JP4537850B2 - タンパク質およびグルコース脱水素酵素の精製方法 - Google Patents

Description

本発明は、液体クロマトグラフィーを利用して、タンパク質を精製する方法に関する。この精製方法は、たとえば電子伝達タンパク質が結合したグルコース脱水素酵素を精製する際に利用されるものである。

特定の基質に対して特異的に反応する酵素を用いたバイオセンサの開発は、産業の分野を問わず盛んに行われている。バイオセンサの代表的なものとしては、主に医療分野で使用されるグルコースセンサが挙げられる。

グルコースセンサは、酵素と電子伝達物質を含む反応系を構築するためのものであり、このグルコースセンサを利用する場合には、たとえばアンペロメトリックな手法を用いてグルコースが定量される。酵素としては、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）やグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が使用されている。

ＧＯＤは、グルコースに対する基質特異性が高くて熱安定性に優れており、酵素の量産化が可能であるために生産コストが他の酵素と比べて安価であるといった利点がある。その反面、ＧＯＤを使用した系は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けやすいため、溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすといった問題がある。

一方、ＧＤＨを使用した系は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けにくい。このため、ＧＤＨを使用した系は、酸素分圧が低い環境下で測定を行ったり、酸素量が多く要求される高濃度サンプルを測定する場合であっても、精度よくグルコース濃度を測定することができる。その反面、ＧＤＨは、熱安定性が悪く、基質特異性がＧＯＤよりも劣るといった問題点がある。

このような事情から、ＧＯＤとＧＤＨの双方の欠点を補う酵素が模索されていた。早出は、国際公開ＷＯ０２／３６７７９号公報に開示されているように、温泉付近の土壌から新規菌株（ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株）を分離し、この菌株から新しいＧＤＨを取得した。このＧＤＨは、α，β，γサブユニットからなるものであり（以下「ＣｙＧＤＨ」という）、電子伝達物質との反応速度が高く、耐熱性の面でも問題がないものであり、グルコースセンサ用としては好適なものであった。

ＣｙＧＤＨをグルコースセンサに応用する場合には、ＣｙＧＤＨを含む酵素溶液から、ＣｙＧＤＨを精製する必要がある。酵素の精製には、通常、液体クロマトグラフィーが利用されている。そのため、本発明者らは、常法にしたがって、疎水クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを併用して酵素溶液の精製を試みた。ところが、精製酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、α，β，γサブユニット以外に多くのタンパク質が含まれており、ＣｙＧＤＨを純度良く精製することができなかった。

本発明は、タンパク質の新規な精製方法を提供することを目的としている。

本発明の第１の側面により提供されるタンパク質の精製方法は、目的タンパク質が溶解したタンパク質溶液から、液体クロマトグラフィーを利用して前記目的タンパク質を精製する方法であって、前記液体クロマトグラフィーは、充填剤が充填された充填槽に前記タンパク質溶液を導入し、前記充填剤に対して前記目的タンパク質を保持させる第１ステップと、ヒドロキシコラン酸塩を含む溶離液を用いて、前記充填剤から前記目的タンパク質を溶離させる第２ステップと、を含んでいる。

なお、本明細書においては、「液体クロマトグラフィー」という場合には、特段の限定がない限りは、カラムを用いてフロー（連続式）で精製する場合の他、バッチ式でタンパク質を精製する場合も含まれる。バッチ式の精製方法としては、たとえば容器内に充填剤とタンパク質溶液とを共存させて充填剤に目的タンパク質を結合させた後に充填剤を分離し、この充填剤を溶離液に接触させて充填剤から目的タンパク質を分離して回収する方法が挙げられる。

精製対象となる目的タンパク質としては、たとえば電子伝達タンパク質を含むものが挙げられる。典型的には、目的タンパク質としては、電子伝達タンパク質とグルコース脱水素活性を有するタンパク質とを含んだグルコース脱水素酵素を例示することができる。

充填剤としては、たとえばイオン交換樹脂が使用され、イオン交換クロマトグラフィーによってタンパク質が精製される。この場合、イオン交換樹脂としては、たとえば４級アンモニウム基をイオン交換基として有しているものが使用される。

ここで、「ヒドロキシコラン酸」とは、コラン酸の３水和物であるコール酸および広義での誘導体をさすものとし、ヒドロキシコラン酸塩としては、コール酸塩、グリコウルソデオキシコール酸塩、タウログリコウルソデオキシコール酸塩、タウロウルソデオキシコール酸塩、ウルソデオキシコール酸塩、グリココール酸塩、タウロコール酸塩、グリコケノデオキシコール酸塩、タウロケノデオキシコール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、ケノデオキシコール酸塩、デオキシコール酸塩、グリコリトコール酸塩、タウロリトコール酸塩、リトコール酸塩などが挙げられる。その中でも、コール酸塩、たとえばコール酸ナトリウムを使用するのが好ましい。

充填剤からの目的タンパク質の溶離は、溶離液におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度を一定にして行うのが好ましい。この場合、溶離液におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度は、０．５〜２．５重量％の範囲、さらに好ましくは０．８〜１．２重量％の範囲から選択するのが好ましい。このような手法は、バッチ式で目的タンパク質の溶離を行う場合に限らず、連続式で目的タンパク質の溶離を行う場合にも適用される。また、溶離液におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度を時間とともに変化させて目的タンパク質の溶離を行うこともできる。この場合、溶離液の濃度の上限は、たとえば３重量％以下、さらに好ましくは１．５重量％、最も好ましくは１重量％とされる。すなわち、溶離液の濃度変化は、たとえば０〜３重量％の範囲、さらに好ましくは０〜１．５重量％の範囲、最も好ましくは０〜１．０重量％の範囲で行われる。

電子伝達タンパク質は、たとえば還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａである。一方、グルコース脱水素活性を有するタンパク質は、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａである。このような電子伝達タンパク質およびサブユニットを含むグルコース脱水素酵素は、たとえばグルコース脱水素酵素を産生する能力を有するブルクホルデリア属に属する微生物から、あるいは形質転換体から取得することができる。

本発明で採用されるブルクホルデリア属に属する微生物は、本酵素の生産能を有するブルクホルデリア属に属する微生物であれば特に制限されないが、ブルクホルデリア・セパシア、特にブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株（以下、単に「ＫＳ１株」という）が好ましい。このＫＳ１株は、平成１２年９月２５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に微生物受託番号第ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６として寄託されている。

形質転換体は、たとえばブルクホルデリア属に属する微生物から取得した電子伝達タンパク質およびグルコース脱水素活性を有するタンパク質をコードする配列を含むＤＮＡを、宿主微生物に導入することにより形成することができる。宿主微生物としては、シュードモナス属に属する微生物（とくにシュードモナス・プチダ）または大腸菌を使用するのが好ましい。

国際公開ＷＯ０２／３６７７９号公報などに開示されているように、ＫＳ１株由来のグルコース脱水素酵素は、サブユニット（αサブユニット）および電子伝達タンパク質（βサブユニット）に加えて、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約１４ｋＤａであるγサブユニットを有するものとして産生される。

γサブユニットをαサブユニットとともに発現させると、αサブユニットのみを発現させた場合に比べて高い酵素活性が得られることが早出によって確認されている。したがって、酵素活性の観点からは、γサブユニットを発現させるのが好ましく、前記ＤＮＡにおいては、γサブユニットの構造遺伝子は、αサブユニットの上流域に含ませておくのが好ましい。そうすれば、形質転換体においては、αサブユニットを産生する際に、先ずγサブユニットが発現されてタンパク質として存在することにより微生物体内で効率良くαサブユニットを産生することができるものと考えられる。

本発明の第２の側面においては、疎水クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーとを組み合わせてグルコース脱水素酵素を精製する方法であって、前記疎水クロマトグラフィーは、固定相に前記グルコース脱水素酵素を保持させるステップと、不要なタンパク質を溶出させるステップと、ヒドロキシコラン酸塩を含む溶離液を用いて前記グルコース脱水素酵素を溶出させるステップと、を含み、前記陰イオン交換クロマトグラフィーは、固定相に前記グルコース脱水素酵素を保持させるステップと、ヒドロキシコラン酸塩を含む溶離液を用いて前記グルコース脱水素酵素を溶出させるステップと、を含むことを特徴とする、グルコース脱水素酵素の精製方法が提供される。

疎水クロマトグラフィーにおいては、たとえばグルコース脱水素酵素の溶出は、溶離液におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度を時間とともに変化させて行われる。一方、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいては、たとえばグルコース脱水素酵素の溶出は、溶離液におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度を一定にして行われる。また、溶離液におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度を時間とともに変化させて目的タンパク質の溶離を行うこともできる。この場合、溶離液の濃度の上限は、たとえば３重量％以下、さらに好ましくは１．５重量％、最も好ましくは１重量％とされる。すなわち、溶離液の濃度変化は、たとえば０〜３重量％の範囲、さらに好ましくは０〜１．５重量％の範囲、最も好ましくは０〜１．０重量％の範囲で行われる。

本発明のグルコース脱水素酵素の精製方法では、疎水クロマトグラフィーを行った後に、前記陰イオン交換クロマトグラフィーを行うのが好ましい。

グルコース脱水素酵素は、たとえばグルコース脱水素酵素を産生する能力を有するブルクホルデリア属に属する微生物が産生したものである。ブルクホルデリア属に属する微生物は、たとえばＫＳ１株である。

グルコース脱水素酵素は、形質転換体が産生したものであってもよい。形質転換体は、グルコース脱水素酵素を産生する能力を有するブルクホルデリア属に属する微生物から取得した前記グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡを、宿主微生物に導入することにより形成することができる。宿主微生物としては、たとえばシュードモナス・プチダまたは大腸菌を用いることができる。

本発明のグルコース脱水素酵素の精製方法では、陰イオン交換クロマトグラフィーを、４級アンモニウム基をイオン交換基として有するイオン交換樹脂を用いて行い、ヒドロキシコラン酸塩としてコール酸塩を用いるのが好ましい。

図１は、シュードモナス・プチダの形質転換体から得た粗酵素溶液を、溶離剤としてコール酸Ｎａを用いて精製した酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示したものである。 図２は、シュードモナス・プチダの形質転換体から得た粗酵素溶液を、溶離剤としてＮａＣｌまたはＫＣｌを用いて精製した酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示したものである。 図３は、大腸菌の形質転換体から得た粗酵素溶液を溶離剤としてコール酸Ｎａを用いて精製した酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果について、シュードモナス・プチダの形質転換体およびＫＳ１株から得た粗酵素溶液を精製した酵素とともに示したものである。

以下、本発明に係るタンパク質の精製方法について、グルコース脱水素酵素（以下、「ＧＤＨ」という）を精製する場合を例にとって具体的に説明する。

グルコース脱水素酵素の精製にあたっては、まず、酵素溶液を準備する。酵素溶液は、グルコース脱水素酵素を産生する微生物やその培養液から採取してもよいし、この微生物から取得したＤＮＡを導入した形質転換体やその培養液から採取してもよい。

酵素溶液は、ＧＤＨが菌体内に存在する場合には、ろ過または遠心分離などの手段により培養液から菌体を採取した後、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤および界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化することにより得ることができる。一方、ＧＤＨが菌体外（培養液中）に存在する場合には、酵素溶液は、ろ過または遠心分離などの手段により培養液から菌体を分離することにより得ることができる。

グルコース脱水素酵素を産生する微生物としては、たとえばブルクホルデリア属に属する微生物、とくにブルクホルデリア・セパシアが好ましく使用される。このブルクホルデリア・セパシアからは、たとえば可溶化膜画分として酵素溶液を採取することができる。可溶化膜画分は、たとえば培養液を遠心分離して得られる菌体を破砕して細胞抽出液を採取し、この細胞抽出液を遠心分離して得られる上清を超遠心することにより沈殿物として得ることができる。菌体の破砕は、常法に従い、機械的方法または酵素的方法により行うことができる。

形質転換体は、たとえばαサブユニット（グルコース脱水素活性を有するタンパク質）およびβサブユニット（電子伝達タンパク質）の発現をコードする配列を含むＤＮＡを取得した後、このＤＮＡを含む組み換えベクターを、宿主微生物に導入することにより形成される。

ＤＮＡの取得にあたっては、まず組み換えベクターが構築される。この組み換えベクターは、グルコース脱水素活性を有する酵素を産生する微生物から染色体ＤＮＡを分離・精製した後、この染色体ＤＮＡを切断した染色体ＤＮＡ断片またはＰＣＲなどにより増幅させたＤＮＡ断片と、リニアーな発現ベクターとを結合閉鎖させることにより構築することができる。

宿主微生物としては、大腸菌をはじめとする腸内細菌群、シュードモナス属やグルコノバクター属などのグラム陰性菌、バチルス・サブチリスなどのバチルス属細菌をはじめとするグラム陽性菌、サッカロマイセス・セビシエなどの酵母、アスペルギルス・ニガーなどの糸状菌が挙げられる。その中でもとくに、大腸菌およびシュードモナス属に属する微生物（たとえばシュードモナス・プチダ）が好ましく使用される。微生物の形質転換は、例えばエシェリヒア属細菌ではカルシウム処理によるコンピテントセル法、バチルス属細菌ではプロトプラスト法、酵母ではＫＵ法やＫＵＲ法、糸状菌ではマイクロマニュピレーション法等の方法によって行うことができる。形質転換する方法としては、エレクトロポーレーション法を用いることもできる。

酵素溶液の精製は、液体クロマトグラフィーを利用して行われる。液体クロマトグラフィーによる精製においては、目的とする精製の程度が得られるように、液体クロマトグラフィーの種類、回数、組み合わせが選択される。液体クロマトグラフィーとしては、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティクロマトグラフィーを挙げることができる。

液体クロマトグラフィーは、カラム内に形成した固定相に目的タンパク質を保持させた後に、連続的に溶離液を供給して目的タンパク質を溶離させて回収してもよいし、バッチ式で行ってもよい。バッチ式では、たとえば容器内に充填剤と目的タンパク質を含んだ試料とを供給して充填剤に目的タンパク質を保持させた後に不純物を除去し、溶離液を供給して充填剤から目的タンパク質を溶離させ、目的タンパク質が回収される。

溶離液としては、溶離剤としてのヒドロキシコラン酸塩を含む溶液が使用される。複数回の液体クロマトグラフィーにより目的タンパク質を精製する場合には、少なくとも一回の液体クロマトグラフィーにおいて、溶離液としてヒドロキシコラン酸塩が使用される。この場合、最後に行う液体クロマトグラフィーにおいて、溶離液としてヒドロキシコラン酸塩を使用するのが好ましい。

ヒドロキシコラン酸塩としては、コール酸塩、グリコウルソデオキシコール酸塩、タウログリコウルソデオキシコール酸塩、タウロウルソデオキシコール酸塩、ウルソデオキシコール酸塩、グリココール酸塩、タウロコール酸塩、グリコケノデオキシコール酸塩、タウロケノデオキシコール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、ケノデオキシコール酸塩、デオキシコール酸塩、グリコリトコール酸塩、タウロリトコール酸塩、リトコール酸塩などが挙げられる。その中でも、コール酸塩、たとえばコール酸ナトリウムを使用するのが好ましい。

溶離液は、この液中のヒドロキシコラン酸塩の濃度を一定にして充填剤と接触させてもよいし、ヒドロキシコラン酸塩の濃度を時間とともに直線的に変化させて供給してもよい。

液体クロマトグラフィーは、酵素溶液から直接行ってもよいが、酵素溶液中の目的タンパク質を濃縮した後に行ってもよい。濃縮は、たとえば減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、あるいは親水性有機溶媒（たとえばメタノール、エタノール、アセトン）による分別沈殿法、加熱処理、等電点処理により行うことができる。

このようにして得られた精製酵素は、たとえば凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライにより粉末化して市場に流通させることができる。

以下においては、上述した製造方法の具体的な例について説明するとともに、溶離剤としてコール酸Ｎａを用いた場合には、溶離剤としてＮａＣｌやＫＣｌを用いる場合に比べて、効率よくＧＤＨを精製できることを実証する。

＜酵素溶液の取得方法＞
（１）ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株からの酵素溶液の取得
ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の培養は、好気的培養条件で行った。より具体的には、ＫＳ１株の培養は、培養液１Ｌ当たりの組成が表１となるように調整された培地２０Ｌを用いて、３４℃で８時間行った。

次いで、本培養液２０Ｌを４℃、１０分間、９０００×ｇで遠心分離することにより約２５０ｇの菌体を得た。回収菌体は、凍結させた後に１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（Ｒａｎｎｉｅ社 デンマーク）を用いて５００ｂａｒの圧力で数回通液して菌体膜を破砕した。菌体膜を破砕することにより得られた細胞抽出液は、ＧＤＨ活性が６０ｋＵであった。この細胞抽出液を８０００×ｇで６０分間、遠心分離して細胞固形物を除去した。さらに、その上清を１０℃で１７万×ｇ、１時間の超遠心分離を行い、沈澱物としての膜画分を回収した。

膜画分は、最終濃度でコール酸Ｎａが１．５％、ＫＣｌが０．１Ｍとなるように、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）で再分散させ、４℃で一夜撹拌した。その結果、３０ｋＵのＧＤＨを含む膜画分懸濁液が得られた。この膜画分懸濁液を１０℃で１７万×ｇ、９０分間、超遠心分離することにより沈殿を除去し、ＧＤＨを含有する可溶化膜画分（ＧＤＨ活性が２６ｋＵ）を得た。この可溶化膜画分を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）で３夜透析し、生成した不溶物を１０℃で１７万×ｇ、９０分間の超遠心分離により沈殿として除去した。得られた上清（可溶化ＧＤＨ画分）中のＧＤＨは、活性が２８ｋＵ、比活性が６．８Ｕ／ｍｇであった。

（２）形質転換体からの粗酵素溶液の取得
以下の実施例および比較例における精製を行うに当たって、宿主の異なる２種類の形質転換体のそれぞれから粗酵素溶液を取得した。

形質転換体の形成に当たっては、まず、α，β，γサブユニットをコードする配列を含むＤＮＡを、常法にしたがってＫＳ１株から取得した。

次いで、得られたＤＮＡをベクタープラスミドに挿入してＧＤＨ発現用プラスミドを形成し、これを宿主微生物に導入して形質転換した。

宿主としては、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０株（ＡＴＣＣ４７０５４）および大腸菌ＢＬ２１株を使用した。

宿主としてシュードモナス・プチダＫＴ２４４０株を用いる場合には、ＧＤＨ遺伝子を挿入するベクタープラスミドとしてＲＳＦ１０１０を用い、大腸菌ＢＬ２１株を用いる場合には、ベクタープラスミドとしてｐＴｒｃ９９Ａを用いた。また、宿主として大腸菌を用いる場合には、チトクロムＣ成熟化（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ：ｃｃｍ）遺伝子群を常時発現させた。まず、大腸菌ｃｃｍ遺伝子群をコードする配列を含むＤＮＡを、常法にしたがってＪＭ１０９株から取得し、これをベクタープラスミドに挿入してｃｃｍ発現用プラスミドを形成した。このときにベクタープラスミドとしてｐＢＢＲ１２２を用いた。次に、ＧＤＨ発現用プラスミドを導入済みの宿主大腸菌にｃｃｍ発現用プラスミドを導入して形質転換した。

それぞれの形質転換体については、別個に培養した。

シュードモナス・プチダの形質転換体の場合は、通常通りの好気的条件で２０Ｌの培養液中において行った。培養液の組成は、３．２％ポリペプトン、２％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、２％グリセロール、０．０５ｍＬ／ＬアデカノールＬＧ−１２６（旭電化 東京）、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ｐＨ７．０）とした。培養液に対しては、２００ｍＬの前培養液を植菌し、３４℃で培養開始した。培養開始から４時間後には、０．２ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加して更に２０時間培養を行って本培養液を得た。本培養液をシャープレス型遠心分離器で遠心分離し、シュードモナスプチダの形質転換体については約８００ｇの菌体を得た。

大腸菌の形質転換体の場合も、培養は通常通りの好気的条件で２Ｌの培養液中にて行った。培養液の組成は、３．２％ポリペプトン、２％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、２％グリセロール、０．０５ｍＬ／ＬアデカノールＬＧ−１２６（旭電化 東京）、５０μｇ／ｍＬアンピシリン、５０μｇ／ｍＬカナマイシン（ｐＨ７．０）とした。培養液に対しては、５０ｍＬの前培養液を植菌し、３０℃で２９時間培養した。培養液からは、遠心分離により大腸菌の形質転換体が約８５ｇ得られた。

次いで、得られた菌体（形質転換体）は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（５００ｂａｒ）を用いて破砕した後、マイドール１２（花王 東京）およびＫＣｌを、それぞれを１％および０．１Ｍとなるように添加して３０分間撹拌した。次に、遠心分離（８０００×ｇ、６０分、１０℃）により沈殿として細胞固形物を除去し、上清として粗酵素液を得た。

粗酵素液は、シュードモナス・プチダの形質転換体については、ＧＤＨ活性が２９３０ｋＵ、比活性が２２Ｕ／ｍｇであり、大腸菌の形質転換体についてはＧＤＨ活性が２５９ｋＵ、比活性が１０．３Ｕ／ｍｇであった。

＜グルコース脱水素活性の測定方法＞
グルコース脱水素活性は、グルコースの脱水素化に基づく、電子受容体の還元反応を追跡することにより行った。電子受容体としては、２，６−ジクロロフェノルインドフェノル（ＤＣＩＰ）及びフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を用いた。

具体的には、まず２０ｍＭグルコース、２ｍＭ ＰＭＳおよび０．１ｍＭ ＤＣＩＰを含む４７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）９００μＬを分光光度計のセルに入れ、３７℃で３分間プレインキュベーションした。次に、０．５〜１０μＬの酵素溶液を添加して、直ちに転倒混和して反応を開始させ、波長が６００ｎｍのときの吸光度低下を３７℃において経時的に測定した。ＤＣＩＰの吸収波長は６００ｎｍであり、吸光度低下はグルコースの脱水素化に基づく、電子受容体の還元反応によるものである。

ここで、吸光度の演算にあたっては、ＤＣＩＰのモル吸光係数を４．７６ｍＭ／ｃｍとした。酵素１単位（Ｕ）は、標準測定条件下で１分毎に１μＭのグルコースを酸化する量と定義した。タンパク質濃度は、ＵＶ法を用いて測定し、２８０ｎｍにおける吸収が１の場合のタンパク質濃度を１ｇ／Ｌと定義した。

[実施例１]
本実施例では、上述した手法によりＫＳ１株から得た酵素溶液（可溶化ＧＤＨ画分）を、疎水クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて精製した。

疎水クロマトグラフィーは、６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）によって予め平衡化しておいたＯｃｔｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（４４ｍｍＩＤ×２０ｃｍアマシャムバイオサイエンス）を用いて行った。カラムに対しては、最終濃度が６０ｍＭとなるように１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）を加えて調製した可溶化ＧＤＨ画分（酵素溶液）を供給した。続いて、６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）を６００ｍＬ、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）を９００ｍＬ通液した後に、強固に吸着したＧＤＨを、溶離液を通液することにより溶出させた。溶離液としては、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）中のコール酸Ｎａを溶解させたものを使用した。溶離液は、コール酸Ｎａの濃度が０〜１重量％の範囲において直線的に変化するように、流速を１５ｍＬ／ｍｉｎとして供給した。

その結果、ＧＤＨは、コール酸Ｎａの濃度が約０．８重量％のときに溶出され、ＧＤＨ活性を有する画分が３４０ｍＬ回収できた。この回収画分（Ｏｃｔｙｌ回収画分）の活性を測定したところ、比活性１０８Ｕ／ｍｇ、総活性１６ｋＵであった。

陰イオン交換クロマトグラフィーは、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）によって予め平衡化しておいたＱ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（３２ｍｍＩＤ×１２ｃｍアマシャムバイオサイエンス）を用いて行った。このカラムに対しては、Ｏｃｔｙｌ回収画分を供給した後、溶離液を供給した。溶離液としては，１重量％コール酸Ｎａを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）を用いた。溶離液は、流速を８ｍＬ／ｍｉｎとして６００ｍＬ供給した。

その結果、ＧＤＨは、溶離液を３００ｍＬ通液した辺りで特異的に溶出され、ＧＤＨ活性を有する画分を３４０ｍＬ回収できた。この回収画分（Ｑ回収画分）の活性を測定したところ、比活性７７０Ｕ／ｍｇ、総活性１４ｋＵであった。

なお、各操作後における液量、総活性、比活性、収率をまとめたものを、下記表２に示した。

[実施例２]
本実施例では、シュードモナス・プチダの形質転換体から得た粗酵素溶液を、疎水クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて精製した。

疎水クロマトグラフィーでは、まず、０．１ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）によって予め平衡化しておいたＰｈｅｎｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅカラム（３００ｍｍＩＤ×１０ｃｍチッソ、東京）に対して、粗酵素液を供給して充填剤にＧＤＨを保持させた。次に、０．１ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）を７Ｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）を２１Ｌ通液した後に、強固に吸着したＧＤＨを１溶離液を通液することにより溶出させた。溶離液としては、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）中にコール酸Ｎａを溶解させたものを使用した。溶離液は、コール酸Ｎａの濃度が０〜１重量％の範囲において直線的に変化するように、流速を７Ｌ／ｈｒとして供給した。

その結果、ＧＤＨは、コール酸Ｎａの濃度が約０．９重量％のときに溶出され、活性画分が７３００ｍＬ回収された。この回収画分（Ｐｈｅｎｙｌ回収画分）の活性を測定したところ、比活性２０４Ｕ／ｍｇ、総活性５９６ｋＵであった。

陰イオン交換クロマトグラフィーは、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）で予め平衡化しておいたＱ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（４４ｍｍＩＤ×２０ｃｍアマシャムバイオサイエンス）を用いて行った。このカラムに対しては、Ｐｈｅｎｙｌ回収画分を供給した。Ｐｈｅｎｙｌ回収画分は、分画分子量５００００のラボモジュール（旭化成 東京）を用いて１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）にバッファー置換した後にカラムに供給した。次に、カラムに対して１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）を６００ｍＬを供給した後、溶離液を供給した。溶離液としては、１重量％コール酸Ｎａを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）を用いた。溶離液は、流速を１０ｍＬ／ｍｉｎとして供給した。

その結果、ＧＤＨは、溶離液を１４００ｍＬ通液した辺りで特異的に溶出され、３１５ｍＬの活性画分が回収された。この活性画分（Ｑ回収画分）の活性を測定したところ、比活性１２８３Ｕ／ｍｇ、総活性が３９０ｋＵであった。

なお、各操作後における液量、総活性、比活性、収率をまとめたものを、下記表３に示した。

本実施例ではさらに、Ｐｈｅｎｙｌ回収画分およびＱ回収画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液を用いて８−２５％ポリアクリルアミドの勾配ゲル中で実施した。ゲル中を泳動したタンパク質については、ＣＢＢ染色を施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果は、図１に示した。同図においては、レーン２がＰｈｅｎｙｌ回収画分のＣＢＢ染色を、レーン３がＱ回収画分のＣＢＢ染色をそれぞれ示している。

[実施例３]
本実施例では、シュードモナス・プチダの形質転換体から得た粗酵素溶液を、疎水クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて精製した。

疎水クロマトグラフィーは、実施例２と同様にして行い、回収溶液を限外濃縮し、比活性３００Ｕ／ｍｇ、総活性が２１ｋＵであるＰｈｅｎｙｌ回収画分を７０１ｍＬ得た。

陰イオン交換クロマトグラフィーは、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）によって予め平衡化しておいたＱＡＥ−トヨパール５５０カラム（４４ｍｍＩＤ×１０ｃｍ東ソー 東京）を用いて行った。このカラムに対しては、Ｐｈｅｎｙｌ回収画分を供給した後に、溶離液を供給した。溶離液としては、１重量％コール酸Ｎａを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）を用いた。溶離液は、流速を５ｍＬ／ｍｉｎとして２０００ｍＬ供給した。

その結果、ＧＤＨは、溶離液を１６００ｍＬ通液した辺りで特異的に溶出され、３００ｍＬの活性画分が回収された。この活性画分（ＱＡＥ回収画分）の活性を測定したところ、比活性１５００Ｕ／ｍｇ、総活性が７．８ｋＵであった。

なお、各操作後における液量、総活性、比活性、収率をまとめたものを、下記表４に示した。

本実施例ではさらに、実施例２と同様な手法によりＱＡＥ回収画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った後、タンパク質についてＣＢＢ染色を施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果は、図１に示した。同図においては、レーン４がＱＡＥ回収画分を示している。

［比較例１］
本比較例では、シュードモナス・プチダの形質転換体から得た粗酵素溶液を、疎水クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて精製した。

疎水クロマトグラフィーは、実施例２と同様にして行い、比活性３１４Ｕ／ｍｇ、総活性が２５６ｋＵであるＰｈｅｎｙｌ回収画分を７２００ｍＬ得た。ただし、本比較例では、Ｐｈｅｎｙｌ回収画分うちの総活性３９ｋＵに相当する１１００ｍＬ（Ｑアプライ）について、次に説明する陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。

陰イオン交換クロマトグラフィーは、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）によって予め平衡化しておいたＱ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（４４ｍｍＩＤ×１３ｃｍアマシャムバイオサイエンス）を用いて行った。このカラムに対しては、Ｑアプライを供給した。その後、カラムに８００ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）を通液して非吸着タンパク質を洗い流した。次いで、カラムに対して溶離液を供給した。溶離液としては、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）中にＮａＣｌを溶解させたものを使用した。溶離液は、ＮａＣｌの濃度が０〜０．６Ｍの範囲において直線的に変化するように、流速を７．５ｍＬ／ｍｉｎとして供給した。

その結果、ＧＤＨは、ＮａＣｌ濃度が約０．２５Ｍと約０．４Ｍの２箇所に溶出し、１４０ｍＬおよび３６０ｍＬの活性画分が回収された。これらの活性画分（Ｑ回収画分（１）およびＱ回収画分（２））のそれぞれについて活性を測定したところ、Ｑ回収画分（１）は比活性６００Ｕ／ｍｇ、総活性４．５ｋＵ、Ｑ回収画分（２）は比活性４３２Ｕ／ｍｇ、総活性１２ｋＵであった。

なお、各操作後における液量、総活性、比活性、収率をまとめたものを、下記表５に示した。

本比較例ではさらに、実施例２と同様な手法によりＰｈｅｎｙｌ回収画分およびＱ回収画分（２）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った後、タンパク質についてＣＢＢ染色を施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果は、図２に示した。同図においては、レーン２がＰｈｅｎｙｌ回収画分を、レーン３がＱ回収画分（１）をそれぞれ示している。

［比較例２］
本比較例では、比較例１で得られたＰｈｅｎｙｌ回収画分のうち、総活性７４ｋＵに相当する２１００ｍＬ（ＱＡＥアプライ）から、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてＧＤＨを精製した。

陰イオン交換クロマトグラフィーは、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）によって予め平衡化しておいたＱＡＥ−トヨパール５５０カラム（４４ｍｍＩＤ×１０ｃｍ東ソー 東京）を用いて行った。このカラムに対しては、まずＱＡＥ回収画分（総活性７４ｋＵ）を供給した。次いで、８００ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）を通液して非吸着タンパク質を洗い流した。その後、カラムに対して溶離液を供給した。溶離液としては、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）中にＫＣｌを溶解させたものを使用した。溶離液は、ＫＣｌの濃度が０〜１Ｍの範囲において直線的に変化するように、流速を５ｍＬ／ｍｉｎとして供給した。

その結果、ＧＤＨは、ＫＣｌの濃度が約０．２３Ｍと約０．４３Ｍの２箇所に溶出し、２００ｍＬおよび４００ｍＬの活性画分が回収された。これらの活性画分（ＱＡＥ回収画分（１）およびＱＡＥ回収画分（２））のそれぞれについて活性を測定したところ、ＱＡＥ回収画分（１）は比活性３９９Ｕ／ｍｇ、総活性７．４ｋＵ、ＱＡＥ回収画分（２）は比活性２１７Ｕ／ｍｇ、総活性６．４ｋＵであった。

なお、各操作後における液量、総活性、比活性、収率をまとめたものを、下記表６に示した。

本比較例ではさらに、実施例２と同様な手法によりＱＡＥ回収画分（２）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った後、タンパク質についてＣＢＢ染色を施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果は、図２に示した。同図においては、レーン４がＱＡＥ回収画分（２）を示している。

[実施例４]
本実施例では、大腸菌の形質転換体から得られた粗酵素溶液を、疎水クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて精製した。

疎水クロマトグラフィーは、Ｏｃｔｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムを用いて、実施例１と同様な条件において行った。

その結果、ＧＤＨは、コール酸Ｎａの濃度が約０．８重量％のときに溶出され、ＧＤＨ活性を有する画分が２２０ｍＬ回収できた。この回収画分（Ｏｃｔｙｌ回収画分）の活性を測定したところ、比活性５０３Ｕ／ｍｇ、総活性１４９ｋＵであった。

陰イオン交換クロマトグラフィーは、Ｑ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムを用いて、実施例１と同様な条件において行った。

その結果、ＧＤＨは、溶離液を５００ｍＬ通液した辺りで特異的に溶出され、ＧＤＨ活性を有する画分を１７５ｍＬ回収できた。この回収画分（Ｑ回収画分）の活性を測定したところ、比活性１１４７Ｕ／ｍｇ、総活性５０ｋＵであった。

なお、各操作後における液量、総活性、比活性、収率をまとめたものを、下記表７に示した。

本実施例ではさらに、実施例２と同様な手法によりＱ回収画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った後、タンパク質についてＣＢＢ染色を施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果は、図３に示した。同図においては、レーン３が本実施例のＱ回収画分を示している。図３においては、実施例１におけるＱ回収画分（レーン２）および実施例２におけるＱ回収画分（レーン４）についても同時に電気泳動を行っている。

＜結果の検討＞
表２〜表７から分かるように、溶離剤としてコール酸Ｎａを用いてＧＤＨを溶出させた場合には（実施例１から４）、溶離剤としてＮａＣｌやＫＣｌを用いてＧＤＨをグラジエント溶出させた場合（比較例１および２）に比べ、最終的な比活性が高く、効率よくＧＤＨが精製されている。この点については、図１および図２にも明確に表れている。すなわち、ＫＳ１株由来のＧＤＨは、α，β，γサブユニットからなるが、これらのサブユニットの還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量は、それぞれ約６０ｋＤａ、約４３ｋＤａ，および約１４ｋＤａである。この点を踏まえて図１および図２をみれば、実施例２および３で得られる回収画分では、比較例１および２で得られる回収画分に比べて、α，β，γサブユニットに相当するバンドが大きく、その他の分子量のタンパク質が少なくなっている。したがって、疎水クロマトグラフィーや陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせてＧＤＨを精製する際に、コール酸Ｎａを用いてＧＤＨを溶出させた場合には、効率よくＧＤＨが精製できるといえる。

また、図３から分かるように、宿主を大腸菌とした形質転換体からの粗酵素を用いた場合には、γサブユニットに相当するバンドが小さいものの、α，βサブユニットに相当するバンドが他の粗酵素溶液を用いる場合に比べて大きくなっている。また、大腸菌は、安価かつ入手容易であるともに、自己増殖性に優れたものである。したがって、工業的な応用を考えた場合には、大腸菌を宿主とする形質転換体から粗酵素溶液を得、この粗酵素溶液を精製してＧＤＨを得る方法は有用であるといえる。

Claims (19)

1. 目的タンパク質が溶解したタンパク質溶液から、疎水クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを利用して前記目的タンパク質を精製する方法であって、
   前記疎水クロマトグラフィーを行い、その後に前記陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、
   前記疎水クロマトグラフィーは、
   第１充填剤が充填された充填槽に前記タンパク質溶液を導入し、前記第１充填剤に対して前記目的タンパク質を保持させるステップと、
   ヒドロキシコラン酸塩を含む溶離液を用いて、前記第１充填剤から前記目的タンパク質を溶離させるステップと、を含み、
   前記陰イオン交換クロマトグラフィーは、
   第２充填剤が充填された充填槽に前記タンパク質溶液を導入し、前記第２充填剤に対して前記目的タンパク質を保持させるステップと、
   ヒドロキシコラン酸塩を含む溶離液を用いて、前記第２充填剤から前記目的タンパク質を溶離させるステップと、を含む、タンパク質の精製方法であって、
   前記目的タンパク質は、グルコース脱水素活性を有するタンパク質をサブユニットとして含み、且つ、電子伝達タンパク質をサブユニットとして含む、タンパク質の精製方法。
2. 前記第２充填剤は、４級アンモニウム基をイオン交換基として有するイオン交換樹脂である、請求項１に記載のタンパク質の精製方法。
3. 前記電子伝達タンパク質は、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａであり、
   前記グルコース脱水素活性を有するタンパク質は、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａである、請求項１または２に記載のタンパク質の精製方法。
4. 前記ヒドロキシコラン酸塩は、コール酸塩である、請求項１から３のいずれか一つに記載のタンパク質の精製方法。
5. 前記第２充填剤からの前記目的タンパク質の溶離は、前記溶離液におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度を一定にして行われる、請求項１から４のいずれか一つに記載のタンパク質の精製方法。
6. 前記溶離液におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度は、０．５〜２．５重量％の範囲から選択される、請求項５に記載のタンパク質の精製方法。
7. 目的タンパク質が溶解したタンパク質溶液から、疎水クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを利用して前記目的タンパク質を精製する方法であって、
   前記疎水クロマトグラフィーを行い、その後に前記陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、
   前記疎水クロマトグラフィーは、
   第１充填剤が充填された充填槽に前記タンパク質溶液を導入し、前記第１充填剤に対して前記目的タンパク質を保持させるステップと、
   ヒドロキシコラン酸塩を含む溶離液を用いて、前記第１充填剤から前記目的タンパク質を溶離させるステップと、を含み、
   前記陰イオン交換クロマトグラフィーは、
   第２充填剤が充填された充填槽に前記タンパク質溶液を導入し、前記第２充填剤に対して前記目的タンパク質を保持させるステップと、
   ヒドロキシコラン酸塩を含む溶離液を用いて、前記第２充填剤から前記目的タンパク質を溶離させるステップと、を含む、タンパク質の精製方法であって、
   前記目的タンパク質は、グルコース脱水素酵素を産生する能力を有するブルクホルデリア属に属する微生物が産生したグルコース脱水素酵素である、タンパク質の精製方法。
8. 前記ブルクホルデリア属に属する微生物は、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６）である、請求項７に記載のタンパク質の精製方法。
9. 前記目的タンパク質は、形質転換体が産生したグルコース脱水素酵素であり、
   この形質転換体は、グルコース脱水素酵素を産生する能力を有するブルクホルデリア属に属する微生物から取得した前記電子伝達タンパク質および前記グルコース脱水素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを、宿主微生物に導入して形成したものである、請求項１から８のいずれか一つに記載のタンパク質の精製方法。
10. 前記宿主微生物は、シュードモナス・プチダである、請求項９に記載のタンパク質の精製方法。
11. 前記宿主微生物は、大腸菌である、請求項９に記載のタンパク質の精製方法。
12. 疎水クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーとを組み合わせてグルコース脱水素酵素を精製する方法であって、
    前記疎水クロマトグラフィーを行い、その後に前記陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、
    前記疎水クロマトグラフィーは、固定相に前記グルコース脱水素酵素を保持させるステップと、不要なタンパク質を溶出させるステップと、ヒドロキシコラン酸塩を含む溶離液を用いて前記グルコース脱水素酵素を溶出させるステップと、を含み、
    前記陰イオン交換クロマトグラフィーは、固定相に前記グルコース脱水素酵素を保持させるステップと、ヒドロキシコラン酸塩を含む溶離液を用いて前記グルコース脱水素酵素を溶出させるステップと、を含んでいる、グルコース脱水素酵素の精製方法。
13. 前記疎水クロマトグラフィーにおいては、前記グルコース脱水素酵素の溶出は、前記溶離液におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度を時間とともに変化させて行われ、
    前記陰イオン交換クロマトグラフィーにおいては、前記グルコース脱水素酵素の溶出は、前記溶離液におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度を一定にして行われる、請求項１２に記載のグルコース脱水素酵素の精製方法。
14. 前記グルコース脱水素酵素は、グルコース脱水素酵素を産生する能力を有するブルクホルデリア属に属する微生物が産生したものである、請求項１２または１３に記載のグルコース脱水素酵素の精製方法。
15. 前記ブルクホルデリア属に属する微生物は、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６）である、請求項１４に記載のグルコース脱水素酵素の精製方法。
16. 前記グルコース脱水素酵素は、形質転換体が産生したものであり、
    この形質転換体は、グルコース脱水素酵素を産生する能力を有するブルクホルデリア属に属する微生物から取得した前記グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡを、宿主微生物に導入して形成したものである、請求項１２または１３に記載のグルコース脱水素酵素の精製方法。
17. 前記宿主微生物は、シュードモナス・プチダである、請求項１６に記載のグルコース脱水素酵素の精製方法。
18. 前記宿主微生物は、大腸菌である、請求項１６に記載のグルコース脱水素酵素の精製方法。
19. 前記陰イオン交換クロマトグラフィーは、４級アンモニウム基をイオン交換基として有するイオン交換樹脂を用いて行い、
    前記ヒドロキシコラン酸塩としては、コール酸塩を用いる、請求項１２から１８のいずれか一つに記載のグルコース脱水素酵素の精製方法。

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