서는 이용 가능한 어떠한 질소화합물도 사용 가능하며, 예를 들면, 펩톤, 고기 엑기스, 효모 엑기스, 카제인 가수분해물, 콩깻묵(soybean meal) 알칼리추출물 등이 사용된다. 그 외에, 인산염, 탄산염, 황산염, 마그네슘, 칼슘, 칼륨, 철, 망간, 아연 등의 염류, 특정한 아미노산, 특정한 비타민 등이 필요에 따라서 사용된다.

배양온도는 균이 생육하여, GDH를 생산하는 범위에서 적절하게 변경할 수 있지만, 바람직하게는 20∼42℃ 정도이다. 배양시간은 조건에 따라서 다소 다르다. 그러나, GDH가 최고수량에 달하는 시기를 가늠하여 적당한 시기에 배양을 완료할 수 있고, 통상은 12∼72시간 정도이다. 배지의 pH는 균이 발육하여, GDH를 생산하는 범위에서 적절하게 변경할 수 있지만, 바람직하게는 pH 6.0∼9.0 정도의 범위이다.

배양물 중에서 GDH를 생산하는 균체를 포함하는 배양액은 그대로 채취하여, 이용할 수 있다. 그러나, GDH가 배양액 중에 존재하는 경우, 배양액은 일반적으로 여과, 원심분리 등에 의해, 통상의 방법으로 GDH 함유용액과 미생물 균체를 분리한 후에 이용된다. GDH가 균체내에 존재하는 경우에는, 여과 또는 원심분리 등의 수단에 의해 얻어진 배양물로부터 균체를 채취하고, 그 후 이 균체를 기계적 방법 또는 리소자임(lysozyme) 등의 효소적 방법으로 파괴하고, 또한, 필요에 따라서, EDTA 등의 킬레이트제 및 계면활성제를 더욱 첨가하여 GDH를 가용화하여, 수용액으로서 분리 채취한다.

GDH는 예를 들면 감압 농축, 막 농축, 황산암모늄, 황산나트륨 등의 염석처리, 혹은 메탄올, 에탄올, 아세톤 등의 친수성 유기용매에 의한 분별침전법에 의해, 상기한 바와 같이 하여 얻어진 GDH 함유용액으로부터 침전될 수 있다. 또한, 가열처리나 등전점(isoelectric point)처리도 유효한 정제수단이다. 그 후, 흡착제 혹은 겔여과제 등에 의한 겔여과, 흡착 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피를 적절하게 조합하는 것에 의해, 정제된 GDH를 얻을 수 있다.

컬럼 크로마토그래피에 의해 분리, 정제하여, 정제 효소표품을 얻을 수 있다. 상기 정제 효소표품은, 전기영동(SDS-PAGE)에서 단일의 밴드를 나타내는 정도로 순화되어 있는 것이 바람직하지만, γ-서브유닛이 포함되어 있더라도 좋다.

상기한 바와 같이 하여 얻어진 정제효소를, 예를 들면 동결건조, 진공건조나 스프레이건조 등에 의해 분말화하여 유통시키는 것이 가능하다.

또한, 하기 실시예에 나타내는 α-서브유닛의 아미노산 서열의 결정과 같이 하여 β-서브유닛의 아미노산 서열을 결정하고, 상기 β-서브유닛을 코딩하는 DNA를 단리할 수가 있다. 또한, 얻어진 DNA를 사용하여, β-서브유닛을 제조할 수가 있다. 또한, α-서브유닛을 코딩하는 DNA 및 β-서브유닛을 코딩하는 DNA를 사용하여, 다량체효소를 제조할 수도 있다.

<4> 본 발명의 글루코오스 센서

본 발명의 글루코오스 센서는, 본 발명의 효소(상기 다량체효소 또는 펩티드효소, 또는 γ-서브유닛을 포함하는 상기 다량체효소 또는 펩티드효소), 본 발명의형질전환체, 또는 본 발명의 미생물(버크호르데리아 세파시아 KS1 균주)을, 효소전극으로서 사용하는 것을 특징으로 한다. 전극으로서는, 카본전극, 금전극, 백금전극 등을 사용하고, 이 전극상에 본 발명의 효소를 고정화한다. 고정화 방법으로서는, 가교시약을 사용하는 방법, 고분자 매트릭스 안에 봉입(entrapping)하는 방법, 투석막으로 피복하는 방법, 광가교성 폴리머, 도전성 폴리머, 산화환원 폴리머 등을 사용하는 방법이 있다. 혹은, 상기 효소는 페로센 또는 그 유도체로 대표되는 전자 미디에이터(electronic mediator)와 함께 폴리머 안에 고정 혹은 전극상에 흡착 고정될 수 있고, 또한 이들을 조합한 방법이 사용될 수도 있다. 전형적으로는, 글루타르알데히드를 사용하여 본 발명의 글루코오스 탈수소효소를 카본전극상에 고정화한 후, 아민기를 갖는 시약으로 처리하여 글루타르알데히드를 블로킹한다.

글루코오스의 농도의 측정은, 아래와 같이 하여 할 수 있다. 항온셀에 완충액을 넣고, 미디에이터를 가하여 일정온도로 유지한다. 미디에이터로서는, 페리시안화 칼륨, 페나진 메토설페이트 등을 사용할 수 있다. 작용전극으로서 본 발명의 효소를 고정화한 전극을 사용하고, 대극(counter electrode)(예를 들면, 백금전극) 및 참조전극(reference electrode)(예를 들면, Ag/AgC전극)을 사용한다. 카본전극에 일정한 전압을 인가하여, 전류가 정상(steady-state)이 된 후, 글루코오스를 포함하는 시료를 가하여 전류의 증가를 측정한다. 표준농도의 글루코오스용액에 의해 제작한 칼리브레이션 커브에 따라서, 시료 안의 글루코오스의 농도를 계산할 수가 있다.

<5> 본 발명의 글루코오스 어세이 키트

본 발명의 당류 어세이 키트는, 본 발명의 효소(상기 다량체효소 또는 펩티드효소, 또는 γ-서브유닛을 포함하는 상기 다량체효소 또는 펩티드효소)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 글루코오스 어세이 키트는, 본 발명의 효소를 적어도 1회의 어세이에 충분한 양으로 포함한다. 전형적으로, 키트는, 본 발명의 효소외에, 어세이에 필요한 완충액, 미디에이터, 칼리브레이션 커브 작성을 위한 글루코오스 등의 표준용액, 및 사용지침을 포함한다. 본 발명에 따르는 효소는 여러 가지의 형태로, 예를 들면, 동결건조된 시약으로서, 또는 적절한 보존용액중의 용액으로서 제공할 수 있다.

본 발명은, 신규 글루코오스 탈수소효소 및 그 제조방법, 동일효소를 코딩하는 DNA, 동일효소를 코딩하는 DNA를 함유하는 재조합 벡터, 동일 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 동일효소를 생산하는 신규 미생물, 상기 효소, 형질전환체 또는 미생물을 포함하는 효소전극을 사용한 글루코오스 센서, 및 글루코오스 어세이 키트(assay kit)에 관한 것이다.

도 1은, 본 발명효소의 native PAGE 전기영동에 의한 분자량을 나타내는 도면이다.

도 2는, 본 발명효소의 SDS-PAGE 전기영동에 의한 분자량을 나타내는 전기영동사진이다.

도 3은, 본 발명효소의 적당한 반응온도(a), 및 열안정성(b)을 나타내는 도면이다.

도 4는, 본 발명효소의 α-서브유닛만을 구성하는 펩티드효소의 적당한 반응온도(a), 및 열안정성(b)을 나타내는 도면이다.

도 5는, 열처리 전의 글루코오스 비존재 또는 존재 하에서의 본 발명효소의 분광광도분석(a), 및 열처리 후의 글루코오스 비존재 또는 존재 하에서의 본 발명효소의 분광광도분석(b)을 나타내는 도면이다.

도 6은, 형질전환체로부터 얻어지는 GDH를 사용한 글루코오스 센서의 각 온도에서의 글루코오스에 대한 응답을 나타내는 도면이다.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

실시예 1: 글루코오스 탈수소효소의 생산기능을 갖는 균의 취득

[스크리닝]

본 발명의 미생물은, 일본의 여러 온천 근처의 토양을 입수하여, 그 토양으로부터의 글루코오스를 영양원으로 하는 세균 중에서 글루코오스 탈수소효소 활성을 나타내는 것을 선택하여 입수하였다.

이 균주의 형태학적 성질, 생육 특성, 생리학적 특성을 조사한 결과를 다음에 나타낸다.

[균학적 성질]

그램 염색 음성

세포의 형상 간균(rod-shaped)

극성 편모(flagellum) 지님

운동성 양성

프래그먼트의 수 〉5

적당한 증식온도 45℃

옥시다제 음성

카탈라제 양성

아세토인의 생성 음성

H₂S의 생성 음성

인돌의 생성 음성

글루코오스부터의 산 양성

알기닌 디히드로라제 음성

유레아제 음성

β-글루코시다제 음성

프로테아제 음성

β-갈락토시다제 양성

라이신 카르복시라제 음성

오르니틴 카르복시라제 음성

질산염의 환원 양성

[동화 특성]

글리세롤 양성

에리트리톨 음성

D-아라비노오스 음성

L-아라비노오스 양성

리보오스 양성

D-크실로오스 양성

L-크실로오스 음성

아도니톨 양성

β-메틸-크실로시드 음성

갈락토오스 양성

D-글루코오스 양성

D-프룩토오스 양성

D-맨노오스 양성

L-소르보오스 음성

램노오스 음성

둘시톨 양성

이노시톨 양성

매니톨 양성

소르비톨 양성

α-메틸-D-매노시드 음성

α-메틸-D-글루코시드 음성

N-아세틸-글루코사민 양성

아미그다린(Amygdaline) 음성

알부틴 음성

에스큐린 음성

살리신 음성

셀로비오스 음성

말토오스 음성

락토오스 음성

멜리비오스 음성

수크로오스 음성

트레할로오스 양성

이눌린 음성

멜레지토오스 음성

D-라피노오스 음성

아미돈 음성

글리코겐 음성

크실리톨 양성

β-겐티오비오스 음성

D-투라노오스 음성

D-릭소오스 음성

D-타가토오스 음성

D-푸코오스 음성

L-푸코오스 음성

D-아라비톨 양성

L-아라비톨 양성

글루콘산 양성

2-케토글루콘산 양성

5-케토글루콘산 음성

카프린산 양성

아디핀산 양성

사과산 양성

구연산 양성

페닐 아세테이트 양성

[산화 특성]

글리세롤 음성

에리트리톨 음성

D-아라비노오스 음성

L-아라비노오스 양성

리보오스 양성

D-크실로오스 양성

L-크실로오스 음성

아도니톨 양성

β-메틸-크실로시드 음성

갈락토오스 양성

D-글루코오스 양성

D-프룩토오스 양성

D-맨노오스 양성

L-소르보오스 음성

램노오스 음성

둘시톨 양성

이노시톨 양성

매니톨 양성

소르비톨 양성

α-메틸-D-매노시드 음성

α-메틸-D-글루코시드 음성

N-아세틸-글루코사민 음성

아미그다린 음성

알부틴 음성

에스큐린 양성

살리신 음성

셀로비오스 양성

말토오스 양성

락토오스 양성

멜리비오스 음성

수크로오스 음성

트레할로오스 양성

이눌린 음성

멜레지토오스 음성

D-라피노오스 음성

아미돈 음성

글리코겐 음성

크실리톨 음성

β-겐티오비오스 양성

D-투라노오스 음성

D-릭소오스 음성

D-타가토오스 음성

D-푸코오스 양성

L-푸코오스 음성

D-아라비톨 양성

L-아라비톨 양성

글루콘산 음성

2-케토글루콘산 음성

5-케토글루콘산 음성

상기의 균학적 성질을 갖는 KS1 균주의 분류학상의 위치를 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology)를 참조하여 검토하여, 버크호르데리아속에 속하는버크호르데리아 세파시아 균주로 확인되었다.

버크호르데리아속은, 종래에는 슈도모너스속에 분류되었으나, 현재는 버크호르데리아속으로 분류되어 있다(Yabuuchi, E., Kosako, Y., Oyaizu, H., Yano, I., Hotta, H., Hashimoto, Y., Ezaki, T. and Arakawa, M., Microbio1. Immunol. Vo1. 36(12): 1251-1275(1992); International Journal of Systematic Bacteriology, Apr., 1993, pp.398-399).

또한, 본 발명자들은 버크호르데리아 세파시아 KS1 균주 이외에, 재단법인 발효연구소(Institute for Fermentation, 0saka) 또는 이화학연구소 미생물계통 보존시설(Japan Collection of Microorganisms(JCM))에 기탁되어 있는 버크호르데리아 세파시아의 몇 개의 균주를 가져와서 글루코오스 탈수소효소 활성을 측정한 바, 동일활성을 갖는 것을 확인하였다. 글루코오스 탈수소효소 활성은, 후술의 실시예 2에 기재된 방법에 의해 측정하였다. KSl 균주의 수용성화분의 효소활성을 100으로 하였을 때의 상대활성을 표 1에 나타낸다.

표 1

균주		글루코오스 탈수소효소 활성
균주		70℃	45℃
KS1	수용성 부분	100	100
JCM5506	수용성 부분	100	100
	막 부분	100	100
JCM5507	수용성 부분	100	100
	막 부분	100	100
JCM2800	수용성 부분	100	100
JCM2801	수용성 부분	100	100
IF015124	수용성 부분	100	100
IF014595	수용성 부분	100	100

실시예 2 : 글루코오스 탈수소효소의 추출

<l> 균체의 배양

본 세균의 배양조건은 통상적으로 호기적 배양조건이 사용된다. 배양액 1L 당 이하의 성분을 포함하는 배지 7L에서, 34℃에서, 8시간 배양하였다.

폴리펩톤 10g

효모 추출액 1g

NaCl 5g

KH₂P0₄2g

글루코오스 5g

Einol(ABLE Co., 도쿄 일본) 0.14g

증류수 포함한 총 부피 1L

pH 조정 7.2

본 배양액 7L를 9,000 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리하여, 약 60g의 균체를 얻었다.

<2> 개략 정제된 프랙션의 제작

60g의 균체를 10mM의 인산칼륨 완충액(pH 6.O)에 분산시키고, 프렌치프레스(오타케세이사쿠쇼, 도쿄, 일본)을 사용하여 1,50OKg/cm²의 압력차를 가하여, 균체막을 파괴하였다. 세포 추출액을 8,000 ×g에서 10분간 원심분리하여, 세포 고형물을 제거하였다. 또한, 이 상청(supernatant)을, 4℃, 69,800 ×g에서 90분간 초원심(ultracentrifugation)하여, 침전물로서의 막 프랙션(membrane fraction) 약 8g을 얻었다.

<3> 효소의 정제

막 프랙션을, 최종농도로 Triton X-100이 1%가 되도록, 10mM 인산칼륨 완충액(pH 6.0)으로 재분산하였다. 그리고, 4℃에서 하룻밤 천천히 교반하였다. 초원심(4℃, 69,800 ×g, 90분) 후, 가용화막 프랙션을, 4℃, 15,000 ×g에서 15분간 재원심하여, 상청을 얻었다.

상기 가용화막 프랙션에 0.2% Triton X-100을 포함하는 동량의 10mM인산칼륨 완충액(pH 8.0)을 가하였다. 투석 후, 그 용액을, 0.2% Triton X-100을 포함하는 10mM 인산칼륨 완충액(pH 8.0)으로 등량화된 DEAE-TOYOPEARL 컬럼(22mm ID ×20cm, Tosoh Corporation, 도쿄, 일본)에 공급하였다. 단백질을, 10mM 인산칼륨 완충액 (pH 8.0) 중의 NaCl의 농도가 0∼0.15M인 직선 그라디언트로 용출하였다. 그 유속은 5㎖/min에서 행하였다. GDH는 약 75mM의 NaCl 농도에서 용출되었다. GDH 활성을 갖는 프랙션을 모아, 0.2% Triton X-100을 포함하는 10mM 인산칼륨 완충액(pH 8.0, 4℃)으로 하룻밤, 투석하였다.

또한, 투석조제 효소액을, DEAE-5PW 컬럼(8.0mm ID ×7.5cm, Tosoh Corporation, 도쿄, 일본)에 통과시켰다. 그 컬럼은 미리, 0.2% Triton X-100을 포함하는 10mM 인산칼륨 완충액(pH 6.0)으로 평형화되어 있다. 단백질을, 10mM 인산칼륨 완충액(pH 8.0) 중의 NaCl의 농도가 0∼100mM인 직선 그라디언트로 용출하였다. 그 유속은 1㎖/min에서 행하였다. GDH 활성이 있는 프랙션은 약 20mM의 NaCl 농도에서 용출하였다. GDH 활성을 갖는 프랙션을 모아, 0.2% Triton X-100을포함하는 10mM 인산칼륨 완충액(pH 8.0)으로, 하룻밤, 탈염(desalt)하여, 본 정제효소를 얻었다.

GDH 활성측정은, 본 실시예 및 이하의 실시예를 통해서, 이하의 방법에 따라서 행하였다.

전자수용체로서, 2,6-디클로로페놀-인도페놀(DCIP) 및 페나진 메토설페이트 (RMS)를 사용하였다. 반응은 폴리에틸렌 튜브 내에서 소정의 온도로 실시하였다. 0.75mM PMS와 0.75mM DCIP를 함유하는 25mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 20㎕에 효소용액 5㎕을 첨가하였다. 이 혼합액을 1분간 사전에 정해진 온도에 방치하였다. 2M 글루코오스 1㎕(최종농도 : 77mM)의 첨가에 의해 반응을 시작시켜, 2분간 정해진 온도에 방치하였다. 그 후, 빙냉(ice-cooled) 증류수 100㎕ 또는 7.5M 요소 120㎕를 첨가하여 시료를 냉각하였다. 초미량 계측용 셀(100㎕) 및 이 셀을 사용하여 계측할 수 있는 분광광도계(UV160, 시마즈제작소, 교토, 일본)를 사용하여, 글루코오스의 탈수소화에 근거하는 전자수용체의 환원반응을 추적하였다. 즉, DCIP 환원에 근거하는 시간에 따른 퇴색을, DCIP의 흡수파장인 600nm에서 계측하였다. DCIP의 몰흡광계수(22.23mM ×cm^-1)를 사용하였다. 효소 1단위(U)는 표준검정조건 하에서 1분마다 1μM의 글루코오스를 산화하는 량으로 정의하였다. 단백질 농도는 로리법(Lowry method)으로 측정하였다.

실시예 3

본 정제효소에 대해서, Native PAGE 전기영동을 실시하였다. 본 전기영동의조건은, 1% Triton X-100을 포함하는 Tris-a1anine 완충액 시스템을 사용한 8∼25% 폴리아크릴아미드 그라디언트 겔 상에서 실시하였다. 그 겔은 질산은으로 염색하였다. 단백질 마커로, 티로글로블린(Thyroglobulin): 669kDa, 페리틴(Ferritin): 440kDa, 카탈라제(Catalase): 232kDa, 알도라제(Aldolase): 158kDa, 소혈청 알부민 (Bovine Serum Albumin): 67kDa, 오발부민(Ovalbumin): 43kDa 및 키모트립시노겐 A(Chymotrypsinogen A): 25kDa을 사용하였다.

또한, 상기 Native PAGE 겔에 관해서, 상기 겔을 이하의 용액 중에 30분간 인큐베이션하는 것에 의해 활성염색을 실시하였다. GDH의 활성부위는 니트로블루 테트라졸륨이 환원되고, 포르마잔이 생성되어, 어두운 보라색이 발색하였다.

200mM 글루코오스

0.1mM 니트로블루 테트라졸륨

0.3mM 페나진 메토설페이트

20mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)

Native PAGE의 은염색 결과로부터, 본 효소가 단일효소이고, 그 분자량이 약 400kDa인 것이 추측되었다. 또한, 상기 겔을 활성염색하면, 은염색에서와 같은 이동도 부위에 활성이 인정되었다(도 1 참조. 도면 중, 레인 1은 표준분자량을 갖는 마커 단백질의 은염색을, 레인 2는 본 효소의 은염색을, 레인 4는 본 효소의 활성 염색을 나타낸다). 본 효소를 70℃에서 30분간 열처리를 하면, 활성이 기대외로 잔존하여, 분자량 85kDa 부근에 활성을 갖는 단백질로 분리된다(도 1 참조. 도면 중, 레인 3은 70℃에서 30분간 열처리된 본 효소의 은염색을, 레인 5는 70℃에서30분간 열처리된 본 효소의 활성염색을 나타낸다). 이 결과는 본 효소가 서브유닛으로 이루어지는 것을 시사하고 있다.

실시예 4

본 정제효소액을 SDS-PAGE에 전기영동을 하였다. SDS-PAGE는 Tris-Tricine 완충액을 사용하여 8∼25% 그라디언트 폴리아크릴아미드 겔 중에서 실시하였다. 그 겔의 단백질은 질산은으로 염색을 하였다. Phast System(Pharmacia)를 사용하여, 분리와 전개를 자동적으로 행하였다. 표준단백의 상대이동도에 의해 분자질량을 측정하였다. SDS-PAGE에 의해서, 본 효소는 분자량 약 60kDa와 43kDa의 단백질로 분리되었다(도 2 참조. 도 2는 전기영동사진이다. 도면 중, 레인 1은 표준분자량을 갖는 마커 단백질의 질산은 염색을, 레인 2는 본 효소의 질산은 염색을 나타낸다}. 따라서, 본 효소는 60kDa의 α-서브유닛과 43kDa의 β-서브유닛이 결합하고 있는 것이 시사되고, 또한, 이들 서브유닛 4개가 각각 결합하여 8량체를 형성하고 있는 것이 예상되었다.

SDS-PAGE에서 분리된 43kDa의 단백질인 β-서브유닛을 폴리비닐리덴 플루오라이드 막에 전사한 후, 아미노산 시퀀서(시마즈제작소, PPSQ-10)에 의해 β-서브유닛의 N-말단 아미노산 서열을 측정하였다. 그 결과, 본 단백질의 N-말단 아미노산 서열은 서열번호: 5의 아미노산 서열의 16잔기로 구성되어 있는 것이 분명해졌다.

또한, 본 효소를 70℃에서 30분간 열처리한 경우의 결과를 도 2의 레인 3으로 나타낸다. 이 SDS-PAGE의 결과로부터, 열처리 후 이 효소는 분자량 60kDa의 단일 폴리펩티드로 변한 것을 상정할 수 있다.

실시예 5

본 효소의 겔 여과 크로마토그래피를 실시하였다. 겔로서, TSK Gel G3000SW (Tosoh Corporation)를 사용하고, 겔 컬럼(8.0mm ID ×30cm Tosoh Corporation, 도쿄, 일본)은 10mM 인산칼륨 완충액(PH 6.0) 중에 0.3M NaC1과 0.1% Triton X-100을 포함하는 용액으로 평형화하였다. 프랙션(125㎕)을 모았다. 7 종류의 단백질 마커를 본 정제효소의 분자량을 결정하기 위해서 사용하였다. 단백질 마커로서, 티로글로블린(Thyroglobulin): 669kDa, 페리틴(Ferritin): 440kDa, 카탈라제 (Catalase): 232kDa, 알도라제(Aldolase): 158kDa, 소혈청 알부민(Bovine Serum Albumin): 67kDa, 오발부민(Ovalbumin): 43kDa, 및 키모트립시노겐 A(Chymo trypsinogen A): 25kDa를 사용하였다.

본 효소의 분자량은 약 380kDa인 것이, 확인되었다.

실시예 6

정제한 본 효소의 적당한 온도를 조사하였다.

Tris-HCl 완충액(pH 8.0) 중에서, 미리 1분간 설정온도로 인큐베이션한 후, 반응을 시작하였다. 소정의 반응온도에서 활성을 측정하였다. 적당한 온도는 45℃ 부근에서 볼 수 있었다(도 3(a) 참조). 또한, 45℃ 부근에 비교해서 활성은 낮지만, 75℃ 부근에서도 피크를 볼 수 있었다.

또한, 본 효소의 열안정성을 조사하기 위해서, 30분간 각각 정해진 온도방치 후, 45℃에서 잔존 효소활성을 측정하였다(도 3(b) 참조).

실시예 7

본 효소를 70℃에서 30분간 열처리한 경우의 분자량 60kDa의 단일 올리고펩티드를 구성하는 해당 펩티드효소의 적당한 온도 및 열안정성을 조사하였다.

이 펩티드효소는 비열처리효소보다도 높은 적당한 온도를 나타내고, 또한 열안정성도 높게 나타내었다. 이러한 온도의존성을 나타내는 효소에 대한 보고는 아직 없다.

Tris-HCl 완충액(pH 8.0) 중에서, 미리 1분간 설정온도로 인큐베이션한 후, 반응을 시작하였다. 소정의 반응온도에서 활성을 측정하였다. 적당한 온도는 75℃ 부근에서 볼 수 있었다(도 4(a) 참조).

또한, 본 효소의 열안정성을 조사하기 위해서, 30분간 각각 정해진 온도로 방치한 후, 70℃에서 잔존 효소활성을 측정하였다(도 4(b) 참조).

실시예 8

각각의 서브유닛의 역할을 조사하기 위해서, 열처리 전후의 GDH의 분광광도 분석을 하였다. 도 5(a) 및 (b)는, 열처리 전후의 산화형 및 환원형의 GDH의 흡수를 나타내고 있다(글루코오스의 존재 하에서). 원래의 GDH인 열처리 전 산화 GDH의 흡수파장은, 409nm에서 특징적인 피크를 나타내었다. 또한, 글루코오스의 존재 하에서, 상기 피크는 417nm로 이동(shift)하고, 523nm 및 550nm에서 2개의 피크를 더 관찰되었다(도 5(a)). 대조적으로, 열처리 후 GDH는 409nm에서의 특징적인 피크를 더 이상 나타내지 않았고(도 5(b)), 산화형 및 환원형 GDH 간에 중요한 차이는 관찰되지 않았다.

열처리 전의 산화형 GDH, 즉, 원래의 GDH의 흡수파장은Cluconobacter sp.혹은Acetobacter sp.의 탈수소효소 시토크롬 복합체를 포함하는 알코올 탈수소효소 및 알데히드 탈수소효소의 흡수파장과 유사하였다(이하의 문헌참조: Adachi, O., Tayama, K., Shinagawa, E., Matsushita, K. and Ameyama, M., Agr. Biol. Chem., 42, 2045-2056(1978); Adachi, O., Miyagawa, E., Matsushita, K. and Ameyama, M., Agr. Bio1. Chem., 42, 2331-2340(1978); Ameyama, M. and Adachi, O., Methods Enzymo1., 89, 450-457(I982); Adachi, O., Tayama, K., Shinagawa, E., Matsushita, K. and Ameyama, M., Agr. Biol. Chem., 44, 503-515(1980); Ameyama, M. and Adachi, O., Methods Enzymol., 89, 491-497(I982)).

상기 결과는 본 GDH의 올리고머 복합체는 시토크롬을 포함하고 있을 가능성을 시사하였다. 따라서, 관찰된 시토크롬 C의 경우와 유사한 파장은 β-서브유닛에 기인하는 것으로, 열처리 동안 잃었다고 할 수 있고, 따라서 β-서브유닛은 시토크롬 C로 이루어져 있다고 할 수 있다.

실시예 9

실시예 4의 전기영동에 의해서 얻어진 β-서브유닛을 포함하는 밴드를 잘라내어, 펩티드 시퀀서(시마즈제작소, PPSQ-10)에 의해 아미노산 서열을 해석했다. 그 결과, 서열번호: 5에 나타내는 16잔기로 이루어진 N-말단의 아미노산 서열을 얻을 수 있었다.

상기 16잔기의 N-말단 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 영역을 상기 펩티드 서열에 기초한 PCR에 의해 증폭하는 것이 시도되었다. 즉, 16잔기의 펩티드사슬에서, N-말단 5잔기에 해당하는 포워드측의 핵산염기 서열(서열번호: 6) 및 C-말단 5잔기의 안티센스 사슬에 해당하는 반대측의 핵산염기 서열(서열번호: 7)을 가지는 2개의 PCR 프라이머를 디자인하였다. 이 1조의 PCR 프라이머를 사용하여 통상의 방법으로 KS1 균주의 게놈에 대하여 PCR를 했더니, 약 50bp의 유전자 단편이 증폭되었다. 이 유전자 단편을 통상의 방법으로 그 핵산염기 서열을 결정했더니, 상기 PCR 프라이머 1조를 포함하는 핵산염기 서열 58염기가 해독되었다. 이 중, PCR 프라이머를 제외한 18염기에 관해서 해석하여, 상기 β-서브유닛 N-말단 16잔기의 N-말단측에서 6번째 잔기인 Pro로부터 11번째 잔기인 Arg까지에 해당하는 유전자 서열(서열번호: 8)이 발견되었다. 본 증폭된 유전자 단편이 β-서브유닛 유전자 단편을 포함하는 것이 분명해졌다.

또한, β-서브유닛은 α-서브유닛에 계속되는 22 아미노산 잔기 뒤에 존재하는 것을 알 수 있었다. 이것은, 실시예 4에서 결정된 정제된 β-서브유닛의 N-말단에서의 아미노산 서열과, 서열번호: 1중의 핵산염기 번호 2452∼2466의 핵산염기 서열에 의해서 번역되는 5 아미노산 잔기가 일치함으로써, 이들 서열이 동일하다고 판명한 것에 근거하였다.

또한, 서열번호: 1중의 핵산염기번호 2386∼2451의 핵산염기 서열은, β-서브유닛의 시그널 펩티드인 것이 추측된다. 이 핵산염기 서열에 의해서 코드되는 아미노산 서열은, 서열번호: 4의 아미노산 서열의 아미노산번호 1∼22에 해당한다.

실시예 10

0.1% Triton X-100 및 lmM CaCl₂를 포함하는 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5) 중에 본 정제효소 및 시판의 NAD 보조효소(coenzyme) GDH("NAD-GDH"라 한다)를 각각 100U/L의 농도가 되도록 가하여 혼합하였다. 각 용액을 60℃의 고온조에 넣어, 잔존활성을 측정하였다.

표 2 : 잔존 상대활성(%)

시간(분)	NAD-GDH	본 효소 GDH
0	100	100
15	20	100
30	5	100

본 효소는 현재 시판되고 있는 GDH 효소와 비교해서, 경이적인 열안정성이 있는 것을 확인할 수 있었다. 본 효소는 시판의 NAD-GDH와는 완전히 별도의 신규 효소인 것이 판명되었다.

실시예 10 : GDH α-서브유닛을 코딩하는 유전자의 단리

<1> 버크호르데리아 세파시아 KS1 균주로부터 염색체 DNA의 조제

버크호르데리아 세파시아 KS1 균주로부터 염색체 유전자를 통상의 방법에 따라서 조제하였다. 즉, 상기 균주를 TL 액체배지(1L에 폴리펩톤 10g, 효모 추출액 1g, NaCl 5g, KH₂PO₄2g, 글루코오스 5g, pH 7.2)를 사용하여, 34℃에서 하룻밤 진동시켰다. 증식한 균체를 원심분리기에 의해 회수하였다. 이 균체를 10mM NaC1, 20mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 0.5% SDS, 및 100㎍/㎖ 프로테이나제 K를 포함하는 용액에 현탁하여, 50℃에서 6시간 처리하였다. 상기 혼합물에 같은 양의 페놀클로로포름을 가하여 실온에서 10분간 교반한 후, 원심분리기에 의해 상청을 회수하였다. 이 상청에 최종농도가 0.3M이 되도록 초산나트륨을 가하고, 2배량의 에탄올을 중층하여 중간층에 염색체 DNA를 석출시켰다. DNA를 유리막대를 사용하여 취하고, 70% 에탄올로 세정한 후, 적당량의 TE 버퍼에 용해시켜, 염색체 DNA 용액을 얻었다.

<2> GDH α-서브유닛의 N-말단 아미노산 서열의 결정

실시예 2와 같이 하여 정제한 GDH를 동결건조에 의해서 농축 후, 12.5% 폴리아크릴아미드를 사용한 SDS-전기영동으로 전개하여, α-서브유닛을 분리하였다. 이렇게 해서 얻어진 α-서브유닛을 폴리비닐리덴 플루오라이드 막에 전사한 후, 아미노산 시퀀서(시마즈제작소제, PPSQ-10)에 의해 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다. 그 결과, 본 효소가 서열번호: 3의 아미노산 서열에 있어서 아미노산번호 2∼12의 11 잔기로 구성되는 펩티드 서열을 포함하는 것이 분명해졌다.

<3> α-서브유닛을 코딩하는 유전자의 클로닝

<1>에서 조제한 DNA 1㎍를 제한효소 Sau3AI로 한정분해하고, 송아지 소장유래 알칼리 포스파타제(CIAP)로 처리하였다. 한편, 코스미드(cosmid)인 SuperCosI (STRATAGENE사에서 입수)를 BamHI로 처리하고, T4 DNA 리가제를 사용하여 SuperCosI에 α-15 균주 유래의 염색체 DNA 단편을 Sau3AI으로 한정분해하여 얻어진 DNA 단편을 조립하였다. 얻어진 재조합 DNA로 에스케리키아 콜리 XL-l Blue MR(STRATAGENE사에서 입수)을 형질전환하였다. 형질전환체는 SuperCosI의 항생물질내성인 네오마이신내성 및 암피실린내성에 따라서 10㎍/㎖의 니오마이신 및 25㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 LB 한천배지로부터 선별하였다. 얻어진 형질전환체를 상기 LB 액체배지에서 배양하였다. 이들 형질전환 균체를 집균 후, GDH 활성 측정시약에 현탁하여, 글루코오스에 대한 탈수소효소 활성을 지표로하여 클론을 선발하였다. 그 결과, 글루코오스 탈수소효소 활성을 나타내는 하나의 클론 균주를 얻을 수 있었다.

<4> 서브클로닝

<3>에서 얻어진 α-서브유닛을 코딩하는 유전자를 포함하는 코스미드 SuperCosI로부터, 목적 유전자를 포함하는 DNA 단편을 조제하였다. 상기 코스미드로부터 삽입된 유전자 단편을 제한효소 NotI를 사용하여 잘라내었다. 이 DNA 단편을 제한효소 XbaI로 처리하고, XbaI로 절단된 플라스미드 pUC18에 조립하였다. 각 삽입단편을 포함하는 플라스미드 pUC18로 에스케리키아 콜리 DH5αMCR 균주를 형질전환하고, 암피실린 50㎍/㎖를 포함하는 LB 한천배지에서 생기는 콜로니를 채취하였다. 얻어진 형질전환체를 액체 LB 배지에서 배양하고, 각각의 세포의 GDH 활성을 <3>과 같이 조사하였다. 그 결과, 1개의 형질전환체로부터 GDH 활성을 나타내는 균주를 얻을 수 있었다. 이 형질전환체로부터 플라스미드를 추출하고, 그 삽입된 DNA 단편을 분석하였다. 그 결과, 약 8.8kbp의 삽입단편이 확인되었다. 본 플라스미드를 pKS1이라 명명하였다.

<5> 핵산염기 서열의 결정

pKS1에 삽입된 DNA 단편에 대해서, 제한효소해석 및 통상의 방법에 따라서 핵산염기 서열을 결정하였다. 그 결과, 본 삽입 DNA 단편 중에, <2>에서 획인된 α-서브유닛의 N-말단 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열이 확인되었고, 이 서열을 포함하는 오픈리딩프레임(open reading frame)이 발견되었다. 결정된 핵산염기 서열 및 이 핵산염기 서열에 의해 코드될 수 있는 아미노산 서열은, 서열번호: 1 및 3에 나타내는 바와 같다. 아미노산서열로부터 얻어지는 단백질의 분자량은 59,831Da이고, 버크호르데리아 세파시아 KS1 균주 α-서브유닛의 SDS-PAGE로부터 구해진 분자량 60kDa에 거의 일치하였다.

α-서브유닛의 핵산염기 서열이 결정된 것에 의해, 상기 α-서브유닛의 구조유전자를 사용하여 벡터를 제작하고, 또한 상기 벡터로 형질전환체를 제조하였다.

우선 벡터에 삽입하는 유전자를 아래와 같이 조제하였다.

KS1 균주 유래의 게놈 단편을 템플레이트로 사용하여, 원하는 제한효소부위를 포함하도록, PCR반응으로 증폭시켰다. PCR 반응에서는 다음 1조의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다.

(포워드)

5'- CCCAAGCTTGGGCCGATACCGATACGCA-3' (서열번호: 9)

(리버스)

5'-GAGAAGCTTTCCGCACGGTCAGACTTCC-3' (서열번호: 10)

PCR에 의해 증폭된 유전자를 제한효소 HindIII로 절단한 후, 발현벡터 pFLAG-CTS(SIGMA사)의 클로닝부위인 HindIII 부위에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드를 pFLAG-CTS/α라 명명하였다.

상기 플라스미드 pFLAG-CTS/α로 에스케리키아 콜리 DH5αMCR 균주를 형질전환하고, 암피실린 50㎍/㎖을 포함하는 LB 한천배지에서 생기는 콜로니를 채취하였다.

또한, pKS1 삽입단편에 관해서, α-서브유닛의 상류에서 오픈리딩프레임을 검색한 바, 서열번호: 2에 기재되는 168 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 507 핵산염기로 구성되는 구조유전자(서열번호: 1중 핵산염기번호 258∼761)가 새롭게 발견되었다. 이 구조유전자는, γ-서브유닛을 코드하고 있다고 생각되었다.

α-서브유닛의 코딩영역의 상류에, γ-서브유닛을 코딩하는 영역의 존재가 분명해졌기 때문에, γ-서브유닛과 α-서브유닛을 연속적으로 포함하는 폴리시스트론 구조의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작하여, 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 구축하였다.

우선, 벡터에 삽입되는 유전자를 아래와 같이 조제하였다.

γ-서브유닛의 구조유전자 및 α-서브유닛의 구조유전자를 연속적으로 포함하는 KS1 균주 유래의 게놈단편을 템플레이트로 하여, 원하는 제한효소부위를 포함하도록 PCR 반응에 의해 증폭하였다. PCR 반응에는 다음 1조의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다.

(포워드)

5' -CATGCCATGGCACACAACGACAACACT-3' (서열번호: 11)

(리버스)

5'-CCCAAGCTTGGGTCAGACTTCCTTCTTCAGC-3' (서열번호: 12)

이 PCR에 의해 증폭된 유전자의 5'말단 및 3'말단을 NcoI 및 HindIII로 각각절단한 후, 벡터 pTrc99A(Pharmacia사)의 클로닝부위인 NcoI/HindIII에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드를 pTrc99A/γ+α라 명명하였다.

상기 플라스미드 pTrc99A/γ+α로 에스케리키아 콜리 DH5αMCR 균주를 형질전환하고, 암피실린 50㎍/㎖를 포함하는 LB 한천배지에서 생기는 콜로니를 채취하였다.

실시예 11 : 재조합 대장균에 의한 GDH α-서브유닛의 생산

상기 pKS1, pFLAG-CTS/α및 pTrc99A/γ+α 각각의 플라스미드로 형질전환된 에스케리키아 콜리 DH5αMCR 균주를 사용하여 α-서브유닛의 생산을 하였다. 각 형질전환체를 암피실린 50㎍/㎖를 포함하는 LB 배지 3㎖에 식균하고, 37℃에서 12시간 배양하고, 원심분리기에 의해 세포를 집균하였다. 이 세포를 프렌치 프레스 (1500kgf)로 파쇄한 후, 초원심분리(4℃, 160,400 ×g, 90분)에 의해 막 부분 (membrane fraction)(10mM 인산칼륨 완충액, pH 6.0)을 분리하였다.

실시예 12 : 글루코오스의 어세이

우선, 상기 각 막 부분을 사용하여 GDH 활성의 확인을 하였다. 구체적으로는, 594μM의 메틸페나진 메토설페이트(mPMS) 및 5.94μM의 2,6-디클로로페놀-인도페놀(DCIP)을 포함하는 10mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)을 사용하여, 육안으로 판정을 하였다. 결과는 이하와 같다. +의 수는, 청색으로부터 무색으로의 변화의 정도를 나타낸다.

pFLAG-CTS/α에 의한 형질전환체 배양막 부분 +

pKS1에 의한 형질전환체 배양막 부분 ++

pTrc99A/γ+α에 의한 형질전환체 배양막 부분 +++

α-서브유닛만을 조립한 pFLAG-CTS/α에 의한 형질전환체 배양막 부분의 GDH 활성이 가장 낮고, 효율적으로 벡터를 구축한 pTrc99A/γ+ α에 의한 형질전환체 배양막 부분이 가장 높은 GDH 활성을 나타내었다.

α-서브유닛의 구조유전자만을 사용한 벡터를 사용한 형질전환체에서도 α-서브유닛은 발현되지만, γ-서브유닛의 구조유전자와 α-서브유닛의 구조유전자를 조합하여 포함하는 벡터를 사용하는 것에 의해, 효율적으로 α-서브유닛을 얻을 수 있었다.

본 발명의 글루코오스 탈수소효소를 사용하여 글루코오스를 어세이하였다. 본 발명의 글루코오스 탈수소효소(α-서브유닛)의 효소활성을, 각종 농도의 글루코오스를 사용하여 측정하였다. GDH 활성의 측정은 594μM의 메틸페나진 메토설페이트(mPMS) 및 5.94μM의 2,6-디클로로페놀-인도페놀(DCIP)을 포함하는 10mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 속에서 행하였다. 효소시료와 글루코오스를 기질로서 가하고 37℃에서 인큐베이트한 후, DCIP의 600nm에서의 흡광도변화를 분광광도계를 사용하여 추적하였다. 흡광도의 감소속도를 효소 반응속도로 하였다. 본 발명의 GDH를 사용하여, 0.01∼1.0mM의 범위에서 글루코오스의 정량을 할 수 있었다.

실시예 13 : 글루코오스 센서의 제작 및 평가

실시예 2에서 얻어진 본 발명의 글루코오스 탈수소효소(25 단위)에 카본 페이스트 20mg을 가하여 동결건조시켰다. 이것을 잘 혼합한 후, 이미 카본 페이스트가 약 40mg 충전된 카본 페이스트 전극의 표면에만 충전하여, 여과지 상에서 연마하였다. 이 전극을 1%의 글루타르알데히드를 포함하는 10mM MOPS 완충액(pH 7.0) 속에서 실온에서 30분간 처리한 후, 20mM 라이신을 포함하는 10mM MOPS 완충액(pH 7.0) 속에서 실온에서 20분간 처리하여 글루타르알데히드를 블로킹하였다. 이 전극을 10mM MOPS 완충액(pH 7.0) 속에서 실온에서 1시간 이상 평형화시켰다. 전극은 4℃에서 보존하였다.

상기 전극을 작용극으로 사용하고, 참조극으로 Ag/AgC1 전극, 대극으로 Pt 전극을 사용하여, 글루코오스 첨가에 의한 응답전류치를 측정하였다. 1mM 메톡시-PMS를 포함하는 10mM 인산칼륨 완충액을 반응용액으로 사용하여, 100mV의 전압을 가하여 측정을 하였다.

제작한 효소센서를 사용하여 글루코오스의 농도를 측정하였다. 본 발명의 글루코오스 탈수소효소를 고정화한 효소센서를 사용하여, 0.05mM∼5.0mM의 범위에서 글루코오스의 정량을 할 수 있었다(도 6).

실시예 14 : 형질전환체로부터 얻어지는 GDH에 의한 글루코오스 센서의 제작 및 평가

실시예 12에 의해서 얻어진 본원발명의 α-서브유닛(249U/mg 단백질) 10U를 카본 페이스트 50mg에 가하여 동결건조시켰다. 이것을 잘 혼합한 후, 이미 카본 페이스트가 약 40mg 충전된 카본 페이스트 전극의 표면에만 충전하여, 여과지 상에서 연마하였다. 이 전극을 1%의 글루타르알데히드를 포함하는 10mM MOPS 완충액(pH 7.0) 속에서 실온에서 30분간 처리한 후, 20mM 라이신을 포함하는 10mM MOPS 완충액(pH 7.0) 속에서 실온에서 20분간 처리하여 글루타르알데히드를 블로킹하였다. 이 전극을 10mM MOPS 완충액(pH 7.0) 속에서 실온에서 1시간 이상 평형화시켰다. 전극은 4℃에서 보존하였다.

상기 전극을 작용극으로서, Ag/AgCl 전극을 참조극으로, Pt 전극을 대극으로 사용하여, 글루코오스 첨가에 의한 응답전류치를 측정하였다. 1mM 메톡시-PMS를 포함하는 10mM 인산칼륨 완충액을 반응용액으로 하여, 100mV를 전압을 가하면서 각 농도의 글루코오스 수용액을 25℃ 및 40℃에서 측정하였다.

제작한 효소센서를 사용하여 글루코오스의 농도의 측정을 한 바, 각 농도에 따른 전류를 얻을 수 있는 것을 확인하였다.

본 발명에 의해, 기질특이성이 높고, 염가에 생산할 수 있고, 측정 샘플의 용존산소의 영향을 받지 않는 효소로서, 특히 열안정성이 뛰어난 신규 글루코오스 탈수소효소, 및 해당 효소의 제조방법이 제공될 수 있었다. 또한, 이 효소를 생산하는 버크호르데리아 세파시아의 신규 균주를 얻을 수 있었다. 본 효소 또는 균주를 포함하는 효소전극을 사용하면, 글루코오스측정에 유효한 글루코오스 센서도 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 의해 글루코오스 탈수소효소가 유전자, 이 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있는 펩티드, 및 그 펩티드를 코딩하는 DNA가 판명되었기 때문에, 상기 유전자를 기초로 재조합 DNA 기술을 사용하여 GDH를 대량으로 조제할 수가 있다.

Claims

버크호르데리아(Burkhorderia)속에 속하고, 글루코오스 탈수소효소를 생산할 능력을 갖는 미생물을 배지에서 배양하고, 상기 배지 및/또는 상기 미생물 균체로부터 글루코오스 탈수소효소를 채취하는 단계를 포함하는 글루코오스 탈수소효소의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 미생물이 버크호르데리아 세파시아(Burkhorderia cepacia)인 것을 특징으로 하는 글루코오스 탈수소효소의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 글루코오스 탈수소효소가 하기성질을 갖는 것을 특징으로 하는 글루코오스 탈수소효소의 제조방법:

(ⅰ) 상기 효소는 글루코오스의 탈수소반응을 촉매하는 작용을 하고;

(ⅱ) 상기 효소는 환원조건 하에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서, 분자량 약 60kDa와 분자량 약 43kDa를 나타내는 서브유닛으로 이루어지고;

(ⅲ) 상기 효소는 TSK Gel G3000SW(Tosoh Corporation)를 사용한 겔 여과 크로마토그래피에서, 분자량 약 380kDa를 나타내고; 그리고

(ⅳ) 상기 효소는 약 45℃에서 적당한 반응온도를 나타낸다(Tris-HCl 완충액, pH 8.0).
제 3 항에 있어서, 상기 분자량 약 43kDa의 서브유닛이 전자전달 단백질인것을 특징으로 하는 글루코오스 탈수소효소의 제조방법.
제 4 항에 있어서, 상기 전자전달 단백질이 시토크롬 C인 것을 특징으로 하는 글루코오스 탈수소효소의 제조방법.
버크호르데리아속에 속하는 미생물에 의해서 생산될 수 있는 글루코오스 탈수소효소.
제 6 항에 있어서, 상기 미생물이 버크호르데리아 세파시아인 것을 특징으로 하는 글루코오스 탈수소효소.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 글루코오스 탈수소효소가 하기성질을 갖는 것을 특징으로 하는 글루코오스 탈수소효소:

(ⅰ) 상기 효소는 글루코오스의 탈수소반응을 촉매하는 작용을 하고;

(ⅱ) 상기 효소는 환원조건 하에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서, 분자량 약 60kDa와 분자량 약 43kDa를 나타내는 서브유닛으로 이루어지고;

(ⅲ) 상기 효소는 TSK Gel G3000SW(Tosoh Corporation)를 사용한 겔 여과 크로마토그래피에서, 분자량 약 380kDa를 나타내고; 그리고

(ⅳ) 상기 효소는 약 45℃에서 적당한 반응온도를 나타낸다(Tris-HCl 완충액, pH 8.0).
제 8 항에 있어서, 상기 분자량 약 43kDa의 서브유닛이 전자전달 단백질인 것을 특징으로 하는 글루코오스 탈수소효소.
제 9 항에 있어서, 상기 전자전달 단백질이 시토크롬 C인 것을 특징으로 하는 글루코오스 탈수소효소.
제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자량 약 60kDa의 서브유닛이, 서열번호: 3의 아미노산번호 2∼12의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 글루코오스 탈수소효소.
제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자량 43kDa의 서브유닛의 N-말단이 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 글루코오스 탈수소효소.
제 11 항에 있어서, 상기 분자량 약 60kDa의 서브유닛이 이하의 (A) 또는 (B)에 나타내는 단백질인 것을 특징으로 하는 글루코오스 탈수소효소:

(A) 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(B) 서열번호: 3의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 갖고, 글루코오스 탈수소효소 활성을 갖는 단백질.
제 6 항에 있어서, 45℃ 부근과 75℃ 부근에 활성피크를 갖는 것을 특징으로 하는 글루코오스 탈수소효소.
제 10 항에 기재된 글루코오스 탈수소효소의 서브유닛으로서, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 시토크롬 C.
제 15 항에 기재된 시토크롬 C의 일부를 코딩하고, 서열번호: 8의 핵산염기 서열을 갖는 DNA.
제 15 항에 기재된 시토크롬 C의 일부를 코딩하고, 서열번호: 1에 기재된 핵산염기 서열 중 핵산염기번호 2386∼2467의 핵산염기 서열을 갖는 DNA.
제 15 항에 기재된 시토크롬 C의 시그널 펩티드를 코딩하고, 서열번호: 1의 핵산염기 서열 중 핵산염기번호 2386∼2451의 핵산염기 서열을 포함하는 DNA.
시토크롬 C의 시그널 펩티드로서, 서열번호: 4의 아미노산 서열 중 아미노산번호 1∼22의 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
하기 성질을 갖는 단백질:

(ⅰ) 상기 단백질은 서브유닛으로서 제 6 항에 기재된 글루코오스 탈수소효소를 구성할 수 있고;

(ⅱ) 상기 단백질은 글루코오스 탈수소효소 활성을 갖고;

(ⅲ) 상기 단백질은 환원조건 하에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서, 분자량 약 60kDa를 나타내고; 그리고

(ⅳ) 상기 단백질은 약 75℃에서 적당한 반응온도를 나타낸다(Tris-HCl 완충액, pH 8.0).
제 20 항에 있어서, 서열번호: 3에 있어서 아미노산번호 2∼12의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
상기 단백질이 이하의 (A) 또는 (B)에 나타내는 단백질인 제 21 항에 기재된 글루코오스 탈수소효소:

(A) 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(B) 서열번호: 3의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 갖고, 글루코오스 탈수소효소 활성을 갖는 단백질.
이하의 (A) 또는 (B)에 나타내는 단백질:

(A) 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(B) 서열번호: 3의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 갖고, 글루코오스 탈수소효소 활성을 갖는 단백질.
이하의 (A) 또는 (B)에 나타내는 단백질을 코딩하는 DNA:

(A) 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(B) 서열번호: 3의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 갖고, 글루코오스 탈수소효소 활성을 갖는 단백질.
제 24 항에 있어서, 이하의 (a) 또는(b)에 나타내는 DNA인 것을 특징으로 하는 DNA:

(a) 서열번호: 1의 핵산염기 서열 중, 핵산염기번호 764∼2380의 핵산염기 서열을 포함하는 DNA;

(b) 서열번호: 1 중에서 핵산염기번호 764∼2380의 서열을 포함하는 핵산염기 서열 또는 이 서열로부터 제조될 수 있는 프로브(probe)와 엄격한 조건하에서 교배할 수 있고, 글루코오스 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
제 24 항 또는 제 25 항에 기재된 DNA를 포함하는 재조합 벡터.
제 26 항에 있어서, 제 18 항에 기재된 시그널 펩티드 및 β-서브유닛을 코딩하는 핵산염기 서열을 포함하는 재조합 벡터.
제 24 항 또는 제 25 항에 기재된 DNA, 또는 제 26 항 또는 제 27 항에 기재된 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제 28 항에 기재된 형질전환체를 배양하여 상기 DNA의 발현산물로서 글루코오스 탈수소효소를 생산하고, 이것을 채취하는 단계를 포함하는 글루코오스 탈수소효소의 제조방법.
버크호르데리아 세파시아 KS1 균주(FERM BP-7306).
제 6 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 글루코오스 탈수소효소, 제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 기재된 단백질, 제 27 항에 기재된 형질전환체, 또는 제 30 항에 기재된 균주를 포함하는 효소전극을 사용한 글루코오스 센서.
제 6 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 글루코오스 탈수소효소, 또는 제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 기재된 단백질을 포함하는 글루코오스 어세이 키트(assay kit).
서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질.
서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.
제 34 항에 있어서, 서열번호: 1의 핵산염기서열 중, 핵산염기번호 258∼761의 핵산염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 34 항 또는 제 35 항에 기재된 DNA, 및 제 24 항 또는 제 25 항에 기재된 DNA를 이 순서로 포함하는 DNA.
제 36 항에 있어서, 서열번호: 1의 핵산염기 서열 중, 핵산염기번호 258∼2380의 핵산염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 36 항 또는 제 37 항에 기재된 DNA를 포함하는 재조합 벡터.
제 38 항에 있어서, 제 18 항에 기재된 시그널 펩티드 및 β-서브유닛을 코딩하는 핵산염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 36 항 또는 제 37 항에 기재된 DNA, 또는 제 38 항 또는 제 39 항에 기재된 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제 40 항에 기재된 형질전환체를 배양하여, 제 36 항 또는 제 37 항에 기재된 DNA의 발현물질로서 글루코오스 탈수소효소를 생산하고, 이것을 채취하는 단계를 포함하는 글루코오스 탈수소효소의 제조방법.