KR101880206B1 - 탈수소 효소 및 이의 기질 농도 측정 방법, 전자 메디에이터 및 상기 전자 메디에이터를 포함하는 탈수소 효소 및 이의 기질용 측정 시약 - Google Patents

탈수소 효소 및 이의 기질 농도 측정 방법, 전자 메디에이터 및 상기 전자 메디에이터를 포함하는 탈수소 효소 및 이의 기질용 측정 시약 Download PDF

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Abstract

생세포 존재 하에 탈수소 효소 및 이의 기질 농도 측정 방법에 있어서, 예를 들면, 하기 구조식(I)으로 표시되는 생세포에 의해 환원되기 어려운 전자 메디에이터를 이용하는 것을 특징으로 하는 측정 방법, 하기 구조식(I)으로 표시되는 전자 메디에이터, 해당 전자 메디에이터를 포함하는 탈수소 효소 및 이의 기질용 측정 시약을 개시하고 있다.
A-L-M
(구조식(I) 중, A는 적어도 1 종류의 음이온성기를 함유하는 구조 부위를 나타내고, M은 전자 수수를 하는 구조 부위를 나타내고, L은 상기 A와 M을 연결하는 연결 부위를 나타낸다).

Description

탈수소 효소 및 이의 기질 농도 측정 방법, 전자 메디에이터 및 상기 전자 메디에이터를 포함하는 탈수소 효소 및 이의 기질용 측정 시약{MEASUREMENT METHOD FOR DEHYDROOGENASE AND SUBSTRATE CONCENTRATION THEREOF, ELECTRON MEDIATOR, AND MEASUREMENT REAGENT FOR DEHYDROGENASE INCLUDING SAID ELECTRON MEDIATOR AND FOR SUBSTRATE THEREOF}
본 발명은 세포 배양액이나 혈액 중의 성분 측정의 기술 분야에 속하며, 특히, 생세포 존재 하에서 탈수소 효소 및 이의 기질 농도 측정에 유용한 탈수소 효소 및 이의 기질 농도 측정 방법, 상기 방법에 이용되는 전자 메디에이터 및 상기 전자 메디에이터를 포함하는 탈수소 효소 및 이의 기질용 측정 시약에 관한 것이다.
세포 배양액이나 혈액 중의 글루코오스 등의 기질 농도의 측정에는 산화 효소나 탈수소 효소 등의 기질 특이적인 효소를 이용하는 검출계가 이용되고 있다. 특히, 탈수소 효소를 이용하는 측정계는 대기 중의 산소의 영향을 받지 않기 때문에 이용 가치가 높다. 탈수소 효소가 기질과 반응하면 니코틴 아미드 디뉴클레오티드(NAD)나 니코틴 아미드 디뉴클레오티드 인산(NADP) 등의 보조 효소가 환원된다(NAD+ → NADH, NADP+ → NADPH). 생성한 조효소의 환원제로부터 PMS(페나진 메토설페이트), 1-Methoxy PMS(1-페나진 메토설페이트)과 PES(페나진 에토설페이트) 등의 전자 메디에이터(electron mediator)를 통해서 전극이나 환원 발색 색소에 전자를 건넴으로써 전류 값이나 발색 강도로 기질 농도를 구할 수 있다. 또한, 외부로부터 기질을 가하면 동일한 계에서 탈수소 효소의 농도를 측정할 수 있다.
한편, 상기와 같은 전자 메디에이터는 생세포로부터 전자를 받는 특성을 가지고 있다. 예를 들면, 신약 개발의 드러그 스크리닝(drug screening)이나 각종 물질의 독성 분석 등에서 이용되고 있는 세포 증식·세포 독성 시험에서는 생세포와 전자 수수를 수행하는 1-Methoxy PMS나 PES 등의 전자 메디에이터를 통해서 생세포 활성을 측정하는 각종 기법이 이용되고 있다. 사세포의 일부로부터 배양액 중에 유출한 효소의 활성을 전자 메디에이터를 통해서 측정함으로써 세포 독성을 평가하는 방법도 이용되고 있으나, 상기 전자 메디에이터는 생세포 사이에서도 전자 수수를 하기 때문에 세포 배양액을 생세포와 분리한 후에 측정 시료를 조제할 필요가 있었다(비특허 문헌 1 참조). 생세포를 분리하지 않는 방법도 제안되고 있으나 생세포의 영향을 피할 수 있는 것이 아니라 반응 온도를 낮추거나 반응 시간을 짧게 할 필요가 있다(특허문헌 1 참조).
기질 농도 측정
세포 독성 시험에서 저분자 전자 메디에이터 대신에, 전자 수수하는 효소인 디아포라아제(diaphorase)를 이용함으로써 생세포의 전자 수수를 막아 생세포 존재 하에 사세포 유래의 탈수소 효소 농도 또는 활성을 측정하는 방법도 제안되었으나, 효소를 이용하는 것으로부터 시약 용액의 안정성이 나쁘고, 사용하기 쉬운 것은 아니다.
특표 2005-523022호 공보
F. K.-M. Chan et al., Methods Mol. Biol., 2013, 979, 65-70.
본 발명의 목적은 종래 기술에 있어서의 상술한 문제점을 해소하고 생세포 존재 하에 탈수소 효소 및 이의 기질 농도를 측정하는 새로운 기술을 제공하는 데 있다.
본 발명자는 검토를 거듭한 결과, 생세포와 거의 전자 수수를 하지 않고, 생세포 존재 하에서도 탈수소 효소 및 이의 기질 농도가 측정 가능한 전자 메디에이터의 합성에 성공하고 본 발명을 이끌어 냈다.
본 발명의 제1의 양태는 생세포 존재 하에 탈수소 효소 및 이의 기질 농도 측정 방법이며, 생세포에 의해 환원되기 어려운 전자 메디에이터를 이용하는 것을 특징으로 하는 측정 방법을 제공함으로써, 상기 과제를 해결할 것이다.
본 발명의 제1의 양태에 관한 측정 방법에서 상기 생세포에 의해 환원되기 어려운 전자 메디에이터가 하기의 구조식(I)으로 표시되는 화합물인 것이 바람직하다.
A-L- M (I)
(구조식(I) 중, A는 적어도 1종류의 음이온성기를 함유하는 구조 부위를 나타내고, M은 전자 수수를 하는 구조 부위를 나타내고, L은 상기 A와 M을 연결하는 연결 부위를 나타낸다).
본 발명의 제1의 양태에 관한 측정 방법에서 상기 전자 수수를 하는 구조 부위 M이 하기의 구조식(II)로 나타내는 것이라도 좋다.
Figure 112016100938068-pct00001
(구조식(II) 중, X은 탄소 수 1~5의 분기를 가지고 있어도 좋은 알킬기, 알킬 황산기, 알킬 술폰산기을 나타내고, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 서로 독립적으로 수소 원자, 탄소 수 1~5의 분기를 가지고 있어도 좋은 알킬기 또는 알콕시기, 수산기, 또는 할로겐 원자, 또는 나이트로기, 또는 치환기를 가지고 있어도 좋은 아미노기를 나타내고, R1~R7 중 어느 하나는 상기 연결 부위 L이다).
본 발명의 제2의 양태는 상기의 구조식(I)로 나타내는 전자 메디에이터를 제공함으로써, 상기 과제를 해결할 것이다.
본 발명의 제2의 양태에 대한 전자 메디에이터에서 상기 전자 수수를 하는 구조 부위 M은 상기의 구조식(II)로 나타내는 것이라도 좋다.
본 발명의 제2의 양태에 대한 전자 메디에이터는 하기 식(I-1)~(I-16) 중 어느 하나로 나타내어지는 것이라도 좋다.
Figure 112016100938068-pct00002
Figure 112016100938068-pct00003
본 발명의 제3의 양태는 본 발명의 제2의 양태에 대한 전자 메디에이터를 포함하는 것을 특징으로 하는 탈수소 효소 및 이의 기질용 측정 시약을 제공함으로써, 상기 과제를 해결할 것이다.
본 발명의 제3의 양태에 관련되는 탈수소 효소 및 이의 기질용 측정 시약은 젖산 탈수소 효소용 측정 시약이라도 좋다.
본 발명의 생세포 존재 하에 탈수소 효소 및 이의 기질 농도 측정 방법, 전자 메디에이터 및 이를 포함하는 탈수소 효소 및 이의 기질용 측정 시약을 이용하면 생세포와 전자 메디에이터 사이의 전자 수수가 거의 일어나지 않는다. 생세포를 분리하지 않고 생세포가 존재하는 상태에서 탈수소 효소 및 이의 기질 농도 측정을 할 수 있다.
[도 1] 생세포의 존재하에서 탈수소 효소 및 이의 기질 농도를 측정하는 본 발명의 원리를 종래 기술과 비교하여 모식적으로 나타내는 도이다.
[도 2] 생세포의 존재하에서 사세포로부터 빠져나가는 젖산 탈수소 효소 농도 또는 활성을 측정하는 본 발명에 따른 사세포 분석의 원리를 종래 기술과 비교하여 모식적으로 나타내는 도이다.
[도 3] 생세포와 전자 수수에 관해서 본 발명의 전자 메디에이터와 기존 전자 메디에이터의 차이를 비교하고 나타낸 도이다.
[도 4] 본 발명의 전자 메디에이터를 이용한 생세포 존재하에서의 사세포 의존적인 발색 반응을 나타낸 도이다.
[도 5] 사세포 유래의 LDH를 지표로 하는 본 발명의 전자 메디에이터를 이용한 생세포 존재하에서의 사세포 분석과 생세포의 분리가 필요한 종래 제품에서의 사세포 분석의 비교를 나타낸 도이다.
본 발명의 제1의 실시 형태와 관련한 생세포 존재 하에 탈수소 효소 및 이의 기질 농도 측정 방법(이하, "측정 방법"이라 약칭하는 경우가 있다.)에 있어서, 본 발명의 제2의 실시 형태와 관련된 하기의 구조식(I)로 나타내는 전자 메디에이터( 생세포에 의해 환원되기 어려운 전자 메디에이터의 일례. 이하 "전자 메디에이터"이라 약칭하는 경우가 있다.)이 이용되고 있다.
[구조식 1]
A-L-M
(구조식(I) 중, A는 적어도 1 종류의 음이온성기를 함유하는 구조 부위를 나타내고, M은 전자 수수를 하는 구조 부위를 나타내고, L은 상기 A와 M을 연결하는 연결 부위를 나타낸다).
상기 구조식(I)에서, A는 적어도 1종류의 음이온성기를 함유하는 구조 부위를 가지고 있다. 이 음이온성기에 의해 생세포와 전자 수수를 하지 않는 특성이 부여된다.
A로는 특히 한정되는 것은 아니나, 예를 들면, 아스파라긴산(aspartic acid)이나 글루타민산(glutamic acid) 등의 아미노산, 타우린(taurine), 호모 타우린(homotaurine) 등의 아미노 술폰산, 파미드론산(pamidronic acid)이나 알렌드론산(alendronic acid) 등의 아미노 포스폰산, 니코틴 아미드 디뉴클레오티드, 니코틴 아미드 디뉴클레오티드 인산 등의 뉴클레오티드류 등을 들 수 있다.
상기 구조식(I)에서 M은 전자 수수를 수행하는 부위로 기능하는 산화형 구조 부위를 나타낸다. 이 산화형 구조 부위는 전자의 전달을 중개하며, 그 자체도 산화형/환원형의 구조를 보인다.
전자 메디에이터를 구성하는 구조식(I)의 화합물에서의 산화형 구조 부위로는 종래보다 탈수소 효소 및 이의 기질의 검출에 이용되는 각종 구조에 유래하는 것이 원리적으로는 적용 가능하지만, 특히 바람직한 것은 하기 구조식(II)로 나타내는 페나지늄(phenazinium) 구조를 가지는 것이다.
[구조식 (II)]
Figure 112016100938068-pct00004
구조식(II) 중, X은 탄소 수 1~5의 분기를 가지고 있어도 좋은 알킬기, 알킬 황산, 알킬 술폰산을 나타내고, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 서로 독립적으로 수소 원자, 탄소 수 1~5의 분기를 가지고 있어도 좋은 알킬기 또는 알콕시기, 수산기, 또는 할로겐 원자, 또는 나이트로기, 또는 치환기를 가지고 있어도 좋은 아미노기를 나타낸다. 또한, 구조식(II) 중, L은 연결 부위(후술)을 나타내고, R1~R7 중 어느 하나는 상기 연결 부위 L인 것을 의미한다.
상기 구조식(I) 및 (II)에서, L은 A(적어도 1종류의 음이온성기를 함유하는 구조 부위)와 M(전자 수수를 수행하는 산화형 구조 부위)을 연결하는 연결 부위를 나타낸다. 연결 부위의 구조는 특히 한정하는 것은 아니다.
상기 메디에이터를 구성하는 구조식(I)으로 표시되는 화합물의 바람직한 예로서 하기 식(I-1)~(I-16)로 나타낼 수 있으나, 전자 메디에이터는 이들에 한정되는 것은 아니다.
Figure 112016100938068-pct00005
Figure 112016100938068-pct00006
이리하여 본 발명에 따르면 본 발명의 다른 양태로서, 생세포가 존재하여 얻는 세포 배양액과 혈액 시료 중의 탈수소 효소 및 이의 기질 농도 측정 방법이며, 생세포를 분리하지 않고 해당 시료에, 구조식(I)의 화합물로부터 이루어진 전자 메디에이터 및 환원 발색 색소(reductive chromogenic dye)를 가하여 탈수소 효소 및 이의 기질을 정량하는 방법 및 이의 방법에 이용되는 측정 시약에 있어서, 구조식(I)의 화합물로부터 이루어진 전자 메디에이터 및 환원 발색 색소를 포함하는 탈수소 효소 및 이의 기질의 측정 시약이 제공된다.
본 발명의 제1의 실시 형태와 관련되는 탈수소 효소 및 이의 기질 농도 측정 방법에 이용되는 환원 발색 색소는 전자 수용체로서 일하고, 자신은 환원되어 발색(색 변화)을 보이는 화합물이다. 이 환원 발색 색소로서 바람직한 예는 각종 테트라졸륨염이며, 환원되어 용이하게 포르마잔(formazan)으로 발색한다. 테트라졸륨염으로서 특히 바람직한 것은 하기 구조식(III)으로 나타내고 WST로 일컬어지는 것이며 430 nm~490 nm에서의 흡광도를 측정할 수 있는 고감도 수용성 포르마잔을 생성한다. 환원 발색 색소로서는 테트라졸륨염에 한정되는 것이 아니며, 이 외에 예를 들면 레자주린(resazurin) 등도 사용 가능하다.
[구조식(III)]
Figure 112016100938068-pct00007
본 발명에 따른 측정 예의 하나로, 사세포로부터 유출된 젖산 탈수소 효소(LDH)을 지표로 하는 사세포 분석이 있다. 도 2는 생세포의 존재 하에서도 사세포를 측정(Assay) 할 수 있는 원리를 종래 기술의 경우와 비교해서 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2(B)와 같이, 생세포와 전자 수수를 수행하는 종래 전자 메디에이터(Med:예를 들면, 1-Methoxy PMS나 PES), 기질인 젖산(Lactate), 조효소인 NAD와 환원 발색 색소를 세포 시료(세포 배양 배지)에 첨가하면, 사세포에서 유출된 LDH가 젖산 탈수소 반응하여, 이에 따른 NAD의 환원 → Med의 환원 → 환원 발색 색소(예를 들면 WST-8)의 환원에 의해 발색에 더하여, 생세포 내의 NADH에 의해서도 Med가 환원되고 WST-8이 발색하여 버리기 때문에 사세포만을 선택적으로 측정할 수는 없다. 여기에서 종래의 기술에서는 배지의 일부를 다른 플레이트에 옮기고 측정하거나 부유 세포에는 원심 조작을 실시하는 것으로부터 측정하는 등, 생세포를 분리할 필요가 있었다.
이에 대해서 도 2(A)에 나타낸 본 발명의 제1의 실시의 형태에 관한 측정 방법에서는 전자 메디에이터가 생세포 내의 NADH에 따라서는 환원될 수 없으므로 생세포 존재 하에서도 사세포 유래의 LDH의 양을 측정할 수 있다. 이처럼 본 발명에 따르면 생세포가 존재하는 상태에서 발색제(A-L-M, 기질, 보조 효소 및 환원 발색 색소를 포함한다)을 넣을 뿐, 배지의 일부를 다른 플레이트에 옮기거나 부유 세포를 원심하지 않고 사세포를 측정할 수 있다. 또한, 상기 발색액은 단백질인 전자 전달 효소를 포함하지 않는 것으로부터 매우 안정성이 높고, 용액에서의 장기 보존이 가능하다. 이리하여 본 발명에 따fms 사세포 측정 기술은 특히 신약의 연구 개발에서 약 후보의 세포 독성 스크리닝을 대량으로 신속하게 하는 경우 등에 유용하다.
[실시예]
이하, 본 발명의 특징을 보다 구체적으로 나타내기 위하여 실시예를 기재하나, 본 발명은 이러한 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: I-1의 합성
Figure 112016100938068-pct00008
5-메틸-1-카르복시부틸 페나진 유도체(1)는 기보(국제 공개 제2009/118157호)의 방법에 따라 합성하였다. 40 mg(57 μmol)의 N6-2AE-NAD(동인 화학 연구소)을 100 mmol/L의 인산 완충액(pH 7.4) 1 mL에 녹여, 40 mg(209 μmol)의 WSC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보다이이미드 하이드로클로라이드) 및 85.8 mg(209 μmol)의 화합물 1을 가하고 실온에서 20시간 반응시켰다. 반응 혼합물을 역상 HPLC에서 정제하고 건조기 내에서 진공 건조하여 I-1의 적색 고체 12 mg을 얻었다.
실시예 2: I-4의 합성
Figure 112016100938068-pct00009
5-에틸-1-카르복시부틸 페나진 유도체(2)는 기보(국제 공개 제2009/118157호)의 방법에 따라 합성하였다. 44.8 mg(57 μmol)의 N6-2AE-NADP(동인 화학 연구소)을 100 mmol/L의 인산 완충액(pH 7.4) 1 mL에 녹여, 40 mg(209 μmol)의 WSC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보다이이미드 하이드로클로라이드) 및 88.7 mg(209 μmol)의 화합물 2을 가하고 실온에서 20시간 반응시켰다. 반응 혼합물을 역상 HPLC에서 정제하고 건조기 내에서 진공 건조하여 I-4의 적색 고체 15 mg을 얻었다.
실시예 3: I-6의 합성
Figure 112016100938068-pct00010
5-에틸-1-카르복시부틸 페나진 유도체(2)는 기보(국제 공개 제2009/118157호)의 방법에 따라 합성하였다. 40 mg(301 μmol)의 아스파라긴산을 100mmol/L의 인산 완충액(pH 7.4) 1 mL에 녹여 40 mg(209 μmol)의 WSC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보다이이미드 하이드로클로라이드) 및 88.7 mg(209 μmol)의 화합물 2을 가하고 실온에서 20시간 반응시켰다. 반응 혼합물을 역상 HPLC에서 정제하고 건조기 내에서 진공 건조하여 I-6의 적색 고체 45 mg을 얻었다.
실시예 4: I-10의 합성
Figure 112016100938068-pct00011
5-에틸-1-카르복시부틸 페나진 유도체(2)는 기보(국제 공개 제2009/118157호)의 방법에 따라 합성하였다. 40 mg(320 μmol)의 타우린을 100 mmol/L의 인산 완충액(pH 7.4) 1 mL에 녹여 40 mg(209 μmol)의 WSC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보다이이미드 하이드로클로라이드) 및 88.7 mg(209 μmol)의 화합물 2를 가하여 실온에서 20시간 반응시켰다. 반응 혼합물을 역상 HPLC에서 정제하고 건조기 내에서 진공 건조하여 I-10의 적색 고체 50 mg을 얻었다.
실시예 5: I-15의 합성
Figure 112016100938068-pct00012
5-에틸-1-카르복시부틸 페나진 유도체(1)는 기보(국제 공개 제2009/118157호)의 방법에 따라 합성하였다. 75 mg(301 μmol)의 알렌드론산을 100 mmol/L의 인산 완충액(pH 7.4)1mL에 녹여 40 mg(209 μmol)의 WSC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보다이이미드 하이드로클로라이드) 및 85.8 mg(209 μmol)의 화합물 1을 가하고 실온에서 20시간 반응시켰다. 반응 혼합물을 역상 HPLC에서 정제하고 건조기 내에서 진공 건조하여 I-15의 적색 고체 40 mg을 얻었다.
실시예 6: 생세포와 전자 수수 평가
전자 메디에이터와 생세포와 전자 수수를 평가한 예를 나타낸다. 비교를 위해서 생세포와 전자 수수하는 것이 알려진 전자 메디에이터인 1-메톡시 PMS에 대해서도 마찬가지 실험을 하였다. 인간 골수성 백혈병 세포(HL60)을 25,000~0 세포/well이 되도록 96 웰 마이크로 플레이트에 파종하고 마지막 농도가 하기와 같이 되도록 측정 시약을 첨가하여 37℃에서 3시간 반응시킨 후 450 nm의 흡광도를 측정하였다. 측정 시약의 마지막 농도: WST-8(500 μM), 전자 메디에이터(10 μM).
측정 결과를 도 3에 나타낸다. 1-메톡시 PMS를 이용한 경우, 생세포로부터 1-메톡시 PMS가 전자를 받아 WST-8을 환원하고 황색의 색소인 포르마잔을 생성하여 흡광도 상승이 보인다. 이에, 본 발명의 전자 메디에이터는 어느 유도체를 이용한 경우에도 생세포 유래 포르마잔의 생성이 1-메톡시 PMS보다 현저하게 억제되어 있다.
실시예 7: 생세포 존재 하에서의 사세포 유래의 LDH 측정
혈구 계산반으로 세포 수 계측 후의 인간 골수성 백혈병 세포(HL60)를 2개로 나누어 한쪽을 동결 융해에 의해 사멸시켰다(사세포 샘플). 남은 한쪽(생세포 샘플)과 사세포 샘플을, 비율을 바꾸어 혼합하고, 전 세포 수는 동일하게 사세포와 생세포의 비율이 다른 샘플을 제작하였다.
마지막 농도가 하기가 되도록 LDH의 기질인 젖산, 환원 발색 시약, 보조 효소 및 전자 메디에이터를 첨가하고, 실온에서 15분간 반응시킨 후 450 nm의 흡광도를 측정하였다. 시약 마지막 농도: 젖산(0.375%), WST-8(500 μM), NAD(10 μM), 전자 메디에이터(10 μM).
측정 결과를 도 4에 나타낸다. 가로 축은 사세포 수 0 일때는 생세포 20,000, 사세포 수 10,000 일때는 생세포 10,000, 사세포 20,000 일때는 생세포 0이 된다. 본 발명의 전자 메디에이터는 어느 유도체를 이용한 경우도 사세포에 대해서 직선적으로 흡광도가 상승하는 그래프로 생세포의 영향이 거의 없는 것을 알 수 있다.
실시예 8: 사세포를 지표로 하는 세포 독성 시험
본 발명의 전자 메디에이터를 포함하는 발색 시약 용액을 조제하여, 사세포로부터 유출된 LDH를 지표로 하는 세포 독성 시험을 실시한 예를 나타낸다. 세포 독성 시험 모델로서 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 대한 약제 미토마이신 C(mitomycin C:MMC)의 세포 독성을 평가하였다.
CHO 세포를 1.5×105 cell/mL의 농도가 되도록 혈청 함유 배지를 이용하여 현탁액을 조제하여, 100 μL씩 96 well 마이크로 플레이트에 파종하였다. 37℃에서 4시간, CO2 인큐베이터 안에서 인큐베이션한 후 10 μL의 MMC를 마지막 농도가 1 mM ~ 0.0001 mM이 되도록 넣었다. 37℃에서 20시간, CO2 인큐베이터 안에서 인큐베이션하였다. well 중의 모든 세포가 사멸한 경우의 발색을 측정하기 위해서, Triton X-100을 일부의 well을 가하여 세포를 모두 사멸시켰다. 발색 시약 용액(실시예 7의 마지막 농도가 되도록 만든 것)을 10 μL씩 총 well에 넣었다. 37℃에서 20분 동안 CO2 인큐베이터 안에서 인큐베이션한 후 450 nm의 흡광도를 플레이트 리더로 측정하였다.
시판의 LDH를 지표로 하는 사세포 분석 도구(biopioneer사; LDH-Cytotoxicity Assay Kit)를 비교 대상으로 하여 실험도 하였다. 사용 방법은 제품 첨부의 프로토콜에 따랐다. 흡광 측정법은 상술과 동일하나, 발색 반응을 할 때 생세포가 혼재하지 않도록 배양 상청을 취해 다른 플레이트에 옮기는 것이 필요하다.
측정 결과를 도 5에 나타낸다. 약제 미토마이신 C의 CHO 세포에 대한 세포 독성의 정도를 나타내는 50% 저해 농도(IC50)의 값은 본 발명의 전자 메디에이터를 이용한 경우에도(도 5(A) 참조), 사세포 분석으로 수용되고 있는 종래 제품의 경우(도 5(B) 참조)와 비교하여 차이가 없어 본 발명의 전자 메디에이터는 생세포 존재 하에서 사세포의 측정에 적용할 수 있을 것으로 확인하였다.
상기에는 탈수소 효소 농도 또는 활성 측정 예를 나타냈으나, 원리적으로는 탈수소 효소만 아니라 탈수소 효소의 기질 농도를 측정할 수도 있다. 이처럼 본 발명의 화합물을 이용하면 생세포의 혼재 속에서도 탈수소 효소 및 이의 기질의 농도를 측정할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 광의의 정신과 범위를 일탈하지 않고, 다양한 실시의 형태 및 변형이 가능할 것이다. 또한, 상술한 실시의 형태는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 즉, 본 발명의 범위는 실시의 형태가 아니고, 특허청구의 범위로 나타난다. 또한, 특허청구의 범위 및 이와 동등한 발명의 의미 범위 내에서 행해지는 다양한 변형이 본 발명의 범위로 간주된다.
본 출원은 2014년 4월 18일에 출원된 일본 특허 출원 특원 2014-086180호에 근거한다. 본 명세서 중에 일본 특허 출원 특원 2014-086180호의 명세서, 특허청 구의 범위, 도면 전체를 참조로서 도입한다.

Claims (8)

  1. 생세포 존재 하에 탈수소 효소 및 이의 기질 농도 측정 방법에 있어서,
    생세포에 의해 환원되기 어려운 전자 메디에이터로서, 하기 구조식(I)으로 표시되는 화합물을 이용하는 것을 특징으로 하는 생세포 존재 하에 탈수소 효소 및 그 기질 농도 측정 방법.
    [구조식 (I)]
    A-L-M
    (구조식(I) 중, A는 적어도 1 종류의 음이온성기를 함유하는 구조 부위를 나타내고, M은 하기 구조식(II)로 나타내며, 전자 수수를 하는 구조 부위를 나타내고, L은 상기 A와 M을 연결하는 연결 부위를 나타낸다)
    [구조식(II)]
    Figure 112018047470498-pct00022

    (구조식(II) 중, X은 탄소 수 1~5의 분기를 가지고 있어도 좋은 알킬기, 알킬 황산기, 알킬 술폰산기를 나타내고, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 서로 독립적으로 수소 원자, 탄소 수 1~5의 분기를 가지고 있어도 좋은 알킬기 또는 알콕시기, 수산기, 또는 할로겐 원자, 또는 나이트로기, 또는 치환기를 가지고 있어도 좋은 아미노기를 나타내고, R1~R7 중 어느 하나는 상기 연결 부위 L이다)
  2. 삭제
  3. 하기 (I-1)~(I-16) 중 어느 하나로 나타내어지는 것을 특징으로 하는 제1항에 기재된 전자 메디에이터.
    Figure 112018047470498-pct00015

    Figure 112018047470498-pct00016

  4. 제3항의 전자 메디에이터를 포함하는 것을 특징으로 하는 탈수소 효소 및 이의 기질용 측정 시약.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 탈수소 효소 및 이의 기질용 측정 시약은 젖산 탈수소 효소용 측정 시약인 것을 특징으로 하는 탈수소 효소 및 이의 기질용 측정 시약.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
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