JPWO2002036779A1 - 新規グルコース脱水素酵素及び該脱水素酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

ブルクホルデリア属に属し、グルコース脱水素酵素を産生する能力を有する微生物を培地に培養し、同培地又は／及び前記微生物菌体からグルコース脱水素酵素を採取することにより、基質特異性が高く、安価に生産でき、測定サンプルの溶存酸素の影響を受けない酵素であって、特に熱安定性に優れた新規なグルコース脱水素酵素を得る。

Description

技術分野
本発明は、新規なグルコース脱水素酵素及びその製造方法、同酵素をコードするＤＮＡ、同酵素をコードするＤＮＡを含有する組換えベクター、同組換えベクターで形質転換された形質転換体、同酵素を生産する新規な微生物、前記酵素、形質転換体又は微生物を含む酵素電極を用いたグルコースセンサ、及びグルコースアッセキットに関する。
背景技術
特定の基質に対して特異的に反応する酵素を用いたバイオセンサの開発は、産業の分野を問わず盛んに行われている。その中でも特にバイオセンサの１つであるグルコースセンサは、主に医療分野で測定方法やその方法を利用した装置の開発が盛んに行われている。
グルコースセンサは、１９６２年にＣｌａｒｋとＬｙｏｎｓによってグルコースオキシダーゼと酸素電極を組み合わせたバイオセンサーの報告（Ｌ．ｃ．Ｃｌａｒｋ，Ｊ．ａｎｄ　Ｌｙｏｎａｓ，Ｃ．”Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｉｎ　ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｓｕｒｇｅｒｙ．”Ａｎｎ，ｎ．ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５：２０−４５）が最初にされて以来、約４０年ほどの歴史を有している。
このように、グルコースセンサに、酵素としてグルコースオキシダーゼを採用してからの歴史は、長い。なぜならグルコースオキシダーゼは、グルコースに対する基質特異性が高く、熱安定性に優れており、更に酵素の量産化が可能であり、生産コストが他の酵素と比べて安価である、からである。
基質特異性が高いということは、酵素がグルコース以外の糖とは反応しないため、測定値に誤差を生じることなく、正確な測定が行なえるという利点に通じる。
また、熱安定性に優れているということは、酵素が熱により変性し酵素活性が失活するという問題を防止することができ、長期間正確な測定が行えるという利点に通じる。
しかし、グルコースオキシダーゼは、基質特異性が高く、熱安定性に優れ、安価に生産できる一方、以下で説明するような溶存酸素の影響を受け、測定結果に影響があるという問題を有する。
一方、グルコースオキシダーゼ以外に、グルコース脱水素酵素（以下、「グルコースデヒドロゲナーゼ」ともいう）を利用したグルコースセンサの開発も行われてきた。そして、酵素も、微生物から発見されている。
例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）及びクリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属由来グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１９）が知られている。
前者のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）は、β−Ｄ−グルコース＋ＮＡＤ（Ｐ）^＋→Ｄ−δ−グルコノラクトン＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ^＋の反応を触媒する酵素であり、後者のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１９）は、Ｄ−グルコース＋ＮＡＤＰ^＋→Ｄ−δ−グルコノラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ^＋の反応を触媒する酵素であり、前述した微生物由来のグルコースデヒドロゲナーゼは、既に市販もされている。
これらグルコースデヒドロゲナーゼは、測定サンプルの溶存酸素の影響を受けないという利点を有する。このことは、酸素分圧が低い環境下で測定を行ったり、酸素量が多く要求される高濃度サンプルを測定する場合であっても、測定結果に誤差を及ぼさずに正確に測定することができるという利点に通じる。
しかし、グルコースデヒドロゲナーゼは、溶存酸素の影響を受けない一方、熱安定性が悪く、基質特異性がグルコースオキシダーゼよりも劣るという問題点を有する。
そこで、グルコースオキシダーゼやグルコースデヒドロゲナーゼの両欠点を補う酵素の提供が望まれていた。
尚、本発明者は　Ｓｏｄｅ，Ｋ．，Ｔｓｕｇａｗａ，Ｗ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．，Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｎ．，ａｎｄＴａｎａｋａ，Ｍ．，（１９９６）Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９，８２−８５．や、Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｔｓｕｇａｗａ，Ｗ．，ａｎｄＳｏｄｅ，Ｋ．，（１９９９）Ａｐｐｌｉ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃ．７７−７９／０３２５や、Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｔｓｕｇａｗａ，Ｗ．，ａｎｄＳｏｄｅ，Ｋ．，（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃ　Ｌｅｔｔ．２１，１９９−２０２において、温泉近くの土壌より採取した試料を用い、グルコース脱水素酵素についての研究結果を報告している。
しかし、該酸素を産生する能力を有する菌株の同定は該研究段階では行われていなかった。
発明の開示
本発明は、従来から知られているグルコースオキシダーゼやグルコースデヒドロゲナーゼ両者の欠点をそれぞれ補う性質を持ち、基質特異性が高く、熱安定性に優れ、安価に生産でき、測定サンプルの溶存酸素の影響を受けない酵素を提供することを課題とする。
また本発明は、前記酵素の製造方法、該酵素の特性を活かしたタンパク質および該酵素を生産する新規な微生物を提供することを課題とする。
また本発明は、前記酵素をコードするＤＮＡ、同酵素をコードするＤＮＡを含有する組換えベクター、同組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供することを課題とする。
また本発明は、前記酵素、形質転換体又は前記微生物を含む酵素電極を用いたグルコースセンサ、及び前記酵素を含むグルコースアッセキットを提供することを課題とする。
本発明者は、温泉近くの土壌より上記の目的に合った酵素を生産するブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ）を単離することに成功し、本発明に至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ブルクホルデリア属に属し、グルコース脱水素酵素を産生する能力を有する微生物を培地に培養し、同培地又は／及び前記微生物菌体からグルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするグルコース脱水素酵素の製造方法。
（２）前記微生物がブルクホルデリア・セパシアである（１）のグルコース脱水素酵素の製造方法。
（３）前記グルコース脱水素酵素が下記性質を有することを特徴とする（１）又は（２）のグルコース脱水素酵素の製造方法。
▲１▼作用：
グルコースの脱水素反応を触媒する。
▲２▼還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０ｋＤａと分子量約４３ｋＤａを示すサブユニットからなる。
▲３▼ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ（東ソー（株）製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、分子量約３８０ｋＤａを示す。
▲４▼至適反応温度：
４５℃付近（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）。
（４）前記分子量約４３ｋＤａのサブユニットが電子伝達タンパク質であることを特徴とする（３）のグルコース脱水素酵素の製造方法。
（５）前記電子伝達タンパク質がチトクロムＣであることを特徴とする（４）のグルコース脱水素酵素の製造方法。
（６）ブルクホルデリア属に属する微生物によって産生され得るグルコース脱水素酵素。
（７）前記微生物がブルクホルデリア・セパシアである（６）のグルコース脱水素酵素。
（８）前記グルコース脱水素酵素が下記性質を有することを特徴とする（６）又は（７）のグルコース脱水素酵素。
▲１▼作用：
グルコースの脱水素反応を触媒する。
▲２▼還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０ｋＤａと分子量約４３ｋＤａを示すサブユニットからなる。
▲３▼ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ（東ソー（株）製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、分子量約３８０ｋＤａを示す。
▲４▼至適反応温度：
４５℃付近　（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）。
（９）前記分子量約４３ｋＤａのサブユニットが電子伝達タンパク質であることを特徴とする（８）のグルコース脱水素酵素。
（１０）前記電子伝達タンパク質がチトクロムＣであることを特徴とする（９）のグルコース脱水素酵素。
（１１）前記分子量約６０ｋＤａのサブユニットが、配列番号３のアミノ酸番号２〜１２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする（８）〜（１０）のいずれかのグルコース脱水素酵素。
（１２）前記４３ｋＤａのサブユニットのＮ末端が配列番号５のアミノ酸配列を有する請求項８〜１１のいずれか１項に記載のグルコース脱水素酵素。
（１３）前記分子量約６０ｋＤａのサブユニットが以下の（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質である（１１）のグルコース脱水素酵素。
（Ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（１４）４５℃付近と７５℃付近にそれぞれ活性ピークを有することを特徴とする（６）のグルコース脱水素酵素。
（１５）（１０）のグルコース脱水素酵素のサブユニットであって、配列番号５のアミノ酸配列を有することを特徴とするチトクロームＣ。
（１６）（１５）のチトクロムＣの一部をコードし、配列番号８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（１７）（１５）のチトクロームＣの一部をコードし、配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号２３８６〜２４６７の塩基配列を有するＤＮＡ。
（１８）（１５）のチトクロームＣのシグナルペプチドをコードし、配列番号１の塩基配列のうち塩基番号２３８６〜２４５１の塩基配列を含むＤＮＡ。
（１９）チトクロームＣのシグナルペプチドであって、配列番号４のアミノ酸配列のうちアミノ酸番号１〜２２のアミノ酸配列を有するペプチド。
（２０）下記性質を有するタンパク質。
▲１▼サブユニットとして（６）のグルコース脱水素酵素を構成し得る。
▲２▼グルコース脱水素酵素活性を有する。
▲３▼還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０ｋＤａを示す。
▲４▼至適反応温度：
７５℃付近　　（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）。
（２１）配列番号３においてアミノ酸番号２〜１２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする（２０）のタンパク質。
（２２）前記タンパク質が以下の（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質である（２１）のグルコース脱水素酵素。
（Ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（２３）以下の（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（２４）以下の（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（２５）以下の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡである（２４）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２６）（２４）又は（２５）のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（２７）（１８）のシグナルペプチド及びβ−サブユニットをコードする塩基配列を含む（２６）の組換えベクター。
（２８）（２４）又は（２５）のＤＮＡ、又は（２６）又は（２７）の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（２９）（２８）の形質転換体を培養して、前記ＤＮＡの発現産物としてグルコース脱水素酵素を産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素の製造方法。（３０）ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３０６）。
（３１）（６）〜（１４）のいずれかのグルコース脱水素酵素、（２０）〜（２３）のいずれかのタンパク質、（２７）の形質転換体、又は（３０）の菌株を含む酵素電極を用いたグルコースセンサ。
（３２）（６）〜（１４）のいずれかのグルコース脱水素酵素、又は（２０）〜（２３）のいずれかのタンパク質を含むグルコースアッセイキット。
（３３）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（３４）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３５）配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号２５８〜７６１からなる塩基配列含む（３４）のＤＮＡ。
（３６）（３４）又は（３５）のＤＮＡと、（２４）又は（２５）のＤＮＡをこの順に含むＤＮＡ。
（３７）配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号２５８〜２３８０からなる塩基配列を含む（３６）のＤＮＡ。
（３８）（３６）又は（３７）のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（３９）（１８）のシグナルペプチド及びβ−サブユニットをコードする塩基配列を含む（３８）の組換えベクター。
（４０）（３６）又は（３７）のＤＮＡ又は（３８）又は（３９）の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（４１）（４０）の形質転換体を培養して、（３６）又は（３７）のＤＮＡの発現物質としてグルコース脱水素酵素を産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素の製造方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のグルコース脱水素酵素を産生する新規菌株
本発明酵素（以下、「本酵素」または「ＧＤＨ」ということがある）は、ブルクホルデリア属に属する細菌によって生産され得る。本発明に用いるブルクホルデリア属細菌は、本酵素の生産能を有するブルクホルデリア属細菌であれば特に制限されないが、ブルクホルデリア・セパシア、特にブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株が好ましい。この菌株は、後記実施例に示すように、本発明者らが温泉付近の土壌から分離した新規菌株であり、その菌学的性質からブルクホルデリア・セパシアと同定された。従来、ブルクホルデリア属に属する微生物がグルコース脱水素酵素を産生しうることは知られていない。この菌株は、ＫＳ１株と命名された。この株は、平成１２年９月２５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に微生物受託番号第ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３０６として寄託されている。
なお、本発明者らはブルクホルデリア・セパシア　ＫＳ１株以外の株について、財団法人発酵研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，ＩＦＯ）又は理化学研究所微生物系統保存施設（Ｊａｐａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ＪＣＭ）に寄託されている同ブルクホルデリア・セパシアのいくつかの菌株を取り寄せてグルコース脱水素酵素活性を測定したところ、いずれの菌株にも活性があることを確認した。
＜２＞本発明のグルコース脱水素酵素
本発明のグルコース脱水素酵素は、グルコース脱水素酵素産生能を有するブルクホルデリア属細菌、例えばブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株を、通常、微生物の培養に用いられる栄養培地、好ましくは酵素生産能を高めるためにグルコース或はグルコースを含む物質を添加した培地で培養することにより、培養生成物中又は菌体中に生産蓄積されるので、公知の方法で採取することができる。更に本酵素の製造方法を、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株を例として具体的に説明する。まずブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株を適当な栄養培地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類、グルコース或はこれらを含む物質などを含む培地で培養して本酵素を培養生成物中か菌体中に生産蓄積させる。
炭素源としては、資化できるものはいずれの物質も利用でき、例えば、Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビソース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、デンプン、各種ペプトン類などが挙げられる。窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキス、各種ペプトン類、各種肉エキス類、コーンスティープリカー、アミノ酸溶液、アンモニウム塩など有機、無機の窒素化合物又はこれらを含有した物質が利用できる。無機塩としては、各種リン酸塩、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムなどの塩類が使用される。また必要に応じて菌の生育或は酵素生産に必要な各種の無機物や有機物、例えばシリコーン油、ゴマ油、各種界面活性剤などの消泡剤やビタミン類を培地に添加することができる。
培養の形態は、液体培養でも固体培養でもよいが、通常は液体培養が好適である。
こうして得られた培養物の培地中又は／及び菌体中から本発明酵素を得ることが出来る。菌体中にある酵素は、菌体を破砕あるいは溶解することによって、菌体抽出液として得られる。
培養生成物中あるいは菌体抽出液中のグルコース脱水素酵素は、イオン交換体、ゲル濾過担体、ハイドロフォービック（疎水性）担体などを用いたクロマトグラフィーを適宜組み合わせることによって精製することができる。
本酵素の活性は、公知のグルコース脱水素酵素の活性測定と同様の方法で測定することができる。具体的には、例えば後記実施例に示す方法によって測定できる。
次に本発明の新規グルコース脱水素酵素の理化学的性質を示す。
▲１▼作用：
グルコースの脱水素反応を触媒する。
▲２▼還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０ｋＤａと分子量約４３ｋＤａを示すサブユニットからなる。
▲３▼ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ（東ソー（株）製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、分子量約３８０ｋＤａを示す。
▲４▼至適反応温度：
４５℃付近　（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）。
尚、上記グルコース脱水素酵素酵素は、上記条件で４５℃付近に活性ピークを有するが、７５℃付近にも活性ピークを有する（図３（ａ）参照）。このように、２つの温度領域で活性ピークを示すＧＤＨは知られていない。
尚、分子量及び至適温度は後記実施例に記載の方法で測定できる。
上記、本発明のグルコース脱水素酵素は分子量約６０ｋＤａのαサブユニットと分子量約４３ｋＤａのβサブユニットの２つの別個のポリペプチドで構成されている（以下、このグルコース脱水素酵素を「多量体酵素」ということがある）が、本発明者らはさらに２つのサブユニットにつき詳細に検討した。
βサブユニットはチトクロムＣであることがわかった（後記実施例で示す）。
αサブユニットのみを含むタンパク質は以下の理化学的性質を示す。
▲１▼サブユニットとして前記多量体酵素を構成し得る。
▲２▼グルコース脱水素酵素活性を有する。
▲３▼還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量６０ｋＤａを示す。
▲４▼至適反応温度：
７５℃付近　　（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）。
尚、至適温度は後記実施例に記載の方法で測定できる。
尚、このタンパク質はそれ自身酵素活性を有しているため、説明の内容に応じ、適宜このタンパク質をペプチド酵素もしくは酵素と言い換えて使用することとする。
本発明のペプチド酵素の具体的態様として、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また同ペプチド酵素は、ＧＤＨ活性を有する限り、配列番号３のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、配列番号３には、配列番号１の塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列を示してあるが、Ｎ末端のメチオニン残基は、翻訳後に脱落している可能性がある。
また、本発明の多量体酵素の具体的態様として、αサブユニットが配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む多量体が挙げられる。また同多量体酵素は、ＧＨＤ活性を有する限り、αサブユニットが配列番号３のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を含む多量体であってもよい。
本発明において「１又は複数」とは、１〜１０個、好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個である。
本発明者らは前記αサブユニット又は前記βサブユニット以外にも、γサブユニットの存在を確認している。
後述する実施例においては、前記γサブユニットは、培養上清あるいは菌体抽出液中から本発明の酵素を精製する段階で除去されて、精製後の酵素ではγサブユニットが確認されなかった。しかし、実施例に示したように、αサブユニットとともにγサブユニットを発現させると、αサブユニットのみを発現させた場合に比べて高い酵素活性が得られた。このことから、γサブユニットは、微生物体内においてαサブユニットが生成する際に何らかの関わりがあるタンパク質であることが示唆された。いずれの場合もαサブユニットの比活性（タンパク質当たりの酵素活性）が同じであるとすれば、酵素活性は酵素量を反映するから、酵素活性が低いことは酵素としてのαサブユニットの量が少ないことを示している。一方、生成したαサブユニットがγサブユニットによって何らかの保護を受けているのか、それともタンパク質としてのαサブユニットの充分発現しているが、γサブユニットが存在しないため酵素活性を示すことができる立体構造を取れずに、結果的に酵素活性が低くなったのかもしれない。いずれにしても、γサブユニットをαサブユニットとともに発現させることにより、高い酵素活性が得られる。
＜３＞本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、本発明のＤＮＡを含有する微生物、例えばブルクホルデリア・セパシアから取得することができる。本発明のＤＮＡは、本発明を完成する過程においては、ブルクホルデリア・セパシア染色体ＤＮＡから単離されたが、本発明によりその塩基配列及び同塩基配列によってコードされるアミノ酸配列が明らかとなったので、これらの配列に基づいて化学合成することによっても取得することができる。また。前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブ又はプライマーとするハイブリダイゼーション又はＰＣＲによって、ブルクホルデリア・セパシア等の染色体ＤＮＡから取得することもできる。
本発明のＤＮＡは、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものの他、配列番号３のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。
本発明のＤＮＡは具体的には、配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＧＤＨのαサブユニットをコードしている。
また本発明のＤＮＡは、配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
尚、配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号２５８〜７６１からなる塩基配列は、γサブユニットをコードしていると推定される。そのアミノ酸配列を配列番号２に示す。αサブユニットの上流域にγサブユニットの構造遺伝子が含まれることにより、微生物によってαサブユニットを生産する際に、先ずγサブユニットが発現されてタンパク質として存在することにより微生物体内で効率良くαサブユニットを生産することができると考えられる。したがって、本発明のＤＮＡは、前記ＤＮＡ以外にも、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んでいてもよい。
上記のような配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法又は突然変異処理等の方法によって取得することができる。変異が導入されたＤＮＡがコードするタンパク質のＧＤＨ活性は、例えば次のようにして測定することができる。
５９４μＭのメチルフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）および５．９４μＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、酵素試料および基質としてグルコースを基質として加え、３７℃でインキュベートする。ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少速度により、酵素反応速度とする。
さらに、配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号２３８６以降の塩基配列は、β−サブユニットをコードしていると推定される。また、塩基番号２３８６〜２４５１の塩基配列は、β−サブユニットのシグナルペプチドをコードしていると推測される。同シグナルペプチドの推定されるアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸番号１〜２２のアミノ酸配列である。シグナルペプチドは、リボソームで合成されたタンパク質が膜を通って分泌される際に必要なペプチドであり、１５〜３０残基の疎水性アミノ酸残基から成ることが判明されている。よってシグナルペプチドの存在によって、培養上清中に含有するタンパク質量が増加するため、タンパク質の製造方法おいて有効に作用するペプチドである。
以下に、本発明のＤＮＡを取得する方法を例示する。
ブルクホルデリア・セパシア等の微生物から染色体ＤＮＡを分離、精製した後、染色体ＤＮＡを超音波処理、制限酵素処理等を用いて切断したものと、リニアーな発現ベクターとをＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。得られた組換えベクターを、同ベクターが自律複製可能な宿主微生物に移入した後、形質転換体をベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、ＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。得られた微生物が持つ組換えベクターには、少なくともαサブユニットをコードする塩基配列が含まれていると予想される。また、クローン化断片が十分な大きさを有していれば、γサブユニットをコードする塩基配列も含まれている可能性が高い。
次いで、上記組換えベクターを保持する微生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベクターを分離、精製し、該発現ベクターからＧＤＨをコードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝子供与体である染色体ＤＮＡは、具体的には以下のようにして採取される。
前記遺伝子供与微生物を、例えば１〜３日間攪拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次いで、これを溶菌させることによりＧＤＨ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。
上記のようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
微生物から分離、精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。制限酵素は、ベクターの切断末端と適合する末端を生じさせるものを用いてもよく、あるいは任意の制限酵素を用い、切断末端を平滑末端化してベクターと連結してもよい。
クローニングする際のベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、Ｌａｍｂｄａ　ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ　ｇｔ１１などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１９，ｐＵＣ１１９，ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔあるいはコスミドであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩなどが例示される。
クローニングの際、上記のようなベクターを、上述したＧＤＨをコードする遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の付着末端とベクター断片の付着末端とのライゲーションの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作製する。必要に応じて、ライゲーションの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製することもできる。
クローニングに使用する宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるのであれば特に制限されない。一般的には、エシェリヒア・コリＤＨ５α，ＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲなどを用いることができる。
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
上記の方法により得られたクローン化断片がＧＤＨをコードしていることは、同断片の塩基配列を常法により解読することによって確認することができる。
上記のように得られた形質転換体から、組換えベクターを回収すれば、本発明のＤＮＡが得られる。
本発明のＤＮＡ又は同ＤＮＡを含む組換えベクターを保持する形質転換体を培養して、同ＤＮＡの発現産物としてＧＤＨを産生させ、これを菌体又は培養液から採取することにより、ＧＤＨを製造することができる。その際、本発明のＤＮＡは、αサブユニットをコードするＤＮＡであってもよいが、さらにγサブユニットをαサブユニットとともに発現させることによって、発現効率を高めることができる。
ＧＤＨを産生させる微生物としては、大腸菌をはじめとする腸内細菌群、シュードモナス属やグルコノバクター属などのグラム陰性細菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌をはじめとするグラム陽性細菌、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌が挙げられるが、これらに限られず、異種タンパク質生産に適した宿主微生物であれば用いることができる。
一度選択されたＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる微生物の形質転換は、例えばエシェリヒア属細菌ではカルシウム処理によるコンピテントセル法、バチルス属細菌ではプロトプラスト法、酵母ではＫＵ法やＫＵＲ法、糸状菌ではマイクロマニュピレーション法等の方法によって行うことができる。また、エレクトロポーレーション法も広く用いることができる。
宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
培養温度は菌が生育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は１２〜７２時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
培養物中のＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ＧＤＨ含有溶液と微生物菌体と分離した後に利用される。ＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを適宜組み合わせることによって精製することができる。を行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。
カラムクロマイトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましいが、γサブユニットが含まれていても良い。
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。
また、後記実施例に示すαサブユニットのアミノ酸配列と同様にしてβサブユニットのアミノ酸配列を決定し、βサブユニットをコードするＤＮＡを単離することができる。また、得られたＤＮＡを用いて、βサブユニットを製造することができる。さらに、αサブユニットをコードするＤＮＡ及びβサブユニットをコードするＤＮＡを用いて、多量体酵素を製造することもできる。
＜４＞本発明のグルコースセンサ
本発明のグルコースセンサは、本発明の酵素（前記多量体酵素もしくはペプチド酵素、又はγサブユニットが含まれる前記多量体酵素もしくはペプチド酵素）、本発明の形質転換体、又は本発明の微生物（ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株）を、酵素電極として用いることを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のグルコース脱水素酵素をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
グルコースの濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の酵素を固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコースの濃度を計算することができる。
＜５＞本発明のグルコースアッセイキット
本発明の糖類アッセイキットは、本発明の酵素（前記多量体酵素もしくはペプチド酵素、又はγサブユニットが含まれる前記多量体酵素もしくはペプチド酵素）を含むことを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明の酵素を少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の酵素に加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作成のためのグルコースなどの標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う酵素は種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
実施例１　グルコース脱水素酵素の生産能を有する菌の取得
〔スクリーニング〕
本発明の微生物は、日本の種々の温泉の近くの土壌を入手し、その土壌中より、グルコースを栄養源とする細菌の中からグルコースデヒドロゲナーゼ活性を示すものを選択して入手した。
この株の形態学的性質、生育特性、生理学特性を調べた結果を次に示す。
菌学的性質；
グラム染色　　　　　　　　　　　　　　陰性
細胞の形状　　　　　　　　　　　　　　桿菌
極性鞭毛を持つ
運動性　　　　　　　　　　　　　　　　陽性
フラグメントの数　　　　　　　　　　　＞５
至適増殖温度　　　　　　　　　　　　　４５℃
オキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　陰性
カタラーゼ　　　　　　　　　　　　　　陽性
アセトインの生成　　　　　　　　　　　陰性
Ｈ_２Ｓの生成　　　　　　　　　　　　　陰性
インドールの生成　　　　　　　　　　　陰性
グルコースからの酸　　　　　　　　　　陽性
アルギニンジヒドロラーゼ　　　　　　　陰性
ウレアーゼ　　　　　　　　　　　　　　陰性
β−グルコシダーゼ　　　　　　　　　　陰性
プロテアーゼ　　　　　　　　　　　　　陰性
β−ガラクトシダーゼ　　　　　　　　　陽性
リジンカルボキシラーゼ　　　　　　　　陰性
オリニチンカルボキシラーゼ　　　　　　陰性
硝酸塩の還元　　　　　　　　　　　　　陽性
〔資化性〕
グリセロール　　　　　　　　　　　　　陽性
エリトリトール　　　　　　　　　　　　陰性
Ｄ−アラビノース　　　　　　　　　　　陰性
Ｌ−アラビノース　　　　　　　　　　　陽性
リボース　　　　　　　　　　　　　　　陽性
Ｄ−キシロース　　　　　　　　　　　　陽性
Ｌ−キシロース　　　　　　　　　　　　陰性
アドニトール　　　　　　　　　　　　　陽性
β−メチル−キシロシド　　　　　　　　陰性
ガラクトース　　　　　　　　　　　　　陽性
Ｄ−グルコース　　　　　　　　　　　　陽性
Ｄ−フルクトース　　　　　　　　　　　陽性
Ｄ−マンノース　　　　　　　　　　　　陽性
Ｌ−ソルボース　　　　　　　　　　　　陰性
ラムノース　　　　　　　　　　　　　　陰性
ズルシトール　　　　　　　　　　　　　陽性
イノシトール　　　　　　　　　　　　　陽性
マンニトール　　　　　　　　　　　　　陽性
ソルビトール　　　　　　　　　　　　　陽性
α−メチル−Ｄ−マンノシド　　　　　　陰性
α−メチル−Ｄ−グルコシド　　　　　　陰性
Ｎ−アセチル−グルコサミン　　　　　　陽性
アミグダリン（Ａｍｙｇｄａｌｉｎｅ）　陰性
アルブチン　　　　　　　　　　　　　　陰性
エスクリン　　　　　　　　　　　　　　陰性
サリシン　　　　　　　　　　　　　　　陰性
セロビオース　　　　　　　　　　　　　陰性
マルトース　　　　　　　　　　　　　　陰性
ラクトース　　　　　　　　　　　　　　陰性
メリビオース　　　　　　　　　　　　　陰性
サッカロース　　　　　　　　　　　　　陰性
トレハロース　　　　　　　　　　　　　陽性
イヌリン　　　　　　　　　　　　　　　陰性
メレチトース　　　　　　　　　　　　　陰性
Ｄ−ラフィノース　　　　　　　　　　　陰性
アミドン（Ａｍｉｄｏｎ）　　　　　　　陰性
グリコーゲン　　　　　　　　　　　　　陰性
キシリトール　　　　　　　　　　　　　陽性
β−ゲンチオビオース　　　　　　　　　陰性
Ｄ−チュラノース　　　　　　　　　　　陰性
Ｄ−リキソース　　　　　　　　　　　　陰性
Ｄ−タガトース　　　　　　　　　　　　陰性
Ｄ−フコース　　　　　　　　　　　　　陰性
Ｌ−フコース　　　　　　　　　　　　　陰性
Ｄ−アラビトール　　　　　　　　　　　陽性
Ｌ−アラビトール　　　　　　　　　　　陽性
グルコン酸　　　　　　　　　　　　　　陽性
２−ケトグルコン酸　　　　　　　　　　陽性
５−ケトグルコン酸　　　　　　　　　　陰性
カプリン酸　　　　　　　　　　　　　　陽性
アジビン酸　　　　　　　　　　　　　　陽性
リンゴ酸　　　　　　　　　　　　　　　陽性
クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　陽性
フェニルアセテート　　　　　　　　　　陽性
〔酸化性〕
グリセロール　　　　　　　　　　　　　陰性
エリトリトール　　　　　　　　　　　　陰性
Ｄ−アラビノース　　　　　　　　　　　陰性
Ｌ−アラビノース　　　　　　　　　　　陽性
リボース　　　　　　　　　　　　　　　陽性
Ｄ−キシロース　　　　　　　　　　　　陽性
Ｌ−キシロース　　　　　　　　　　　　陰性
アドニトール　　　　　　　　　　　　　陽性
β−メチル−キシロシド　　　　　　　　陰性
ガラクトース　　　　　　　　　　　　　陽性
Ｄ−グルコース　　　　　　　　　　　　陽性
Ｄ−フルクトース　　　　　　　　　　　陽性
Ｄ−マンノース　　　　　　　　　　　　陽性
Ｌ−ソルボース　　　　　　　　　　　　陰性
ラムノース　　　　　　　　　　　　　　陰性
ズルシトール　　　　　　　　　　　　　陽性
イノシトール　　　　　　　　　　　　　陽性
マンニトール　　　　　　　　　　　　　陽性
ソルビトール　　　　　　　　　　　　　陽性
α−メチル−Ｄ−マンノシド　　　　　　陰性
α−メチル−Ｄ−グルコシド　　　　　　陰性
Ｎ−アセチル−グルコサミン　　　　　　陰性
アミグダリン（Ａｍｙｇｄａｌｉｎｅ）　陰性
アルブチン　　　　　　　　　　　　　　　陰性
エスクリン　　　　　　　　　　　　　　陽性
サリシン　　　　　　　　　　　　　　　陰性
セロビオース　　　　　　　　　　　　　陽性
マルトース　　　　　　　　　　　　　　陽性
ラクトース　　　　　　　　　　　　　　陽性
メリビオース　　　　　　　　　　　　　陰性
サッカロース　　　　　　　　　　　　　陰性
トレハロース　　　　　　　　　　　　　陽性
イヌリン　　　　　　　　　　　　　　　陰性
メレチトース　　　　　　　　　　　　　陰性
Ｄ−ラフィノース　　　　　　　　　　　陰性
アミドン（Ａｍｉｄｏｎ）　　　　　　　陰性
グリコーゲン　　　　　　　　　　　　　陰性
キシリトール　　　　　　　　　　　　　陰性
β−ゲンチオビオース　　　　　　　　　陽性
Ｄ−チュラノース　　　　　　　　　　　陰性
Ｄ−リキソース　　　　　　　　　　　　陰性
Ｄ−タガトース　　　　　　　　　　　　陰性
Ｄ−フコース　　　　　　　　　　　　　陽性
Ｌ−フコース　　　　　　　　　　　　　陰性
Ｄ−アラビトール　　　　　　　　　　　陽性
Ｌ−アラビトール　　　　　　　　　　　陽性
グルコン酸　　　　　　　　　　　　　　陰性
２−ケトグルコン酸　　　　　　　　　　陰性
５−ケトグルコン酸　　　　　　　　　　陰性
上記の菌学的性質を有するＫＳ１株の分類学上の位置をバージェイズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）を参照して検討すると、ブルクホルデリア属に属し、ブルクホルデリア・セパシアである菌株と同定された。
尚、ブルクホルデリア属は、従来シュードモナス属に分類されていたが、現在ではブルクホルデリア属に分かれている（Ｙａｂｕｕｃｈｉ，Ｅ．，Ｋｏｓａｋｏ，Ｙ．，Ｏｙａｉｚｕ，Ｈ．，Ｙａｎｏ，Ｉ．，Ｈｏｔｔａ，Ｈ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｅｚａｋｉ，Ｔ．ａｎｄ　Ａｒａｋａｗａ，Ｍ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ３６（１２），１２５１−１２７５，１９９２；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｒ，１９９３，ｐ３９８−３９９）。
また、本発明者らはブルクホルデリア・セパシア　ＫＳ１株以外の株について、財団法人発酵研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ）又は理化学研究所微生物系統保存施設（Ｊａｐａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ＪＣＭ）に寄託されているブルクホルデリア・セパシアのいくつかの菌株を取り寄せてグルコース脱水素酵素活性を測定したところ、同活性を有することを確認した。グルコース脱水素酵素活性は、後述の実施例２に記載の方法により測定した。ＫＳ１株の水溶性画分の酵素活性を１００としたときの相対活性を表１に示す。

実施例２　グルコース脱水素酵素の抽出
＜１＞菌体の培養
本細菌の培養条件は通常通りの好気的培養条件が用いられる。培養液１Ｌ中に以下の成分を含む培地７Ｌで、３４℃、８時間、培養した。
ポリペプトン　　　　　　　　　　　　　　１０ｇ
酵母抽出液　　　　　　　　　　　　　　　　１ｇ
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ
ＫＨ_２ＰＯ_４　　　　　　　　　　　　　　　２ｇ
グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ
Ｅｉｎｏｌ（ＡＢＬＥ　Ｃｏ．東京　日本）　０．１４ｇ
Ｔｏｔａｌ、蒸留水　　　　　　　　　　　　１Ｌ
ｐＨ調製　　　　　　　　　　　　　　　　　７．２
本培養液７Ｌを４℃、１０分間、９，０００×ｇで遠心分離し、約６０ｇの菌体を得た。
＜２＞粗精製フラクションの作製
６０ｇの菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に分散し、フレンチプレス（大竹製作所　東京　日本）で１，５００Ｋｇ／ｃｍ_２の圧力差を加えて、菌体膜を破壊した。細胞抽出液を８，０００×ｇで１０分間、遠心分離し、細胞固形物を除いた。さらに、その上清を、４℃で６９，８００×ｇで９０分間、超遠心し、沈殿物としての膜フラクション、約８ｇを得た。
＜３＞酵素の精製
膜フラクションを、最終濃度でＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００が１％になるように、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で再分散した。そして、４℃、一晩、ゆっくり攪拌した。超遠心後（４℃、６９，８００ｇ、９０分間）、可溶化膜フラクションを、４℃で、１５０００×ｇで１５分間、再遠心し、上清を得た。
その可溶化膜フラクションに、同量の０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を加えた。透析後、その溶液を、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で等量化されたＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラム（２２ｍｍＩＤ×２０ｃｍ　東ソー　東京　日本）に供給した。タンパク質を、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中のＮａＣｌの濃度が０〜０．１５Ｍになるように、直線的グラジエントで溶出した。その流速は５ｍｌ／ｍｉｎで行った。ＧＤＨは約７５ｍＭのＮａＣｌ濃度で溶出された。ＧＤＨ活性をもつフラクションを集め、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０　４℃）で一夜、透析した。
さらに透析調製酵素液を、ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（８．０ｍｍＩＤ×７．５ｃｍ　東ソー、東京、日本）に通した。そのカラムは予め、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化されている。タンパク質を、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中のＮａＣｌの濃度が０〜１００ｍＭになるように、直線的グラジエントで溶出した。その流速は１ｍｌ／ｍｉｎで行った。ＧＤＨ活性のあるフラクションが約２０ｍＭのＮａＣｌ濃度で溶出した。ＧＤＨ活性をもつフラクションを集め、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で、一夜、脱塩し、本精製酵素を得た。
尚、ＧＤＨの活性測定は、本実施例及び以下の実施例を通して、以下の方法に従い行った。
電子受容体として、２，６−ジクロルフェノルインドフェノル（ＤＣＩＰ）及びフェナンジメトサルフェート（ＰＭＳ）を用いた。反応はポリエチレンチューブ内で所定の温度で実施した。０．７５ｍＭＰＭＳと０．７５ｍＭＤＣＩＰ含有２５ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０　２０μｌに酵素溶液５μｌを添加した。この混合液を１分間事前定温放置した。２Ｍグルコース１μｌ（最終濃度：７７ｍＭ）の添加により反応を開始させ、２分間定温放置した。次に氷冷蒸留水１００μｌまたは７．５Ｍ尿素１２０μｌを添加して試料を冷却した。超微量計測用セル（１００μｌ）及びこれを用いて計測できる分光光度計（ＵＶ１６０、島津製作所、京都、日本）を用いて、グルコースの脱水素化に基づく、電子受容体の還元反応を追跡した。すなわちＤＣＩＰ還元にもとづく退色を、ＤＣＩＰの吸収波長である６００ｎｍを時間とともに計測した。ＤＣＩＰのモル吸光係数（２２．２３ｍＭ×ｃｍ^−１）を用いた。酵素１単位（Ｕ）は標準検定条件下で１分ごとに１μＭグルコースを酸化する量と定義した。タンパク濃度はローリー法で測定した。
実施例３
本精製酵素について、Ｎａｔｉｖｅ　ＰＡＧＥ電気泳動を実施した。本電気泳動の条件は、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＴｒｉｓ−Ａｌａｎｉｎｅ緩衝液システムを用いた８−２５％ポリアクリルアミドグラジエントゲル上で実施した。そのゲルは硝酸銀で染色を行った。タンパク質マーカーとして、チログロブリン（Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）：６６９ｋＤａ、フェリチン（Ｆｅｒｒｉｔｉｎ）：４４０ｋＤａ、カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）：２３２ｋＤａ、アルドラーゼ（Ａｌｄｏｌａｓｅ）：１５８ｋＤａ、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ）：６７ｋＤａ、オバルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）：４３ｋＤａ、キモトリプシノーゲン（ＣｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎＡ）：２５ｋＤａ、のタンパク質を用いた。
また、そのＮａｔｉｖｅ　ＰＡＧＥゲルについて、活性染色を実施した。本ゲルを以下の溶液中に３０分間インキュベーションする事により行った。ＧＤＨの活性部位はニトロブルーテトラゾリウムが還元され、ホルマザンが生成し、暗紫色に発色した。
２００ｍＭ　　　グルコース
０．１ｍＭ　　　ニトロブルーテトラゾリウム
０．３ｍＭ　　　フェナジンメトサルフェート
２０ｍＭ　　　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
Ｎａｔｉｖｅ　ＰＡＧＥの銀染色の結果より、本酵素は単一酵素であること、その分子量は約４００ｋＤａであることが推測された。また、同ゲルを活性染色すると、銀染色と同様の移動度の部位に活性が認められた（図１参照。図中、レーン１は分子量標準マーカータンパク質の銀染色を、レーン２は本酵素の銀染色を、レーン４は、本酵素の活性染色を示す）。本酵素を７０℃で３０分間、熱処理をすると、以外にも活性は残存し、分子量８５ｋＤａ付近に活性をもつタンパク質に分離した（図１参照。図中、レーン３は７０℃、３０ｍｉｎ、熱処理された本酵素の銀染色を、レーン５は７０℃、３０ｍｉｎ、熱処理された本酵素の活性染色を示す）。このことは本酵素がサブユニットからなる事を示唆している。
実施例４
本精製酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＴｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液を用いて８−２５％ポリアクリルアミドの勾配ゲル中で実施した。そのゲルのタンパク質は硝酸銀で染色を行った。Ｐｈａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により、分離と展開を自動的に行った。標準タンパクの相対移動度により分子質量を測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって、本酵素は約６０ｋＤａと４３ｋＤａのタンパク質に分離した（図２参照。図２は電気泳動写真である。図中、レーン１は分子量標準マーカータンパク質の硝酸銀染色を、レーン２は本酵素の硝酸銀染色を示す）。従って、本酵素は６０ｋＤａのα−サブユニットと４３ｋＤａのβ−サブユニットが結合していることが示唆され、かつ、それらが４個結合した８量体を形成していることが予想された。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された４３ｋＤａのタンパク質であるβ−サブユニットをポリビニリデンフルオリド膜に転写した後、アミノ酸シークエンサー（島津製作所、ＰＰＳＱ−１０）によりβ−サブユニットのＮ末端アミノ酸配列の決定を行った。その結果、本タンパク質のＮ末端アミノ酸配列は配列番号５のアミノ酸配列からなる１６残基から構成されていることが明かとなった。
また、本酵素を７０℃で３０分間、熱処理した場合の結果を図２中レーン３で示す。このＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から熱処理後この酵素は分子量６０ｋＤａの単一ポリペプチドに変わったことが想定できる。
実施例５
本酵素のゲルろ過クロマトグラフィーを実施した。ゲルとして、ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ（東ソー（株）製）を用い、ゲルカラムは（８．０ｍｍＩＤ×３０ｃｍ　東ソー、東京、日本）、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＰＨ６．０）中の０．３Ｍ　ＮａＣｌと０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む溶液で平衡化されている。フラクション（１２５μｌ）を集めた。７つのタンパク質マーカーを本精製酵素の分子量を決定するために用いた。タンパク質マーカーとして、チログロブリン（Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）：６６９ｋＤａ、フェリチン（Ｆｅｒｒｉｔｉｎ）：４４０ｋＤａ、カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）：２３２ｋＤａ、アルドラーゼ（Ａｌｄｏｌａｓｅ）：１５８ｋＤａ、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ）：６７ｋＤａ、オバルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）：４３ｋＤａ、キモトリプシノーゲン（ＣｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎＡ）：２５ｋＤａ、を用いた。
本酵素の分子量は約３８０ｋＤａであることが、確認された。
実施例６
精製した本酵素の至適温度を調べた。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０中で、あらかじめ１分間設定温度でインキュベーションした後、反応を開始した。所定の反応温度で活性を測定した。至適温度は４５℃付近にみられた（図３（ａ）参照）。また、４５℃付近に比べて活性は低いが、７５℃付近にもピークがみられた。
また、本酵素の熱安定性を調べるため、各温度で３０分間定温放置後、４５℃で残存酵素活性を測定した（図３（ｂ）参照）。
実施例７
本酵素を７０℃で３０分間熱処理した場合の分子量６０ｋＤａの単一オリゴペプチドを構成する該ペプチド酵素の至適温度及び熱安定性を調べた。
このペプチド酵素は非熱処理酵素よりも高い至適温度を示し、さらに熱安定性も示した。このような温度依存性を示す酵素の報告は未だない。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０中で、あらかじめ１分間設定温度でインキュベーションした後、反応を開始した。所定の反応温度で活性を測定した。至適温度は７５℃付近にみられた（図４（ａ）参照）。
また、本酵素の熱安定性を調べるため各温度で３０分間定温放置後、７０℃で残存酵素活性を測定した（図４（ｂ）参照）。
実施例８
それぞれのサブユニットの役割を調査するために、熱処理前後のＧＤＨの分光光度解析を行った。図５（ａ）（ｂ）は、熱処理前後の（グルコースの存在下で）酸化型及び還元型のＧＤＨの吸収を示している。もともとのＧＤＨである熱処理前の酸化ＧＤＨの波長は、４０９ｎｍに特徴的なピークを示し、また、グルコースの存在下でそれは４１７ｎｍへと移行し、５２３ｎｍ及び５５０ｎｍに２つのさらなるピークが見られた（図５ａ）。対照的に、熱処理後では４０９ｎｍにおける特徴的なピークが見られなくなり（図５ｂ）、酸化型及び還元型の間に重要な違いが見られなかった。
熱処理前の酸化型ＧＤＨ、もともとのＧＤＨ、の吸収波長はＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．あるいはＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．のデヒドロゲナーゼチトクローム複合体でできているアルコールデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼの吸収波長と類似していた（以下の文献参照。Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．，Ｔａｙａｍａ，Ｋ．，Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｅ．，Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．ａｎｄ　Ａｍｅｙａｍａ，Ｍ．（１９７８）Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４２，２０４５−２０５６．；Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．，Ｍｉｙａｇａｗａ，Ｅ．，Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．ａｎｄ　Ａｍｅｙａｍａ，Ｍ．（１９７８）Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４２，２３３１−２３４０；Ａｍｅｙａｍａ，Ｍ．ａｎｄ　Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．，（１９８２）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８９，４５０−４５７；Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．，Ｔａｙａｍａ，Ｋ．，Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｅ．，Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．ａｎｄ　Ａｍｅｙａｍａ，Ｍ．（１９８０）Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４，５０３−５１５；Ａｍｅｙａｍａ，Ｍ．ａｎｄ　Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．（１９８２）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８９，４９１−４９７）。
結果として、本ＧＤＨのオリゴマー複合体はチトクロームを含んでいる可能性を示唆していた。従って、観察されたチトクロームＣ様の波長はβサブユニットに起因するもので、熱処理の間に失われたものと言える。ゆえにβサブユニットはチトクロームＣからなっているといえる。
実施例９
実施例４の電気泳動によって得られたβサブユニットを含むバンドを切り取り、ペプチドシークエンサー（島津製作所、ＰＰＳＱ−１０）によりアミノ酸配列を解析したところ、配列番号５に示すＮ末端の１６残基のアミノ酸配列を得ることができた。
前記Ｎ末端の１６残基のアミノ酸配列から同ペプチド配列をコードする遺伝子領域をＰＣＲにより増幅することを試みた。すなわち、１６残基のペプチド鎖のＮ末端５残基に相当するフォワード側の塩基配列（配列番号６）及び同Ｃ末端５残基のアンチセンス鎖に相当するリバース側の塩基配列（配列番号７）を持つ２つのＰＣＲプライマーをデザインした。この１組のＰＣＲプライマーを用い常法に従いＫＳ１株のゲノムに対してＰＣＲを行なったところ、約５０ｂｐの遺伝子断片が増幅された。これを常法に従いその塩基配列を決定したところ、上記ＰＣＲプライマー１組を含む塩基配列５８塩基が解読された。このうち、ＰＣＲプライマーを除く１８塩基について解析していたところ、前記βサブユニットＮ末端１６残基のＮ末側から６残基目のＰｒｏから１１残基目のＡｒｇに相当する遺伝子配列（配列番号８）が見出され、本増幅遺伝子断片がβサブユニットの遺伝子断片を含むことが明らかとなった。
又、β−サブユニットは、α−サブユニットに続く２２アミノ酸残基の後に存在することが分かった。これは、実施例４において決定した、精製されたβ−サブユニットのＮ末端におけるアミノ酸配列と、配列番号１中の塩基番号２４５２〜２４６６の塩基配列によって翻訳される５アミノ酸残基が一致することから、両者が同一であると判明したことに基づいている。
又、配列番号１中の塩基番号２３８６〜２４５１の塩基配列は、β−サブユニットのシグナルペプチドであることが推測される。この塩基配列によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜２２に相当する。
実施例１０
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００及び１ｍＭＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中に本精製酵素及び市販のＮＡＤ補酵素ＧＤＨ（ＮＡＤ−ＧＤＨと略す）をそれぞれ１００Ｕ／Ｌになるように加え混和した。この溶液を６０℃の高温漕にいれ、残存活性を測定した。

本酵素は現在市販されているＧＤＨ酵素に比べて、驚異的な熱安定性があることが確認できた。本酵素は市販のＮＡＤ−ＧＤＨとは全く別の新規な酵素であることが判明した。
実施例１０　ＧＤＨ　αサブユニットをコードする遺伝子の単離
＜１＞ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株からの染色体ＤＮＡの調製
ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株をＴＬ液体倍地（ポリペプトン　１０ｇ、酵母抽出液　１ｇ、ＮａＣｌ　５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４　２ｇ、グルコース　５ｇ；１Ｌ、ｐＨ７．２）を用いて、３４℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離機により回収した。この菌体を１０ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％　ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む溶液に懸濁し、５０℃で６時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で１０分間撹拌した後、遠心分離機により上清を回収した。これに終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色体ＤＮＡを析出させた。これをガラス棒を用いてすくいとり、７０％エタノールで洗浄した後、適当量のＴＥバッファーに溶解させ、染色体ＤＮＡ溶液とした。
＜２＞ＧＤＨ　αサブユニットのＮ末端アミノ酸配列の決定
実施例２と同様にして精製したＧＤＨを凍結乾燥によって濃縮後、１２．５％ポリアクリルアミドを用いたＳＤＳ−電気泳動法を用いて展開し、αサブユニットを分離した。こうして得られたαサブユニットをポリビニリデンフルオリド膜に転写した後、アミノ酸シークエンサー（島津製作所製、ＰＰＳＱ−１０）によりＮ末端アミノ酸配列の決定を行った。その結果、本酵素には配列番号３のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２〜１２からなる１１残基から構成されるペプチド配列を含むことが明らかとなった。
＜３＞αサブユニットをコードする遺伝子のクローニング
＜１＞で調製したＤＮＡ１μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで限定分解した。これをＣＩＡＰ（仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ）処理した。一方、コスミドであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（ストラジーン社から入手）をＢａｍＨＩ処理し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼにより、ＳｕｐｅｒＣｏｓＩにα−１５株由来の染色体ＤＮＡ断片をＳａｕ３ＡＩで限定分解して得られたＤＮＡ断片を組み込んだ。得られた組換えＤＮＡでエシェリヒア・コリＸＬ−１　Ｂｌｕｅ　ＭＲ（ストラジーン社から入手）を形質転換した。形質転換体はＳｕｐｅｒＣｏｓＩ上の抗生物質耐性であるネオマイシン耐性およびアンピシリン耐性にしたがって１０μｇ／ｍｌのネオマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地から選抜した。得られた形質転換体をＬＢ液体培地で培養した。これらの形質転換菌体を集菌後、ＧＤＨ活性測定試薬に懸濁し、グルコースに対する脱水素酵素活性を指標にクローンを選抜した。その結果、１株のグルコース脱水素酵素活性を示すクローンが得られた。
＜４＞サブクローニング
＜３＞で得られたαサブユニットをコードする遺伝子を含むコスミドＳｕｐｅｒＣｏｓＩから、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。同コスミドから挿入遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩにより切り出した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理し、それらの断片をＸｂａＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８に組み込んだ。各挿入断片を含むプラスミドｐＵＣ１８でエシェリヒア・コリＤＨ５αＭＣＲ株を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で生じるコロニーを採取した。得られた形質転換体を液体のＬＢ培地で培養し、それぞれの細胞のＧＤＨ活性を＜３＞と同様に調べた。その結果、一つの形質転換体にＧＤＨ活性を示す株が得られた。この形質転換体からプラスミドを抽出し、その挿入ＤＮＡ断片を解析したところ、約８．８ｋｂｐの挿入断片が確認された。本プラスミドをｐＫＳ１と命名した。
＜５＞塩基配列の決定
ｐＫＳ１の挿入ＤＮＡ断片について、制限酵素解析及び常法に従い塩基配列を決定した。その結果、本挿入ＤＮＡ断片中に、＜２＞で明かとなったαサブユニットのＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が確認され、この配列を含むオープンリーディングフレームが見つかった。決定した塩基配列および同塩基配列がコードし得るアミノ酸配列は、配列番号１および３に示す通りである。アミノ酸配列から求められるタンパク質の分子量は５９，８３１Ｄａであり、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株αサブユニットのＳＤＳ−ＰＡＧＥでもとめられた分子量６０ｋＤａにほぼ一致した。
αサブユニットの塩基配列が決定されたことにより、前記αサブユニットの構造遺伝子を用いてベクターを作製し、更に前記ベクターにより形質転換体の製造を行った。
先ずベクターに挿入する遺伝子を以下のように調製した。
ＫＳ１株由来のゲノム断片をテンプレートとして、所望の制限酵素部位を含むように、ＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応には次の１組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
（フォワード）

（リバース）

ＰＣＲにより増幅された遺伝子を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、発現ベクターｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ（ＳＩＧＭＡ社）のクローニング部位であるＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ／αと命名した。
前記プラスミドｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ／αでエッシェリヒア・コリＤＨ５αＭＣＲ株を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で生じるコロニーを採取した。
さらにｐＫＳ１挿入断片について、αサブユニットの上流に関してオープンリーディングフレームを検索したところ、新たに配列番号２に記載される１６８アミノ酸残基から構成されるポリペプチドをコードする５０７塩基から構成される構造遺伝子（配列番号１中塩基番号２５８〜７６１）が見出された。この構造遺伝子は、γサブユニットをコードしていると考えられた。
αサブユニットのコード領域の上流に、γサブユニットをコードする領域の存在が明らかになったことから、γサブユニットとαサブユニットが連続するポリシストロン構造の遺伝子を含む組換えベクターを作製し、同ベクターを導入した形質転換体を構築した。
先ずベクターに挿入する遺伝子を以下のように調製した。
γサブユニットの構造遺伝子およびαサブユニットの構造遺伝子が連続するＫＳ１株由来のゲノム断片をテンプレートとして、所望の制限酵素部位を含むように、ＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応には次の１組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
（フォワード）

（リバース）

このＰＣＲにより増幅された遺伝子の５’末端をＮｃｏＩ、３’末端をＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のクローニング部位である、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに挿入した。得られたプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αと命名した。
前記プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αにより、エシェリヒア・コリＤＨ５αＭＣＲ株を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で生じるコロニーを採取した。
実施例１１　組換え大腸菌によるＧＤＨ　αサブユニットの生産
前記ｐＫＳ１、ｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ／α、ｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αのそれぞりのプラスミドによって形質転換した大腸菌エシェリヒア・コリＤＨ５αＭＣＲ株を用いてαサブユニットの生産を行った。各形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地３ｍｌに植菌し、３７℃で１２時間培養を行い、遠心分離機により細胞を集菌した。この細胞をフレンチプレス（１５００ｋｇｆ）で破砕した後、超遠心（４℃、１６０，４００×ｇ、９０分）により膜画分（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０）を分離した。
実施例１２　グルコースのアッセイ
先ず前記各膜分画を用いてＧＤＨ活性の確認を行った。具体的には５９４μＭのメチルフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）および５．９４μＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）により、目視判定を行った。結果は以下のとおりである。＋の数は、青色から無色への変化の程度を表す。
ｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ／αによる形質転換体培養膜分画　　　＋
ｐＫＳ１による形質転換体培養膜分画　　　　　　　　　　＋＋
ｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αによる形質転換体培養膜分画　　　＋＋＋
αサブユニットのみを組みこんだｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ／αによる形質転換体培養膜分画のＧＤＨ活性が最も低く、効率良くベクターを構築したｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αによる形質転換体培養膜分画が最も高いＧＤＨ活性を示した。
αサブユニットの構造遺伝子のみによるベクターを用いた形質転換体でもαサブユニットは発現されるが、更にγサブユニットの構造遺伝子をαサブユニットの構造遺伝子と合わせたベクターを用いることにより、効率良くαサブユニットを得ることができた。
本発明のグルコース脱水素酵素を用いてグルコースをアッセイした。本発明のグルコース脱水素酵素（αサブユニット）を、各種濃度のグルコースで酵素活性を測定した。ＧＤＨ活性の測定は５９４μＭのメチルフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）および５．９４μＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の中で行った。酵素試料および基質としてグルコースを基質として加え３７℃でインキュベートした時のＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少速度を酵素反応速度とした。本発明のＧＤＨを用いて、０．０１〜１．０ｍＭの範囲でグルコースの定量を行うことができた。
実施例１３　グルコースセンサーの作製および評価
実施例２で得られた本発明のグルコース脱水素酵素（２５単位）にカーボンペースト２０ｍｇを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間処理した後、２０ｍＭリジンを含む１０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で２０分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。この電極を１０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以上平衡化させた。電極は４℃で保存した。
前記電極を作用極として、参照極にＡｇ／ＡｇＣｌ、対極にＰｔ電極を用い、グルコース添加による応答電流値を測定した。反応溶液は１ｍＭメトキシＰＭＳを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液とし、電位１００ｍＶを印加し測定を行った。
作製した酵素センサーを用いてグルコースの濃度の測定を行った。本発明のグルコース脱水素酵素を固定化した酵素センサーを用いて、０．０５ｍＭ〜５．０ｍＭの範囲でグルコースの定量を行うことができた（図６）。
実施例１４　形質転換体から得られるＧＤＨによるグルコースセンサの作製及び評価
実施例１２によって得られた本願発明のαサブユニット（２４９Ｕ／ｍｇタンパク質）１０Ｕをカーボンペースト５０ｍｇを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間処理した後、２０ｍＭリジンを含む１０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で２０分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。この電極を１０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以上平衡化させた。電極は４℃で保存した。
前記電極を作用極として、参照極にＡｇ／ＡｇＣｌ、対極にＰｔ電極を用い、グルコース添加による応答電流値を測定した。反応溶液は１ｍＭメトキシＰＭＳを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液とし、電位１００ｍＶを印加しながら各濃度のグルコース水溶液を２５℃及び４０℃で測定を行った。
作製した酵素センサーを用いてグルコースの濃度の測定を行ったところ各濃度に応じた電流が得られたことを確認した。
産業上の利用可能性
本発明により、基質特異性が高く、安価に生産でき、測定サンプルの溶存酸素の影響を受けない酵素であって、特に熱安定性に優れた新規なグルコース脱水素酵素、及び該酵素の製造方法が提供できた。またこの酵素を生産するブルクホルデリア・セパシアの新規菌株が得られた。本酵素及び菌株を含む酵素電極を用いれば、グルコース測定に有効なグルコースセンサも提供できる。
また、本発明によりグルコース脱水素酵素の遺伝子、及び、同遺伝子を効率良く発現させることのできるペプチド及びそのペプチドをコードするＤＮＡが判明したため、前記遺伝子をもとにＧＤＨを組み換えＤＮＡ技術で大量に調製することができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、本発明酵素のＮａｔｉｖｅ　ＰＡＧＥ電気泳動による分子量を示す図である。
図２は、本発明酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動による分子量を示す電気泳動写真である。
図３は、本発明酵素の至適反応温度（ａ）、及びの熱安定性（ｂ）を示す図である。
図４は、本発明酵素のαサブユニットのみを構成するペプチド酵素の至適反応温度（ａ）、及び熱安定性（ｂ）を示す図である。
図５は、熱処理前のグルコース非存在下とグルコース存在下での本発明酵素の分光光度解析（ａ）、及び熱処理後のグルコース非存在下とグルコース存在下での本発明酵素の分光光度解析（ｂ）を示す図である。
図６は、形質転換体から得られるＧＤＨによるグルコースセンサを用いた各温度のグルコースに対する応答を示す図である。

Claims (41)

1. ブルクホルデリア属に属し、グルコース脱水素酵素を産生する能力を有する微生物を培地に培養し、同培地又は／及び前記微生物菌体からグルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするグルコース脱水素酵素の製造方法。
2. 前記微生物がブルクホルデリア・セパシアである請求項１記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
3. 前記グルコース脱水素酵素が下記性質を有することを特徴とする請求項１又は２に記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
   ▲１▼作用：
   グルコースの脱水素反応を触媒する。
   ▲２▼還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０ｋＤａと分子量約４３ｋＤａを示すサブユニットからなる。
   ▲３▼ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ（東ソー（株）製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、分子量約３８０ｋＤａを示す。
   ▲４▼至適反応温度：
   ４５℃付近（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）。
4. 前記分子量約４３ｋＤａのサブユニットが電子伝達タンパク質であることを特徴とする請求項３記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
5. 前記電子伝達タンパク質がチトクロムＣであることを特徴とする請求項４記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
6. ブルクホルデリア属に属する微生物によって産生され得るグルコース脱水素酵素。
7. 前記微生物がブルクホルデリア・セパシアである請求項６記載のグルコース脱水素酵素。
8. 前記グルコース脱水素酵素が下記性質を有することを特徴とする請求項６又は７に記載のグルコース脱水素酵素。
   ▲１▼作用：
   グルコースの脱水素反応を触媒する。
   ▲２▼還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０ｋＤａと分子量約４３ｋＤａを示すサブユニットからなる。
   ▲３▼ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ（東ソー（株）製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、分子量約３８０ｋＤａを示す。
   ▲４▼至適反応温度：
   ４５℃付近　（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）。
9. 前記分子量約４３ｋＤａのサブユニットが電子伝達タンパク質であることを特徴とする請求項８記載のグルコース脱水素酵素。
10. 前記電子伝達タンパク質がチトクロムＣであることを特徴とする請求項９記載のグルコース脱水素酵素。
11. 前記分子量６０ｋＤａのサブユニットが、配列番号３のアミノ酸番号２〜１２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項８〜１０のいずれか一項に記載のグルコース脱水素酵素。
12. 前記４３ｋＤａのサブユニットのＮ末端が配列番号５のアミノ酸配列を有する請求項８〜１１のいずれか１項に記載のグルコース脱水素酵素。
13. 前記分子量約６０ｋＤａのサブユニットが以下の（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質である請求項１１に記載のグルコース脱水素酵素。
    （Ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質。
    （Ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
14. ４５℃付近と７５℃付近にそれぞれ活性ピークを有することを特徴とする請求項６記載のグルコース脱水素酵素。
15. 請求項１０記載のグルコース脱水素酵素のサブユニットであって、配列番号５のアミノ酸配列を有することを特徴とするチトクロームＣ。
16. 請求項１５記載のチトクロムＣの一部をコードし、配列番号８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
17. 請求項１５記載のチトクロームＣの一部をコードし、配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号２３８６〜２４６７の塩基配列を有するＤＮＡ。
18. 請求項１５記載のチトクロームＣのシグナルペプチドをコードし、配列番号１の塩基配列のうち塩基番号２３８６〜２４５１の塩基配列を含むＤＮＡ。
19. チトクロームＣのシグナルペプチドであって、配列番号４のアミノ酸配列のうちアミノ酸番号１〜２２のアミノ酸配列を有するペプチド。
20. 下記性質を有するタンパク質。
    ▲１▼サブユニットとして請求項６記載のグルコース脱水素酵素を構成し得る。
    ▲２▼グルコース脱水素酵素活性を有する。
    ▲３▼還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０ｋＤａを示す。
    ▲４▼至適反応温度：
    ７５℃付近　　（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）。
21. 配列番号３においてアミノ酸番号２〜１２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２０記載のタンパク質。
22. 前記タンパク質が以下の（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質である請求項２１記載のグルコース脱水素酵素。
    （Ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質。
    （Ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
23. 以下の（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質。
    （Ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質。
    （Ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
24. 以下の（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （Ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質。
    （Ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
25. 以下の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２４記載のＤＮＡ。
    （ａ）配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
    （ｂ）配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
26. 請求項２４又は２５に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
27. 請求項１８記載のシグナルペプチド及びβ−サブユニットをコードする塩基配列を含む請求項２６記載の組換えベクター。
28. 請求項２４又は２５に記載のＤＮＡ、又は請求項２６又は２７に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
29. 請求項２８記載の形質転換体を培養して、前記ＤＮＡの発現産物としてグルコース脱水素酵素を産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素の製造方法。
30. ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３０６）。
31. 請求項６〜１４のいずれか一項に記載のグルコース脱水素酵素、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項２７の形質転換体、又は請求項３０に記載の菌株を含む酵素電極を用いたグルコースセンサ。
32. 請求項６〜１４のいずれか一項に記載のグルコース脱水素酵素、又は請求項２０〜２３のいずれか一項のタンパク質を含むグルコースアッセイキット。
33. 配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質。
34. 配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
35. 配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号２５８〜７６１からなる塩基配列含む請求項３４記載のＤＮＡ。
36. 請求項３４又は３５に記載のＤＮＡと、請求項２４又は２５に記載のＤＮＡをこの順に含むＤＮＡ。
37. 配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号２５８〜２３８０からなる塩基配列を含む請求項３６記載のＤＮＡ。
38. 請求項３６又は３７に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
39. 請求項１８記載のシグナルペプチド及びβ−サブユニットをコードする塩基配列を含む請求項３８記載の組換えベクター。
40. 請求項３６又は３７に記載のＤＮＡ又は請求項３８又は３９に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
41. 請求項４０記載の形質転換体を培養して、請求項３６又は３７に記載のＤＮＡの発現物質としてグルコース脱水素酵素を産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素の製造方法。

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