WO2003106702A1 - グルコース脱水素酵素を用いたグルコース濃度測定方法およびグルコースセンサ - Google Patents

グルコース脱水素酵素を用いたグルコース濃度測定方法およびグルコースセンサ Download PDF

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WO2003106702A1
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glucose
enzyme
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sensor according
concentration
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PCT/JP2003/007630
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山岡　秀亮
星島　光博
朋吾 辻本
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アークレイ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a technique for measuring the concentration of glucose in a sample solution (for example, a biochemical sample such as blood or a preparation thereof).
  • a sample solution for example, a biochemical sample such as blood or a preparation thereof.
  • ⁇ attach a glucose sensor that performs an enzyme reaction field to the blood glucose measuring device and supply blood (specimen) to the gnorecose sensor.
  • the blood glucose level is measured.
  • a method of incising the skin of the measurer to collect blood and supplying the blood night as a sample night to a glucose sensor is generally adopted.
  • the amount of blood to be collected is smaller, so various improvements have been made so that the blood glucose level can be measured with a smaller amount of blood (sample). ; ⁇ Under consideration.
  • the glucose sensor has, for example, a structure in which a reagent layer is formed on a substrate, and a cabillary is provided with the reagent layer contained therein (see FIGS. 2 and 3).
  • the reagent layer is composed of a substance containing an oxidoreductase and an electron transfer substance. GOD and PQQGDH are used as oxidoreductases. Published 2000-65778).
  • a liquid-phase reaction system is built inside the capillary. At this time, for example, the oxidation reaction of glucose is catalyzed by the oxidoreductase, while the reduction reaction of the electron mediator is performed. The reaction is catalyzed.
  • the response current value is measured by applying «! To the reaction system using the electrodes of the gnorecose sensor as IJ.
  • This response current value is caused, for example, by the amount of the reduced electron mediator (the amount correlated with the glucose concentration), and is the basis for calculating the glucose concentration.
  • the glucose concentration is calculated; the coulometry method or the averometry method is used for ⁇ .
  • the coulometric method is a method of reacting almost all glucose in a sample, obtaining an integrated value of a response current value for calculation, and calculating a glucose concentration based on the integrated value (coulomb).
  • the averometry method is a method in which a response current value is obtained after a certain time from the start of the reaction, and the glucose concentration is calculated based on the response current value.
  • GOD has a low rate of reaction with glucose (Km (Michaelis female) is large), so the coulometric method, in which most of the glucose in the sample is reacted to obtain a coulomb for calculation, significantly increases the measurement time.
  • Km Meichaelis female
  • the coulometric method in which most of the glucose in the sample is reacted to obtain a coulomb for calculation, significantly increases the measurement time.
  • the umbellometry method is used.
  • the averometry method has a small measurement range and is not suitable for the measurement of a small amount of sample.
  • GOD is not very reactive with electron mediators. Therefore, in order to shorten the measurement time, it is necessary to use a large amount of electron mediator. as a result, It becomes difficult to reduce the size of W glucose sensors (more precisely, reagent layers and cavities), and accordingly the required sample volume also increases. From this point, it can be said that the method using GOD is not suitable for measuring a small amount of a sample.
  • the amount of a sample that can accurately measure dulcose is 0.6 L at minimum, 15 seconds at minimum in measurement time, and gnorecose concentration in measurement range.
  • the range of 10 to 600 mg / dL is the limit.
  • the use of the coulometric method for the use of PQQGDH as an oxidoreductase makes it possible to measure blood glucose even with a small sample of 0.3 L.
  • the coulometric method is a method of calculating the glucose concentration using almost all glucose in a sample as described above, and thus the measurement time is relatively higher in a high glucose concentration region than in the amperometric method. Tends to be longer. For example, to secure the minimum measurement range (10 to 600 mg / dL) required for practical use, it is necessary to secure a measurement time of 15 to 30 seconds.
  • An object of the present invention is to make it possible to measure a small amount of a sample with high accuracy in a short time while securing a large measurement range.
  • a reaction system including an enzyme and an electron mediator is used.
  • cytochrome C it is preferable to use those derived from microorganisms belonging to the genus Burkholderia.
  • the cytochrome C one having a molecular weight of about 43 kDa can be used, as determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis in reducing conditions.
  • a method for measuring glucose concentration using a reaction system containing an enzyme and an electron mediator wherein a glucose enzyme derived from the genus Burkholderia is used as the enzyme.
  • a glucose concentration measuring method using a glucose ⁇ enzyme is used, wherein a Ru compound is used as the electron mediator.
  • a stimulus is given to the reaction system, while a response to the stimulus is detected, and the glucose concentration is calculated based on the detected amount of the response.
  • the stimulus is given as, for example, and the response is obtained as a current or optical property.
  • a reaction system is provided by providing a first solution and a second solution, and a layer containing an enzyme and an electron transfer substance, and supplying a glucose solution to the reagent layer.
  • a glucose sensor configured to apply a stimulus to the reaction system using the first and second electrodes, wherein a glucose enzyme to which cytochrome C is bound is used as the enzyme;
  • Glucose sensors are known, which use a Ru compound as the electron mediator.
  • cytochrome C it is preferable to use those derived from microorganisms belonging to the genus Burkholderia.
  • cytochrome C those having a molecular weight S of about 43 kDa can be used, as determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis in reducing gel.
  • a first and a second electrode and a reagent layer containing an enzyme and an electron transfer substance, and a glucose solution is supplied to the reagent layer to construct a reaction system.
  • a glucose sensor configured to apply a stimulus to the reaction system using the first and second electrodes, wherein a glucose!
  • a glucose sensor is a glucose sensor in which a Ru compound is used as the electron mediator and a glue layer is used.
  • the glucose ⁇ enzyme has glucose fck enzyme activity, and has a molecular weight of about
  • the glucose dehydrogenase may have a ⁇ -subunit having a molecular weight of about 14 kDa in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions.
  • a complex represented by the following chemical formula can be used as the Ru compound.
  • X in the above chemical formula includes NH 3 , a halogen ion, CN, pyridine, nicotinamide, or 0. Of those exemplified, it is preferable to use a Ru complex in which X is NH 3 or a halogen ion. On the other hand, n + in the chemical formula indicates the valency of the Ru complex determined by the type of X.
  • the Ru complex usually exists as an oxidized form ( ⁇ ) because the reduced form ( ⁇ ) is unstable. Therefore, for example, even when exposed to light or water with the oxidized Ru complex mixed in the reagent layer of the glucose sensor, it is not easily reduced. Further, the Ru complex is unlikely to be crystallized, and has a remarkable property if the fine powder state can be appropriately maintained. From this point, it can be said that the Ru complex has high solubility. Therefore, it is preferable to include a Ru complex as an oxidized type in the ⁇ reagent layer in consideration of exposure resistance, storage stability, and the like.
  • the glucose sensor of the present invention is provided with, for example, a reagent layer, and is further provided with a liquid holding space for storing a captive sample solution.
  • the reagent layer is configured as a solid layer, and is configured such that at least a part of the oxidoreductase and the electron transfer substance dissolve in the sample liquid when the sample liquid is held in the liquid holding space.
  • the glucose sensor be configured such that after the sample supply, a reaction system is formed as a liquid phase by the glucose, the oxidoreductase, and the electron transfer substance in the liquid holding space.
  • the volume of the liquid space is set to, for example, 0.1 to 0.5 L so that a small amount of sample solution can be measured.
  • the content of the oxidoreductase in the reagent layer is, for example, an amount corresponding to 1.0 to 10.0 U of glucose enzyme activity. 1 unit of enzyme (U) Under constant conditions (pH 6.0, 37 ° C), the fading based on the reduction of DCIP (2,6-dichroic phenol-indolephenol) is reduced to 600nm, the absorption wavelength of DCIP! It was defined as the amount that oxidizes 1 ⁇ of glucose every minute (molar extinction coefficient is 4 ⁇ 76 ⁇ 1000 M / cm) when measured periodically.
  • the content of the electron mediator in the reagent layer is, for example, 1.0 to 5.0 wt% corresponding to the concentration of the electron mediator when filled with the liquid holding space force S sample solution. Is done.
  • the liquid space is configured to move the sample liquid by, for example, capillary force.
  • a microorganism belonging to the genus Burkholderia produces an enzyme containing ⁇ -subunit having glucose enzyme activity or cytochrome C (] 3 subunit) (hereinafter sometimes simply referred to as “GDH”).
  • GDH cytochrome C
  • Burkholderia 'Sepathia especially Burkholderia' Sepathia KS1 strain (hereinafter sometimes simply referred to as “KS1 strain”) is preferable.
  • the KS1 strain is a new strain isolated from soil strength near ⁇ , but it has been identified as Burkholderia sepacia based on its microbiological properties, and the industrial technology was established on September 25, 2000. It has been deposited as a microorganism accession number ⁇ FERM BP-7306 at the National Institute for Patent Organism Depositary (1-1, Higashi 1-1, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566, Japan).
  • the KS1 strain can produce GDH containing a submit (molecular weight of about 60 kDa), ⁇ submit (corresponding to cytochrome C) (molecular weight of about 43 kDa) and ⁇ submit (molecular weight of about 14 kDa). However, the molecular weight was measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions.
  • Cytochrome C (including submit) is an electron transfer protein, and binds cytochrome C to a subunit (including ⁇ - subunit) having glucose dehydrogenase activity from the viewpoint of improving the electron transfer rate. It is preferable to use it as a GDH (hereinafter sometimes simply referred to as “CyGDH”). Cytochromes are not limited to those derived from microorganisms belonging to the genus Burkholderia (j3 subunit), but also bind to subunits that have glucose J! Finally, it may be derived from other microorganisms or living cells.
  • the ⁇ -subunit has glucose dehydrogenase activity as described above.
  • GDH that is powerful with ⁇ -subunit and ⁇ -subunit (hereinafter simply referred to as “GDHJ” Has a higher reaction rate with glucose (greater Vmax / Km) than GDm without the ⁇ subunit. This point is ⁇ by the present inventors. Therefore, from the viewpoint of increasing the rate of reaction with glucose, it is preferable to use DHsubunit in combination with ⁇ ⁇ subunit and use it as GDH in the case of using ⁇ subunit.
  • FIG. 1 shows a state in which a glucose sensor according to the present invention is mounted on a concentration measuring device.
  • FIG. 1 is a block diagram of the concentration measuring device, and a plan view of the glucose sensor. .
  • FIG. 2 is an overall perspective view showing an example of the glucose sensor.
  • FIG. 3 is an exploded perspective view of the glucose sensor of FIG.
  • FIG. 4 is a graph showing an example of a voltage value applied between the first and second electrodes and a response current value over time in the measurement of glucose concentration.
  • FIG. 5 is a graph showing another example of the voltage value applied between the first and second electrodes and the response current value over time in measuring the glucose concentration.
  • Figures 6 6 to 6D are graphs showing the relationship between the concentration of Darcos and the response current 5 seconds after the start of the reaction. It is.
  • FIGS. 7A to 7D are graphs showing the relationship between the Darcos concentration and the response current value 5 seconds after the start of the reaction when the reagent layer was formed using an iron complex.
  • FIGS. 8A to 8D are graphs showing the relationship between the concentration of Darcos and the response current 10 seconds after the start of the reaction when the reagent layer is formed using a Ru complex.
  • FIGS. 9A to 9D are graphs showing the relationship between the concentration of Darcos and the response current 10 seconds after the start of the reaction when the reagent layer is formed using an iron complex.
  • FIGS. 10A to 10D are graphs in which the effect of hematocrit (Hct) is evaluated as Bias (based on Hct 42%) after a specific time has elapsed from the start of the reaction.
  • Hct hematocrit
  • the concentration measuring device 1 shown in FIG. 1 is for measuring the concentration of gnorecose in a sample solution containing gnorecose such as blood using the glucose sensor 2 according to the present invention.
  • the concentration measuring device 1 is generally configured to include a voltage applying unit 3, a current value measuring unit 4, a detecting unit 5, a control unit 6, a calculating unit 7, and a display unit 8.
  • the glucose sensor 2 is configured to be used and discarded, and has a cover plate 20, a spacer 21 and an anti-22 as best seen in FIGS.
  • the cover plate 20 is provided with a hole 23, and the spacer 21 is provided with a narrow slit 24 communicating with the hole 23 and having an open end 24a.
  • key Yabirari 25 is defined by the slit 24.
  • the capacity of the capillaries 25 is set to, for example, 0.1 to 0.5 ⁇ L, and the capillaries 25 communicate with the outside via the opening 24 a at the tip of the slit 24 and the hole 23.
  • the distal end opening 24a forms a sample liquid inlet 25a, and the supplied sample liquid flows through the capillaries 25 ⁇ toward the hole 23 by capillary action. I do.
  • a first electrode 26, a second preparation 27, and a drug layer 28 are provided on an upper surface 22 a of the substrate 22.
  • the first and second layers 26 and 27 extend in the longitudinal direction of the screen 22 as a whole, and their ends 26 a and 27 a extend in the lateral direction of the substrate 22.
  • the upper surface 22a of the substrate 22 is covered with an insulating film 29 so that the ends 26a, 26b, 27a, 27b of the first and second electrodes 26, 27 are exposed.
  • the reagent layer 28 is, for example, in a solid state, and ends 26 a, 27 of the first and second electrodes 26, 27. It is provided so as to bridge between a.
  • the reagent layer 28 contains, for example, a relatively large amount of oxidized Ru compound (electron mediator) and a relatively small amount of GDH (glucose dehydrogenase).
  • the content of GDH in the reagent layer is, for example, an amount corresponding to the glucose enzyme activity of 1.0 to 10.0 U, and the content of the Ru compound in the reagent layer is, for example, that the capillaries 25 are filled with the sample solution.
  • the concentration of the Ru compound at that time is 1.0 to 5. ( ⁇ %).
  • the oxidized Ru compound may function as an electron carrier.
  • a Ru complex represented by the following chemical formula.
  • Examples of X in the above formula include NH 3 , a halogen ion, CN, pyridine, nicotinamide, and 3 ⁇ 40. Of those exemplified, it is preferable to use a Ru complex in which X is NH 3 or a halogen ion. On the other hand, n + in the ⁇ ⁇ formula indicates the valency of the Ru complex determined by X.
  • the ratio of the Ru compound to GDH is increased, and the Ru compound has a large effect on the solubility of the reagent layer 28.
  • a Ru complex represented by a chemical formula as a Ru compound is difficult to be crystallized, can appropriately maintain a fine powder state, and has high solubility. Therefore, the reagent layer 28 has a high melting angle needle as a whole, and is easily dissolved by supplying blood. Therefore, even if the volume of the capillary 25 is set to be small as in the above-described range, the Gunorecose sensor 2 can appropriately provide a substantially homogeneous liquid-phase reaction system in the capillary 25 mm when blood is supplied. It can be built.
  • GDH it is preferable to use a substance in which cytoplasm M, an electron transfer protein, is bound to a subunit having glucose enzymatic activity.
  • the subunit cytochrome C having glucose enzymatic activity for example, a microorganism belonging to the genus Purkholderia, for example, a microorganism derived from the strain Burkholderia cepacia KS1.
  • subunit cytochrome C having glucose dehydrogenase activity is not limited to microorganisms belonging to the genus Burkholderia, but may be derived from other microorganisms or living cells as long as the desired function can be exhibited.
  • the expression code of the target subunit is Burkholderia
  • the vector may be obtained from a microorganism belonging to the above, and also transduced into the host with a setter containing the expression code and produced from the host.
  • the submitt with glucose enzymatic activity is obtained as an ⁇ -subunit with a molecular weight of 60 kDa
  • cytochrome C is obtained as a ⁇ -subunit with a molecular weight of 43 kDa.
  • This KS1 strain produces GDH in which 0 / subunit, a molecule of 4 ⁇ 14 kDa, is bound to the 3 ⁇ 4 subunit and the / 3 subunit.
  • the molecular weight is determined by SDS-polyacrylamide under reducing conditions.
  • aGDH in which ⁇ -subunit is bound to c-subunit.
  • CyGDH in which a subunit (cytochrome C) is bonded to aGDH.
  • the mil application section 3 shown in FIG. 1 applies a constant voltage between the end 26 b of the first electrode 26 and
  • 3 ⁇ 4 ⁇ Applying section 3 attaches glucose sensor 2 to an attaching section (not shown) provided in glucose concentration measuring device 1, so that glucose sensor 2 can be connected via first and second worms 3 a and 3 b. It is designed to be electrically connected to the ends 26 b and 27 b of the no-coordinate sensor 2.
  • a direct current source such as a dry battery or a rechargeable battery is used.
  • the current value measuring unit 4 measures a response current value that is correlated with the amount of electrons emitted from, for example, a reduced Ru compound when a shield is applied to the reaction system.
  • the detection unit 5 detects whether or not the sample liquid is supplied to the reagent layer 28 after the glucose sensor 2 is mounted on the glucose concentration measuring device 1 and the glucose concentration can be measured.
  • the control unit 6 controls the application unit 3 to select a state in which E is applied between the first and second electrodes 26 and 27 (closed circuit) and a state in which E is not applied (open circuit). .
  • the calculating unit 7 calculates the glucose concentration in the sample liquid according to the response current value measured by the current value measuring unit 4.
  • each of the detection unit 5, the control unit 6, and the calculation unit 7 is a total of the force detection unit 5, the control unit 6, and the calculation unit 7 configured by, for example, a CPU and a memory such as a memory. It is also possible to configure by connecting multiple memories to one CPU.
  • the calculation result by the calculation unit 7 is displayed on the display unit 8.
  • the display unit 8 is composed of, for example, an LCD.
  • the glucose sensor 2 is set in the glucose concentration measuring device 1. Then, the body 6 b of the first comforter 26 of the glucose sensor 2 is removed with the first insectworm 3 a of the concentration measuring device 1, and the end 27 b of the second electrode 27 is replaced with the second insectworm 3 b. Remove the insects. As mentioned earlier, in this state, the first and second i-lines 26 and 27 can conduct to the mis-applying section 3.
  • the constant ME was set between the first and second comforters 26 and 27 by the application unit 3 under the control of the control unit 6 before the supply of the sample solution. Has been applied.
  • the applied ⁇ value is set, for example, in the range of 100 to 500 mV.
  • a sample liquid such as blood is supplied through the sample liquid inlet 25a of the gnorecourse sensor 2.
  • the sample solution travels in the capillary 25 of the glucose sensor 2 by capillary action.
  • the reagent layer 28 is dissolved by the sample liquid, and a liquid-phase reaction system is established.
  • glucose is oxidized by GDH and the Ru compound is converted to a reduced form.
  • the reduced Ru compound present in the reagent layer 28 is exposed to the end of the first electrode 26. It moves to the 26a side, and emits electrons to the end 26a to become an oxidized Ru compound. Therefore, when a constant mffi is supplied between the first and second electrodes 26 and 27 by the voltage applying unit 3, the amount of electrons provided from the reduced Ru compound is reduced by the first electrode 26 and the first worms 3 The current is measured as a response current by the current value measurement unit 4 via a.
  • the response current value measured by the current value measurement unit 4 is monitored by the detection unit 5, and as shown in FIG. 4, the response 3 ⁇ 4 ⁇ value is changed to the threshold value I (for example, 0.1 to 3.0).
  • the detection unit 5 detects that the sample liquid is supplied to the reagent layer 28 and the reagent layer 28 is dissolved.
  • Part 4 is constant from the detection time (e.g., 1 2 -. T 10 seconds or less, more preferably less than 5 seconds) to measure the response current value 1 2 for operation at the elapsed point 2.
  • a certain period of time (for example, one t. Is 10 seconds or less, and more preferably 3 seconds or less) is detected after the detection unit 5 detects that the sample liquid is supplied. Until the time point ti elapses, the mika-noodles may be discontinued. On top of that, while reapplying the Mffi from time 1 1, a predetermined time after the re-application (e.g. t - ti is 3 seconds or more, more preferably 3 seconds to 5 seconds) the response current at the time t 2 which has passed the value may be the adopted as a response current value 1 2 for operation.
  • a predetermined time after the re-application e.g. t - ti is 3 seconds or more, more preferably 3 seconds to 5 seconds
  • the response current at the time t 2 which has passed the value may be the adopted as a response current value 1 2 for operation.
  • the computing unit 7 computes the gnorecose concentration in the sample solution based on the response current for computation.
  • the response current value is converted to a mm value, and then the ⁇ value is calculated.
  • the calculation is performed by applying a previously created calibration curve indicating the relationship between the HE value and the glucose concentration, and the calibration curve is stored in the ROM together with a program for converting the data into data and shearing the calculation. .
  • the reagent layer 28 is configured by combining a Ru compound and a specific GDH (o; GDH, CyGDH, or the like).
  • the reaction rate (including both the enzyme reaction rate and the electron transfer rate (Vmax / Km)) when the sample solution is supplied is large.
  • Vmax / Km is about 2100. is there. Therefore, even when the concentration of gnorecose is low, the glucose reaction force S progresses at the maximum speed, and the amount of the reaction product generated per unit time is the same regardless of the glucose concentration.
  • the reaction system can be constructed in a substantially uniform liquid phase. Therefore, even when blood (sample) is used as a sample liquid, the response current value can be measured with good reproducibility without being significantly affected by blood cell components.
  • the biosensor using the Ru compound Since Ru compounds such as Ru complexes are stable in the oxidized form and therefore difficult to convert to the reduced form, the biosensor using the Ru compound has high storage stability and a small backround. For this reason, even if the glucose concentration is low and the glucose concentration is measured using a sample or a trace amount of sample, the measurement accuracy may not be reduced.
  • the glucose concentration measuring method has been described in combination with a glucose sensor and a concentration measuring device.
  • the glucose concentration measuring method according to the present invention uses a meter provided with an enzyme-immobilized electrode! / It is also possible to realize this.
  • a glucose sensor composed of a reagent layer by combining Ru complex and GDH or CyGDH has a high reaction rate (a short measurement time) even for a trace amount of analyte. ), Demonstrate that the measurement range is wide and excellent in reproducibility, and that it is not easily affected by hematocrit (Hct).
  • the glucose sensor As the glucose sensor, a sensor with a first electrode, a second electrode, a reagent layer, and a capillary formed on the grave (see Figs. 2 and 3) was used.
  • the first and second electrodes were formed by screen printing a carbon ink thereon and then drying.
  • the volume of the capillaries was basically set at 0.3. However, as for the effect of Hct in the specimen, we examined the case where the volume of capillaries was 0.4 L and 0.5 At L, as described later.
  • the reagent layer had a two-layer structure including an electron transfer layer and an enzyme-containing layer.
  • the electron transfer layer was formed by applying 0.4 ⁇ L of the first material liquid containing the electron transfer substance on the substrate, and then blowing and drying the first material liquid (30 ° C., 10% Rh).
  • the fermentation layer was formed by applying a second material liquid 0.3 containing oxidoreductase on the electron transport layer, and then drying the second material liquid with air (30. C, 10% Rh).
  • the first material liquid was prepared by mixing a liquid mixture obtained by mixing 1 to 1 of Table 1 in the following order in the order of 1 to 3 days, and then adding an electron transfer substance to the mixed liquid. No. 2
  • the material solution was prepared by dissolving oxidoreductase in 0.1% CHAPS.
  • Table 1 Composition of the first material liquid (excluding electron mediator) In Table 1, etc., S ⁇ is an abbreviation for Lucent Tight SW, and CHAPS is
  • 3- [(3- cholamidopropy ⁇ ) dimethylammonio] is an abbreviation for propanesulfonic acid, and is an abbreviation for ACESf ⁇ N- (2-acetamido) -2-aminoetanesulfonic acid.
  • the SWN used was “3150” manufactured by Corp Chemical Co., Ltd.
  • the CHAPS used was “KC062” manufactured by Dojinka ⁇ 1 Kissho
  • the ACES used was “ED067” manufactured by Dojinka ⁇ f Kissho.
  • the ACES solution was prepared to have a pH of 5.
  • ⁇ ⁇ (sample) whose glucose concentration and Hct value were adjusted to target concentrations was used. Hct values are adjusted to 42% unless otherwise specified.
  • the glucose concentration was adjusted to 103 ⁇ g / dL for the 0, 101, 412, 624, and 820 levels depending on the purpose of the test.
  • the response current value was determined by applying a constant potential (200 mV) between the first and second electrodes of the glucose sensor to the reagent layer in an amount corresponding to the capacity of the capillary (0.3 ⁇ m ⁇ , 0.5 ⁇ m).
  • the sample of L) was supplied, and measurement was performed after a lapse of a specified time (10 seconds for 5 seconds). [Evaluation of measurement range]
  • the measurement range was determined by measuring the response current value using samples with various glucose concentrations and plotting the plot points when the glucose concentration was set on the horizontal axis and the response current value was set on the vertical axis.
  • FIGS. 9A to 9D show the results for the response current value 10 seconds after the sample supply.
  • each plot point is shown as an average value after measuring the response current values for 10 gnorecourse sensors that were made the same.
  • the oxidoreductase and electron mediator were as shown in Table 2 below.
  • sensor numbers A-1 to B-3 and B-1 to B-3 are the DLC sensors of the present invention, and the others are glucose sensors for comparison.
  • the activity of oxidoreductase in Table 2 indicates the activity in the liquid phase reaction system when a sample is supplied to the capillaries to form a liquid phase reaction system. It shows the weight ratio of the electron transfer substance in the liquid phase reaction system.
  • the effect of Hct is to measure the response current value after a lapse of a certain period of time from the supply of samples using multiple samples with the same glucose concentration and different Hct values for multiple gnorecoses with the same reagent layer composition.
  • the glucose sensor sensors 1 to 3 of the present invention and a comparison sensor were used.
  • the capillary volume is set to 0.5 with the spacer thickness of 58 ⁇ m
  • the capillary volume is set with the spacer thickness of 44 ⁇ m.
  • FIGS. 10A to 10C The results when using the sensors 1 to 3 of the present invention are shown in FIGS. 10A to 10C, and the results when using the comparative sensor are shown in FIG. 10D.
  • the response current value when the Hct value is 42% is used as a reference, and the amount of deviation (Bias) from the measured value is shown on the vertical axis.
  • the horizontal axis represents time
  • the horizontal axis represents Hct values.
  • Each plot point in each figure is shown as an average value of five measurements, and each plot point in FIG. 10D is calculated based on the value 30 seconds after the supply of the sample.
  • the glucose sensor combining aGDH and Ru complex requires less glucose (2 wt%) to achieve higher glucose content.
  • gnorecose sensors E-1 to 3, F-1 to 3, G_3 to 3, Hl to 3 using Ferri as the electron mediator are shown in Figs. 7A to 7D and 9A to 9A.
  • D 3 ⁇ 4
  • the amount of enzyme is larger in the gnorecose sensors G-1-3 and Hl-3 using PQQGDH as the oxidoreductase.
  • the reaction rate of a system in which Ru and CyGDH are combined is inferior to the reaction rate, and is not practical.
  • Tables 3 to 8 the solubility of Ferri itself is poor, and the overall reproducibility is poor. From this point of view, practicality is lacking.
  • the comparative sensor is greatly affected by Hct even if the Hct value is large even after 30 seconds from the start of sample supply, and its Bias value is equivalent to the 5-second value of the sensor of the present invention. It is about. Therefore, the sensor of the present invention combining Ru complex and CyGDH:! To 3 can be measured in a short time even with a small amount of sample, and is not easily affected by Hct. Therefore, the combination of the Ru complex and CyGDH can reduce the amount of the sample and the measurement time, and can construct a glucose sensor that is hardly affected by Hct.
  • the measurement range is increased by constructing a reaction system in which a Ru complex is combined with a specific glucose dehydrogenase (cytochrome C bound or derived from a microorganism belonging to the genus Burkholderia). It is possible to measure a small amount of glucose and venom at a high accuracy, in a short time and with high accuracy, without much influence of hematocrit.
  • a specific glucose dehydrogenase cytochrome C bound or derived from a microorganism belonging to the genus Burkholderia

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Abstract

　本発明は、酵素と電子伝達物質とを含む反応系を利用してグルコース濃度を測定するための技術に関する。本発明では、酵素としてチトクロムCが結合されたグルコース脱水素酵素あるいはブルクホルデリア属に属する微生物に由来するグルコース脱水素酵素を使用し、電子伝達物質としてRu化合物を使用するグルコース濃度測定方法が提供される。本発明ではさらに、酵素としてチトクロムCが結合されたグルコース脱水素酵素あるいはブルクホルデリア属に属する微生物に由来するグルコース脱水素酵素を使用し、電子伝達物質としてRu化合物を使用したグルコースセンサが提供される。

Description

明 細 書 グルコース脱水素酵素を用いたグルコース濃度測定方法およびグルコースセンサ 技術分野
本発明は、 試料液 (たとえば血液などの生化学的試料またはこれの調整液)のグ ルコース濃度を測定するための技術に関する。 背景技術
糖尿病患者にとっては、 血糖値を管理するために日頃から自己の血糖値を把握 しておくことは重要である。 その一方、 頻繁に医療機関に足を運ぶのが煩わしこ と力ゝら、 患者自身力 S簡易に血糖値の測定を行え、 しかも出先などでも血糖値の測 定を手軽に行えるように、 手のひらに納まるようなサイズの携帯型の簡易血糖値 測定装置が用いられている。
携帯型の簡易血糖 ί直測定装置を使用する:^には、 酵素反応場を するダル コースセンサを血糖値測定装置に装着し、 グノレコースセンサに対して血液 (検体） を供給することにより血糖値の測定が行われる。 この 、 測定者の皮膚を切開 して血液を採取し、 この血夜を試料 ί夜としてグルコースセンサに供給する方法が 一般的に採用されている。 この方法では、 血液採取に対する測定者への負担を小 さくする観点からは、 採取すべき血液量が少ないほうが好ましいため、 少なレ、血 液 (検体)で血糖値を測定できるように様々な改良; ^検討されている。
グルコースセンサは、たとえば基板上に ¾t亟およひ ¾薬層を形成するとともに、 この試薬層を内部に収容した格好でキヤビラリを設けた構成とされる（図 2およ ぴ図 3参照)。試薬層は、酸化還元酵素と電子伝達物質とを含んだものとして構成 される力 酸化還元酵素としては GODや PQQGDH力 電子伝達物質としてはフエリシ ァンィ匕力リゥムが汎用されている（たとえば日本国特開 2000 - 65778号公報)。 この グルコースセンサでは、キヤビラリを利用して試薬層に検体が供給されたときに、 キヤビラリの内部に液相の反応系が構築される。 このとき、 酸化還元酵素によつ て、 たとえばグルコースの酸化反応が触媒される一方で、 電子伝達物質の還元反 応が触媒される。
これに対して、 簡易血糖値測定装置においては、 グノレコースセンサの電極を禾 IJ 用して、 反応系に対して «!£を印加することにより応答電流値が測定される。 こ の応答電流値は、たとえば還元型の電子伝達物質の量 (グルコース濃度に相関する 量)に起因するものであり、グルコース濃度を演算する際の基礎とされるものであ る。 グルコース濃度を演算する;^には、 クーロメトリ法あるいはアンべロメト リ法が採用される。 クーロメトリ法は、 検体中の殆ど全てのグルコースを反応さ せてから、 演算用の応答電流値の積算値を取得し、 積算値 （電量） に基づいてグ ルコース濃度を演算する方法である。 一方、 アンべロメトリ法は、 反応開始から 一定時間後に応答電流値を取得し、 この応答電流値に基づいてグルコース濃度を 演算する方法である。
GODは、 グルコースとの反応速度が小さレヽ (Km (ミカエリス赵女)が大きい）ため、 検体中の大部分のグルコースを反応させて演算用の電量を取得するクーロメトリ 法では測定時間が著しく長くなつてしまう。 そのため、 酸化還元酵素として GOD を用いて短時間でグルコース濃度を測定する には、 アンべロメトリ法が利用 されている。
しかしながら、 アンぺロメトリ法では、 グルコース濃度が小さい # ^には、 応 答電流値を取得する段階にぉレ、て酵素反応が殆ど終了してしまレ、かねず、 得られ る応答電流値が小さくなつて、 低濃度領域での測定精度が悪くなつてしまう。 微 量検体にぉレ、ては、 グルコースの絶対量が少なレ、ために同様な問題が生じうる。 このような不具合を解消するためには、 使用する酵素量を少なくすればよい。 し かしながら、酵素量が少ない ί には、グルコースの反応速度が小さくなるため、 一定以上のグノレコース濃度の検体にお！/、ては、 グルコース濃度の差がグルコース の反応量の差として優位に現れない。 その結果、 酵素量を少なくすれば、 高濃度 領域においては、 グルコース濃度の差を応答電流値の差として有意に得られず、 能が謝匕してしまう。 したがって、 アンべロメトリ法は、 測定レンジが小さ く、 微量検体の測定には不向きな方法であるとレヽえる。
さらに、 GODは、 電子伝達物質との反応性もさほど大きくない。 そのため、 測定 時間を短くするためには、 電子伝達物質を多量に用いる必要がある。 その結果、 W グルコースセンサ (正確には試薬層やキヤビラリ）の小型化が困難となり、 これに 応じて必要な検体量も多くなる。 この点からも、 GODを使用する方法は微量検体を 測定するのに不向きであるといえる。
これらの事情からすれば、 GODを使用するアンぺロメトリ法では、精度良くダル コースを測定できる検体量は、 最小で 0. 6 L、 測定時間にして最小で 15秒、 測定 レンジにしてグノレコース濃度が 10〜600mg/dLの範囲が限界であるといわれている。 その一方で、 酸化還元酵素として PQQGDHを採用した には、 クーロメトリ法 を採用すれば、 0. 3 Lの微量検体でも血糖値を測定することが可能となること力 S 知られている。 ところが、 クーロメトリ法は、 上述のように検体中の殆ど全ての グルコースを利用してグルコース濃度を演算する方法であるため、 アンぺロメト リ法に比べて、グルコース高濃度域では相対的に測定時間が長くなる傾向にある。 たとえば、 実用上必要とされる最低限の測定レンジ (10〜600mg/dL)を確保するた めには、 測定時間を 15〜30秒は確保する必要がある。
測定時間を短くするためには、 試薬層における酵素や電子伝達物質の含有量を 多くすることも考えられるが、 この には、 試薬層の溶解性が割匕する。 その ため、 キヤビラリに検体を供給したときに、 キヤビラリにおレ、て均一な液相の反 応系を構築するのが困難となる。 その結果、 グルコースセンサ毎 (測定毎)の溶解 の の差に起因して再現性が 匕し、 あるレ、は血液中の血球成分の影響を受け やすくなるなどして、 測定精度が 匕するといつた問題が生じる。 とくに、 フエ リシアン化力リゥムは血液に対する溶解性が小さいため、 電子伝達物質としてフ ェリシアン化力リゥムを使用する ¾ ^には、測定精度の割匕が顕著となる。また、 フエリシアン化力リゥムは、保存安定性が悪く、容易に還元体へと樹亍するため、 含有量が多くなるとバックグラウンドの増大につながり、 今度はグルコース低濃 度域の測定精度が低下する。 発明の開示
本発明は、 測定レンジを大きく確保しつつも、 短時間力 精度良く、 微量検体 を測定できるようにすることを目的としている。
本発明の第 1の側面にぉレ、ては、 酵素および電子伝達物質を含む反応系を利用 してグルコース濃度を測定する方法であって、上記酵素としてチトクロム Cが結合 されたグルコース麻素酵素を使用し、 上記電子伝達物質として Ru化合物を使用 する、 グルコース濃度測定方法が «される。
チトクロム Cとしては、ブルクホルデリア属に属する微生物に由来するものを使 用するのが好ましレ、。チトクロム Cとしては、還元条 {匕での SDS -ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動にぉレ、て分子量が約 43kDaであるものを使用すること力 Sできる。 本発明の第 2の側面にぉレ、ては、 酵素および電子伝達物質を含む反応系を利用 してグルコース濃度を測定する方法であって、 上記酵素としてブルクホルデリア 属由来のグルコース 素酵素を使用し、 上記電子伝達物質として Ru化合物を使 用する、 グルコース ΕτΚ素酵素を用いたグルコース濃度測定方法が樹共される。 本発明に係るグルコース濃度測定方法では、 たとえば反応系に対して刺激を与 える一方で、 この刺激に対する応答を検出し、 この応答の検出量に基づいてダル コース濃度が演算される。 この 、 刺激は、 たとえば として与えられ、 応 答は、 電流あるいは光学的特性として得られる。
本発明の第 3の側面においては、 第 1および第 2慰亟と、 酵素および電子伝達 物質を含んだ 層と、 を備え、 上記試薬層に対してグルコース溶液を供給して 反応系を構築するとともに、 この反応系に対して上記第 1および第 2電極を利用 して刺激を与えるように構成されたグルコースセンサであって、 上記酵素として チトクロム Cが結合されたグルコース 素酵素を使用し、上記電子伝達物質とし て、 Ru化合物を使用したことを 敫とする、 グルコースセンサが される。 チトクロム Cとしては、ブルクホルデリア属に属する微生物に由来するものを使 用するのが好ましレ、。チトクロム Cとしては、還元条ィ^匕での SDS -ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動にぉレ、て分子量力 S約 43kDaであるものを使用することができる。 本発明の第 4の側面においては、 第 1および第 2電極と、 酵素および電子伝達 物質を含んだ試薬層と、 を備え、 上記試薬層に対してグルコース溶液を供給して 反応系を構築するとともに、 この反応系に対して上記第 1およぴ第 2電極を利用 して刺激を与えるように構成されたグルコースセンサであって、 上記酵素として ブルクホルデリァ属由来のグルコース! ^素酵素を使用し、 上記電子伝達物質と して Ru化合物を使用したことを糊敷とする、 グルコースセンサが «される。 本発明では、グルコース τΚ素酵素として、グルコース fck素酵素活性を有し、 力つ還元条 f 匕での SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、 分子量が約
60kDaであるひサブュニットを有するものを使用することができる。グルコース脱 水素酵素は、 還元条件ィ匕での SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、 分 子量が約 14kDaである γサブュニットを有するものであってもよい。
本発明では、 Ru化合物として、 たとえば下記化学式に示す錯体を使用すること ができる。
[Ru(NH3) 5X] n+
上記化学式における Xとしては、 NH3、 ハロゲンイオン、 CN, ピリジン、 ニコチ ンアミド、 または 0が挙げられる。 例示したもののうち、 Xが NH3またはハロゲン イオンである Ru錯体を使用するのが好ましレ、。 一方、 化学式における n +は、 X の種類によつて決定される Ru錯体の価数を示してレ、る。
Ru錯体は、 還元型（Π)が不安定なために通常は酸化型 (ΠΙ)として存在する。 そ のため、 たとえばグルコースセンサの試薬層に酸化型の Ru錯体を混在させた状態 で光や水に曝露されたとしても、 容易には還元されない。 また、 Ru錯体は結晶化 しにくく、 微粉末状態を適切に維持することができるとレヽつた特性をも有してレヽ る。 この点からは、 Ru錯体は溶解性が高いといえる。 したがって、 曝露耐性や保 存安定性などを考慮した^ \ 試薬層に対しては、 酸化型として Ru錯体を含ませ' るのが好ましい。
本発明のグルコースセンサは、 たとえば試薬層が設けられ、 カゝっ試料液をィ：^ するための液保持空間をさらに備えたものとして構成される。 この^、 試薬層 は、 固層として構成されるとともに、 液保持空間に試料液を保持した状態では、 酸化還元酵素および電子伝達物質の少なくとも一部が試料液に溶解するように構 成される。 つまり、 グルコースセンサは、 試»給後においては、 液保持空間内 において、 グルコース、 酸化還元酵素および電子伝達物質により液相として反応 系が構築されるように構成するのが好ましい。
液麟空間の容量は、微量試料液を測定できるように、 たとえば 0. 1〜0. 5 L に設定される。 この 、試薬層における酸化還元酵素の含有量は、 たとえばグ ルコース »素酵素活性 1. 0〜10. 0Uに相当する量とされる。酵素 1単位 (U)は、標 定条件 (pH6. 0、 37°C)の下で DCIP (2， 6 -ジクロ口フエノルインドフエノル）の還 元にもとづく退色を、 DCIPの吸収波長である 600nmにお!/ヽて経時的に計測したとき に、 1分ごとに 1 μΜグルコースを酸化する量 (モル吸光係数は 4· 76 X 1000 M /cm) として定義した。 一方、 試薬層における電子伝達物質の含有量は、 たとえば液保 持空間力 S試料液で満たされたときの電子伝達物質の濃度に猶して 1. 0〜5. 0wt% に相当する量とされる。
液麟空間は、たとえば毛細管力により試料液を移動させるように構成される。 本発明でレ、うブルクホルデリァ属に属する微生物は、 グルコース 素酵素活 个生を有する αサブュニット、 またはチトクロム C ( ]3サブュニット）を含む酵素 (以 下、単に「GDH」ということがある）を産出できるものであれば特に限定されないが、 その中でもブルクホルデリァ'セパシァ、 とくにブルクホルデリァ 'セパシァ KS1 株 (以下、 単に「KS1株」ということがある）が好ましい。 KS1株は、 ί 付近の土壌 力、ら分離した新規菌株であるが、 その菌学的性質からブルクホルデリァ ·セパシ ァであると同定されており、 平成 12年 9月 25日に独立行政法人産業技術総合研究 所特許生物寄託センター（〒 305-8566 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 )に微生物受託番号^ FERM BP - 7306として寄託されている。 KS1株は、 a サブュュット（分子量約 60kDa)、 βサブュ-ット（チトク口ム Cに相当） （分子量約 43kDa)および γサブュニット（分子量約 14kDa)を含む GDHを産出することができる。 ただし、 分子量は、 還元条件下での SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい て測定したものである。
チトクロム C ( サブュ-ットを含む)は、電子伝達タンパク質であり、電子伝達 速度を向上させる観点からは、 グルコース脱水素酵素活性を有するサブュニット ( αサブュニットを含む）に対して、チトクロム Cを結合させた形で、 GDH (以下、単 に「CyGDH」 ということがある）として使用するのが好ましレ、。 チトクロム ま、 ブ ルクホルデリア属に属する微生物に由来するもの（j3サブユニット）に限らず、 グ ルコース J!feK素酵素活性を有するサブュニットに結合し、 電子伝薪幾能を発揮で きる限りにおレ、ては、 他の微生物や生体細胞に由来するものであってもよい。
αサブュニットは、 既述のようにグルコース脱水素酵素活' I生を有するものであ る。 αサブュニットと γサブュ-ットと力らなる GDH (以下、単に「ひ GDHJというこ とがある）は、 γサブユニットを有しない GDmこ比べて、 グルコースとの反応速度 が大きい (Vmax/Kmが大きい)。 この点については、本発明者らによって βされて いる。 したがって、 グルコースとの反応速度を大きくする観点からは、 ひサブュ ニットを使用する^^には、 αサブュ-ットに対して Ίサブュニットを結合させ た形で、 GDHとして使用するのが好ましい。
なお、 本願の特許請求の範囲においては、 由来菌によりひサブユニッ ト、 チト クロム C( j3サブュニット）あるいは 0 /サブュニットを特定することがある力 これ は各サブユニットを特定するための便法に過ぎない。 すなわち、 目的とするサブ ュニットの発現コードを含むベクターを宿主に移入し、 この宿主から産出される GDHをグルコース脱水素酵素として使用する場合であっても、相違点が GDH (サブュ ニット）の起源のみしかなレヽときには、本発明の技術的範囲に属することを念のた めにここで しておく。 図面の簡単な説明
図 1は、 濃度測定装置に対して本発明に係るグルコースセンサを装着した状態 を示すものであり、 濃度測定装置についてはブロック図で、 グルコースセンサに っレヽては平面図で示したものである。
図 2は、 グルコースセンサの一例を示す全体斜視図である。
図 3は、 図 2のグルコースセンサの分解斜視図である。
図 4は、 グルコース濃度の測定において、 第 1および第 2電極間に印加する電 圧値、 および応答電流値の経時的変ィ匕の一例を示すグラフである。
図 5は、 グルコース濃度の測定にぉレ、て、 第 1および第 2電極間に印加する電 圧値、 および応答電流値の経時的変ィ匕の他の例を示すダラフである。
図 6 Α〜図 6 Dは、 Ru錯体を用レ、て試薬層を構成した:^にお!/、て、 ダルコ一 ス濃度と反応開始 5秒後の応答電流値との関係を示すグラフである。
図 7 A〜図 7 Dは、 鉄錯体を用いて試薬層を構成した において、 ダルコ一 ス濃度と反応開始 5秒後の応答電流値との関係を示すグラフである。
図 8 A〜図 8 Dは、 Ru錯体を用いて試薬層を構成した場合において、 ダルコ一 ス濃度と反応開始 10秒後の応答電流値との関係を示すグラフである。 図 9 A〜図 9 Dは、 鉄錯体を用いて試薬層を構成した場合において、 ダルコ一 ス濃度と反応開始 10秒後の応答電流値との関係を示すグラフである。
図 10A〜図 10Dは、へマトクリット（Hct)の影響を、反応開始から特定時間経過 後の Bias (Hct42%基準）として評価したグラフである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施するための最良の形態について、 図面を参照して具体的に 説明する。
図 1に示した濃度測定装置 1は、 本発明に係るグルコースセンサ 2を用いて、 血液などのグノレコースを含む試料液中のグノレコース濃度を測定するためのもので ある。 この濃度測定装置 1は、 ®£印加部 3、 電流値測定部 4、 検知部 5、 制御 部 6、 演算部 7および表示部 8を備えて大略構成されている。
グルコースセンサ 2は、 使レ、捨てとして構成されたものであり、 図 2および図 3に良く表れているように、カバー板 20、スぺーサ 21および 反 22を有している。 カバー板 20には穴部 23が設けられており、 スぺーサ 21には穴部 23に連通すると ともに先端部 24 aが開放した細幅なスリット 24が設けられている。 カバー板 20お よびスぺーサ 21が基板 22の上面 22 aに積層された状態では、 スリツト 24によりキ ャビラリ 25が規定されている。 このキヤビラリ 25は、 その容量が、 たとえば 0. 1 〜0. 5 μ Lに設定されており、 スリット 24の先端開口部 24 aおよび穴部 23を介して 外部と連通している。 先端開口部 24 aは試料液導入口 25 aを構成しており、 この 試料液導入口 25 a力、ら供給された試料液は、 毛細管現象により穴部 23に向けてキ ャビラリ 25內を進行する。
基板 22の上面 22 aには、 第 1電極 26、 第 2獻亟 27、 およひ 薬層 28が設けられ ている。
第 1および第 2 ¾¾26，27は、全体として簾 22の長手方向に延びており、それ らの端部 26 a , 27 aが基板 22の短手方向に延ぴている。基板 22の上面 22 aは、第 1 および第 2電極 26， 27の端部 26 a， 26 b , 27 a , 27 bが露出するようにして絶縁膜 29により覆われている。
試薬層 28は、たとえば固形状であり、第 1および第 2電極 26， 27の端部 26 a , 27 a間を橋渡すようにして設けられている。 この試薬層 28は、 たとえば相対的に多 量の酸化型の Ru化合物 (電子伝達物質)およぴ相対的に少量の GDH (グルコース脱水 素酵素）を含んでいる。 試薬層における GDHの含有量は、 たとえばグルコース ½ 素酵素活性 1. 0〜： 10. 0Uに相当する量とされ、試薬層における Ru化合物の含有量は、 たとえばキヤビラリ 25が試料液で満たされたときの Ru化合物の濃度に して 1. 0〜5. (^セ％に相当する量とされる。
酸化型の Ru化合物は、 電子伝達体として機能すればよいが、 たとえば下記化学 式で示される Ru錯体を使用するのが好ましい。
[Ru(NH3) 5X] n+
上記ィ匕学式における Xとしては、 NH3、 ハロゲンイオン、 CN、 ピリジン、 ニコチ ンアミド、 または ¾0が挙げられる。 例示したもののうち、 Xが NH3またはハロゲン イオンである Ru錯体を使用するのが好ましレヽ。 一方、 ィ匕学式における n +は、 X の によつて決定される Ru錯体の価数を示している。
試薬層 28では、 GDHに対して、 Ru化合物の比率が大きくされており、 Ru化合物が 試薬層 28の溶解性に与える影響は大きい。 その一方で、 Ru化合物として化学式で 示した Ru錯体は、 結晶化しにくく、 微粉末の状態を適切に維持でき、 溶解性の高 いものである。 したがって、 試薬層 28は、 全体として溶角針生が高く、 血液の供給 によって容易に溶解するものとされている。そのため、グノレコースセンサ 2では、 キヤビラリ 25の容積を上述した範囲のように小さく設定したとしても、 血液が供 給されたときに、 キヤビラリ 25內において略均一な液相の反応系を適切に構築す ることができるようになる。
一方、 GDHとしては、グルコース 素酵素活性を有するサブュニットに対して 電子伝達たんぱく質であるチトク口ム Cを結合させたもの使用するのが好ましい。 ' グルコース 素酵素活性を有するサブユエットゃチトク口ム Cは、たとえばプル クホルデリァ属に属する微生物、 たとえばブルクホルデリァ ·セパシァ KS1株に由 来するものを使用するのが好ましい。 もちろん、 グルコース脱水素酵素活性を有 するサブュニットゃチトクロム Cは、ブルクホルデリア属に属する微生物に限らず、 目的とする機能が発揮できる範囲において他の微生物や生体細胞に由来するもの であってもよいし、 目的とするサブュニットの発現コードをブルクホルデリア属 に属する微生物から取得するとともに、 この発現コードを含むベタターを宿主に 移入し、 この宿主から産出させたものであってもよい。
微生物としてブルクホルデリァ属に属する KS1株を用いる:^には、グルコース 素酵素活性を有するサブュエツトは分子 60kDaである αサブユニットと して得られ、チトクロム Cは分子爆勺 43kDaである βサブュニットとして得られる。 この KS1株では、 （¾サブユニットおよび /3サブユニットに対して、 分子 4^14kDa である 0 /サブュニットが結合した GDHが産出される。 ただし、分子量は、還元条件 下での SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動にお！/、て測定したものである。 この グルコースとの反応速度を大きくする観点からは、 cサブユニットに対し て γサブュニットを結合させた aGDHを使用するのが好ましレ、。一方、電子伝達速 度を向上させる観点からは、 aGDHに対して サブユエット（チトクロム C)を結合 させた CyGDHを使用するのが好ましい。
図 1に示した mil印加部 3は、 第 1電極 26の端部 26 bと第 2電極 27の |¾7 b との間に定電圧を印加するものである。 ¾Ε印加部 3は、 グルコースセンサ 2を グルコース濃度測定装置 1に設けられた装着部 (図示略)に装着することにより、 第 1およぴ第 2翻虫子 3 a , 3 bを介して、 グノレコースセンサ 2の端部 26 b， 27 b と導通するようになっている。 印加部 3としては、 たとえば乾電池や充電池 などの直流 原が使用される。
電流値測定部 4は、 反応系に文汁る蔽印加時に、 たとえば還元型の Ru化合物 カゝら放出された電子の量に相関する応答電流値を測定するものである。
検知部 5は、 グルコース濃度測定装置 1にグルコースセンサ 2が装着された後 において、 試薬層 28に試料液が供給され、 グルコース濃度の測定が可能になった 力 かを検知するものである。
制御部 6は、 印加部 3を制御し、第 1および第 2電極 26, 27の間に Eが印 カロされる状態 (閉回路）と印加されない状態 (開回路）とを選択するものである。 演算部 7は、 電流値測定部 4により測定された応答電流値に応じて、 試科液中 のグルコース濃度の演算を行うものである。
なお、検知部 5、制御部 6および演算部 7のそれぞれは、たとえば CPUおよ Ό¾0Μ や画などのメモリにより構成される力 検知部 5、制御部 6および演算部 7の全 てを、 1つの CPUに対して複数のメモリを接続することにより構成することもでき る。また、演算部 7による演算結果は、表示部 8により表示される。表示部 8は、 たとえは LCDなどにより構成される。
次に、 試料液中のグルコース濃度測定の手順を図 1なレ、し図 3に加えて、 図 4 および図 5をも参照しつつ説明する。
図 1に良く表れて 、るように、 まずグルコース濃度測定装置 1にグルコースセ ンサ 2をセットする。 そうすると、 グルコースセンサ 2の第 1慰亟 26の體 6 b が濃度測定装置 1の第 1撤虫子 3 aと撤虫し、 第 2電極 27の端部 27 bが第 2翻虫 子 3 bと撤虫する。先にも触れたように、 この状態では第 1および第 2 i亟 26， 27 が mis印加部 3に導通可能とされている。 実際の測定においては、 グルコースセ ンサ 2に試料液を供給する以前から、 制御部 6の制御に基づレ、て、 印加部 3 により第 1および第 2慰亟 26, 27間に定 MEが印加されている。印加 ®ΐ値は、た とえば 100〜500mVの範囲に設定される。
次いで、 グノレコースセンサ 2の試料液導入口 25 aを介して血液などの試料液を 供給する。 試料液は、 毛細管現象によりグルコースセンサ 2のキヤビラリ 25内を 進行する。 その過程において、 試料液により試薬層 28が溶解されて、 液相の反応 系が構築される。反応系においては、たとえば GDHによりグルコースが酸化される とともに Ru化合物が還元型とされる。
2つの端部 26 b , 27 bを介して第 1および第 2電極 26， 27間に定電圧を印加した 状態では、 試薬層 28に存在する還元型の Ru化合物が第 1電極 26の端部 26 a側に移 動し、 この端部 26 aに電子を放出して酸化型の Ru化合物となる。 したがって、 電 圧印加部 3により第 1および第 2電極 26, 27間に定 mffiを供給した状態では、還元 型の Ru化合物から付与された電子の量が第 1電極 26および第 1翻虫子 3 aを介し て電流値測定部 4におレ、て応答電流として測定される。
一方、 電流値測定部 4において測定された応答電流値は、 検知部 5においてモ ユタリングされており、 図 4に示したように、応答 ¾ ^値が閾値 I (たとえば 0. 1 〜3. 0 )を超ぇた時点 で、 検知部 5は試薬層 28に試料液が供給され、 試薬層 28が溶解したことを検知する。
検知部 5において試料液が供給されたことが検知された: ^には、 電流値測定 部 4は、 この検知から一定時間 (たとえば 12— t。が 10秒以下、 さらに好ましくは 5秒以下)の経過時点 2における演算用の応答電流値 1 2を測定する。
なお、 図 5に示したように、 検知部 5におレ、て試料液が供給されたことが検知 されてから一定時間 (たとえば 一 t。が 10秒以下、 さらに好ましくは 3秒以下） が経過する時点 t iまで Mi£の印カ卩をー且中止してもよい。その上で、時点 1 1から Mffiを再印加する一方で、この再印加から一定時間（たとえば t - t iが 3秒以上、 さらに好ましくは 3秒〜 5秒)が経過する時点 t 2における応答電流値を演算用の 応答電流値 1 2として採用してもよい。
一方、 演算部 7では、 演算用の応答電流 "に基づいて、試料液中のグノレコース 濃度を演算する。グルコース濃度の演算は、応答電流値を mm値に娜した後に、 この ®ΐ値を、 予め作成しておいた HE値とグルコース濃度との関係を示す検量 線に当てはめることにより演算される。 検 線は、 たとえばデータ化されて演算 を剪亍するプログラムとともに ROMに格納されてレ、る。
本実施の形態では、 Ru化合物と、特定の GDH( o;GDHや CyGDHなど）と、 を組み合わ せて試薬層 28が構成されている。 このような試薬層 28では、 試料液を供給したと きの反応速度 (酵素反応速度および電子伝達速度 (Vmax/Km) の双方を含む)が大き く、 たとえば CyGDHでは Vmax/Kmが約 2100 である。 そのため、 グノレコース濃度が 小さレ、 であっても、 最大速度でグルコース反応力 S進行し、 単位時間当たりに 生成される反応生成物の量はグルコース濃度の大小に関わらず同じとなる。また、 グルコース濃度力 Sl000mg/dL¾gであっても、 1秒未満全てのグルコースとの反応 が終了し、 検体量が少なくても多くの反応生成物が得られるため、 グルコース濃 度の大きさに関わらず、 短時間でエンドポイントに ¾1 "ることができる。 その結 果、 後述する実施例から明らかとなるが、 測定纖となる試料液 (たとえば血液） の量を少なくしつつも、測定時間（図 4および図 5の t 2— t。）を短く設定できる。 その上、 グルコース濃度が大きい微量検体を測定する： ^であっても、 同一濃度 のグルコース濃度を複数回測定した場合における応答電流値のパラツキが小さく、 測定レンジの幅も大きく確保できるようになる。
上述したように、 試薬層 28が溶解性の高いものとされているため、 微量試料を 測定するためにキヤビラリサイズが小さくされている:^であっても、 試料液の 供給時にキヤビラリ 25におレ、て、略均一な液相の反応系を構築することができる。 そのため、試料液としての血液 (検体)を使用する においても、 血球成分の影 響をさほど受けることなく、 再現性良く応答電流値を測定することができる。
Ru錯体などの Ru化合物は酸化型が安定であるために還元型へとは樹亍しにくい ため、 Ru化合物を用レヽたバイォセンサは保存安定性が高く、 バックダラゥンドが 小さレ、。 そのため、 グルコース濃度が小さレ、試料や微量試料を用いてグルコース 濃度を測定する であっても、 測定精度が 匕することもなレ、。
本実施の形態では、グルコースセンサと濃度測定装置との組み合わせにおいて、 グルコース濃度の測定方法を説明したが、 本発明に係るグルコース濃度の測定方 法は、 酵素固定化電極を備えたメータを用！/ヽて実現することも可能である。
以下においては、 酵素反応を利用したグルコース濃度の測定において、 Ru錯体 とひ GDHまたは CyGDHを組み合わせて試薬層を構成したグルコースセンサは、 微量 検体であっても、 反応速度が大きく（測定時間が短く）、 測定レンジが広くて再現 性に優れ、 へマトクリット（Hct)の影響を受けにくいことを実証する。
〈グノレコースセンサの作成〉
グルコースセンサとしては、 墓上に、 第 1電極、 第 2電極、 試薬層、 および キヤビラリが形成されたもの（図 2および図 3参照）を使用した。 第 1および第 2 電極は、 上にカーボンィンクをスクリーン印刷した後に乾燥させることによ り形成した。 キヤビラリの容積は、 基本的には 0. 3 に設定した。 ただし、 検体 中の Hctの影響については、 後述するようにキヤビラリの容積を 0. 4 Lおよび 0. 5 At Lとしたものについても検討した。試薬層は、電子伝達層および酵素含有層から なる 2層構造とした。電子伝達層は、基板上に電子伝達物質を含む第 1材料液 0. 4 μ Lを塗布した後に第 1材料液を送風乾燥 (30°C, 10%Rh)することにより形成した。 酵 有層は、 電子伝達層上に、 酸化還元酵素を含む第 2材料液 0. 3 を塗布し た後に第 2材料液を送風乾燥 (30。C, 10%Rh)することにより形成した。
第 1材料液は、 下記表 1の①〜④を番^ ®りの順序で混合した混合液を 〜 3 日繊した後、 この混合液に電子伝達物質を添口することにより調製した。 第 2 材料液は、 酸化還元酵素を 0. 1%CHAPSに溶解させることにより調製した。
電子伝達物質としては、 [Ru (NH3) 6] Cl3 (Aldrich製）（以下、 単に「Ru」あるいは「Ru 錯体」という）または K3[Fe(II) (CN) 6] (ナカライテスタ㈱製「28637 - 75」）（以下、 単 に「Ferri」という）を使用し、 酸化還元酵素としては、 CyGDH、 a GDHまたは PQQGDH を使用した。 上述したように、 CyGDHは、 αサブュュット、 サブユニットおよび γサブユニットからなり、 ひ GDHは、 αサブユニットおよび γサブユニットからな るものである。 PQQGDHは PQQ (ピロ口キノリンキノン）を補酵素とするものである。
表 1：第 1材料液の組成 (電子伝達物質を除く）
Figure imgf000015_0001
表 1などにぉレ、て、 S丽はルーセントタイト SW の略号であり、 CHAPSは
3-[ (3 - cholamidopropy丄) dimethylammonio] propanesulfonic acidの略号であり、 ACESf^N- (2-acetamido) -2-aminoetanesulf onic acidの略号である。 SWNとしては コープケミカル㈱製「3150」を使用し、 CHAPSとしては同仁化^ 1究所製「KC062」を 使用し、 ACESとしては同仁化^ f究所製「ED067」を使用した。 なお、 ACES溶液は pH . 5となるように調製した。
〈グノレコース渐夜の調製〉
グルコース溶液としては、グルコース濃度およひ Hct値が目的濃度に調製された ^ώί (検体)を用いた。 Hct値は、特段の限定がない限りは 42%に調整している。 グ ルコース濃度は、 試験目的に応じて、 0、 101、 412、 624、 820あるレヽは 103½g/dL に調整した。
(^答電流 ί直の測定〉
応答電流値は、 グルコースセンサの第 1および第 2電極の間に定電位 (200mV) を印加した状態で、 試薬層にキヤビラリ容積に応じた量 (0. 3 レ ΟΛ μ Ι, 0. 5 μ L)の検体を供給し、 この検体供給から特定時間（ 5秒あるレ、は 10秒)の経過後に測 定した。 [測定レンジの評価]
測定レンジは、 種々のグルコース濃度の検体を用レ、て応答電流値を測定した上 で、 グルコース濃度を横軸に、 応答電流値を縦軸に設定したときのプロット点の
¾/線性から評価した。 検体の供給から 5秒後の応答電流値に関する結果を図 6 A 〜図 6 Dおよび図 7 A〜図 7 Dに、 検体の供給から 10秒後の応答電流値に関する 結果を図 8 A〜図 8 Dおよび図 9 A〜図 9 Dにそれぞれ示した。 これらの図にお いては、 各プロット点は、 同一ネ冓成とされた 10個のグノレコースセンサについて応 答電流値を測定した上で、 その平均値として示してある。 本評価で使用したグル コースセンサにぉレ、ては、 酸化還元酵素および電子伝達物質に関しては下記表 2 に示した通りとした。 表 2においては、 センサ番号 A-l〜3， B - 1〜3が本案のダル コースセンサであり、 その他は比較のためのグルコースセンサである。 表 2にお ける酸化還元酵素の活性は、 キヤビラリに検体を供給して液相反応系を構成した 場合における当該液相反応系での活性を表しており、 電子伝達物質の含有量は、 上記液相反応系における電子伝達物質の重量比率を表している。
表 2 :センサの構成
Figure imgf000016_0001
[再現性の評価]
再現性は、 同—条件下（グルコースセンサの構成および検体の濃度が同一)での 測定値のバラツキにより評価した。 ノ ラツキは、 相対標準偏差 (C. V. )により評価 した。 C. V.は、 図 6〜図 9における各プロット点を計算する際の基礎となる 10個 の測定データに基づレ、て計算した。 5秒値にっレ、ての結果を表 3ないし表 5に、 秒値につ！/、ての結果を表 6な！/ヽし表 8にそれぞれ示した。
表 3
[再現性] G. V. (%)： (電子伝達物質 8wt9«、 応答電流 5秒値) センサ 試薬層の グルコース濃度 （mg/dL)
so.
組成 0 101 412 624 820 1034
A - 3 Ru8%-Cy2U 6.7 1.2 1.4 3.6 0.7 3.5
Β-3 Ru8 -a;2U 9.4 3.5 1.5 1.3 2.5 1.8
C-3 Ru8%-PQQ2U 6.1 11.1 11.9 13.2 8.0 8.8
D-3 Ru8%-PQQ20U 18.1 2.1 0.9 5.0 13.8 7.6
E - 3 Ferri8%-Cy2U 5.0 6.7 4.4 2.1 5.3 2.3
F-3 Ferri8°/o-a?2U 11.1 5.7 4.3 3.3 7.1 3.6
6-3 Ferri8 -PQQ2U 6.0 3.0 7.7 10.6 3.7 9.6
H-3 Ferri8%- PQQ20U 12.9 7.2 2.3 1.9 1.3 2.9 ほ現性] G. V. (%)： (電子伝達物質 4 wt%、 応答電流 5秒値) センサ 試薬層の グルコース濃度 （mg/dL)
番 組成 0 101 412 624 820 1034
A-2 Ru4 -Cy2U 8.9 2.2 1.0 1.9 2.9 3.8
R I—ク Ru4 -af2U 8.9 1.5 3.1 2.3 2.4 6.8
G-2 Ru4%-PQQ2U 12.4 9.2 5.3 14.5 23.1 11.2
D - 2 Ru4%-PQQ20U 10.5 1.4 2.8 5.1 6.0 6.1
E-2 Ferri4 -Cy2U 11.0 2.9 1.8 2.2 1.6 2.7
F-2 Ferri4 -Qf2U 11.0 10.5 5.4 6.0 28.0 6.3
G-2 Ferri4%-PQQ2U 6.5 6.0 12.5 4.4 8.2 3.9
H-2 Ferri4%-PQQ20U 4.9 8.0 5.8 5.4 9.5 22.9
[再現性] C. V. (o/o)： (電子伝達物質 2wt%、 応答電流 5秒値) センサ 試薬層の グルコース濃度 （mg/dL)
so.
奋"^ 組成 0 101 412 624 820 1034
A-1 Ru2%-Cy2U 17.2 2.0 1.0 1.0 2.2 3.7
B-1 Ru2%-Qf2U 22.4 1.6 1.8 9.3 7.1 13.0
C-1 Ru2 -PQQ2U 11.1 7.6 23.5 15.8 8.1 32.1
D - 1 Ru2%-PQQ20U 8.6 1.8 2.2 6.1 9.0 4.7
E-1 Ferri2%-Cy2U 10.4 2.3 2.0 22.8 37.6 39.1
F-1 Ferri2°/o-a2U 15.8 4.7 33.8 36.0 41.4 16.6
G-1 Ferri2%-PQQ2U 5.0 6.9 5.3 10.2 12.7 6.9
H-1 Ferri2%-PQQ20U 6.5 6.4 11.9 8.7 39.2 28.4 表 6
[再現性] C V. (%) ©電子伝達物質 8 wt%、 応答電流 10秒値)
Figure imgf000018_0001
表 7
[再現性] C V. (%)： (電子伝達物質 4wt96、 応答電流 10秒値) センサ 試薬層の グルコース濃度 （mg/dL)
組成 0 101 412 624 820 1034
Α-2 Ru4%-Cy2U 10.6 2.0 2.6 2.1 2.1 2.1
Β-2 Ru4%- 2U 10.4 1.5 3.4 2.4 3.0 3.2
C-2 Ru4 -PQQ2U 13.5 5.2 5.1 14.5 21.8 10.7
D-2 Ru4%-PQQ20U 10.4 2.6 2.8 2.6 5.4 4.5
E-2 Ferri4%-Cy2U 7.0 2.9 2.9 2.1 2.0 2.2
F - 2 Ferri4%-a2U 6.6 5.5 5.1 6.1 35.8 21.0
G-2 Ferri4 -PQQ2U 4.1 3.7 9.8 3.7 7.7 4.7
H-2 Ferri4%-PQQ20U 2.8 3.6 2.1 5.1 4.9 31.2
表 8
ほ現性] c. v. (%)： (電子伝達物質 2 wt96、 応答電流 10 mm センサ 試薬層の グルコース濃度 （mg/dL)
番号 組成 0 101 412 624 820 1034
A - 1 Ru2%-Cy2U 18.7 3.6 1.5 1.0 1.8 1.7
B-1 Ru2%- 2U 21.4 2.2 0.9 3.2 28.0 31.8
G-1 Ru2%-PQQ2U 13.0 7.0 22.5 16.7 8.6 30.3
D-1 Ru2%- PQQ20U 12.8 1.3 1.5 2.7 3.9 2.3
E-1 Ferri2 -Cy2U 6.9 0.9 2.0 27.8 48.3 44.6
F-1 Ferri2%— 2U 10.5 3.2 18.8 19.1 39.9 22.9
6-1 Ferri2%-PQQ2U 3.8 4.2 5.4 8.7 11.9 7.8
H-1 Ferri2 -PQQ20U 8.4 13.3 14.6 16.5 38.5 30.6 [検体中の Hctの影響の検討]
Hctの影響は、試薬層の組成が同一の複数のグノレコースについて、グルコース濃 度が同一で Hct値が異なる複数の検体を用いて、検体供給から一定時間経過後の応 答電流値を測定することにより行った。 グルコースセンサとしては、 本案センサ 1〜 3および比較センサを使用した。本案センサ 1では、スぺーサの厚みを 58 μ m としてキヤビラリ容積 (検体量)を 0. 5 しに設定し、 本案センサ 2では、 スぺーサ の厚みを 44 μ mとしてキヤビラリ容積 (検体量)を 0· 4 μ Lに設定し、本案センサ 3は、 スぺーサの厚みを 33 μ ηιとしてキヤビラリ容積 (検体量)を 0. に設定した。本案 センサ 1〜 3では、 試薬層における CyGDHの含有量を 2· 0U相当量、 [Ru (NH3) 6] Cl3 の含有量を 4 wt% (電子伝達物質の濃度に換算して）とした。 一方、 比較センサと しては、 アークレイ㈱製の簡易血糖値測定機ダルコカード専用センサを用いた。 このセンサは、 酸化還元酵素として GODを、 電子伝達物質として Ferriを用いたも のである。
本案センサ 1〜 3を用レ、たときの結果は図 10 A〜図 10 Cに、 比較センサを用レヽ たときの結果は図 10Dに示した。図 10A〜図 10Dにおレ、ては、 Hct値が 42%のとき の応答電流値を基準とし、 この測定値に対するずれ量 (Bias)を縦軸として表して ある。図 10 A〜図 10 Cにおいては横軸を時間、図 10Dにおいては横軸を Hct値とし て表している。 なお、 各図における各プロット点は、 5回の測定の平均値として 示してあり、 図 10Dにおけるプロット点は、 検体の供給から 30秒後の値に基づい て計算したものである。
[評価結果の考察]
酵素として CyGDH、電子伝達物質として Ru錯体を使用したグルコースセンサ (A - 1 〜3)は、 図 6 Aおよび図 8 Aから分かるように、 Ru錯体の含有量を小さくしても 高い 镍性が得られている。 このような結果は、 5秒値であるか 10秒値であるか を問わず、 またグルコース濃度が高い濃度域 (600〜1000mg/dL)においても得られ ていることから、 CyGDHと Ru錯体とを組み合わせた系は、 反応速度が大きい (Kmが 小さい）ということができる。 表 3〜表 8力 分かるように、 CyGDHと Ru錯体とを 組み合わせた系は、 C. V.が小さく、 再現性に優れている。 以上の結果をまとめる と、 CyGDHと Ru錯体とを組み合わせた系は、 5秒値と 10秒値の双方にぉレ、て Ruの濃 度を変ィ匕させても、 直線性、 再現性に大きな変ィ匕は無く、 5秒で十分反応が終了 し、 グルコースを定量できるといえる。
aGDHと Ru錯体とを組み合わせたグルコースセンサ (B- 1〜3)では、 図 6 Bおよ ぴ図 8 Bから分かるように、 Ru錯体の含有量を小さく（ 2wt%)した には、 グ ルコース濃度が高!/、濃度域 (600〜1000mg/dL)で戲泉性力 S若干乱れてレ、るものの、 基本的には、 CyGDHと Ru錯体とを組み合わせた系と同様な結果が得られている。そ のため、 a GDHと Ru錯体とを糸且み合わせた系につレ、ても、反応速度が大きレヽといえ、 また表 3〜表 8から分かるように、 基本的には再現性に優れているといえる。 し たがって、 a GDHと Ru錯体とを組み合わせた系についても、 5秒で十分反応が終了 し、 グルコースを定量できるといえる。
これに対して、 Ruと PQQGDHとを組み合わせたグノレコースセンサ (C 1〜3， D- 1〜3) では、 図 6 C, 図 6 Dおよび図 8 C, 図 8 Dから分かるように、 直線性を確保す るためには、 Ru錯体およひ 化還元酵素の含有量を大きくする必要がある。 この 場合、 試薬層の総量が大きくなるため、 微量検体 (0. 3 μ ϋを測定するためにキヤ ビラリサイズを小さくする方向性には馴染まず、 実用的でない。
電子伝達物質として Ferriを用レヽたグノレコースセンサ (E - 1〜3， F- 1〜3， G_l〜 3, H-l〜3)は、図 7 A〜図 7 Dおよび図 9 A〜図 9 Dから明らかなように、 ¾；線十生 が悪い。 し力も、 図 7 C, 図 7 Dおよび図 9 C, 図 9 Dから分かるように、 酸化 還元酵素として PQQGDHを使用したグノレコースセンサ G - 1〜3， H-l〜3では、酵素量を 多く（20U)しても、 Ruと CyGDHとを糸且み合わせた系には、反応速度におレ、て及ばず、 実用的でないといえる。 また、表 3〜表 8から分かるように、 Ferri自体の溶解性 の悪さカゝらカゝ、 全体的に再現性が悪く、 この点からも実用性を欠いているといえ る。
図 10 A〜図 10 Cに示したように、 本案センサ；!〜 3では、 測定時間を長く設定 するにつれて、 Hctの影響が小さくなり、検体の供給開始から 10秒後では殆どに Hct の影響を受けていない。 一方、 キヤビラリ容積が小さく、 スぺーサの厚みが小さ レ、本案センサほど、 Hctの影響が小さくなつている。 このこと力、ら、 Hctの影響を 抑制するためには、 スぺーサの厚みを小さくして、 センサの電極表面でのダルコ ース反応を素早く起こさせるのが有用であるといえる。 これに対して、 比較センサでは、 検体の供給開始から 30秒後においても、 Hct 値が大きい場合には、 Hctの影響を大きく受けており、その Bias値は、本案センサ の 5秒値に同等程度である。 したがって、 Ru錯体と CyGDHとを組み合わせた本案セ ンサ：!〜 3は、検体量が少なくても短レヽ時間で測定可能であり、 しかも Hctの影響 を受けにくい。そのため、 Ru錯体と CyGDHとを組み合わせた には、検体量の減 量および測定時間の短縮が可能であり、 Hctの影響を受けにくいグルコースセンサ の構築が可能となる。
以上のことから、 微量検体 (たとえば 0. 3 / L)にて短時間で血糖を測定する齢 においては、 Ruと CyGDHとを組み合わせは、 測定レンジ、 再現性、 測定時間、 Hct の影響を回避する点にぉレ、て、 優位な組み合わせであるといえる。
本発明では、 Ru錯体と特定のグルコース脱水素酵素 (チトクロム Cが結合された もの、またはブルクホルデリア属に属する微生物に由来するもの）とを組み合わせ た反応系を構築することにより、 測定レンジを大きく確保しつつ、 短時間かつ精 度良く、 へマトクリットの影響をさほど受けることなく、 微量なグルコース?辯夜 を測定できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 酵素および電子伝達物質を含む反応系を利用してグルコース濃度を測定する 方法であって、
上記酵素としてチトク口ム cが結合されたグルコース EzK素酵素を使用し、 上記電子伝達物質として Ru化合物を使用する、 グルコース 素酵素を用い たダルコース濃度測定方法。
2 . 上記チトク口ム Cは、ブルクホルデリァ属に属する微生物に由来するものであ る、 請求項 1に記載のグルコース濃度測定方法。
3 .上記チトク口ム Cは、還元条ィ Φί匕での SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に ぉレヽて、 分子量が約 43kDaである、 請求項 1に記載のグノレコース濃度測定方法。
4 . 上記反応系に対して刺激を与える一方で、 この刺激に対する応答を検出し、 この応答の検出量に基づレ、てグルコース濃度を演算する、 請求項 1に記載のダル コース濃度測定方法。
5 . 上記グルコース脱水素酵素は、 グルコース月脉素酵素活性を有し、 力、つ還元 条 匕での SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にぉレ、て、分子量が約 60kDaであ るひサブュュットを有している、 請求項 1に記載のグルコース濃度測定方法。
6 . 上記グルコース foK素酵素は、 還元条件ィ匕での SDS -ポリアクリルアミドゲル 電気泳動において、分子量が約 14kDaである γサブュニットを有している、請求項 1に記載のグルコース濃度測定方法。
7 . 上 ERu化合物は、 下記化学式に示す錯体である、 請求項 1に記載のダルコ一 ス濃度測定方法。
[Ru(NH3) 5幻 n+ (上記ィ匕学式における Xは、 NH3、 ハロゲンイオン、 CN, ピリジン、 ニコチンアミ ド、 または H20であり、 n +は、 Xの種類によって決定される Ru錯体の価数を示し ている。 ) 8 . 酵素および電子伝達物質を含む反応系を利用してグルコース濃度を測定する 方法であって、
上記酵素としてブルクホルデリァ属に属する微生物に由来するグルコース脱 水素酵素を使用し、
上記電子伝達物質として Ru化合物を使用する、 グルコース »素酵素を用い たグルコース濃度測定方法。
9. 上記反応系に対して刺激を与える一方で、 この刺激に対する応答を検出し、 この応答の検出量に基づいてグルコース濃度を演算する、 請求項 8に記載のダル コース濃度測定方法。
10. 上記グルコース «素酵素は、 グルコース 素酵素活性を有し、 力つ還元 条 ヒでの SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量が約 60kDaであ るひサブュニットを有している、 請求項 8に記載のグルコース濃度測定方法。
11. 上記グルコース脱水素酵素は、 還元条件ィヒでの SDS-ポリアクリルアミドゲル 電気泳動において、分子量が約 14kDaである γサブュニットを有している、請求項 8に記載のグルコース濃度測定方法。
12. 上 IHRu化合物は、 下記化学式に示す錯体である、 請求項 8に記載のダルコ一 ス濃度測定方法。
[Ru(NH3) 5X] n+
(上記化学式における Xは、 NH3、 ハロゲンイオン、 CN, ピリジン、 ニコチンアミ ド、 または ¾0であり、 n +は、 Xの種類によって決定される Ru錯体の価数を示し ている。 ）
13.第 1および第 2電極と、酵素および電子伝達物質を含んだ試薬層と、を備え、 上記試薬層に対してグルコース溶液を供給して反応系を構築するとともに、 この 反応系に対して上記第 1および第 2 βを利用して刺激を与えるように構成され たグノレコースセンサであって、
上記酵素としてチトク口ム cが結合されたグルコース fok素酵素を使用し、 上記電子伝達物質として Ru化合物を使用する、 グノレコースセンサ。
14. 上記チトクロム Cは、ブルクホルデリア属に属する微生物に由来するものであ る、 請求項 13に記載のグルコースセンサ。
15. 上記チトク口ム Cは、還元条 匕での SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動に おいて、 分子量が約 43kDaである、 請求項 13に記載のグルコースセンサ。
16. 上記グルコース脱水素酵素は、 グルコース月脉素酵素活性を有し、 力 還元 条#匕での SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動にぉレ、て、分子量が約 60kDaであ る αサブュ-ットを有している、 請求項 13に記載のグルコースセンサ。
17. 上記グルコース脱水素酵素は、 還元条件化での SDS-ポリアクリルアミドゲル 電気泳動において、分子量が約 14kDaである γサブュニットを有している、請求項
13に記載のグノレコースセンサ。
18. 上言 BRu化合物は、 下記化学式に示す錯体である、 請求項 13に記載のダルコ一 スセンサ。
[Ru(NH3) 5X] n+
(上記化学式における Xは、 NH3、 ハロゲンイオン、 CN, ピリジン、 ニコチンアミ ド、 または ¾0であり、 n +は、 Xの種類によって決定される Ru錯体の価数を示し ている。 )
19. 上記試薬層が設けられ、 力 試料液を保持するための液保持空間をさらに備 えており、
上記試薬層は、 固層として構成されているとともに、 上記液保持空間に試料 液を保持した状態では、 上記酸化還元酵素および電子伝達物質の少なくとも一部 が上記試料液に溶解するように構成されている、 請求項 13に記載のグルコースセ ンサ。
20. 上記液保持空間の容量は、 0. 1〜0. 5 しでぁる、請求項 19に記載のグルコース センサ。
21. 上記試薬層における酵素の含有量は、 グルコース 素酵素活性 1· 0〜10. 0U に相当する量である、 請求項 19に記載のグルコースセンサ。
22. 上記試薬層における電子伝達物質の含有量は、 上記液保持空間力試料液で満 たされたときの電子伝達物質の濃度に換算して 1. 0〜5. 0wt%に相当する量である、 請求項 21に記載のダルコースセンサ。
23. 上記 ί夜保持空間は、 毛細管力により試料液を移動させるように構成されてい る、 請求項 19に記載のダルコースセンサ。
24.第 1および第 2電極と、酵素および電子伝達物質を含んだ試薬層と、を備え、 上記試薬層に対してグルコース溶液を供給して反応系を構築するとともに、 この 反応系に対して上記第 1および第 2電極を利用して刺激を与えるように構成され たグ コースセンサであって、
上記酵素としてブルクホルデリァ属に属する微生物に由来のグルコース ΕζΚ 素酵素を使用し、
上記電子伝達物質として Ru化合物を使用する、 グルコースセンサ。
25. 上記グルコース脱水素酵素は、 グルコース麻素酵素活性を有し、 力、つ還元 条 匕での SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動にぉレ、て、分子量が約 60kDaであ るひサブュニットを有している、 請求項 24に記載のグルコースセンサ。
26. 上記グルコース脱水素酵素は、 還元条件化での SDS-ポリアクリルアミドゲル 電気泳動において、分子量が約 14kDaである γサブュニットを有している、請求項
24に記載のグノレコースセンサ。
27. 上言 ERu化合物は、 下記化学式に示す錯体である、 請求項 24に記載のグノレコー スセンサ。
[Ru(NH3) 5X] n+
(上記ィ匕学式における Xは、 NH3、 ハロゲンイオン、 CN， ピリジン、 ニコチンアミ ド、 または 0であり、 n +は、 Xの種類によって決定される Ru錯体の価数を示し ている。 ) 28. 上記試薬層が設けられ、 力つ試料液を保持するための液保持空間をさらに備 えており、
上記試薬層は、 固層として構成されているとともに、 上記液保持空間に試料 液をィ* した状態では、 上記酸化還元酵素および電子伝達物質の少なくとも一部 が上記試料液に溶解するように構成されている、 請求項 24に記載のグルコースセ ンサ。
29. 上記液^空間の容量は、 0· 1〜0· 5 μ ίである、請求項 28に記載のグルコース センサ。
30. 上記試薬層における酵素の含有量は、 グルコース 素酵素活性 1. 0〜10. 0U に相当する量である、 請求項 28に記載のグノレコースセンサ。
31. 上記試薬層における電子伝達物質の含有量は、 上記液保持空間力 S試料液で満 たされたときの電子伝達物質の濃度に換算して 1. 0〜5. 0wt%に相当する量である、 請求項 30に記載のダルコースセンサ。
32. 上記液保持空間は、 毛細管力により試料液を移動させるように構成されてい る、 請求項 24に記載のグルコースセンサ。
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