ES2287164T3 - Nueva glucosa deshidrogenasa y procedimiento para producir la deshidrogenasa. - Google Patents
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Abstract
Una proteína que se define en los siguientes (A) o (B): (A) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3; (B) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3 incluyendo la substitución, deleción, inserción o adición de 1 a 10 residuos de aminoácidos y tiene una actividad de glucosa deshidrogenasa.
Description
Nueva glucosa deshidrogenasa y procedimiento
para producir la deshidrogenasa.
La presente invención se refiere a una nueva
glucosa deshidrogenasa y a un método para producir la misma, a un
DNA que codifica la enzima, a un vector recombinante que comprende
el DNA que codifica la enzima, a un transformante transformado con
el vector recombinante, a un nuevo microorganismo que produce la
enzima, a un sensor para glucosa que usa un electrodo enzimático
que incluye la enzima, al transformante o al microorganismo y a un
estuche de ensayo para glucosa.
Biosensores que usan una enzima que reacciona
específicamente con un substrato particular se están desarrollando
activamente en diversos campos industriales. Como para un sensor
para glucosa, que es uno de los biosensores, en particular, métodos
de medida y dispositivos que utilizan tales métodos se están
desarrollando activamente principalmente en los campos médicos.
El sensor para glucosa tiene una historia de
aproximadamente 40 años desde que Clark y Lyons dieron cuenta en
primer lugar acerca de un biosensor que comprendía glucosa oxidasa y
un electrodo de oxígeno en combinación en 1962 (L.c. Clark, J. y
Lyonas, C. "Electrode systems for continuous monitoring in
cardiovascular surgery" Ann. n. y. Acad. Sci., 105:
20-45).
Así, la adopción de glucosa oxidasa como una
enzima del sensor para glucosa tiene una larga historia. Esto es
debido a que la glucosa oxidasa muestra alta especificidad hacia el
substrato para glucosa y superior estabilidad térmica, esta enzima
puede producirse además a gran escala y su coste de producción es
inferior que los de otras enzimas.
La alta especificidad hacia el substrato
significa que esta enzima no reacciona con un sacárido distinto de
la glucosa, y esto conduce a la ventaja de que puede alcanzarse una
medida exacta sin error en los valores de medida.
Además, la estabilidad térmica superior
significa que pueden evitarse problemas relativos a la
desnaturalización de la enzima y la inactivación de su actividad
enzimática debido al calor, y esto conduce a la ventaja de que
puede realizarse una medida exacta a lo largo de un período de
tiempo prolongado.
Sin embargo, aunque la glucosa oxidasa tiene
alta especificidad hacia el substrato y estabilidad térmica superior
y puede producirse a bajo coste, tiene el problema de que la enzima
se ve afectada por el oxígeno disuelto como se describe
posteriormente y esto afecta a los resultados de medida.
Mientras tanto, además de la glucosa oxidasa,
también se ha desarrollado un sensor para glucosa que utiliza
glucosa deshidrogenasa. Esta enzima también se encuentra en
microorganismos.
Por ejemplo, se conoce glucosa deshidrogenasa
derivada de bacterias Bacillus (EC 1.1.1.47) y glucosa
deshidrogenasa derivada de bacterias Cryptococcus (EC
1.1.1.119).
La primera glucosa deshidrogenasa (EC 1.1.1.47)
es una enzima que cataliza una reacción de
\beta-D-glucosa +
NAD(P)^{+}
D-\delta-gluconolactona +
NAD(P)H + H^{+}, y la última glucosa deshidrogenasa
(EC1.1.1.119) es una enzima que cataliza una reacción de
D-glucosa + NADP^{+}
D-\delta-gluconolactona + NADPH +
H^{+}. Las glucosa deshidrogenasas mencionadas anteriormente
derivan de microorganismos que ya están comercializados.
Estas glucosa deshidrogenasas tienen la ventaja
de que no se ven afectadas por oxígeno disuelto en una muestra de
medida. Esto conduce a la ventaja de que puede alcanzarse una medida
exacta sin provocar errores en los resultados de medida aun cuando
la medida se realice en un ambiente en el que la presión parcial de
oxígeno sea baja, o se use para la medida una muestra de alta
concentración que requiere una gran cantidad de oxígeno.
Sin embargo, aunque la glucosa deshidrogenasa no
se ve afectada por el oxígeno disuelto, tiene problemas de escasa
estabilidad térmica y una especificidad hacia el substrato más pobre
que la de la glucosa oxidasa. Por lo tanto, se desea una enzima que
venza las desventajas tanto de la glucosa oxidasa como de la glucosa
deshidrogenasa.
Los inventores de la presente invención
presentaron resultados de sus estudios acerca de la glucosa
deshidrogenasa usando muestras recogidas de suelo cerca de fuentes
termales en Sode K., Tsugawa W., Yamazaki T., Watanabe M.,
Ogasawara N. y Tanaka M., Enzyme Microb. Technol., 19,
82-85 (1996); Yamazaki T., Tsugawa W. y Sode K.,
Appli. Biochemi. and Biotec., 77-79/0325 (1999); y
Yamazaki T., Tsugawa W. y Sode K., Biotec. Lett., 21,
199-202 (1999).
Sin embargo, una cepa bacteriana que tenga
capacidad reductora de oxígeno no se ha identificado en la fase de
estos estudios.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar una enzima que venza las desventajas tanto de la
glucosa oxidasa como de la glucosa deshidrogenasa conocidas, es
decir, una enzima que muestre alta especificidad hacia el substrato
y estabilidad térmica superior, pueda producirse a un coste bajo y
no esté afectada por oxígeno disuelto en una muestra de medida.
Además, otro objetivo de la presente invención
es proporcionar un método para producir la enzima mencionada
anteriormente, una proteína que utiliza las características de la
enzima y un nuevo microorganismo que produzca la enzima.
Un objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar un DNA que codifique la enzima mencionada
anteriormente, un vector recombinante que contenga el DNA que
codifica la enzima y un transformante transformado con el vector
recombinante.
Un objetivo adicional más de la presente
invención es proporcionar un sensor para glucosa usando un electrodo
enzimático que incluya la enzima, el transformante o el
microorganismo mencionados anteriormente y un estuche de ensayo
para glucosa que incluya la enzima mencionada anteriormente.
Los inventores de la presente invención aislaron
satisfactoriamente Burkhorderia cepacia que produce
una enzima que alcanza los objetivos mencionados anteriormente de
suelo cerca de fuentes termales, y así lograron la presente
invención.
Posteriormente, la presente invención se
explicará aquí con detalle.
La enzima de la presente invención (en lo
sucesivo también denominada aquí "la enzima" o "GDH")
puede producirse mediante una bacteria perteneciente al género
Burkhorderia. La bacteria Burkhorderia usada para la
presente invención no está particularmente limitada con tal de que
sea una bacteria Burkhorderia que tenga capacidad para
producir la enzima. Sin embargo, se prefiere la Burkhorderia
cepacia, en particular la cepa KS1 de Burkhorderia
cepacia. La cepa bacteriana es una nueva cepa bacteriana aislada
por los inventores de la presente invención de suelo cerca de
fuentes termales según se describe posteriormente en los ejemplos y
se identificó como Burkhorderia cepacia basándose en sus
propiedades bacteriológicas. Convencionalmente, no se ha sabido que
un microorganismo perteneciente al género Burkhorderia
pudiera producir glucosa deshidrogenasa. Esta cepa bacteriana se
denominó cepa KS1. Esta cepa se depositó en International Patent
Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial
Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1,
Higashi 1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, Japón, código postal:
305-8566) el 25 de septiembre de 2000 y recibió un
número de registro del microorganismo de FERM
BP-7306.
Los inventores de la presente invención
obtuvieron algunas cepas de Burkhorderia cepacia distintas de
la cepa KS1 de Burkhorderia cepacia, que se depositaron en
Institute for Fermentation (Osaka, IFO) o Japan Collection of
Microorganisms (JCM), the Institute of Physical and Chemical
Research, y se midieron sus actividades de glucosa deshidrogenasa.
Como resultado, confirmaron que todas estas cepas bacterianas tenían
la actividad.
Si una bacteria Burkhorderia que tiene
capacidad productora de glucosa deshidrogenasa, por ejemplo, la
cepa KS1 de Burkhorderia cepacia, se cultiva en un medio
nutritivo usado para el cultivo habitual de un microorganismo,
preferiblemente un medio que contiene glucosa o una substancia que
contiene glucosa para incrementar la capacidad productora de
enzima, la glucosa deshidrogenasa de la presente invención se
produce y se acumula en un producto de cultivo o células
cultivadas. Por lo tanto, puede recogerse mediante un método
conocido. El método para producir la enzima se explicará
específicamente ejemplificando la cepa KS1 de Burkhorderia
cepacia. En primer lugar, la cepa KS1 de Burkhorderia
cepacia se cultiva en un medio nutritivo adecuado, por ejemplo,
un medio que contiene una fuente de carbono, una fuente de
nitrógeno, sales inorgánicas, glucosa, adecuadas, o substancias que
contienen estas, etc., para producir y acumular la enzima en el
producto de cultivo o las células cultivadas.
Como las fuentes de carbono, puede usarse
cualquier substancia que pueda ser asimilada, y ejemplos incluyen,
por ejemplo, D-glucosa, L-arabinosa,
D-xilosa, D-manosa, almidón,
diversas peptonas, etc. Como la fuente de nitrógeno, puede usarse
extracto de levadura, extracto de malta, diversas peptonas, diversos
extractos de carne, licor de impregnación de maíz, soluciones de
aminoácidos y compuestos nitrogenados orgánicos e inorgánicos tales
como sales amónicas o substancias que contienen estos. Como las
sales inorgánicas, pueden usarse diversas sales de ácido fosfórico
y sales de magnesio, potasio, sodio, calcio, etc. Además, según se
requiera, pueden añadirse al medio diversas substancias inorgánicas
y orgánicas requeridas para el crecimiento de la bacteria o la
producción de la enzima, por ejemplo aceite silicónico, aceite de
sésamo, agentes antiespumantes, tales como diversos tensioactivos,
y vitaminas.
Como para el método de cultivo, aunque puede
usarse bien un cultivo líquido o bien un cultivo sólido,
habitualmente se prefiere un cultivo líquido.
La enzima de la presente invención puede
obtenerse a partir del medio y/o las células en el cultivo obtenido
según se describe anteriormente. La enzima que existe en las células
puede obtenerse como un extracto celular rompiendo o sometiendo a
lisis a las células. La glucosa deshidrogenasa en el producto de
cultivo o el extracto de células puede purificarse mediante una
combinación adecuada de técnicas cromatográficas usando un
intercambiador iónico, un portador de filtración en gel, un
portador hidrófobo, etc.
La actividad de la enzima puede medirse mediante
los mismos métodos que los métodos conocidos para la medida de la
actividad de glucosa deshidrogenasa. Específicamente, la actividad
puede medirse mediante, por ejemplo, el método descrito más tarde
en los ejemplos.
Las propiedades fisicoquímicas de la nueva
glucosa deshidrogenasa de la presente invención son como sigue:
- (i)
- la enzima tiene una acción de catalizar la reacción de deshidrogenación de glucosa;
- (ii)
- la enzima consiste en subunidades que muestran un peso molecular de aproximadamente 60 kDa y un peso molecular de aproximadamente 43 kDa en electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS bajo una condición reductora;
- (iii)
- la enzima muestra un peso molecular de aproximadamente 380 kDa en la cromatografía de filtración en gel usando TSK Gel G3000SW (Tosoh Corporation); y
- (iv)
- la enzima muestra una temperatura de reacción óptima a alrededor de 45ºC (tampón de Tris-HCl, pH 8,0).
La glucosa deshidrogenasa muestra un máximo de
actividad a alrededor de 45ºC bajo la condición mencionada
anteriormente y también muestra un máximo de actividad a alrededor
de 75ºC (remítase a la Fig. 3(a)). No se ha sabido que la
GDH muestre el máximo de actividad en dos de las regiones de
temperatura que se describen anteriormente.
El peso molecular y la temperatura óptima pueden
medirse mediante los métodos descritos más tarde en los
ejemplos.
La glucosa deshidrogenasa mencionada
anteriormente de la presente invención consiste en dos polipéptidos
separados, la subunidad \alpha que tiene un peso molecular de
aproximadamente 60 kDa y la subunidad \beta que tiene un peso
molecular de aproximadamente 43 kDa (en lo sucesivo aquí esta
glucosa deshidrogenasa también se denomina "enzima
multímera"). Los inventores de la presente invención investigaron
adicionalmente estas dos subunidades con detalle.
Se ha encontrado que la subunidad \beta era
citocromo C (según se muestra más tarde en los ejemplos). Una
proteína que contiene solo la subunidad \alpha exhibe las
siguientes propiedades fisicoquímicas:
- (i)
- la proteína puede constituir la glucosa deshidrogenasa como una subunidad;
- (ii)
- la proteína tiene una actividad de glucosa deshidrogenasa;
- (iii)
- la proteína muestra un peso molecular de aproximadamente 60 kDa en electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS bajo una condición reductora; y
- (iv)
- la proteína muestra una temperatura de reacción óptima a alrededor de 75ºC (tampón de Tris-HCl, pH 8,0).
La temperatura óptima puede medirse mediante el
método descrito más tarde en los ejemplos.
Ya que esta proteína tiene por sí misma la
actividad enzimática, la proteína puede denominarse opcionalmente
"enzima peptídica" o "enzima" dependiendo del contenido de
la explicación.
Como una modalidad específica de la enzima
peptídica de la presente invención, puede mencionarse una proteína
que tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3. Además, esta
enzima peptídica puede ser una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos que contiene la substitución, deleción, inserción o
adición de uno o más residuos de aminoácido en la secuencia de
aminoácido del Nº ID SEC: 3, con tal de que tenga la actividad de
GDH. Aunque una secuencia de aminoácidos que puede ser codificada
por la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC: 1 se muestra como Nº
ID SEC: 3, el residuo de metionina en el extremo N puede eliminarse
después de la traducción.
Además, como una modalidad específica de la
enzima multímera de la presente invención, puede mencionarse un
multímero que contiene una proteína de la que la subunidad \alpha
tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3. Además, la
enzima multímera mencionada anteriormente puede ser un multímero que
tiene una proteína de la que la subunidad \alpha tiene la
secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3, incluyendo la
substitución, deleción, inserción o adición de uno o más residuos
de aminoácido, con tal de que tenga la actividad de GDH.
En la presente invención, "uno o más"
significa un número de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 5, de forma
particularmente preferible de 1 a 3.
Los inventores de la presente invención
confirmaron la existencia de una subunidad \gamma además de la
subunidad \alpha y la subunidad \beta mencionadas
anteriormente.
En los ejemplos descritos más tarde, la
subunidad \gamma se retiró en la fase de purificación de la enzima
de la presente invención de un sobrenadante de cultivo o
extracelular, y por lo tanto la subunidad \gamma no se confirmaba
en la enzima purificada. Sin embargo, según se muestra en los
ejemplos, cuando la subunidad \gamma se expresaba junto con la
subunidad \alpha, se obtenía una alta actividad enzimática en
comparación con el caso en que se expresaba la subunidad \alpha.
Esto sugería que la subunidad \gamma era una proteína implicada
en la producción de la subunidad \alpha en una célula microbiana
de algún modo. Suponiendo que la actividad específica de la
subunidad \alpha (actividad enzimática por proteína) es la misma
en cualquier caso, una actividad enzimática inferior indica una
cantidad menor de la subunidad \alpha como una enzima, ya que la
actividad enzimática refleja la cantidad de la enzima. Por otra
parte, la subunidad \alpha producida puede protegerse mediante la
subunidad \gamma de una cierta manera, o, aunque la subunidad
\alpha como una proteína se exprese completamente, no puede tener
la estructura dimensional para exhibir la actividad enzimática
debido a la ausencia de subunidad \gamma, y así la actividad
enzimática puede hacerse baja. En cualquier caso, puede obtenerse
una alta actividad enzimática cuando la subunidad \gamma se
expresa junto con la subunidad \alpha.
El DNA de la presente invención puede obtenerse
a partir de un microorganismo que contiene DNA de la presente
invención, por ejemplo Burkhorderia cepacia. El DNA de
la presente invención se aisló de DNA cromosómico de
Burkhorderia cepacia en el procedimiento para llevar a
cabo la presente invención. Sin embargo, puesto que esta secuencia
de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada por esta
secuencia de nucleótidos eran elucidadas por la presente invención,
el DNA también puede obtenerse mediante síntesis química basándose
en esta secuencia. Además, el DNA de la presente invención también
puede obtenerse de DNA cromosómico de Burkhorderia
cepacia o similares mediante hibridación o PCR usando un
oligonucleótido preparado basándose en las secuencias mencionadas
anteriormente como una sonda o un cebador.
Además de DNA que codifica una proteína que
tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3, el DNA de la
presente invención puede ser un DNA que codifica una proteína que
tiene una secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3 que contiene
una substitución, deleción, inserción o adición de uno o más
residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos y tiene la
actividad de GDH.
Como el DNA de la presente invención, puede
mencionarse específicamente un DNA que comprende la secuencia de
nucleótidos de los números de nucleótido 764 a 2380 en la secuencia
de nucleótidos del Nº ID SEC: 1. La secuencia de nucleótidos de los
números de nucleótido 764 a 2380 en la secuencia de nucleótidos del
Nº ID SEC: 1 codifica la subunidad \alpha de GDH que tiene la
secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3.
Además, el DNA de la presente invención también
puede ser un DNA que sea hibridable con la secuencia de nucleótidos
de los números de nucleótido 764 a 2380 en la secuencia de
nucleótidos del Nº ID SEC: 2 o una sonda que puede prepararse a
partir de la secuencia bajo condiciones restrictivas y codifica una
proteína que tiene la actividad de GDH.
Se estima que la secuencia de nucleótidos de los
números de nucleótido 258 a 761 en la secuencia de nucleótidos del
Nº ID SEC: 1 codifica la subunidad \gamma. La secuencia de
aminoácidos se muestra en el Nº ID SEC: 2. Se considera que, puesto
que el gen estructural de la subunidad \gamma está incluido en una
región aguas arriba de la de la subunidad \alpha, y así la
subunidad \gamma se expresa en primer lugar y ya existe como una
proteína durante la producción de la subunidad \alpha por un
microorganismo, la subunidad \alpha puede producirse eficazmente
en el microorganismo. Por lo tanto, el DNA de la presente invención
puede incluir un DNA que codifica la secuencia de aminoácidos del
Nº ID SEC: 2 además del DNA mencionado anteriormente.
Un DNA que codifica una proteína
substancialmente idéntica a la proteína mencionada anteriormente que
tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3 puede obtenerse
mediante, por ejemplo, un método tal como el tratamiento de
mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis. La actividad de GDH de
una proteína codificada por un DNA introducido por una mutación
puede medirse, por ejemplo, como sigue.
Una muestra de enzima y glucosa como un
substrato se añaden a tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 7,0) que
contiene metosulfato de metilfenazina (mPMS) 594 \muM y
2,6-diclorofenolindofenol (DCIP) 5,94 \muM y se
incubaron a 37ºC. El cambio en la absorbancia del DCIP a 600 nm se
verifica usando un espectrofotómetro y la velocidad de disminución
de absorbancia se mide como una velocidad de reacción
enzimática.
Además, se estima que la secuencia de
nucleótidos que consiste en nucleótido del número de nucleótido 2386
y la secuencia después del nucleótido de número de nucleótido 2386
en la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC: 2 codifica la
solubilidad \beta. Además, se estima que la secuencia de
nucleótidos de los números de nucleótido 2386 a 2451 codifica el
péptido de señal de la subunidad \beta. Una secuencia de
aminoácidos estimada de este péptido de señal es la secuencia de
aminoácidos de los números de aminoácido 1 a 22 en el Nº ID SEC: 4.
El péptido de señal es un péptido necesario para una proteína
sintetizada en el ribosoma que ha de secretarse a través de la
membrana y se ha encontrado que comprende de 15 a 30 residuos de
aminoácido hidrófobos. Por lo tanto, puesto que la cantidad de
proteínas en el sobrenadante de cultivo se incrementa debido a la
existencia del péptido de señal, este es un péptido que actúa
eficazmente en un método para producir una proteína.
Posteriormente se explicará aquí un ejemplo de
un método para obtener el DNA de la presente invención.
DNA cromosómico se aísla de un microorganismo
tal como Burkhorderia cepacia y se purifica, y el DNA
cromosómico se segmenta mediante ultrasonicación, tratamiento con
enzimas de restricción o similares y se liga a un vector de
expresión lineal y se cicla usando una DNA ligasa o similares para
construir un vector recombinante. El vector recombinante obtenido
se introduce en un microorganismo huésped en el que el vector es
autónomamente replicable y los transformantes se rastrean usando un
marcador vectorial y la expresión de una actividad enzimática como
índices para obtener un microorganismo que aloja un vector
recombinante que contiene un gen que codifica GDH. Se espera que el
vector recombinante contenido en el microorganismo obtenido
contenga al menos la secuencia de nucleótidos que codifica la
subunidad \alpha. Además, si el fragmento clonado tiene un tamaño
suficiente, es muy probable que también esté contenida la secuencia
de nucleótidos que codifica la subunidad \gamma.
A continuación, el microorganismo que tiene el
vector recombinante puede cultivarse, el vector recombinante puede
aislarse de las células del microorganismo cultivado y purificarse y
el gen que codifica GDH puede recogerse del vector de expresión.
Por ejemplo, DNA cromosómico que sirve como un donante génico se
recoge específicamente, por ejemplo como sigue.
El microorganismo donante génico mencionado
anteriormente puede cultivarse con agitación durante de 1 a 3 días,
por ejemplo, y las células pueden recogerse mediante centrifugación
del caldo de cultivo obtenido y a continuación someterse a lisis
para preparar un lisado celular que contiene el gen de GDH. Como el
método de lisis de las células, se realiza un tratamiento usando
una enzima bacteriolítica tal como lisozima y otras enzimas tales
como proteasa y tensioactivos tales como dodecilsulfato sódico (SDS)
se usan en combinación según se requiera. Además, un método de
ruptura física de células tal como congelación y descongelación o
tratamiento en prensa de French también puede emplearse en
combinación.
El DNA puede aislarse y purificarse del lisado
obtenido como se describe anteriormente de manera convencional, por
ejemplo, mediante una combinación adecuada de desproteinización
mediante tratamiento con fenol o tratamiento con proteasas,
tratamiento con ribonucleasas o precipitación con alcohol, etc.
El DNA aislado y purificado de un microorganismo
puede segementarse, por ejemplo, mediante ultrasonicación,
tratamiento con enzimas de restricción o similares. Preferiblemente,
se usa adecuadamente una enzima de restricción tipo II, que actúa
sobre una secuencia de nucleótidos específica. La enzima de
restricción usada puede generar un extremo que se adapta a un
extremo digerido de un vector, o el extremo digerido puede acabarse
en extremo romo usando una enzima de restricción arbitraria y
ligarse al vector.
Como el vector usado para la clonación, es
adecuado un fago que puede crecer autónomamente en un microorganismo
huésped o un plásmido que se construye para la recombinación
génica. Ejemplos del fago incluyen, por ejemplo, cuando se usa
Escherichia coli como el microorganismo huésped, Lambda gt10,
Lambda gt11, etc. Además, ejemplos del plásmido incluyen, por
ejemplo, cuando se usa Escherichia coli como el
microorganismo huésped, pBR322, pUC18, pUC118, pUC19, pUC119,
pTrc99A y pBluescript así como SuperCosI, que es un cósmido,
etc.
Durante la clonación, puede obtenerse un
fragmento de vector digiriendo el vector mencionado anteriormente
con una enzima de restricción usada para la digestión de un DNA
microbiano como el donante mencionado anteriormente de un gen que
codifica GDH. Sin embargo, no tiene que usarse necesariamente una
enzima de restricción idéntica a la enzima de restricción usada
para la digestión del DNA microbiano. El método para ligar el
fragmento de DNA microbiano y el fragmento de DNA vectorial puede
ser un método conocido que usa una DNA ligasa. Por ejemplo, un
extremo adhesivo del fragmento de DNA microbiano y un extremo
adhesivo del fragmento vectorial se ligan y a continuación un
vector recombinante que contiene el fragmento de DNA microbiano y el
fragmento de DNA vectorial se produce usando una DNA ligasa
adecuada. Si se requiere, después de la ligación, el fragmento
también puede introducirse en el microorganismo huésped para
producir el vector recombinante utilizando una DNA ligasa existente
en el microorganismo.
El microorganismo huésped usado para la
clonación no está particularmente limitado con tal de que el vector
recombinante sea estable y pueda crecer autónomamente en el huésped,
y un gen extraño pueda expresarse en el huésped. Pueden usarse
generalmente Escherichia coli DH5\alpha,
XL-1 BlueMR, etc.
Como el método para introducir el vector
recombinante en el microorganismo huésped, por ejemplo, cuando el
microorganismo es Escherichia coli, puede usarse el método de
células competentes que usa tratamiento con calcio, electroporación
o similares.
Si el fragmento clonado obtenido mediante el
método obtenido anteriormente codifica GDH, puede confirmarse
mediante decodificación la secuencia de nucleótidos del fragmento de
manera convencional.
El DNA de la presente invención puede obtenerse
recogiendo un vector recombinante del transformante obtenido como
se describe anteriormente. Puede producirse GDH cultivando un
transformante que contiene DNA de la presente invención o un vector
recombinante que contiene el DNA para producir GDH como un producto
de expresión del DNA y recogerlo de las células o el caldo de
cultivo. Para esta producción, aunque el DNA de la presente
invención puede ser un DNA que codifica la subunidad \alpha, la
eficacia de expresión puede incrementarse expresando adicionalmente
la subunidad \gamma junto con la subunidad \alpha.
Ejemplos del microorganismo en el que se produce
GDH incluyen bacterias entéricas tales como Escherichia
coli, bacterias Gram negativas tales como las de los géneros
Pseudomonas y Gluconobacter, bacterias Gram positivas
incluyendo bacterias Bacillus, tales como Bacillus
subtilis, levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae
y hongos filamentosos tales como Aspergillus niger. Sin
embargo, el microorganismo no está limitado a estos
microorganismos, y puede usarse cualquier microorganismo huésped
adecuado para la producción de proteínas extrañas.
El gen de GDH contenido en el vector
recombinante seleccionado una vez que contiene el gen de GDH puede
transferirse fácilmente a un vector recombinante que puede
replicarse en un microorganismo recuperando un DNA que es el gen de
GDH procedente de vector recombinante que contiene el gen de GDH
usando una enzima de restricción o mediante PCR y ligándolo a otro
fragmento vectorial. Además, el microorganismo puede transformarse
fácilmente con estos vectores, por ejemplo mediante el método de
células competentes usando tratamiento con calcio para bacterias
Escherichia, el método de los protoplastos para bacterias
Bacillus, el método KU o KUR para levaduras, el método de
micromanipulación para hongos filamentosos, etc. Además, también
puede usarse ampliamente la electroporación.
El microorganismo huésped en el que se introduce
un vector recombinante diana puede seleccionarse buscando un
microorganismo que expresa simultáneamente un marcador de
resistencia a fármaco del vector que contiene el DNA diana y la
actividad de GDH. Por ejemplo, puede seleccionarse un microorganismo
que crece en un medio selectivo basado en el marcador de
resistencia a fármaco y que produce GDH.
Como el método de cultivo para el transformante,
las condiciones de cultivo pueden seleccionarse considerando
propiedades nutricionales y fisiológicas del huésped. En muchos
casos, se realiza un cultivo líquido. Es industrialmente ventajoso
realizar cultivo aeróbico con agitación.
Como nutrientes del medio, pueden usarse
ampliamente los usados habitualmente para el cultivo de
microorganismos. Como fuentes de carbono, pueden usarse
cualesquiera compuestos carbonados que puedan ser asimilados, y
ejemplos de los mismos incluyen glucosa, sacarosa, lactosa,
maltosa, lactosa, melazas, ácido pirúvico, etc. Además, como
fuentes de nitrógeno, pueden utilizarse cualesquiera compuestos
nitrogenados, y ejemplos de los mismos incluyen peptona, extractos
de carne, extracto de levadura, hidrolizado de caseína, extracto
alcalino de harina de soja, etc. Además, se usan según se requieran
sales de ácido fosfórico, sales de ácido carbónico, sales de ácido
sulfúrico, sales de magnesio, calcio, potasio, hierro, manganeso,
zinc, etc., aminoácidos particulares, vitaminas particulares,
etc.
Aunque la temperatura del cultivo puede
cambiarse apropiadamente en un intervalo en el que las bacterias
crecen y producen GDH, es preferiblemente de aproximadamente 20ºC a
42ºC. El tiempo de cultivo varía algo dependiendo de las
condiciones. Sin embargo, el cultivo puede completarse en un tiempo
apropiado estimado para dar el nivel de GDH máximo y el tiempo de
cultivo es habitualmente de aproximadamente 12 a 72 horas. Aunque el
pH del medio puede cambiarse apropiadamente en un intervalo en el
que las bacterias crecen y producen GDH, está preferiblemente en el
intervalo de aproximadamente pH 6,0 a 9,0.
El caldo de cultivo que contiene células que
producen GDH en el cultivo puede recogerse y utilizarse como tal.
Sin embargo, cuando existe GDH en el caldo de cultivo, el caldo de
cultivo habitualmente se separa en una solución que contiene GDH y
células de microorganismo mediante filtración, centrifugación o
similares, de manera convencional, y a continuación se usa. Cuando
existe GDH en las células, las células se recogen del cultivo
obtenido por medio de filtración, centrifugación o similares, y a
continuación las células se rompen mediante un método mecánico o un
método enzimático tal como el uso de lisozima, y se les añaden
adicionalmente un agente quelante tal como EDTA y un tensioactivo
para solubilizar la GDH, según se requiera, para aislar y recoger
la GDH como una solución acuosa.
La GDH puede precipitarse de la solución que
contiene GDH obtenida como se describe anteriormente mediante, por
ejemplo, concentración a vacío, concentración con membrana, desalado
con sulfato amónico, sulfato potásico o similares, o una
precipitación fraccionada con un disolvente orgánico hidrófilo tal
como metanol, etanol y acetona. Además, el tratamiento térmico y el
tratamiento del punto isoeléctrico también son medios de
purificación eficaces. A continuación, la GDH puede purificarse
mediante una combinación adecuada de filtración en gel usando un
adsorbente o un agente de filtración en gel, cromatografía de
absorción, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de
afinidad para obtener GHD pura.
Una preparación enzimática purificada puede
obtenerse mediante el aislamiento y la purificación basándose en
cromatografía en columna. Aunque la preparación enzimática
purificada se purifica preferiblemente hasta tal punto que debe
obtenerse una sola banda en la electroforesis
(SDS-PAGE), puede contener la subunidad
\gamma.
La enzima purificada obtenida como se describe
anteriormente puede formarse como un polvo mediante, por ejemplo,
liofilización, secado a vacío, secado por pulverización o similares,
y distribuirse.
Además, la secuencia de aminoácidos de la
subunidad \beta también puede determinarse de la misma manera que
en la determinación de la secuencia de aminoácidos de la subunidad
\alpha descrita posteriormente en los ejemplos, y un DNA que
codifica la subunidad \beta puede aislarse basándose en la
secuencia. Además, la subunidad \beta también puede producirse
usando el DNA obtenido. Además, la enzima multímera también puede
producirse usando un DNA que codifica la subunidad \alpha y DNA
que codifica la subunidad \beta.
El sensor para glucosa de la presente invención
se caracteriza por usar la enzima de la presente invención (la
enzima multímera o la enzima peptídica mencionada anteriormente, o
la enzima multímera o la enzima peptídica que contiene la subunidad
\gamma), el transformante de la presente invención o el
microorganismo de la presente invención (cepa KS1 de
Burkhorderia cepacia) como un electrodo enzimático.
Como el electrodo, puede usarse un electrodo de carbono, un
electrodo de oro, un electrodo de platino o similares, y la enzima
de la presente invención se inmoviliza sobre este electrodo.
Ejemplos del método para la inmovilización incluyen un método de
uso de un reactivo de reticulación, un método de atrapamiento de la
enzima en una matriz polímera, un método de cobertura de la enzima
con una membrana de diálisis, métodos de uso de un polímero de
fotorreticulación, un polímero conductor, un polímero de
oxidación-reducción o similares. Alternativamente,
la enzima puede inmovilizarse en un polímero o inmovilizarse sobre
un electrodo mediante adsorción junto con un mediador electrónico
del cual son ejemplos típicos el ferroceno y derivados del mismo, o
estos métodos pueden usarse en combinación. Típicamente, la glucosa
deshidrogenasa de la presente invención se inmoviliza sobre un
electrodo de carbono usando glutaraldehído y el glutaraldehído se
bloquea mediante un tratamiento con un reactivo que tiene un grupo
amino.
La concentración de glucosa puede medirse como
sigue. Un tampón se pone en una celdilla de temperatura constante y
se añade un mediador, y se mantiene a una temperatura constante.
Como el mediador, puede usarse ferricianuro potásico, metosulfato
de fenazina, etc. Un electrodo sobre el que la enzima de la presente
invención se inmoviliza se usa como el electrodo de trabajo, y se
usan un contraelectrodo (por ejemplo, electrodo de platino) y un
electrodo de referencia (por ejemplo, electrodo de Ag/AgC). Un
voltaje constante se aplica al electrodo de carbono y, después de
que se obtenga una corriente en estado estacionario, una muestra que
contiene glucosa se añade y se mide el incremento de la corriente.
La concentración de glucosa en la muestra puede calcularse de
acuerdo con una curva de calibración producida usando soluciones de
glucosa que tienen concentraciones estándar.
El estuche de ensayo para sacárido de la
presente invención se caracteriza por diluir la enzima de la
presente invención (la enzima multímera o la enzima peptídica
mencionada anteriormente o la enzima multímera o la enzima
peptídica mencionada anteriormente que contiene la subunidad
\gamma). El estuche de ensayo para glucosa de la presente
invención incluye la enzima de la presente invención en una cantidad
suficiente para al menos un ensayo. Típicamente, el estuche
incluye, además de la enzima de la presente invención, un tampón, un
mediador, soluciones estándar de glucosa o similares para crear una
curva de calibración, que son necesarias para el ensayo, y una guía
para el uso. La enzima de la presente invención puede proporcionarse
en diversas formas, por ejemplo, como un reactivo liofilizado o una
solución en una solución de almacenamiento apropiada.
La Fig. 1 muestra un peso molecular de la enzima
de la presente invención determinado mediante electroforesis de
PAGE natural.
La Fig. 2 muestra una fotografía electroforética
que muestra un peso molecular de la enzima de la presente invención
basada en electroforesis de SDS-PAGE.
La Fig. 3 muestra la temperatura de reacción
óptima (a) y la estabilidad térmica (b) de la enzima de la presente
invención.
La Fig. 4 muestra la temperatura de reacción
óptima (a) y la estabilidad térmica (b) de una enzima peptídica que
constituye solo la subunidad \alpha de la enzima de la presente
invención.
La Fig. 5 muestra los resultados de análisis
espectrofotométrico de la enzima de la presente invención en
ausencia o presencia de glucosa antes del tratamiento térmico (a) y
el análisis espectrofotométrico de la enzima de la presente
invención en ausencia o presencia de glucosa después del tratamiento
(b).
La Fig. 6 muestra respuestas de un sensor para
glucosa usando GDH obtenida de un transformante para glucosa a
diversas temperaturas.
La presente invención se explicará más
específicamente con referencia a los siguientes ejemplos.
El microorganismo de la presente invención se
obtuvo recogiendo suelo de cerca de diversas fuentes termales en
Japón y seleccionando una bacteria que tiene una actividad de
glucosa deshidrogenasa entre bacterias que utilizan glucosa como un
nutriente del suelo.
Los resultados de la investigación de las
características morfológicas, las características de crecimiento y
las características fisiológicas de esta cepa se muestran
posteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
- Tinción Gram
- negativa
- Morfología de la célula
- conformación de bastón
Con flagelo polar
- Movilidad
- positiva
- Número de fragmentos
- > 5
- Temperatura de crecimiento óptima
- 45ºC
- Oxidasa
- negativa
- Catalasa
- positiva
- Producción de acetoína
- negativa
- Producción de H_{2}S
- negativa
- Producción de indol
- negativa
- Ácido procedente de glucosa
- positiva
- Arginina dihidrolasa
- negativa
- Ureasa
- negativa
- \beta-Glucosidasa
- negativa
- Proteasa
- negativa
- \beta-Galactosidasa
- positiva
- Lisina carboxilasa
- negativa
- Ornitina carboxilasa
- negativa
- Reducción de nitrato
- positiva
\vskip1.000000\baselineskip
- Glicerol
- positiva
- Eritritol
- negativa
- D-Arabinosa
- negativa
- L-Arabinosa
- positiva
(Continuación)
- Ribosa
- positiva
- D-Xilosa
- positiva
- L-Xilosa
- negativa
- Adonitol
- positiva
- \beta-Metil-xilósido
- negativo
- Galactosa
- positiva
- D-Glucosa
- positiva
- D-Fructosa
- positiva
- D-Manosa
- positiva
- L-Sorbosa
- negativa
- Ramnosa
- negativa
- Dulcitol
- positivo
- Inositol
- positivo
- Manitol
- positivo
- Sorbitol
- positivo
- \alpha-Metil-D-manósido
- negativo
- \alpha-Metil-D-glucósido
- negativo
- N-Acetilglucosamina
- positiva
- Amigdalina
- negativa
- Arbutina
- negativa
- Esculina
- negativa
- Salicina
- negativa
- Celobiosa
- negativa
- Maltosa
- negativa
- Lactosa
- negativa
- Melibiosa
- negativa
- Sacarosa
- negativa
- Trehalosa
- positiva
- Inulina
- negativa
- Melezitosa
- negativa
- D-Rafinosa
- negativa
- Almidón
- negativo
- Glicógeno
- negativo
(Continuación)
\global\parskip0.980000\baselineskip
- Xilitol
- positiva
- \beta-Gentiobiosa
- negativa
- D-Turanosa
- negativa
- D-Lixosa
- negativa
- D-Tagatosa
- negativa
- D-Fucosa
- negativa
- L-Fucosa
- negativa
- D-Arabitol
- positivo
- L-Arabitol
- positivo
- Ácido glucónico
- positivo
- Ácido 2-cetoglucónico
- positivo
- Ácido 5-cetoglucónico
- negativo
- Ácido cáprico
- positivo
- Ácido adípico
- positivo
- Ácido málico
- positivo
- Ácido cítrico
- positivo
- Acetato de fenilo
- positivo
\vskip1.000000\baselineskip
- Glicerol
- negativo
- Eritritol
- negativo
- D-Arabinosa
- negativa
- L-Arabinosa
- positiva
- Ribosa
- positiva
- D-Xilosa
- positiva
- L-Xilosa
- negativa
- Adonitol
- positivo
- \beta-Metil-xilósido
- negativo
- Galactosa
- positiva
- D-Glucosa
- positiva
- D-Fructosa
- positiva
- D-Manosa
- positiva
- L-Sorbosa
- negativa
- Ramnosa
- negativa
(Continuación)
\global\parskip0.970000\baselineskip
- Dulcitol
- positivo
- Inositol
- positivo
- Manitol
- positivo
- Sorbitol
- positivo
- \alpha-Metil-D-manósido
- negativo
- \alpha-Metil-D-glucósido
- negativo
- N-Acetilglucosamina
- negativa
- Amigdalina
- negativa
- Arbutina
- negativa
- Esculina
- positiva
- Salicina
- negativa
- Celobiosa
- positiva
- Maltosa
- positiva
- Lactosa
- positiva
- Melibiosa
- negativa
- Sacarosa
- negativa
- Trehalosa
- positiva
- Inulina
- negativa
- Melezitosa
- negativa
- D-Rafinosa
- negativa
- Amidón
- negativo
- Glicógeno
- negativo
- Xilitol
- negativo
- \beta-Gentiobiosa
- positiva
- D-Turanosa
- negativa
- D-Lixosa
- negativa
- D-Tagatosa
- negativa
- D-Fucosa
- positiva
- L-Fucosa
- negativa
- D-Arabitol
- positivo
- L-Arabitol
- positivo
- Ácido glucónico
- negativo
- Ácido 2-cetoglucónico
- negativo
- Ácido 5-cetoglucónico
- negativo
\global\parskip1.000000\baselineskip
La posición taxonómica de la cepa KS1 que tiene
las características bacteriológicas mencionadas anteriormente se
investigó con referencia al Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology, y se identificó que la cepa pertenecía al género
Burkhorderia, y era una cepa bacteriana de Burkhorderia
cepacia.
El género Burkhorderia se clasificaba
convencionalmente dentro del género Pseudomonas, pero se
clasifican separadamente como el género Burkhorderia en la
actualidad (Yabuuchi, E., Kosako, Y., Oyaizu, H., Yano, I., Hotta,
H., Hashimoto, Y., Ezaki, T. y Arakawa, M., Microbiol. Immunol. Vol.
36 (12): 1251-1275 (1992); International Journal of
Systematic Bacteriology, abril de 1993,
pp.398-399).
Además, los inventores de la presente invención
obtuvieron varias cepas de Burkhorderia cepacia distintas de
la cepa KS1 de Burkhorderia cepacia, que se depositaron en
the Institute for Fermentation, Osaka o the Japan Collection of
Microorganisms (JCM), Institute of Physical and Chemical Research, y
se midieron las actividades de glucosa deshidrogenasa de las cepas,
y se confirmó que tenían la actividad. La actividad de glucosa
deshidrogenasa se midió mediante el método descrito más tarde en el
Ejemplo 2. Las actividades relativas de estas cepas basándose en la
actividad enzimática de una fracción soluble en agua de la cepa KS1,
que se toma como 100, se muestran en la Tabla 1.
Como las condiciones de cultivo de la bacteria,
se usaron condiciones de cultivo aeróbicas habituales. Las células
se cultivaron a 34ºC durante 8 horas en 7 l de un medio que contenía
los siguientes ingredientes por litro.
Polipeptona | 10 g |
Extracto de levadura | 1 g |
NaCl | 5 g |
KH_{2}PO_{4} | 2 g |
Glucosa | 5 g |
Einol (ABLE Co., Tokio, Japón) | 0,14 g |
Volumen total incluyendo agua destilada | 1 l |
pH ajustado | 7,2 |
Un volumen de 7 l del caldo de cultivo se
centrifugó a 9.000 x g a 4ºC durante 10 minutos para obtener
aproximadamente 60 g de células.
Una cantidad de 60 g las células se dispersó en
tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 6,0) y una diferencia de
presión de 1.500 kg/cm^{2} se aplicó a las células usando una
prensa de French (Otake Corporation, Tokio, Japón) para romper las
membranas celulares. El extracto de células se centrifugó a 8.000 x
g durante 10 minutos para retirar sólido celular. Además, el
sobrenadante se sometió a ultracentrifugación a 69.800 x g a 4ºC
durante 90 minutos para obtener aproximadamente 8 g de una fracción
de membrana como precipitados.
La fracción de membrana se redispersó en tampón
de fosfato potásico 10 mM (pH 6,0) que contenía 1% de Triton
X-100 como una concentración final. A continuación,
la dispersión se agitó lentamente durante la noche a 4ºC. Después
de que la dispersión se sometiera a ultracentrifugación (69.800 x g,
4ºC, 90 minutos), la fracción de membrana solubilizada se
centrifugó de nuevo a 4ºC durante 15 minutos a 15.000 x g para
obtener un sobrenadante.
Se añadió a la fracción de membrana solubilizada
el mismo volumen de tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 8,0) que
contenía 0,2% de Triton X-100. La solución se
dializó y a continuación se aplicó a una columna
DEAE-TOYOPEARL (22 mm de DI x 20 cm, Tosoh
Corporation, Tokio, Japón) igualada con tampón de fosfato potásico
10 mM (pH 8,0) que contenía 0,2% de Triton X-100.
Las proteínas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 0 a 0,15 M
en tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 8,0). El caudal era 5
ml/min. La GDH se eluyó a una concentración de NaCl de
aproximadamente 75 mM. Las fracciones que exhibían la actividad de
GDH se recogieron y se dializaron durante la noche contra tampón de
fosfato potásico 10 mM (pH 8,0, 4ºC) que contenía 0,2% de Triton
X-100.
Además, la solución de enzima dializada se
aplicó a una columna DEAE-5PW (8,0 mm de DI x 7,5
cm, Tosoh Corporation, Tokio, Japón). Esta columna se equilibró de
antemano con tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 6,0) que contenía
0,2% de Triton X-100. Las proteínas se eluyeron con
un gradiente lineal de NaCl de 0 a 100 mM en tampón de fosfato
potásico 10 mM (pH 8,0). El caudal era 1 ml/min. Las fracciones que
exhibían la actividad de GDH se eluyeron a una concentración de
NaCl de aproximadamente 20 mM. Las fracciones que tenían la
actividad de GDH se recogieron y se desalaron durante la noche con
tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 8,0) que contenía 0,2% de
Triton X-100 para obtener la enzima purificada.
La actividad de GDH se midió de acuerdo con el
siguiente método a lo largo de este ejemplo y los siguientes
ejemplos.
Como aceptores de electrones, se usaron
2,6-diclorofenolindofenol (DCIP) y metosulfato de
fenazina (PMS). La reacción se dejó en un tubo de polietileno a una
temperatura predeterminada. Un volumen de 5 \mul de la solución
de enzima se añadió a 20 \mul de tampón de
Tris-HCl 25 mM (pH 8,0) que contenía PMS 0,75 mM y
DCIP 0,75 mM. Esta mezcla se dejó durante 1 minuto de antemano a una
temperatura constante. La reacción se inició con la adición de 1
\mul de glucosa 2 M (concentración final: 77 mM) y se dejó a una
temperatura constante durante 2 minutos. Subsiguientemente, 100
\mul de agua destilada enfriada con hielo o 120 \mul de urea a
0,75 M se añadieron para enfriar la mezcla. Una reacción de
reducción de los aceptores de electrones debida a la
deshidrogenación de glucosa se verificó usando una celdilla de
ultramicromedida (100 \mul) y un espectrofotómetro (UV160,
Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón) que permitía la medida usando la
celdilla. Esto es, la decoloración con el tiempo debida a la
reducción de DCIP se midió a 600 nm, que es la longitud de onda de
absorción del DCIP. Se usó el coeficiente de absorbancia molar de
DCIP (22,23 mM x cm^{-1}). Una unidad (U) de la enzima se definió
como la cantidad para oxidar 1 \muM de glucosa por minuto bajo
condiciones de prueba estándar. La concentración de proteína se
midió mediante el método de Lowry.
Se realizó electroforesis de PAGE natural para
la enzima purificada. La electroforesis se realizó sobre gel de
gradiente de poliacrilamida de 8 a 25% usando un sistema tamponador
de Tris-alanina que contiene 1% de Triton
X-100. El gel se tiñó con nitrato de plata. Como
marcadores proteínicos se usaron tiroglobulina (669 kDa), ferritina
(440 kDa), catalasa (232 kDa), aldolasa (158 kDa), albúmina de suero
bovino (67 kDa), ovalbúmina (43 kDa) y quimotripsinógeno A (25
kDa).
Además, la tinción de actividad se realizó para
el gel de PAGE natural incubando el gel en la siguiente solución
durante 30 minutos. En los sitios de actividad de GDH, se reducía
nitroazul tetrazolio y se producía formazano, dando como resultado
el desarrollo de un color púrpura oscuro.
200 mM | glucosa |
0,1 mM | nitroazul tetrazolio |
0,3 mM | metosulfato de fenazina |
20 mM | tampón de Tris-HCl (pH 8,0) |
A partir de los resultados de la tinción con
plata en la PAGE natural, se estimó que la enzima consistía en un
solo tipo de enzima y tenía un peso molecular de aproximadamente 400
kDa. Además, cuando el gel se teñía con respecto a la actividad, la
actividad se observaba en un sitio de la misma movilidad que en la
tinción con plata (véase la Fig. 1). En la figura, el Carril 1
muestra los resultados de tinción con plata de proteínas marcadoras
que tienen pesos moleculares estándar, el Carril 2 muestra la
tinción con plata de la enzima y el Carril 4 muestra la tinción con
respecto a la actividad de la enzima. Cuando la enzima se trataba a
70ºC durante 30 minutos, la actividad permanecía inesperadamente y
la enzima se separaba en proteínas, una de las cuales tenía la
actividad y mostraba un peso molecular de aproximadamente 85 kDa
(véase la Fig. 1. En la figura, el Carril 3 muestra los resultados
de la tinción con plata de la enzima calentada a 70ºC durante 30
minutos y el Carril 5 muestra la tinción con respecto a la
actividad de la enzima calentada a 70ºC durante 30 minutos). Estos
resultados sugieren que la enzima consiste en subunidades.
La solución de enzima purificada se sometió a
SDS-PAGE. La SDS-PAGE se realizó en
gel de poliacrilamida de 8 a 25% usando un tampón de
Tris-tricina. Las proteínas del gel se tiñeron con
nitrato de plata. La separación y el revelado se realizaron
automáticamente usando Phast System (Pharmacia). La masa molecular
se determinó basándose en las migraciones relativas de las
proteínas estándar. La enzima se separó en proteínas que tenían
pesos moleculares de aproximadamente 60 kDa y 43 kDa mediante
SDS-PAGE (Véase la Fig. 2. La Fig. 2 es una
fotografía electroforética). En la figura, el Carril 1 muestra los
resultados de tinción con nitrato de plata de las proteínas
marcadoras que tienen pesos moleculares estándar y el Carril 2
muestra los resultados de la tinción con nitrato de plata de la
enzima). Así, se sugería que la subunidad \alpha de 60 kDa y la
subunidad \beta de 43 kDa estaban unidas en la enzima, y se
esperaba que un octámero fuera formado por cuatro de cada una de
estas subunidades que se unían entre sí.
La subunidad \beta, una proteína de 43 kDa
separada por SDS-PAGE, se transformó en una membrana
de poli(fluoruro de vinilideno) y a continuación la
secuencia de aminoácidos en el extremo N de la subunidad \beta se
determinó usando un secuenciador de aminoácidos
(PPSQ-10, Shimadzu Corporation). Como resultado, se
encontró que la secuencia de aminoácidos en el extremo N de la
proteína consistía en 16 residuos de la secuencia de aminoácidos
del Nº ID SEC: 5.
Además, los resultados obtenidos con la enzima
sometida a un tratamiento térmico a 70ºC durante 30 minutos se
muestran como Carril 3 en la Fig. 2. Basándose en este resultado de
SDS-PAGE, puede estimarse que la enzima se cambiaba
por un solo polipéptido que tenía un peso molecular de 60 kDa
después del tratamiento térmico.
La enzima se sometió a cromatografía de
filtración en gel. Como el gel, se usó TSK Gel G3000SW (Tosoh
Corporation) y la columna de gel (8,0 mm de DI x 30 cm Tosoh
Corporation, Tokio, Japón) se equilibró con una solución que
contenía NaCl 0,3 M y 0,1% de Triton X-100 en tampón
de fosfato potásico 10 mM (pH 6,0). Se recogieron fracciones (125
\mul). Siete tipos de marcadores proteínicos se usaron para
determinar el peso molecular de la enzima purificada. Como los
marcadores proteínicos se usaron tiroglobulina (669 kDa), ferritina
(440 kDa), catalasa (232 kDa), aldolasa (158 kDa), albúmina de
suero bovino (67 kDa), ovalbúmina (43 kDa) y quimotripsinógeno A
(25 kDa).
Se confirmó que el peso molecular de la enzima
era aproximadamente 380 kDa.
Se examinó la temperatura óptima de la enzima
purificada.
La enzima se incubó de antemano en tampón de
Tris-HCl (pH 8,0) a una temperatura predeterminada
durante 1 minuto y a continuación se inició la reacción. La
actividad se midió a una temperatura de reacción predeterminada. La
temperatura óptima se observó alrededor de 45ºC (véase la Fig.
3(a)). Además, también se observó un pico alrededor de 75ºC,
aunque la actividad era inferior que la actividad alrededor de
45ºC.
Además, para examinar la estabilidad térmica de
la enzima, la enzima se dejó a cada temperatura constante durante
30 minutos y la actividad enzimática residual se midió a 45ºC (véase
la Fig. 3(b)).
Se examinó la temperatura óptima y la
estabilidad térmica de la enzima peptídica que constituye el único
oligopéptido que tiene un peso molecular de 60 kDa obtenido
calentando la enzima a 70ºC durante 30 minutos.
Esta enzima peptídica mostraba una temperatura
óptima superior que la de la enzima no calentada así como
estabilidad térmica. No existen informes acerca de una enzima que
tenga tal dependencia de la temperatura.
La enzima se incubó de antemano en tampón de
Tris-HCl (pH 8,0) a una temperatura predeterminada
durante 1 minuto, y a continuación la reacción se inició. La
actividad se midió a una temperatura de reacción predeterminada. La
temperatura óptima se observó alrededor de 75ºC (véase la Fig.
4(a)).
Además, para examinar la actividad térmica de la
enzima, la enzima se dejó a cada temperatura constante durante 30
minutos y la actividad enzimática residual se midió a 70ºC (véase la
Fig. 4(b)).
Para investigar un papel de cada subunidad, se
realizó análisis espectrofotométrico para GDH antes y después del
tratamiento térmico. Las Figs. 5(a) y (b) muestran
absorciones de GDHs oxidada y reducida antes y después del
tratamiento térmico (en presencia de glucosa). La longitud de onda
de absorción de la GDH oxidada antes del tratamiento térmico, que
da la GDH original, mostraba un pico característico a 409 nm.
Además, el pico cambiaba hasta 417 nm en presencia de glucosa y se
observan dos picos más a 523 nm y 550 nm (Fig. 5(a)). En
contraste, la GDH después del tratamiento térmico ya no mostraba el
pico característico a 409 nm (Fig. 5(b)) y no se observaba
diferencia entre las GDHs oxidada y reducida.
La longitud de onda de absorción de la GDH
oxidada antes del tratamiento térmico, que era la GDH original, era
similar a la longitud de onda de absorción de alcohol deshidrogenasa
o aldehído deshidrogenasa que comprende un complejo de
deshidrogenasa-citocromo de especies de
Gluconobacter o especies de Acetobacter (refiérase a
las siguientes referencias: Adachi, O., Tayama, K., Shinagawa, E.,
Matsushita, K. y Ameyama, M., Agr. Biol. Chem., 42,
2045-2056 (1978); Adachi, O., Miyagawa, E.,
Matsushita, K. y Ameyama, M., Agr. Biol. Chem., 42,
2331-2340 (1978); Ameyama, M. y Adachi, O., Methods
Enzymol., 89, 450-457 (1982); Adachi, O., Tayama,
K., Shinagawa, E., Matsushita, K. y Ameyama, M., Agr. Biol. Chem.,
44, 503-515 (1980); Ameyama, M. y Adachi, O.,
Methods Enzymol., 89, 491-497 (1982)).
Los resultados indicaban una posibilidad de que
el complejo oligómero de la GDH contuviera citocromo. Por lo tanto,
puede considerarse que la longitud de onda observada similar a la
del citocromo C es atribuible a la subunidad \beta y se perdía
durante el tratamiento térmico, y así la subunidad \beta consiste
en citocromo C.
Una banda que contiene la subunidad \beta
obtenida mediante la electroforesis en el Ejemplo 4 se cortó y la
secuencia de aminoácidos se analizó usando un secuenciador de
péptidos (PPSQ-10, Shimadzu Corporation). Como
resultado, podía obtenerse la secuencia de aminoácidos del extremo N
que consistía en 16 residuos mostrados en el Nº ID SEC: 5.
Se intentó amplificar una región génica que
codifica la secuencia de aminoácidos del extremo N de 16 residuos
mencionada anteriormente mediante PCR basada en la secuencia
peptídica, esto es, se diseñaron dos cebadores de PCR, que tenían
una secuencia de nucleótidos en el lado directo (Nº ID SEC: 6)
correspondiente a 5 residuos en el extremo N y una secuencia de
nucleótidos en el lado inverso (Nº ID SEC: 7) correspondiente a la
hebra antisentido de 5 residuos en el extremo C en la cadena
peptídica de los 16 residuos. Cuando se realizaba PCR de manera
convencional para el genoma de la cepa KS1 usando este par de
cebadores de PCR, se amplificaba un fragmento génico de
aproximadamente 50 pb. Cuando la secuencia de nucleótidos de este
fragmento génico se determinaba de manera convencional, se
descodificaba una secuencia de nucleótidos de 58 nucleótidos que
contenía el par de cebadores de PCR. Entre estos nucleótidos, se
analizaron 18 nucleótidos excluyendo los cebadores de PCR y se
encontró una secuencia génica correspondiente a una región desde
Pro, que era el 6º residuo desde el lado del extremo N de los 16
residuos mencionados anteriormente en el extremo N de la subunidad
\beta, hasta Arg, que era el residuo 11º, (Nº ID SEC: 8). Así, se
encontró que el fragmento génico amplificado incluía el fragmento
génico de la subunidad \beta.
Además, también se encontró que la subunidad
\beta existía después de 22 residuos de aminoácido tras la
subunidad \alpha. Esto se basaba en el hallazgo de que, puesto que
la secuencia de aminoácidos en el extremo N de la subunidad \beta
purificada determinada en el Ejemplo 4 se adaptaba a 5 residuos de
aminoácido traducidos desde la secuencia de nucleótidos de los
números de nucleótido 2452 a 2466 en el Nº ID SEC: 1, estas
secuencias son idénticas.
Por otra parte, se infiere que la secuencia de
nucleótidos de los números de nucleótido 2386 a 2451 en el Nº ID
SEC: 1 es el péptido de señal de la subunidad \beta. La secuencia
de aminoácidos codificada por esta secuencia de nucleótidos
corresponde a los números de aminoácido 1 a 22 en la secuencia de
aminoácidos del Nº ID SEC: 4.
La enzima purificada y una NAD coenzima GDH
(abreviada como "NAD-GDH") disponible
comercialmente se añadieron y se mezclaron en tampón de fosfato
potásico 50 mM (pH 7,5) que contenía 0,1% de Triton
X-100 y CaCl_{2} 1 mM a una concentración de 100
U/l cada una. Cada solución se puso en un depósito caliente a 60ºC y
se midió la actividad residual.
Se confirmó que la enzima tenía una estabilidad
térmica sorprendente en comparación con la de la enzima GDH
actualmente disponible comercialmente. Se encontró que la enzima era
una nueva enzima que es totalmente diferente de la
NAD-GDH disponible comercialmente.
Se preparó un gen cromosómico de la cepa KS1 de
Burkhorderia cepacia de manera convencional. Esto es,
la cepa bacteriana se batió durante la noche a 34ºC usando un medio
líquido TL (10 g de polipeptona, 1 g de extracto de levadura, 5 g
de NaCl, 2 g de KH_{2}PO_{4}, 5 g de glucosa en 1 l, pH 7,2).
Las células desarrolladas se recogieron usando una centrífuga. Las
células se suspendieron en una solución que contenía NaCl 10 mM,
Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, 0,5% de SDS y
100 \mug/ml de proteinasa K y se trataron a 50ºC durante 6 horas.
Esta mezcla se añadió a un volumen equivalente de fenolcloroformo y
se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, y a
continuación el sobrenadante se recogió usando una centrífuga. Se
añadió al sobrenadante acetato sódico hasta una concentración final
de 0,3 M y se cubrió con dos veces el volumen de etanol para
precipitar DNA cromosómico en la capa intermedia. El DNA se recogió
con una barra de vidrio, se lavó con etanol al 70% y se disolvió en
una cantidad apropiada de tampón de TE para obtener una solución de
DNA cromosómico.
GDH purificada de la misma manera que en el
Ejemplo 2 se concentró mediante liofilización y se reveló mediante
electroforesis en SDS usando poliacrilamida al 12,5% para aislar la
subunidad \alpha. La subunidad \alpha así obtenida se
transfirió sobre una membrana de poli(fluoruro de vinilideno)
y a continuación la secuencia de aminoácidos del extremo N se
determinó usando un secuenciador de aminoácidos
(PPSQ-10, Shimadzu Corporation). Como resultado, se
encontró que la enzima incluía una secuencia peptídica que consistía
en 11 residuos de los números de aminoácido 2 a 12 en la secuencia
de aminoácidos del Nº ID SEC: 3.
Una cantidad de 1 \mug del DNA preparado en
<1> se sometió a digestión limitada con una enzima de
restricción Sau3AI y se trató con fosfatasa alcalina intestinal de
ternero (CIAP). Separadamente, SuperCosI (obtenido de STRATAGENE),
que es un cósmido, se trató con BamHI y el fragmento de DNA obtenido
mediante la digestión limitada del fragmento de DNA cromosómico
derivado de la cepa \alpha-15 con Sau3AI se
incorporó en SuperCosI usando DNA ligasa de T4.
XL-1 Blue MR de Escherichia coli (obtenido de
STRATAGENE) se transformó con el DNA recombinante obtenido. Los
transformantes se seleccionaron sobre un medio de agar LB que
contenía 10 \mug/ml de neomicina y 25 \mug/ml de ampicilina
basándose en la resistencia a neomicina y la resistencia a
ampicilina, que son resistencias a antibióticos de SuperCosI. Los
transformantes obtenidos se cultivaron en el medio líquido LB.
Estas células transformantes se recogieron y se suspendieron en un
reactivo para medir la actividad de GDH, y los clones se
seleccionaron usando actividad de deshidrogenasa para glucosa como
un índice. Como resultado, se obtuvo una cepa clónica que mostraba
la actividad de glucosa deshidrogenasa.
Fragmentos de DNA que contienen el gen diana se
prepararon a partir del cósmido, SuperCosI, que contiene el gen que
codifica la subunidad \alpha obtenida en <3>. Los fragmentos
génicos insertados se cortaron del cósmido usando una enzima de
restricción NotI. Estos fragmentos de DNA se trataron con una enzima
de restricción XbaI y se incorporaron en el plásmido pUC18 digerido
con XbaI. La cepa DH5\alphaMCR de Escherichia coli se
transformó con el plásmido pUC18 que contenía cada fragmento de
inserto y se recogieron colonias desarrolladas sobre un medio de
agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina. Los transformantes
obtenidos se cultivaron en un medio LB líquido y se examinaron con
respecto a la actividad de GDH en las células de la misma manera
que en <3>. Como resultado, una cepa que mostraba la actividad
de GDH se obtuvo a partir de un transformante. El plásmido se
extrajo de este transformante y el fragmento de DNA insertado se
analizó. Como resultado, se confirmó un fragmento de inserto de
aproximadamente 8,8 kpb. Este plásmido se denominó pKS1.
La secuencia de nucleótidos del fragmento de DNA
insertado en pKS1 se determinó de acuerdo con el análisis con
enzimas de restricción y un método convencional. Como resultado, la
secuencia del DNA que codifica la secuencia de aminoácidos del
extremo N de la subunidad \alpha encontrada en <2> se
confirmó en este fragmento de DNA insertado y se encontró un marco
de lectura abierto que contenía esta secuencia. La secuencia de
nucleótidos determinada y la secuencia de aminoácidos que puede ser
codificada por esta secuencia de nucleótidos son como se muestran
en los Nº ID SEC: 1 y 3. El peso molecular de una proteína obtenida
a partir de la secuencia de aminoácidos era 59.831 Da y se adaptaba
substancialmente al peso molecular de 60 kDa obtenido mediante
SDS-PAGE de la subunidad \alpha de la cepa KS1 de
Burkhorderia cepacia.
Puesto que se determinaba la secuencia de
nucleótidos de la subunidad \alpha, se producía un vector usando
el gen estructural mencionado anteriormente de la subunidad \alpha
y se producía además un transformante con este vector.
En primer lugar, un gen que ha de insertarse en
el vector se preparaba como sigue.
La amplificación se realizó mediante PCR usando
un fragmento genómico derivado de la cepa KS1 como una plantilla de
modo que debe incluirse un sitio de enzima de restricción deseado.
El siguiente par de cebadores oligonucleotídicos se usó en PCR.
(Directo)
5'-CCCAAGCTTGGGCCGATACCGATACGCA-3'
(Nº ID SEC: 9)
\vskip1.000000\baselineskip
(Inverso)
5'-GAGAAGCTTTCCGCACGGTCAGACTTCC-3'
(Nº ID SEC: 10)
\vskip1.000000\baselineskip
El gen amplificado mediante PCR se digirió con
una enzima de restricción HindIII y se insertó en el vector de
expresión pFLAG-CTS (SIGMA) en su sitio de
clonación, sitio HindIII. El plásmido obtenido se denominó
pFLAG-CTS/\alpha.
La cepa DH5\alphaMCR de Escherichia
coli se transformó con el plásmido mencionado anteriormente
pFLAT-CTS/\alpha y se recogió una colonia
desarrollada sobre un medio de agar LB que contenía 50 \mug/ml de
ampicilina.
Además, cuando el marco de lectura abierto del
fragmento de inserto pKS1 se buscaba aguas arriba de la subunidad
\alpha, se encontraba nuevamente un gen estructural de 507
nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende 168 residuos
de aminoácido mostrados en el Nº ID SEC: 2 (números de nucleótido
258 a 761 en el Nº ID SEC: 1). Se consideraba que este gen
estructural codificaba la subunidad \gamma.
Puesto que se encontraba que la región que
codifica la subunidad \gamma existía aguas arriba de la región
codificante de la subunidad \alpha, se produjo un vector
recombinante que contenía un gen que tenía una estructura
policistrónica que incluía continuamente la subunidad \gamma y la
subunidad \alpha, y se construyó un transformante introducido con
este vector.
En primer lugar, un gen que ha de insertarse en
el vector se preparó como sigue.
La amplificación se realizó mediante PCR usando
un fragmento genómico de la cepa KS1 que incluye continuamente el
gen estructural de la subunidad \gamma y el gen estructural de la
subunidad \alpha como una plantilla, de modo que debe incluirse
un sitio de enzima de restricción deseado. El siguiente par de
cebadores oligonucleotídicos se usó para la PCR.
(Directo)
5'-CATGCCATGGCACACAACGACAACACT-3'
(Nº ID SEC: 11)
\vskip1.000000\baselineskip
(Inverso)
5'-CCCAAGCTTGGGTCAGACTTCCTTCTTCAGC-3'
(Nº ID SEC: 12)
\vskip1.000000\baselineskip
El extremo 5' y el extremo 3' del gen
amplificado mediante PCR se digirió con NcoI y HindIII,
respectivamente, y el gen se insertó en el vector pTrc99A
(Pharmacia) en su sitio de clonación, sitio NcoI/HindIII. El
plásmido obtenido se denominó pTrc99A/\gamma+\alpha.
La cepa DH5\alphaMCR de Escherichia
coli se transformó con el plásmido pTrc99A/\gamma+\alpha
mencionado anteriormente y se recogió una colonia desarrollada
sobre un medio de agar LB que contenía 50 \mug/ml de
ampicilina.
La subunidad \alpha se produjo usando la cepa
DH5\alphaMCR de Escherichia coli transformada con cada uno
de los plásmidos mencionados anteriormente, pKS1
pFLAG-CTS/\alpha y pTrc99A/\gamma+\alpha. Cada
transformante se inoculó en 3 ml de medio LB que contenía 50
\mug/ml de ampicilina y se cultivó a 37ºC durante 12 horas, y las
células se recogieron usando una centrífuga. Las células se
rompieron usando una prensa de French (1500 kgf) y una fracción de
membrana (tampón de fosfato potásico 10 mM, pH 6,0) se aisló
mediante centrifugación (160.400 x g, 4ºC, 90 minutos).
En primer lugar, se confirmó la actividad de GDH
en cada una de las fracciones de membrana mencionadas anteriormente.
Específicamente, se realizó una determinación visual usando un
tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 7,0) que contenía metosulfato
de metilfenazina (mPMS) 594 \muM y
2,6-diclorofenolindofenol (DCIP) 5,94 \muM. Los
resultados se muestran posteriormente. El número de + representa el
grado de cambio de color de azul a incoloro.
Fracción de membrana de transformante cultivo | |
transformado con pFLAG-CTS/\alpha | + |
Fracción de membrana de transformante cultivo | |
transformado con pKS1 | ++ |
Fracción de membrana de transformante cultivo | |
transformado con pTrc99A/\gamma+\alpha | +++ |
La actividad de GDH de la fracción de membrana
del transformante cultivado transformado con
pFLAG-CTS/\alpha que incorporaba solo la
subunidad \alpha era la más baja, y la actividad de GDH de la
fracción de membrana del transformante cultivado transformado con
pTrc99A/\gamma+\alpha, con la que se construía eficazmente un
vector, era la más alta.
Aunque la subunidad \alpha se expresaba
incluso en el transformante transformado con un vector usando solo
el gen estructural de la subunidad \alpha, la subunidad \alpha
podía obtenerse eficazmente usando un vector que contenía el gen
estructural de la subunidad \gamma y el gen estructural de la
subunidad \alpha en combinación.
La glucosa se ensayó usando la glucosa
deshidrogenasa de la presente invención. La actividad enzimática de
la glucosa deshidrogenasa (subunidad \alpha) de la presente
invención se midió usando glucosa a diversas concentraciones. La
actividad de GDH se midió en tampón de fosfato potásico 10 mM (pH
7,0) que contenía metosulfato de metilfenazina (mPMS) 594 \muM y
2,6-diclorofenol-indofenol (DCIP)
5,94 \muM. Una muestra de enzima y glucosa como un substrato se
añadieron y se incubaron a 37ºC, y se verificó el cambio en la
absorbancia de DCIP a 600 nm usando un espectrofotómetro. La
velocidad de disminución de la absorbancia se midió como una
velocidad de reacción enzimática. La glucosa podía cuantificarse en
el intervalo de 0,01 a 1,0 mM usando la GDH de la presente
invención.
A la glucosa deshidrogenasa (25 unidades) de la
presente invención obtenida en el Ejemplo 2 se le añadieron 20 mg
de pasta de carbono y se liofilizó. Se mezclaron suficientemente, se
aplicaron solamente sobre una superficie de un electrodo de pasta
de carbono ya cargado con aproximadamente 40 mg de pasta de carbono
y se pulieron con un papel de filtro. Este electrodo se trató en
tampón de MOPS 10 mM (pH 7,0) que contenía 1% de glutaraldehído a
temperatura ambiente durante 30 minutos y a continuación se trató en
tampón de MOPS 10 mM (pH 7,0) que contenía lisina 20 mM a
temperatura ambiente durante 20 minutos para bloquear el
glutaraldehído. Este electrodo se equilibró en tampón de MOPS 10 mM
(pH 7,0) a temperatura ambiente durante 1 hora o más. El electrodo
se almacenó a
4ºC.
4ºC.
Usando el electrodo mencionado anteriormente
como un electrodo de trabajo, un electrodo de Ag/AgCl como un
electrodo de referencia y un electrodo de Pt como un
contraelectrodo, se midió un valor de corriente de respuesta
durante la adición de glucosa. El tampón de fosfato potásico 10 mM
que contenía metoxi-PMS 1 mM se usó como la
solución de reacción, y un potencial de 100 mV se aplicó para la
medida.
La concentración de glucosa se midió usando el
sensor enzimático producido. La glucosa podía cuantificarse en el
intervalo de 0,05 a 5,0 mM usando el sensor enzimático sobre el que
se inmovilizaba la glucosa deshidrogenasa de la presente invención
(Fig. 6).
A una cantidad de 10 U de la subunidad \alpha
(249 U/mg de proteína) de la presente invención obtenida en el
Ejemplo 12 se añadieron 50 mg de pasta de carbono y se liofilizaron.
Se mezclaron suficientemente, se aplicaron solamente sobre una
superficie de un electrodo de pasta de carbono ya cargado con
aproximadamente 40 mg de pasta de carbono y se pulieron con un
papel de filtro. Este electrodo se trató en tampón de MOPS 10 mM (pH
7,0) que contenía 1% de glutaraldehído a temperatura ambiente
durante 30 minutos y a continuación se trataron en tampón de MOPS
10 mM (pH 7,0) que contenía lisina 20 mM a temperatura ambiente
durante 20 minutos para bloquear el glutaraldehído. Este electrodo
se equilibró en tampón de MOPS 10 mM (pH 7,0) a temperatura ambiente
durante 1 hora o más. El electrodo se almacenó a 4ºC.
Usando el electrodo mencionado anteriormente
como un electrodo de trabajo, un electrodo de Ag/AgCl como un
electrodo de referencia y un electrodo de Pt como un
contraelectrodo, se midió un valor de corriente de respuesta
durante la adición de glucosa. El tampón de fosfato potásico 10 mM
que contenía metoxi-PMS 1 mM se usó como la
solución de reacción y la medida se realizó para soluciones acuosas
de glucosa de diversas concentraciones a 25ºC y 40ºC aplicando un
potencial de 100 mV.
Se confirmó que, cuando la concentración de
glucosa se medía usando el sensor enzimático producido, se obtenía
una corriente correspondiente a cada concentración.
De acuerdo con la presente invención, puede
producirse una enzima que tiene especificidad hacia el substrato
alta a un bajo coste y no se ve afectada por el oxígeno disuelto en
una muestra de medida, en particular, nueva glucosa deshidrogenasa
que tiene estabilidad térmica superior y un método para producir la
enzima. Además, se obtenía una nueva cepa bacteriana de
Burkhorderia cepacia que produce la enzima. También se
proporcionaba un sensor para glucosa eficaz para la medida de
glucosa usando un electrodo enzimático que contenía la enzima o la
cepa bacteriana.
Además, puesto que se encontraron mediante la
presente invención el gen de glucosa deshidrogenasa, un péptido que
permite la expresión eficaz del gen y un DNA que codifica ese
péptido, una gran cantidad de GDH puede prepararse usando técnicas
de DNA recombinante basadas en el gen.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> SODE, Koji
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nueva Glucosa Deshidrogenasa y
Procedimiento para Producir la Deshidrogenasa
\vskip0.400000\baselineskip
<130> K01262
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
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<150> JP 2000-332085
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<150> JP 2000-357102
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<150> JP 2001-276832
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2001-09-12
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2467
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Burkhorderia cepacia
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (258)..(761)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (764)..(2380)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2386)..(2466)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Burkhorderia cepacia
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 539
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Burkhorderia cepacia
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Burkhorderia cepacia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala
Gly Cys Leu Ala Leu}
\sac{Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala
Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Burkhorderia cepacia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys Arg
Gly Glu Tyr Leu Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipgcggatgcgg cggat
\hfill15
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<210> 7
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipcgccagatat tcgcc
\hfill15
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<210> 8
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipccggcgctgg tgaaacgc
\hfill18
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<210> 9
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<211> 28
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipcccaagcttg ggccgatacc gatacgca
\hfill28
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<210> 10
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<211> 28
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 10
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 11
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\hfill27
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<211> 31
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskipcccaagcttg ggtcagactt ccttcttcag c
\hfill31
Claims (21)
1. Una proteína que se define en los siguientes
(A) o (B):
- (A)
- una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3;
- (B)
- una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3 incluyendo la substitución, deleción, inserción o adición de 1 a 10 residuos de aminoácidos y tiene una actividad de glucosa deshidrogenasa.
2. La proteína de acuerdo con la reivindicación
1, en la que el número de substituciones, deleciones, inserciones o
adiciones de residuos de aminoácido es 1-5.
3. La proteína de acuerdo con la reivindicación
1, en la que el número de substituciones, deleciones, inserciones o
adiciones de residuos de aminoácido es 1-3.
4. Un DNA que codifica la proteína de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. El DNA de acuerdo con la reivindicación 4,
que es un DNA definido en los siguientes (a) o (b)
- (a)
- un DNA que comprende la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 764 a 2380 en la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC: 1;
- (b)
- un DNA que es hibridable con una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de los números de nucleótido 764 a 2380 en el Nº ID SEC: 1 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia bajo una condición restrictiva y codifica una proteína que tiene una actividad de glucosa deshidrogenasa.
6. Un vector recombinante que comprende el DNA
de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5.
7. Un microorganismo transformado con el DNA de
acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 o el vector recombinante de
acuerdo con la reivindicación 6.
8. Un método para producir una proteína que
tiene actividad de glucosa deshidrogenasa, que comprende las etapas
de cultivar el microorganismo de acuerdo con la reivindicación 7
para producir glucosa deshidrogenasa como un producto de expresión
del DNA, y recogerlo.
9. Un método para producir una proteína que
tiene actividad de glucosa deshidrogenasa, que comprende las etapas
de cultivar un microorganismo perteneciente al género
Burkhorderia y que tiene una capacidad para producir la
proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-3 en un medio, y recoger la proteína o el
complejo que comprende la proteína del medio y/o las células del
microorganismo.
10. El método de acuerdo con la reivindicación
9, en el que la proteína que tiene actividad de glucosa
deshidrogenasa se define en la reivindicación 1 (A) y el
microorganismo es una cepa KS1 de Burkhorderia cepacia
(FERM BP-7306).
11. Un cepa KS1 de Burkhorderia
cepacia (FERM BP-7306).
12. Un sensor para glucosa que usa un electrodo
enzimático que comprende la proteína de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, el microorganismo de acuerdo con la
reivindicación 7 o la cepa de acuerdo con la reivindicación 11.
13. Un estuche de ensayo para glucosa que
comprende la proteína de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
14. Una proteína que tiene la secuencia de
aminoácido del Nº ID SEC: 2.
15. Un DNA que codifica la proteína de acuerdo
con la reivindicación 14.
16. El DNA de acuerdo con la reivindicación 15,
que comprende la secuencia de nucleótidos de los números de
nucleótido 258 a 761 en la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC:
1.
17. Un DNA que comprende el DNA de acuerdo con
la reivindicación 15 ó 16 y el DNA de acuerdo con la reivindicación
4 ó 5 en este orden.
18. El DNA de acuerdo con la reivindicación 17,
que comprende la secuencia de nucleótidos de los números de
nucleótido 258 a 2380 en la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC:
1.
19. Un vector recombinante que comprende el DNA
de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18.
20. Un microorganismo transformado con el DNA de
acuerdo con la reivindicación 17 ó 18 o el vector recombinante de
acuerdo con la reivindicación 19.
21. Un método para producir una proteína que
tiene actividad de glucosa deshidrogenasa, que comprende las etapas
de cultivar el microorganismo de acuerdo con la reivindicación 20
para producir un producto de expresión del DNA de acuerdo con la
reivindicación 17 ó 18, y recogerlo.
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