KR20050019139A - 글루코스 탈수소효소를 이용한 글루코스 농도 측정방법 및글루코스 센서 - Google Patents

글루코스 탈수소효소를 이용한 글루코스 농도 측정방법 및글루코스 센서

Info

Publication number
KR20050019139A
KR20050019139A KR10-2004-7020491A KR20047020491A KR20050019139A KR 20050019139 A KR20050019139 A KR 20050019139A KR 20047020491 A KR20047020491 A KR 20047020491A KR 20050019139 A KR20050019139 A KR 20050019139A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
glucose
sensor
reagent layer
enzyme
glucose dehydrogenase
Prior art date
Application number
KR10-2004-7020491A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100729307B1 (ko
Inventor
야마오카히데아키
호시지마미쯔히로
쯔지모토토모미치
Original Assignee
아크레이 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아크레이 인코퍼레이티드 filed Critical 아크레이 인코퍼레이티드
Publication of KR20050019139A publication Critical patent/KR20050019139A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100729307B1 publication Critical patent/KR100729307B1/ko

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood
    • G01N27/3272—Test elements therefor, i.e. disposable laminated substrates with electrodes, reagent and channels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은，효소와 전자전달 물질을 포함하는 반응계를 이용하여 글루코스 농도를 측정하기 위한 기술에 관한 것이다．본 발명에서는，효소로서 시토크롬 C가 결합된 글루코스 탈수소효소 또는 버크홀데리아 속에 속하는 미생물에서 유래한 글루코스 탈수소효소를 사용하고，전자전달 물질로서 Ru 화합물을 사용하는 글루코스 농도 측정방법이 제공된다．본 발명에서는 또한，효소로서 시토크롬 C가 결합된 글루코스 탈수소효소 또는 버크홀데리아 속에 속하는 미생물에서 유래한 글루코스 탈수소효소를 사용하고，전자전달 물질로서 Ru 화합물을 사용하는 글루코스 센서가 제공된다．

Description

글루코스 탈수소효소를 이용한 글루코스 농도 측정방법 및 글루코스 센서{METHOD OF MEASURING GLUCOSE CONCENTRATION AND GLUCOSE SENSOR WITH THE USE OF GLUCOSE DEHYDROGENASE}
본 발명은，시료액(예를 들면 혈액 등의 생화학적 시료 또는 이것의 조정액) 의 글루코스 농도를 측정하기 위한 기술에 관한 것이다．
당뇨병 환자로서는，혈당값을 관리하기 위해 평소부터 자기의 혈당값을 파악해 두는 것이 중요하다．한편，빈번하게 의료기관에 가는 것이 번거롭기 때문에，환자 자신이 간이하게 혈당값의 측정을 행할 수 있고，게다가 행선지 등에서도 혈당값의 측정을 간단하게 행할 수 있도록，손바닥에 들어갈 정도의 사이즈의 휴대형 간이 혈당값 측정장치가 이용되고 있다．
휴대형의 간이 혈당값 측정장치를 사용하는 경우에는，효소 반응장을 제공하는 글루코스 센서(glucose sensor)를 혈당값 측정 장치에 장착하고，글루코스 센서에 대하여 혈액(검체)을 공급함으로써 혈당값의 측정이 행해진다．이 경우，측정자의 피부를 절개하여 혈액을 채취하고，이 혈액을 시료액으로서 글루코스 센서에 공급하는 방법이 일반적으로 채용되고 있다．이 방법에서는，혈액 채취에 대한 측정자에의 부담을 작게 하는 관점에서는，채취해야 할 혈액량이 적은 쪽이 바람직하기 때문에，적은 혈액(검체)으로 혈당값을 측정할 수 있도록 다양한 개량이 검토되고 있다．
글루코스 센서는，예를 들면 기판 상에 전극 및 시약층을 형성함과 동시에，이 시약층을 내부에 수용한 모양에서 캐필러리(capillary)를 설치한 구성으로 된다(도 ２ 및 도 ３ 참조)．시약층은，산화환원효소와 전자전달 물질을 포함하는 것으로 구성되지만，산화환원효소로서는 GOD나 PQQGDH가，전자전달 물질로서는 페리시안화 칼륨이 범용되고 있다(예를 들면 일본국 특개 2000-65778호 공보)．이 글루코스 센서에서는，캐필러리를 이용하여 시약층에 검체가 공급된 때에，캐필러리의 내부에 액상(液相)의 반응계가 구축된다．이 때，산화환원효소에 의하여，예를 들면 글루코스의 산화 반응이 촉매되는 한편으로，전자전달 물질의 환원반응이 촉매된다．
이에 대하여，간이 혈당값 측정장치에 있어서는，글루코스 센서의 전극을 이용하여，반응계에 대하여 전압을 인가함으로써 응답 전류값이 측정된다．이 응답 전류값은，예를 들면 환원형의 전자전달 물질의 양(글루코스 농도에 상관하는 양)에서 기인하는 것으로, 글루코스 농도를 연산할 때의 기초로 되는 것이다．글루코스 농도를 연산하는 경우에는，쿨로메트리(coulometry)법 또는 암페로메트리(amperometry)법이 채용된다．쿨로메트리법은，검체 중의 거의 대부분의 글루코스를 반응시키고 나서，연산용의 응답전류값의 적산값을 취득하고，적산값(전량(電量))에 근거하여 글루코스 농도를 연산하는 방법이다．한편，암페로메트리법은，반응 개시로부터 일정 시간 후에 응답전류값을 취득하고，이 응답 전류값에 근거하여 글루코스 농도를 연산하는 방법이다．
GOD는，글루코스와의 반응 속도가 작기(Km(미카엘리스 정수)이 크다)때문에, 검체 중의 대부분의 글루코스를 반응시켜서 연산용의 전량(電量)을 취득하는 쿨로메트리법에서는 측정 시간이 현저하게 길어져 버린다．그 때문에, 산화환원 효소로서 GOD를 사용하여 단시간에 글루코스 농도를 측정하는 경우에는，암페로메트리법이 이용되고 있다．
그렇지만，암페로메트리법에서는，글루코스 농도가 작은 경우에는，응답 전류값을 취득하는 단계에 있어 효소 반응이 대부분 종료해 버리고，얻어지는 응답 전류값이 작아져서，저농도 영역에서의 측정 정밀도가 나빠져 버린다．미량 검체에서는，글루코스의 절대량이 적기때문에 동일한 문제가 생길 수 있다．이와 같은 결함을 해소하기 위해서는，사용하는 효소량을 적게 하면 좋다．그렇지만，효소량이 적은 경우에는，글루코스의 반응 속도가 작아지기 때문에，일정 이상의 글루코스 농도의 검체에 있어서는，글루코스 농도의 차이가 글루코스의 반응량의 차이로서 우위에 나타나지 않는다．그 결과，효소량을 적게 하면，고농도 영역에서는，글루코스 농도의 차이를 응답 전류값의 차이로서 유의하게 얻을 수 없고，분해능이 악화되어 버린다．따라서, 암페로메트리법은，측정 레인지(range)가 작아，미량 검체의 측정에는 부적합한 방법이라고 말할 수 있다．
또한，GOD는，전자전달 물질과의 반응성도 그다지 크지 않다．그 때문에, 측정시간을 단축하기 위해서는，전자전달 물질을 다량으로 이용할 필요가 있다．그 결과，글루코스 센서(정확하게는 시약층이나 캐필러리(capillary))의 소형화가 곤란해지고，이에 따라 필요한 검체량도 많아진다．이 점에서도，GOD를 사용하는 방법은 미량 검체를 측정하는데도 부적합하다고 말할 수 있다．
이러한 사정에서 보면，GOD를 사용하는 암페로메트리법에서는，정밀도 좋게 글루코스를 측정할 수 있는 검체량은，최소 0.6μL，측정 시간으로 최소 15초，측정 레인지로 글루코스 농도가 10~600mg/dL의 범위가 한계라고 할 수 있다．
그 한편으로，산화환원효소로서 PQQGDH를 채용한 경우에는，쿨로메트리법을 채용하면，0.3μL의 미량 검체라도 혈당값을 측정하는 것이 가능해지는 것으로 알려져 있다. 그런데，쿨로메트리법은，상술한 바와 같이 검체 중의 거의 대부분의 글루코스를 이용하여 글루코스 농도를 연산하는 방법이기 때문에，암페로메트리법과 비교하여，글루코스 고농도 영역에서는 상대적으로 측정시간이 길어지는 경향이 있다．예를 들면，실용상 필요로 되는 최저한의 측정 레인지(10~600mg/dL)를 확보하기 위해서는，측정 시간을 15~30초는 확보할 필요가 있다．
측정시간을 단축하기 위해서는，시약층에서 효소나 전자전달 물질의 함유량을 많게 하는 것도 생각할 수 있지만，이 경우에는，시약층의 용해성이 악화된다．그 때문에, 캐필러리(capillary)에 검체를 공급한 때에，캐필러리에서 균일한 액상의 반응계를 구축하는 것이 곤란해진다．그 결과，글루코스 센서마다(측정 마다)의 용해 정도의 차이에 기인하여 재현성이 악화되거나, 혈액 중의 혈구 성분의 영향을 받기 쉬워지는 등으로 해서，측정 정밀도가 악화된다고 하는 문제가 생긴다．특히，페리시안화칼륨은 혈액에 대한 용해성이 작기때문에，전자전달 물질로서 페리시안화칼륨을 사용하는 경우에는，측정 정밀도의 악화가 현저해진다．또，페리시안화 칼륨은，보존안정성이 나쁘고，용이하게 환원체로 이행하기 때문에，함유량이 많아지면 백그라운드(background)의 증대와 관련하여，이번에는 글루코스 저농도 영역의 측정 정밀도가 저하된다．
도 １은，농도측정장치에 대하여 본 발명에 관계된 글루코스 센서를 장착한 상태를 나타내는 것이고, 농도측정장치에 관해서는 블록도로，글루코스 센서에 관해서는 평면도로 나타낸 것이다．
도 ２는，글루코스 센서의 일례를 나타내는 전체 사시도이다．
도 ３은，도 ２의 글루코스 센서의 분해 사시도이다．
도 ４는，글루코스 농도의 측정에 있어，제 １ 및 제 ２ 전극간에 인가하는 전압값 및 응답 전류값의 경시적 변화의 일례를 나타내는 그래프이다．
도 ５는，글루코스 농도의 측정에 있어，제 １ 및 제 ２ 전극간에 인가하는 전압값，및 응답 전류값의 경시적 변화의 다른 예를 나타내는 그래프이다．
도 ６Ａ~도 6Ｄ는，Ru 착체를 사용하여 시약층을 구성한 경우에 있어，글루코스 농도와 반응 개시 ５초후의 응답 전류값과의 관계를 나타내는 그래프이다．
도 ７Ａ~도 ７Ｄ는，철착체(鐵錯體)를 이용하여 시약층을 구성한 경우에 있어，글루코스 농도와 반응 개시 ５초후의 응답 전류값과의 관계를 나타내는 그래프이다．
도 ８Ａ~도 ８Ｄ는，Ru 착체를 이용하여 시약층을 구성한 경우에 있어，글루코스 농도와 반응 개시 10 초 후의 응답 전류값과의 관계를 나타내는 그래프이다．
도 ９Ａ~도 ９Ｄ는，철착체를 이용하여 시약층을 구성한 경우에 있어，글루코스 농도와 반응 개시 10초 후의 응답 전류값과의 관계를 나타내는 그래프이다．
도 10 Ａ~도 10 Ｄ는，헤마토크리트(hematocrit)(Hct)의 영향을，반응 개시로부터 특정 시간 경과후의 Bias(Hct 42％ 기준)로 평가한 그래프이다．
본 발명은，측정 레인지를 크게 확보하면서도，단시간에 정밀도 좋게，미량 검체를 측정할 수 있도록 하는 것을 목적으로 하고 있다．
본 발명의 제 １의 측면에 있어서는，효소 및 전자전달 물질을 포함하는 반응계를 이용하여 글루코스 농도를 측정하는 방법에 있어서，상기 효소로서 시토크롬 C(cytochrome C)가 결합된 글루코스 탈수소효소를 사용하고，상기 전자전달 물질로서 Ru 화합물을 사용하는, 글루코스 농도 측정방법이 제공된다．
시토크롬 C로서는, 버크홀데리아(Burkholderia) 속에 속하는 미생물에서 유래한 것을 사용하는 것이 바람직하다．시토크롬 C로서는, 환원 조건화에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어 분자량이 약 43kDa인 것을 사용할 수 있다．
본 발명의 제 ２의 측면에 있어서는，효소 및 전자전달 물질을 포함하는 반응계를 이용하여 글루코스 농도를 측정하는 방법에 있어서，상기 효소로서 버크홀데리아속 유래의 글루코스 탈수소효소를 사용하고，상기 전자전달 물질로서 Ru 화합물을 사용하는, 글루코스 탈수소효소를 이용한 글루코스 농도 측정방법이 제공된다．
본 발명에 관계된 글루코스 농도 측정방법에서는，예를 들면 반응계에 대하여 자극을 주는 한편으로，이 자극에 대한 응답을 검출하고，이 응답의 검출량에 근거하여 글루코스 농도가 연산된다．이 경우，자극은，예를 들면 전압으로 부여되고，응답은，전류 또는 광학적 특성으로 얻어진다．
본 발명의 제 ３의 측면에 있어서는，제 １ 및 제 ２ 전극과，효소 및 전자전달 물질을 포함하는 시약층을 구비하고，상기 시약층에 대하여 글루코스 용액을 공급하여 반응계를 구축함과 동시에，이 반응계에 대하여 상기 제 １ 및 제 ２ 전극을 이용하여 자극을 주도록 구성되는 글루코스 센서에 있어서，상기 효소로서 시토크롬 C가 결합된 글루코스 탈수소효소를 사용하고，상기 전자전달 물질로서，Ru 화합물을 사용하는 것을 특징으로 하는, 글루코스 센서가 제공된다．
시토크롬 C로서는, 버크홀데리아 속에 속하는 미생물에서 유래한 것을 사용하는 것이 바람직하다．시토크롬 C로서는, 환원 조건화에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어 분자량이 약 43kDa인 것을 사용할 수 있다．
본 발명의 제 ４의 측면에 있어서는，제 １ 및 제 ２ 전극과，효소 및 전자 전달물질을 포함하는 시약층을 구비하고，상기 시약층에 대하여 글루코스 용액을 공급하여 반응계를 구축함과 동시에，이 반응계에 대하여 상기 제 １ 및 제 ２ 전극을 이용하여 자극을 주도록 구성되는 글루코스 센서에 있어서，상기 효소로서 버크홀데리아속 유래의 글루코스 탈수소효소를 사용하고，상기 전자전달 물질로서 Ru화합물을 사용하는 것을 특징으로 하는, 글루코스 센서가 제공된다．
본 발명에서는, 글루코스 탈수소효소로서，글루코스 탈수소효소 활성을 가지고，또 환원조건화에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어，분자량이 약 60kDa인 α서브유닛(subunit)을 가지는 것을 사용할 수 있다．글루코스 탈수소효소는，환원조건화에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어，분자량이 약 14kDa인 γ서브유닛을 가지는 것이어도 좋다．
본 발명에서는，Ru 화합물로서，예를 들면 하기 화학식으로 표시되는 착체를 사용할 수 있다．
상기 화학식에서 X로는, NH3，할로겐 이온，CN，피리딘(pyridine), 니코틴아미드, 또는 H2O를 들 수 있다．예시한 것 중， X는 NH3 또는 할로겐 이온인 Ru착체를 사용하는 것이 바람직하다．한편，화학식에 있어서 ｎ＋는，X의 종류에 따라 결정되는 Ru 착체의 가수를 나타낸다．
Ru 착체는，환원형(II)이 불안정하기 때문에 통상은 산화형(III)으로서 존재한다．그 때문에, 예를 들면 글루코스 센서의 시약층에 산화형의 Ru 착체를 혼재시킨 상태에서 빛이나 물에 노출되었다고 해도，용이하게는 환원되지 않는다．또，Ru 착체는 결정화되기 어렵고，미분말 상태를 적절하게 유지할 수 있다고 하는 특성도 가지고 있다．이 점에서는，Ru 착체는 용해성이 높다고 말할 수 있다．따라서, 노출 내성이나 보존안정성 등을 고려한 경우，시약층에 대해서는，산화형으로서 Ru 착체를 포함시키는 것이 바람직하다．
본 발명의 글루코스 센서는，예를 들면 시약층이 설치되고，또 시료액을 유지하기 위한 액 유지공간을 더 구비하는 것으로 구성된다．이 경우，시약층은 ，고층(固層)으로 구성됨과 동시에，액 유지공간에서 시료액을 유지한 상태에서는，산화환원효소 및 전자전달 물질의 적어도 일부가 시료액에 용해되도록 구성된다．즉，글루코스 센서는，시료 공급후에 있어서는，액 유지공간내에서，글루코스, 산화환원효소 및 전자전달 물질에 의하여 액상으로 반응계가 구축되도록 구성되는 것이 바람직하다．
액 유지공간의 용량은，미량시료액을 측정할 수 있도록，예를 들면 0.1~0.5 μL로 설정된다．이 경우，시약층에서 산화환원효소의 함유량은，예를 들면 글루코스 탈수소효소 활성 1.0~10.0U에 상당하는 양으로 된다．효소 １단위(U)는，표준검정조건(pH6.0, 37 ℃) 하에서 DCIP(2,6-디클로로페놀 인도페놀)의 환원에 기인하는 퇴색을， DCIP의 흡수파장인 600nm에서 경시적으로 계측한 때에，1 분마다 1μM 글루코스를 산화하는 양(몰 흡광계수는 4.76×1000μM /cm)으로 정의했다．한편，시약층에서 전자전달 물질의 함유량은，예를 들면 액 유지공간이 시료액으로 가득 찬 때의 전자전달 물질의 농도로 환산하여 1.0~5.0wt％에 상당하는 양으로 된다．
액 유지공간은，예를 들면 모세관력에 의하여 시료액을 이동시키도록 구성된다．
본 발명에서 말하는 버크홀데리아 속에 속하는 미생물은，글루코스 탈수소효소 활성을 가지는 α서브유닛, 또는 시토크롬 C(β서브유닛)를 포함하는 효소(이하，간단히「GDH」라고 하는 경우가 있다)를 산출할 수 있는 것이면 특히 한정되지 않지만，그 중에서도 버크홀데리아·세파시아, 특히 버크홀데리아·세파시아 KS1주(이하，간단히「KS1주」라고 하는 경우가 있다)가 바람직하다．KS1주는，온천 부근의 토양에서 분리한 신규 균주이지만，그 균학적 성질로부터 버크홀데리아·세파시아라고 고정되어 있고，평성 12년９월 25일에 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터( 305-8566 　일본 이바라키현 츠쿠바 시토우１가 １번지１중앙 제 ６)에 미생물 수탁번호 제 FERM BP-7306으로 기탁되어 있다． KS1주는，α 서브유닛(분자량 약 60kDa)，β 서브유닛(시토크롬 C에 상당)(분자량 약 43kDa) 및 γ 서브유닛(분자량 약 14kDa)을 포함하는 GDH를 산출할 수 있다．단, 분자량은，환원 조건하에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 측정한 것이다．
시토크롬 C(β 서브유닛을 포함한다)는，전자전달 단백질이고，전자전달 속도를 향상시키는 관점에서는，글루코스 탈수소효소 활성을 가지는 서브유닛(α 서브유닛을 포함한다)에 대하여，시토크롬 C를 결합시킨 형태로, GDH(이하，간단히 「CyGDH」라고 하는 경우가 있다)로서 사용하는 것이 바람직하다．시토크롬 C는, 버크홀데리아 속에 속하는 미생물에서 유래하는 것(β 서브유닛)에 한하지 않고，글루코스 탈수소효소 활성을 가지는 서브유닛에 결합하고，전자전달 기능을 발휘할 수 있는 한에 있어서는，다른 미생물이나 생체 세포에서 유래하는 것이어도 좋다．
α 서브유닛은，기술한 바와 같이 글루코스 탈수소효소 활성을 가지는 것이다．α 서브유닛과 γ서브유닛으로 이루어진 GDH(이하，간단히「αGDH」라고 하는 경우가 있다.)는，γ 서브유닛을 가지지 않는 GDH와 비교하여，글루코스와의 반응 속도가 크다(Vmax/Km이 크다)．이 점에 관해서는，본 발명자들에 의해서 확인되어 있다．따라서, 글루코스와의 반응 속도를 크게 하는 관점에서는, α 서브유닛을 사용하는 경우에는，α 서브유닛에 대하여 γ 서브유닛을 결합시킨 형태로, GDH로서 사용하는 것이 바람직하다．
또한，본원의 특허청구의 범위에 있어서는，유래균에 의하여 α 서브유닛，시토크롬 C(β 서브유닛) 또는 γ 서브유닛을 특정하는 것이 있지만，이것은 각 서브유닛을 특정하기 위한 편법에 지나지 않는다．즉，목적으로 하는 서브유닛의 발현 코드를 포함하는 벡터를 숙주에 이입하고，이 숙주로부터 산출되는 GDH를 글루코스 탈수소효소로 사용하는 경우라도，차이점이 GDH(서브유닛)의 기원밖에 없는 때에는，본 발명의 기술적 범위에 속한다는 것을 명확하게 여기에서 확인해 둔다．
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하，본 발명을 실시하기 위한 최선의 형태에 관하여，도면을 참조하여 구체적으로 설명한다．
도 １에 나타난 농도측정장치(１)는，본 발명에 관계된 글루코스 센서(２)를 이용하여，혈액 등의 글루코스를 포함하는 시료액 중의 글루코스 농도를 측정하기 위한 것이다．이 농도측정장치(１)는，전압인가부(３)，전류값 측정부(４)，검지부(５)，제어부(６)，연산부(７) 및 표시부(８)를 구비하여 대략 구성되어 있다．
글루코스 센서(２)는，일회용으로 구성된 것이고, 도 ２ 및 도３에 잘 나타나 있는 것처럼，커버판(20)，스페이서(spacer)(21) 및 기판(22)을 가지고 있다．
커버판(20)에는 혈부(穴部)(23)가 설치되어 있고，스페이서(21)에는 혈부(23)에 연통함과 동시에 선단부(24ａ)가 개방된 세폭(細幅) 슬릿(slit)(24)이 설치되어 있다．커버판(20) 및 스페이서(21)가 기판(22)의 윗면(22ａ)에 적층된 상태에서는，슬릿(24)에 의하여 캐필러리(25)가 규정되어 있다．이 캐필러리(25)는，그 용량이，예를 들면 0.1~ 0.5μL로 설정되어 있고，슬릿(24)의 선단 개구부(24ａ) 및 혈부(23)를 개재하여 외부와 연통(連通)하고 있다．선단 개구부(24ａ)는 시료액 도입구(25ａ)를 구성하고 있고，이 시료액 도입구(25ａ)로부터 공급된 시료액은，모세관 현상에 의하여 혈부(23)를 향하여 캐필러리(25)내를 진행한다．
기판(22)의 윗면(22ａ)에는，제 １ 전극(26)，제 ２ 전극(27)，및 시약층(28)이 설치되어 있다．
제 １ 및 제 ２ 전극(26, 27)은，전체로서 기판(22)의 길이 방향으로 연장되어 있고，이들의 단부(26ａ, 27ａ)가 기판(22)의 폭 방향으로 연장되어 있다．기판(22)의 윗면(22ａ)은，제 １ 및 제 ２ 전극(26, 27)의 단부(26ａ, 26ｂ, 27ａ, 27ｂ)가 노출되도록 하여 절연막(29)에 의하여 덮혀 있다．
시약층(28)은，예를 들면 고(固)형상이고，제 １ 및 제 ２ 전극(26, 27)의 단부(26ａ, 27ａ)사이를 다리놓도록 해서 설치되어 있다．이 시약층(28)은，예를 들면 상대적으로 다량의 산화형의 Ru 화합물(전자전달 물질) 및 상대적으로 소량의 GDH(글루코스 탈수소효소)를 포함하고 있다．시약층에 있어서 GDH의 함유량은，예를 들면 글루코스 탈수소효소 활성 1.0~10.0U에 상당하는 양으로 되고，시약층에 있어서 Ru화합물의 함유량은，예를 들면 캐필러리(25)가 시료액으로 가득 찬 때의 Ru 화합물의 농도로 환산하여 1.0~5.0wt％에 상당하는 양으로 된다．
산화형의 Ru 화합물은，전자전달체로서 기능하면 좋지만，예를 들면 하기 화학식으로 표시되는 Ru 착체를 사용하는 것이 바람직하다．
상기 화학식에서 X로는, NH3，할로겐 이온, CN, 피리딘，니코틴아미드 또는 H2O를 들 수 있다．예시한 것 중, X는 NH3 또는 할로겐 이온인 Ru착체를 사용하는 것이 바람직하다．한편，화학식에서 ｎ＋는, X의 종류에 따라 결정되는 Ru 착체의 가수를 나타낸다．
시약층(28)에서는, GDH에 대하여, Ru 화합물의 비율이 크게 되어 있고, Ru 화합물이 시약층(28)의 용해성에 주는 영향은 크다．그 한편으로，Ru 화합물로서 화학식으로 나타난 Ru 착체는，결정화하기 어렵고，미분말의 상태를 적절하게 유지할 수 있으며，용해성이 높은 것이다．따라서 시약층(28)은, 전체로서 용해성이 높고，혈액의 공급에 의하여 용이하게 용해되는 것으로 되어 있다．그 때문에, 글루코스 센서(２)에서는，캐필러리(25)의 용적을 상술한 범위와 같이 작게 설정했다고 해도，혈액이 공급된 때에，캐필러리(25) 내에서 거의 균일한 액상(液相)의 반응계를 적절하게 구축할 수 있게 된다．
한편，GDH로서는, 글루코스 탈수소효소 활성을 가지는 서브유닛에 대하여 전자전달 단백질인 시토크롬 C를 결합시킨 것을 사용하는 것이 바람직하다．글루코스 탈수소효소 활성을 가지는 서브유닛이나 시토크롬 C는，예를 들면 버크홀데리아 속에 속하는 미생물，예를 들면 버크홀데리아·세파시아 KS1주에서 유래한 것을 사용하는 것이 바람직하다．물론，글루코스 탈수소효소 활성을 가지는 서브유닛이나 시토크롬 C는，버크홀데리아 속에 속하는 미생물에 한하지 않고，목적으로 하는 기능을 발휘할 수 있는 범위에서 다른 미생물이나 생체 세포에서 유래하는 것이어도 좋고，목적으로 하는 서브유닛의 발현 코드를 버크홀데리아 속에 속하는 미생물로부터 취득함과 동시에，이 발현 코드를 포함하는 벡터를 숙주에 이입하여，이 숙주로부터 산출시킨 것이어도 좋다．
미생물로서 버크홀데리아 속에 속하는 KS1주를 이용하는 경우에는, 글루코스 탈수소효소 활성을 가지는 서브유닛은 분자량 약 60kDa인 α서브유닛으로 얻어지고，시토크롬 C는 분자량 약 43kDa인 β 서브유닛으로 얻어진다．이 KS1주에서는, α 서브유닛 및 β 서브유닛에 대하여，분자량 약 14kDa인 γ 서브유닛이 결합한 GDH가 산출된다．단, 분자량은，환원 조건하에서의 SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동에서 측정한 것이다．이 경우，글루코스와의 반응 속도를 크게 하는 관점에서는，α서브유닛에 대하여 γ서브유닛을 결합시킨 αGDH를 사용하는 것이 바람직하다．한편，전자전달속도를 향상시키는 관점에서는，αGDH에 대하여 β서브유닛(시토크롬 C)을 결합시킨 CyGDH를 사용하는 것이 바람직하다．
도 １에 나타난 전압인가부(３)는，제 １ 전극(26)의 단부(26ｂ)와 제 ２ 전극(27)의 단부(27ｂ)와의 사이에 정전압을 인가하는 것이다．전압인가부(３)는，글루코스 센서(2)를 글루코스 농도 측정장치(１)에 설치된 장착부(도시 생략)에 장착함으로써，제 １ 및 제 ２ 접촉자(３a, ３ｂ)를 개재하여，글루코스 센서(２)의 단부(26ｂ, 27ｂ)와 도통하게 되어 있다．전압인가부(３)로서는, 예를 들면 건전지나 충전지 등의 직류 전원이 사용된다．
전류값 측정부(４)는，반응계에 대한 전압 인가시에，예를 들면 환원형의 Ru 화합물로부터 방출된 전자의 양에 상관하는 응답전류값을 측정하는 것이다．
검지부(５)는，글루코스 농도 측정장치(１)에 글루코스 센서(２)가 장착된 후에 있어，시약층(28)에 시료액이 공급되고，글루코스 농도의 측정이 가능해지는지 아닌지를 검지하는 것이다．
제어부(６)는，전압인가부(３)를 제어하고，제 １ 및 제 ２ 전극(26, 27)의 사이에 전압이 인가되는 상태(폐회로)와 인가되지 않는 상태(개회로)를 선택하는 것이다．
연산부(７)는，전류값 측정부(４)에 의하여 측정된 응답 전류값에 따라，시료액 중의 글루코스 농도의 연산을 행하는 것이다．
또한，검지부(５)，제어부(６) 및 연산부(７)의 각각은，예를 들면 CPU 및 ROM이나 RAM 등의 메모리에 의하여 구성되지만，검지부(５)，제어부(６) 및 연산부(７)의 전부를，１개의 CPU에 대하여 복수의 메모리를 접속함으로써 구성할 수도 있다．또，연산부(７)에 의한 연산 결과는，표시부(８)에 의하여 표시된다．표시부(８)는，예를 들면 LCD 등에 의하여 구성된다．
다음으로，시료액 중의 글루코스 농도 측정의 절차를 도 １ 내지 도 ３에 더하여，도 ４ 및 도 ５도 참조하면서 설명한다．
도 １에 잘 나타나 있는 것처럼，먼저 글루코스 농도 측정장치(１)에 글루코스 센서(２)를 세트(set)한다．그러면，글루코스 센서(２)의 제 １ 전극(26) 의 단부(26ｂ)가 농도측정장치(１)의 제 １ 접촉자(３ａ)와 접촉하고，제 ２ 전극( 27)의 단부(27ｂ)가 제 ２ 접촉자(３ｂ)와 접촉한다．앞에서도 접촉된 것처럼，이 상태에서는 제 １ 및 제 ２ 전극(26, 27)이 전압인가부(３)에 도통 가능하게 되어 있다．실제의 측정에 있어서는，글루코스 센서(２)에 시료액을 공급하기 이전부터，제어부(６)의 제어에 근거하여，전압인가부(３)에 의하여 제 １ 및 제 ２ 전극(26, 27) 사이에 정전압이 인가되어 있다．인가 전압값은，예를 들면 100~500mV의 범위로 설정된다．
이어서，글루코스 센서(２)의 시료액 도입구(25ａ)를 이용하여 혈액 등의 시료액을 공급한다．시료액은，모세관 현상에 의하여 글루코스 센서(２)의 캐필러리( 25) 내를 진행한다．그 과정에 있어，시료액에 의하여 시약층(28)이 용해되고，액상의 반응계가 구축된다．반응계에 있어서는，예를 들면 GDH에 의하여 글루코스가 산화됨과 동시에 Ru 화합물이 환원형으로 된다．
２개의 단부(26ｂ, 27ｂ)를 개재하여 제 １ 및 제 ２ 전극(26, 27) 사이에 정전압을 인가한 상태에서는，시약층(28)에 존재하는 환원형의 Ru 화합물이 제 １ 전극(26)의 단부(26ａ)측으로 이동하고，이 단부(26ａ)에 전자를 방출하여 산화형의 Ru 화합물로 된다．따라서, 전압인가부(３)에 의하여 제 １ 및 제 ２ 전극(26, 27) 사이에 정전압을 공급한 상태에서는，환원형의 Ru 화합물로부터 부여된 전자의 양이 제 １ 전극(26) 및 제 １ 접촉자(３ａ)를 개재하여 전류값 측정부(4)에 있어 응답 전류로서 측정된다．
한편，전류값 측정부(４)에 있어 측정된 응답 전류값은，검지부(５)에서 모니터링(monitoring)되고，도４에 나타난 것처럼，응답 전류값이 역치Ｉ1 (예를 들면 0.1~ 3.0μA)를 초과한 시점 t0 에서，검지부(５)는 시약층(28)으로 시료액이 공급되어，시약층(28)이 용해된 것을 검지한다．
검지부(５)에서 시료액이 공급된 것이 검지된 경우에는，전류값 측정부(４)는，이 검지로부터 일정 시간(예를 들면 ｔ2 －ｔ0 가 10초 이하, 더욱 바람직하게는 ５초 이하)의 경과 시점 ｔ2 에 있어서 연산용의 응답 전류값 Ｉ2를 측정한다．
또，도５에 나타난 것처럼，검지부(５)에서 시료액이 공급된 것이 검지되고 나서 일정 시간(예를 들면 ｔ1 －ｔ0 가 10 초 이하, 더욱 바람직하게는 ３초 이하)이 경과한 시점 ｔ1 까지 전압의 인가를 일단 중지해도 좋다．게다가，시점 ｔ1 으로부터 전압을 재인가하는 한편으로，이 재인가로부터 일정시간(예를 들면 ｔ2 －ｔ1 이 ３초 이상, 더욱 바람직하게는３초~５초)이 경과하는 시점 ｔ2 에 있어서 응답전류값을 연산용의 응답 전류값 Ｉ2 로서 채용해도 좋다．
한편，연산부(７)에서는，연산용의 응답 전류 Ｉ2 에 근거하여，시료액 중의 글루코스 농도를 연산한다．글루코스 농도의 연산은，응답 전류값을 전압값으로 환산한 후에，이 전압값을，미리 작성해 둔 전압값과 글루코스 농도와의 관계를 나타내는 검량선에 적용시킴으로써 연산된다．검량선은，예를 들면 데이터화되어 연산을 실행하는 프로그램과 함께 ROM에 격납되어 있다．
본 실시 형태에서는，Ru 화합물과，특정한 GDH(αGDH나 CyGDH 등)를 조합시켜 시약층(28)이 구성되어 있다．이와 같은 시약층(28)에서는，시료액을 공급한 때의 반응 속도(효소 반응 속도 및 전자전달속도(Vmax/Km)의 쌍방을 포함한다.)가 크고，예를 들면 CyGDH에서는 Vmax/Km이 약 2100mM이다．그 때문에, 글루코스 농도가 작은 경우라도，최대 속도로 글루코스 반응이 진행되고，단위시간당에 생성되는 반응 생성물의 양은 글루코스 농도의 대소에 관계없이 동일해진다．또，글루코스 농도가 1000mg/dL 정도이어도，１초 미만에서 모든 글루코스와의 반응이 종료되고，검체량이 적어져도 많은 반응 생성물이 얻어지기 때문에，글루코스 농도의 크기에 관계없이，단시간에 엔드포인트에 이를 수 있다．그 결과，후술하는 실시례로부터 명확하게 되지만，측정 대상으로 되는 시료액(예를 들면 혈액)의 양을 적게 하면서도，측정 시간(도４ 및 도 ５의 ｔ2 －ｔ0 )을 짧게 설정할 수 있다．게다가，글루코스 농도가 큰 미량 검체를 측정하는 경우라도，동일 농도의 글루코스 농도를 여러 차례 측정한 경우에 있어서 응답전류값의 불규칙함이 적고，측정 레인지의 폭도 크게 확보할 수 있게 된다．
상술한 것처럼，시약층(28)이 용해성이 높은 것으로 되어 있기 때문에，미량 시료를 측정하기 위해 캐필러리 사이즈가 작게 되어 있는 경우라도，시료액의 공급시에 캐필러리(25)에서，거의 균일한 액상의 반응계를 구축할 수 있다．그 때문에, 시료액으로서의 혈액(검체)을 사용하는 경우에 있어서도，혈구 성분의 영향을 그다지 받는 일 없이，재현성 좋게 응답 전류값을 측정할 수 있다．
Ru 착체 등의 Ru 화합물은 산화형이 안정하기 때문에 환원형으로는 이행하기 어려워, Ru 화합물을 이용한 바이오 센서는 보존 안정성이 높고，백그라운드가 적다．그 때문에, 글루코스 농도가 적은 시료나 미량 시료를 이용하여 글루코스 농도를 측정하는 경우라도，측정 정밀도가 악화되는 경우도 없다．
본 실시 형태에서는，글루코스 센서와 농도측정장치와의 조합에 있어，글루코스 농도의 측정방법을 설명했지만，본 발명에 관계된 글루코스 농도의 측정방법은，효소 고정화 전극을 구비한 미터를 이용하여 실현하는 것도 가능하다．
실시예
이하에서는，효소 반응을 이용한 글루코스 농도의 측정에 있어，Ru 착체와 αGDH 또는 CyGDH를 조합하여 시약층을 구성한 글루코스 센서는，미량 검체라도，반응 속도가 크고(측정 시간이 짧고)，측정 레인지가 넓으며, 재현성에서 우수하고，헤마토크리트(hematocrit)(Hct)의 영향을 받기 어렵다는 것을 실증한다．
〈글루코스 센서의 작성〉
글루코스 센서로서는, 기판상에 ，제 １ 전극，제 ２ 전극，시약층 및 캐필러리가 형성된 것(도 ２ 및 도 ３ 참조)을 사용했다．제 １ 및 제 ２ 전극은，기판상에 카본 잉크를 스크린 인쇄한 후에 건조시킴으로써 형성했다．캐필러리의 용적은，기본적으로는 0.3μL로 설정했다．단, 검체 중의 Hct의 영향에 관해서는，후술하는 바와 같이 캐필러리의 용적을 0.4μL 및 0.5μL로 한 것에 대해서도 검토했다．시약층은，전자전달층 및 효소 함유층으로 이루어진 ２층 구조로 했다．전자전달층은，기판상에 전자전달 물질을 포함하는 제 １ 재료액 0.4μL를 도포한 후에 제 １ 재료액을 송풍 건조(30℃, 10％ Rh)함으로써 형성했다．효소함유층은，전자전달층 상에，산화환원효소를 포함하는 제 ２ 재료액 0.3μL를 도포한 후에 제 ２ 재료액을 송풍 건조(30℃, 10％ Rh)함으로써 형성했다．
제 １ 재료액은，하기 표 １의 ①~④를 번호 대로의 순서로 혼합한 혼합액을 １~３일 방치한 후，이 혼합액에 전자전달 물질을 첨가함으로써 조제했다．제 ２ 재료액은，산화환원효소를 0.1％ CHAPS에 용해시킴으로써 조제했다．
전자전달 물질로서는, [Ru(NH3)6]Cl3(Aldrich 제)(이하，간단히 「Ru」또는 「Ru 착체」라 한다) 또는 K3[Fe(III)(CN)6 ]( 나카라이테스크(주)제「28637-75」)(이하，간단히 「Ferri」라 한다)를 사용하고，산화환원효소로서는, CyGDH，αGDH 또는 PQQGDH를 사용했다．상술한 것처럼, CyGDH는，α서브유닛，β서브유닛 및 γ서브유닛으로 이루어지고，αGDH는，α서브유닛 및 γ서브유닛으로 이루어진 것이다．PQQGDH는 PQQ(피롤로퀴놀린퀴논)를 보효소로 하는 것이다．
제 1 재료액의 조성(전자전달 물질을 제외한다)
①SWN 용액 ②CHAPS 용액 ③증류수 ④ACES 용액
농도 용량 농도 용량 농도 용량
1.2% 250μL 10% 25μL 225μL 200mM 500μL
표 １ 등에 있어서， SWN은 루센트타이트 SWN의 약호이고， CHAPS는 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio] propanesulfonic acid의 약호이고, ACES는 N-(2-acetamido)-2-aminoetanesulfonic acid의 약호이다. SWN으로서는 컵케미칼(주)제「3150」을 사용하고, CHAPS로서는 동인화학 연구소(同仁化學硏究所제「KC062」를 사용하고, ACES로서는 동인화학연구소제「ED067」을 사용했다. 또한, ACES 용액은 pH가 7.5로 되도록 조제했다．
<글루코스 용액의 조제>
글루코스 용액으로서는, 글루코스 농도 및 Hct 값이 목적 농도로 조제된 전혈(全血)(검체)을 이용했다. Hct 값은，특별한 한정이 없는 한은 42%로 조정되어 있다．글루코스 농도는，시험 목적에 따라, 0, 101, 412, 624, 820 또는 1034mg/dL로 조정했다．
<응답 전류값의 측정>
응답 전류값은，글루코스 센서의 제 １ 및 제 ２ 전극의 사이에 정전위 (200mV)를 인가한 상태에서，시약층에 캐필러리 용적에 따른 양(0.3μL，0.4μL， 0.5μL)의 검체를 공급하고，이 검체 공급으로부터 특정시간(５초 또는 10초)의 경과후에 측정했다．
[측정 레인지의 평가]
측정 레인지는，여러 가지의 글루코스 농도의 검체를 이용하여 응답 전류값을 측정한 다음，글루코스 농도를 횡축으로，응답 전류값을 종축으로 설정한 때의 플롯(plot) 점의 직선성으로부터 평가했다．검체의 공급으로부터 ５초후의 응답 전류값에 관한 결과를 도 ６Ａ~도 ６Ｄ 및 도 ７Ａ~도 ７Ｄ에，검체의 공급으로부터 10초후의 응답 전류값에 관한 결과를 도 ８Ａ~도 ８Ｄ 및 도 ９Ａ~도 ９Ｄ에 각각 나타냈다．이러한 도면에 있어서는，각 플롯 점은，동일 구성으로 된 10개의 글루코스 센서에 관하여 응답 전류값을 측정한 다음，그 평균치로서 나타내었다．본 평가에서 사용한 글루코스 센서에 있어，산화환원효소 및 전자전달 물질에 관해서는 하기 표２에 나타낸 대로 했다．표 ２에 있어서는，센서 번호 A-1~3, B-1~3이 본안의 글루코스 센서이고，그 외는 비교를 위한 글루코스 센서이다．표 ２에 있어서 산화환원효소의 활성은，캐필러리에 검체를 공급하여 액상 반응계를 구성한 경우에 있어서 상기 액상 반응계에서의 활성을 나타내고 있고，전자전달 물질의 함유량은，상기 액상 반응계에 있어서 전자전달 물질의 중량비율을 나타내고 있다．
센서의 구성
센서 번호 산화환원효소 전자전달 물질
종류 활성(U) 종류 함유량(wt%)
A-1 또는 2 또는 3 CyGDH 2 Ru 2 또는 4 또는 8
B-1 또는 2 또는 3 αGDH 2 Ru 2 또는 4 또는 8
C-1 또는 2 또는 3 PQQGDH 2 Ru 2 또는 4 또는 8
D-1 또는 2 또는 3 PQQGDH 20 Ru 2 또는 4 또는 8
E-1 또는 2 또는 3 CyGDH 2 Ferri 2 또는 4 또는 8
F-1 또는 2 또는 3 αGDH 2 Ferri 2 또는 4 또는 8
G-1 또는 2 또는 3 PQQGDH 2 Ferri 2 또는 4 또는 8
H-1 또는 2 또는 3 PQQGDH 20 Ferri 2 또는 4 또는 8
[재현성의 평가]
재현성은，동일 조건하(글루코스 센서의 구성 및 검체의 농도가 동일)에서의 측정값의 불규칙함에 의하여 평가했다．불규칙함은，상대표준편차(C.V.)에 의하여 평가했다. C.V.는，도 ６~도９에 있어서 각 플롯 점을 계산할 때의 기초로 되는 10 개의 측정 데이터에 근거하여 계산했다．５초값에 관한 결과를 표 ３ 내지 표 ５에, 10초값에 관한 결과를 표 ６ 내지 표 ８에 각각 나타냈다．
[ 재현성] C.V.(％): (전자전달 물질 ８wt％，응답전류 ５초값)
센서 번호 시약층의 조성 글루코스 농도(mg/dL)
0 101 412 624 820 1034
A-3 Ru8%-Cy2U 6.7 1.2 1.4 3.6 0.7 3.5
B-3 Ru8%-α2U 9.4 3.5 1.5 1.3 2.5 1.8
C-3 Ru8%-PQQ2U 6.1 11.1 11.9 13.2 8.0 8.8
D-3 Ru8%-PQQ20U 18.1 2.1 0.9 5.0 13.8 7.6
E-3 Ferri8%-Cy2U 5.0 6.7 4.4 2.1 5.3 2.3
F-3 Ferri8%-α2U 11.1 5.7 4.3 3.3 7.1 3.6
G-3 Ferri8%-PQQ2U 6.0 3.0 7.7 10.6 3.7 9.6
H-3 Ferri8%-PQQ20U 12.9 7.2 2.3 1.9 1.3 2.9
[재현성] C.V.(％):(전자전달 물질 ４wt％，응답 전류 ５초값)
센서 번호 시약층의 조성 글루코스 농도(mg/dL)
0 101 412 624 820 1034
A-2 Ru4%-Cy2U 8.9 2.2 1.0 1.9 2.9 3.8
B-2 Ru4%-α2U 8.9 1.5 3.1 2.3 2.4 6.8
C-2 Ru4%-PQQ2U 12.4 9.2 5.3 14.5 23.1 11.2
D-2 Ru4%-PQQ20U 10.5 1.4 2.8 5.1 6.0 6.1
E-2 Ferri4%-Cy2U 11.0 2.9 1.8 2.2 1.6 2.7
F-2 Ferri4%-α2U 11.0 10.5 5.4 6.0 28.0 6.3
G-2 Ferri4%-PQQ2U 6.5 6.0 12.5 4.4 8.2 3.9
H-2 Ferri4%-PQQ20U 4.9 8.0 5.8 5.4 9.5 22.9
[재현성] C.V.(％): (전자전달 물질 2wt％，응답전류 ５초값)
센서 번호 시약층의 조성 글루코스 농도(mg/dL)
0 101 412 624 820 1034
A-1 Ru2%-Cy2U 17.2 2.0 1.0 1.0 2.2 3.7
B-1 Ru2%-α2U 22.4 1.6 1.8 9.3 7.1 13.0
C-1 Ru2%-PQQ2U 11.1 7.6 23.5 15.8 8.1 32.1
D-1 Ru2%-PQQ20U 8.6 1.8 2.2 6.1 9.0 4.7
E-1 Ferri2%-Cy2U 10.4 2.3 2.0 22.8 37.6 39.1
F-1 Ferri2%-α2U 15.8 4.7 33.8 36.0 41.4 16.6
G-1 Ferri2%-PQQ2U 5.0 6.9 5.3 10.2 12.7 6.9
H-1 Ferri2%-PQQ20U 6.5 6.4 11.9 8.7 39.2 28.4
[재현성] C.V.(％): (전자전달 물질 8wt％，응답전류 10초값)
센서 번호 시약층의 조성 글루코스 농도(mg/dL)
0 101 412 624 820 1034
A-3 Ru8%-Cy2U 6.4 2.2 5.1 4.4 3.0 2.6
B-3 Ru8%-α2U 10.0 3.2 2.9 3.7 3.5 3.3
C-3 Ru8%-PQQ2U 6.9 7.5 9.4 12.4 6.8 10.6
D-3 Ru8%-PQQ20U 16.0 4.0 2.0 2.5 7.2 3.4
E-3 Ferri8%-Cy2U 4.2 5.9 4.5 3.8 5.7 3.1
F-3 Ferri8%-α2U 7.4 6.1 6.3 2.4 7.5 4.6
G-3 Ferri8%-PQQ2U 4.5 2.4 6.2 10.5 3.5 9.5
H-3 Ferri8%-PQQ20U 9.7 6.5 1.4 1.9 2.5 3.3
[재현성] C.V.(％): (전자전달 물질 4wt％，응답전류 10초값)
센서 번호 시약층의 조성 글루코스 농도(mg/dL)
0 101 412 624 820 1034
A-2 Ru4%-Cy2U 10.6 2.0 2.6 2.1 2.1 2.1
B-2 Ru4%-α2U 10.4 1.5 3.4 2.4 3.0 3.2
C-2 Ru4%-PQQ2U 13.5 5.2 5.1 14.5 21.8 10.7
D-2 Ru4%-PQQ20U 10.4 2.6 2.8 2.6 5.4 4.5
E-2 Ferri4%-Cy2U 7.0 2.9 2.9 2.1 2.0 2.2
F-2 Ferri4%-α2U 6.6 5.5 5.1 6.1 35.8 21.0
G-2 Ferri4%-PQQ2U 4.1 3.7 9.8 3.7 7.7 4.7
H-2 Ferri4%-PQQ20U 2.8 3.6 2.1 5.1 4.9 31.2
[재현성] C.V.(％): (전자전달 물질 2wt％，응답전류 10초값)
센서 번호 시약층의 조성 글루코스 농도(mg/dL)
0 101 412 624 820 1034
A-1 Ru2%-Cy2U 18.7 3.6 1.5 1.0 1.8 1.7
B-1 Ru2%-α2U 21.4 2.2 0.9 3.2 28.0 31.8
C-1 Ru2%-PQQ2U 13.0 7.0 22.5 16.7 8.6 30.3
D-1 Ru2%-PQQ20U 12.8 1.3 1.5 2.7 3.9 2.3
E-1 Ferri2%-Cy2U 6.9 0.9 2.0 27.8 48.3 44.6
F-1 Ferri2%-α2U 10.5 3.2 18.8 19.1 39.9 22.9
G-1 Ferri2%-PQQ2U 3.8 4.2 5.4 8.7 11.9 7.8
H-1 Ferri2%-PQQ20U 8.4 13.3 14.6 16.5 38.5 30.6
[검체 중의 Hct의 영향의 검토]
Hct의 영향은，시약층의 조성이 동일한 복수의 글루코스에 관하여，글루코스 농도가 동일하고 Hct 값이 다른 복수의 검체를 이용하여，검체 공급으로부터 일정 시간 경과후의 응답 전류값을 측정함으로써 행했다．글루코스 센서로서는, 본안 센서(１~３) 및 비교 센서를 사용했다．본안 센서(1)에서는，스페이서의 두께를 58 μm로 해서 캐필러리 용적(검체량)을 0.5μL로 설정하고，본안 센서(２)에서는，스페이서의 두께를 44μm로 해서 캐필러리 용적(검체량)을 0.4 μL로 설정하고，본안 센서(３)는，스페이서의 두께를 33μm로 해서 캐필러리 용적(검체량)을 0.3 μL로 설정했다．본안 센서(１~３)에서는，시약층에서 CyGDH의 함유량을 2.0U 상당량, [Ru(NH3)6 ]Cl3 의 함유량을 ４wt％(전자전달 물질의 농도로 환산하여)로 했다. 한편，비교 센서로서는, 아크래이(주)제의 간이혈당값 측정기 글루코카드 전용 센서를 이용했다．이 센서는，산화환원효소로서 GOD를，전자전달 물질로서 Ferri를 이용한 것이다．
본안 센서(１~３)를 이용한 때의 결과는 도 10 Ａ~도 10 Ｃ에，비교 센서를 이용한 때의 결과는 도 10Ｄ에 나타냈다．도 10Ａ~도 10Ｄ에 있어서는, Hct 값이 42％의 때의 응답 전류값을 기준으로 하여, 이 측정값에 대한 차이량(Bias)을 종축으로 나타내고 있다．도 10Ａ~도 10Ｃ에 있어서는 횡축을 시간，도 10Ｄ에 있어서는 횡축을 Hct 값으로 나타내고 있다. 또한, 각 도면에 있어서 각 플롯 점은，５ 회의 측정 평균값으로서 나타내고 있고, 도 10Ｄ에 있어서 플롯 점은，검체의 공급으로부터 30초후의 값에 근거하여 계산한 것이다．
[평가 결과의 고찰]
효소로서 CyGDH，전자전달 물질로서 Ru 착체를 사용한 글루코스 센서(A-1 ~ 3)는，도 ６Ａ 및 도 ８Ａ로부터 알 수 있는 바와 같이, Ru착체의 함유량을 작게 해도 높은 직선성을 얻을 수 있다．이와 같은 결과는，５초 값인지 10초 값인지를 불문하고，또 글루코스 농도가 높은 농도영역(600~1000mg/dL)에 있어서도 얻어지기 때문에，CyGDH와 Ru 착체를 조합한 계는，반응 속도가 크다(Km이 작다)라고 말할 수 있다．표 ３~표８로부터 알 수 있는 것처럼，CyGDH와 Ru 착체를 조합한 계는， C.V.가 작고，재현성이 뛰어나다．이상의 결과를 정리하면, CyGDH와 Ru 착체를 조합한 계는，５초값과 10초값의 쌍방에 있어 Ru의 농도를 변화시켜도，직선성，재현성에서 큰 변화는 없고，５초만에 충분 반응이 종료되고，글루코스를 정량할 수 있다고 말할 수 있다．
αGDH와 Ru 착체를 조합한 글루코스 센서(B-１~3)에서는, 도 ６Ｂ 및 도 ８Ｂ로부터 알 수 있는 바와 같이, Ru 착체의 함유량을 작게(２wt％)한 경우에는 ，글루코스 농도가 높은 농도 영역(600~1000mg/dL)에서 직선성이 약간 흐트러지지지만，기본적으로는, CyGDH와 Ru 착체를 조합한 계와 동일한 결과를 얻을 수 있다．그 때문에, αGDH와 Ru착체를 조합한 계에 대해서도，반응 속도가 크다고 말할 수 있고, 또 표 ３~ 표 ８로부터 알 수 있는 바와 같이，기본적으로는 재현성이 뛰어나다고 말할 수 있다．따라서, αGDH와 Ru 착체를 조합한 계에 대해서도，５초만에 충분 반응이 종료되고，글루코스를 정량할 수 있다고 말할 수 있다．
이에 대하여，Ru와 PQQGDH를 조합한 글루코스 센서(C-1~3, D-1~3)에서는，도 ６Ｃ，도 ６Ｄ 및 도 ８Ｃ，도 ８Ｄ로부터 알 수 있는 바와 같이，직선성을 확보하기 위해서는, Ru 착체 및 산화환원효소의 함유량을 크게 할 필요가 있다．이 경우，시약층의 총량이 커지기 때문에，미량 검체(0.3 μL)를 측정하기 위해 캐필러리 사이즈를 작게 하는 방향성에는 익숙해지지 않아，실용적이지 않다．
전자전달 물질로서 Ferri를 이용한 글루코스 센서(E-1~3, F-1~3, G-1~3, H-1~3)는，도 ７Ａ~도 ７Ｄ 및 도 ９Ａ~도 ９Ｄ로부터 명확한 것처럼，직선성이 나쁘다．게다가，도 ７Ｃ, 도 ７Ｄ 및 도 ９Ｃ, 도 ９Ｄ로 부터 알 수 있는 바와 같이, 산화환원효소로서 PQQGDH를 사용한 글루코스 센서(G-1~3, H-1~3)에서는，효소량을 많게(20U)해도，Ru와 CyGDH를 조합한 계에서는，반응 속도에서 미흡하여，실용적이지 않다고 말할 수 있다．또，표 ３~표 ８로부터 알 수 있는 바와 같이，Ferri 자체의 용해성이 나쁘기 때문인지，전체적으로 재현성이 나쁘고，이 점에서도 실용성을 결여하고 있다고 말할 수 있다．
도 10Ａ~도 10Ｃ에 나타난 것처럼，본안 센서(１~３)에서는，측정 시간을 길게 설정함으로써, Hct의 영향이 작아지고，검체의 공급개시로부터 10 초후에는 대부분에서 Hct의 영향을 받고 있지 않다．한편，캐필러리 용적이 적고，스페이서의 두께가 작은 본안 센서 만큼， Hct의 영향이 작아지고 있다．이것으로부터， Hct의 영향을 억제하기 위해서는，스페이서의 두께를 작게 하여，센서의 전극 표면에서의 글루코스 반응을 재빠르게 일으키는 것이 유용하다고 말할 수 있다．
이에 대하여，비교 센서에서는，검체의 공급개시로부터 30초후에 있어서도， Hct 값이 큰 경우에는， Hct의 영향을 크게 받고 있고，그 Bias 값은，본안 센서의 ５초값에 동등한 정도이다．따라서, Ru 착체와 CyGDH를 조합한 본안 센서(１~３)는，검체량을 적게 해도 짧은 시간에 측정 가능하고，게다가 Hct의 영향을 받기 어렵다．그 때문에, Ru 착체와 CyGDH를 조합한 경우에는，검체량의 감량 및 측정 시간의 단축이 가능하고， Hct의 영향을 받기 어려운 글루코스 센서의 구축이 가능해진다．
이상의 내용으로부터，미량 검체(예를 들면 0.3 μL)로서 단시간에 혈당을 측정하는 경우에 있어서는， Ru와 CyGDH를 조합한 것은，측정 레인지，재현성，측정 시간，Hct의 영향을 회피하는 점에 있어，우위의 조합이라고 말할 수 있다．
본 발명에서는, Ru 착체와 특정한 글루코스 탈수소효소(시토크롬 C가 결합된 것，또는 버크홀데리아 속에 속하는 미생물에서 유래한 것)를 조합한 반응계를 구축함으로써，측정 레인지를 크게 확보하면서，단시간에 정밀도 좋게，헤마토크리트의 영향을 그다지 받는 일 없이，미량의 글루코스 용액을 측정할 수 있다．

Claims (32)

  1. 효소 및 전자전달 물질을 포함하는 반응계를 이용하여 글루코스 농도를 측정하는 방법에 있어서，
    상기 효소로서 시토크롬 C(cytochrome C)가 결합된 글루코스 탈수소효소를 사용하고，
    　　상기 전자전달 물질로서 Ru 화합물을 사용하는, 글루코스 탈수소효소를 이용한 글루코스 농도 측정방법．
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 시토크롬 C는，버크홀데리아(Burkholderia) 속에 속하는 미생물에서 유래한 것인 글루코스 농도 측정방법．
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 시토크롬 C는，환원 조건화에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어，분자량이 약 43kDa인, 글루코스 농도 측정방법．
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 반응계에 대하여 자극을 주는 한편으로，이 자극에 대한 응답을 검출하고，이 응답의 검출량에 근거하여 글루코스 농도를 연산하는, 글루코스 농도 측정방법．
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 글루코스 탈수소효소는，글루코스 탈수소효소 활성을 가지고，또 환원 조건화에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어，분자량이 약 60kDa인 α서브유닛을 가지는, 글루코스 농도 측정방법．
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 글루코스 탈수소효소는，환원 조건화에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어，분자량이 약 14kDa인 γ서브유닛을 가지는, 글루코스 농도 측정방법．
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 Ru 화합물은，하기 화학식으로 표시되는 착체인, 글루코스 농도 측정방법．
    (상기 화학식에서 X는, NH3，할로겐 이온，CN，피리딘，니코틴아미드 또는 H2O이고, ｎ＋는， X의 종류에 따라 결정되는 Ru 착체의 가수를 나타낸다.)
  8. 효소 및 전자전달 물질을 포함하는 반응계를 이용하여 글루코스 농도를 측정하는 방법에 있어서，
    상기 효소로서 버크홀데리아 속에 속하는 미생물에서 유래한 글루코스 탈수소효소를 사용하고，
    상기 전자전달 물질로서 Ru 화합물을 사용하는, 글루코스 탈수소효소를 이용한 글루코스 농도 측정방법．
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 반응계에 대하여 자극을 주는 한편으로，이 자극에 대한 응답을 검출하고，이 응답의 검출량에 근거하여 글루코스 농도를 연산하는, 글루코스 농도 측정방법．
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 글루코스 탈수소효소는，글루코스 탈수소효소 활성을 가지고，또 환원 조건화에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어，분자량이 약 60kDa인 α서브유닛을 가지는, 글루코스 농도 측정방법．
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 글루코스 탈수소효소는，환원 조건화에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어，분자량이 약 14kDa인 γ서브유닛을 가지는, 글루코스 농도 측정방법．
  12. 제 8 항에 있어서,
    상기 Ru 화합물은，하기 화학식으로 표시되는 착체인，글루코스 농도 측정방법．
    (상기 화학식에서 X는, NH3，할로겐 이온，CN，피리딘，니코틴아미드 또는 H2O이고, ｎ＋는， X의 종류에 따라 결정되는 Ru 착체의 가수를 나타낸다.)
  13. 제 １ 및 제 ２ 전극과，효소 및 전자전달 물질을 포함하는 시약층을 구비하고，상기 시약층에 대하여 글루코스 용액을 공급하여 반응계를 구축함과 동시에，이 반응계에 대하여 상기 제 １ 및 제 ２ 전극을 이용하여 자극을 주도록 구성되는 글루코스 센서에 있어서，
    상기 효소로서 시토크롬 C가 결합된 글루코스 탈수소효소를 사용하고，
    상기 전자전달 물질로서 Ru 화합물을 사용하는, 글루코스 센서．
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 시토크롬 C는，버크홀데리아 속에 속하는 미생물에서 유래한 것인, 글루코스 센서．
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 시토크롬 C는，환원 조건화에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어，분자량이 약 43kDa인，글루코스 센서．
  16. 제 13 항에 있어서,
    상기 글루코스 탈수소효소는，글루코스 탈수소효소 활성을 가지고，또 환원 조건화에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어，분자량이 약 60kDa인 α 서브유닛을 가지는, 글루코스 센서．
  17. 제 13 항에 있어서,
    상기 글루코스 탈수소효소는，환원 조건화에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어，분자량이 약 14kDa인 γ서브유닛을 가지는, 글루코스 센서．
  18. 제 13 항에 있어서,
    상기 Ru 화합물은，하기 화학식으로 표시되는 착체인 글루코스 센서．
    (상기 화학식에서 X는, NH3，할로겐 이온，CN，피리딘，니코틴아미드 또는 H2O이고, ｎ＋는， X의 종류에 따라 결정되는 Ru 착체의 가수를 나타낸다.)
  19. 제 13 항에 있어서,
    상기 시약층이 설치되고，또 시료액을 유지하기 위한 액 유지공간을 더 구비하고，
    상기 시약층은，고층(固層)으로 구성됨과 동시에，상기 액 유지공간에서 시료액을 유지한 상태에서는，상기 산화환원효소 및 전자전달 물질 중 적어도 일부가 상기 시료액에 용해되도록 구성되는, 글루코스 센서．
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 액 유지공간의 용량은， 0.1~ 0.5 μL인 글루코스 센서．
  21. 제 19 항에 있어서,
    상기 시약층에서 효소의 함유량은，글루코스 탈수소효소 활성 1.0~10.0U에 상당하는 양인，글루코스 센서．
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 시약층에서 전자전달 물질의 함유량은，상기 액 유지공간이 시료액으로 가득 찬 때의 전자전달 물질의 농도로 환산하여 1.0~5.0wt％에 상당하는 양인, 글루코스 센서．
  23. 제 19 항에 있어서,
    상기 액 유지공간은，모세관력에 의하여 시료액을 이동시키도록 구성되는 글루코스 센서．
  24. 제 １ 및 제 ２ 전극과，효소 및 전자전달 물질을 포함하는 시약층을 구비하고，상기 시약층에 대하여 글루코스 용액을 공급하여 반응계를 구축함과 동시에，이 반응계에 대하여 상기 제 １ 및 제 ２ 전극을 이용하여 자극을 주도록 구성되는 글루코스 센서에 있어서，
    상기 효소로서 버크홀데리아 속에 속하는 미생물에서 유래한 글루코스 탈수소효소를 사용하고，
    상기 전자전달 물질로서 Ru 화합물을 사용하는, 글루코스 센서．
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 글루코스 탈수소효소는，글루코스 탈수소효소 활성을 가지고，또 환원 조건화에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어，분자량이 약 60kDa인 α서브유닛을 가지는, 글루코스 센서．
  26. 제 24 항에 있어서,
    상기 글루코스 탈수소효소는，환원 조건화에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어，분자량이 약 14kDa인 γ서브유닛을 가지는, 글루코스 센서．
  27. 제 24 항에 있어서,
    상기 Ru 화합물은，하기 화학식으로 표시되는 착체인 글루코스 센서．
    (상기 화학식에서 X는, NH3，할로겐 이온，CN，피리딘，니코틴아미드 또는 H2O이고, ｎ＋는，X의 종류에 따라 결정되는 Ru 착체의 가수를 나타낸다.)
  28. 제 24 항에 있어서,
    상기 시약층이 설치되고，또 시료액을 유지하기 위한 액 유지공간을 더 구비하고，
    상기 시약층은，고층(固層)으로 구성됨과 동시에，상기 액 유지공간에서 시료액을 유지한 상태에서는，상기 산화환원효소 및 전자전달 물질 중 적어도 일부가 상기 시료액에 용해되도록 구성되는, 글루코스 센서．
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 액 유지공간의 용량은，0.1~0.5μL인 글루코스 센서．
  30. 제 28 항에 있어서,
    상기 시약층에서 효소의 함유량은，글루코스 탈수소효소 활성 1.0~10.0U에 상당하는 양인 글루코스 센서．
  31. 제 30 항에 있어서,
    상기 시약층에서 전자전달 물질의 함유량은，상기 액 유지공간이 시료액으로 가득 찬 때의 전자전달 물질의 농도로 환산하여 1.0~5.0wt％에 상당하는 양인，글루코스 센서．
  32. 제 24 항에 있어서,
    상기 액 유지공간은，모세관력에 의하여 시료액을 이동시키도록 구성되는 글루코스 센서．
KR1020047020491A 2002-06-17 2003-06-16 글루코스 탈수소효소를 이용한 글루코스 농도 측정방법 및글루코스 센서 KR100729307B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002176368 2002-06-17
JPJP-P-2002-00176368 2002-06-17
PCT/JP2003/007630 WO2003106702A1 (ja) 2002-06-17 2003-06-16 グルコース脱水素酵素を用いたグルコース濃度測定方法およびグルコースセンサ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20050019139A true KR20050019139A (ko) 2005-02-28
KR100729307B1 KR100729307B1 (ko) 2007-06-15

Family

ID=29728091

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020047020491A KR100729307B1 (ko) 2002-06-17 2003-06-16 글루코스 탈수소효소를 이용한 글루코스 농도 측정방법 및글루코스 센서

Country Status (9)

Country Link
US (2) US7341846B2 (ko)
EP (1) EP1522592B1 (ko)
JP (1) JP4621841B2 (ko)
KR (1) KR100729307B1 (ko)
CN (2) CN102533939B (ko)
AT (1) ATE403742T1 (ko)
AU (1) AU2003241683A1 (ko)
DE (1) DE60322708D1 (ko)
WO (1) WO2003106702A1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8562815B2 (en) 2011-09-08 2013-10-22 Korea Institute Of Geoscience And Mineral Resources Glucose sensor having titanium dioxide-graphene composite
KR20150112875A (ko) 2014-03-28 2015-10-07 에스케이이노베이션 주식회사 이중 전극쌍을 이용한 전기화학 바이오 센서
WO2020235919A1 (ko) * 2019-05-20 2020-11-26 서강대학교 산학협력단 탄소나노튜브를 포함하는 생체신호 측정용 전기화학적 바이오 센서 및 이의 제조방법

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060231396A1 (en) 2002-12-20 2006-10-19 Hideaki Yamaoka Thin analyzing device
WO2005023111A1 (ja) * 2003-09-02 2005-03-17 Koji Sode グルコースセンサおよびグルコース濃度測定装置
JP5021183B2 (ja) * 2005-05-20 2012-09-05 アークレイ株式会社 タンパク質固定化膜および固定化方法、ならびにバイオセンサ
EP2447271A1 (en) * 2005-12-21 2012-05-02 F. Hoffmann-La Roche AG Redox mediators
JP2007197297A (ja) * 2005-12-27 2007-08-09 Canon Inc 多孔体、多孔体を含む組成物及び多孔体を備えるセンサー
WO2008040984A1 (en) 2006-10-05 2008-04-10 Lifescan Scotland Limited A reagent formulation using ruthenium hexamine as a mediator for electrochemical test strips
EP2095114B1 (en) * 2006-11-20 2013-01-02 Bayer HealthCare, LLC Test-sensor cartridge
MX2010000972A (es) * 2007-07-26 2010-03-01 Home Diagnostics Inc Sistema y metodos que determinan concentracion de analito utilizando amperometria resuelta en tiempo.
US8101062B2 (en) 2007-07-26 2012-01-24 Nipro Diagnostics, Inc. System and methods for determination of analyte concentration using time resolved amperometry
KR101103682B1 (ko) * 2008-04-08 2012-01-11 주식회사 올메디쿠스 바이오센서
EP2426200A4 (en) 2009-04-30 2012-11-14 Ikeda Food Res Co Ltd ELECTRONIC MEDIATOR OF PROTEIN TYPE
EP2333544A1 (de) * 2009-12-11 2011-06-15 F. Hoffmann-La Roche AG Sterilisierbare Chemie für Testelemente
WO2014002999A1 (ja) * 2012-06-25 2014-01-03 合同会社バイオエンジニアリング研究所 酵素電極
CN106232830B (zh) * 2014-04-18 2020-02-14 株式会社同仁化学研究所 脱氢酶及其基质浓度的测定方法，电子中介和包含该电子中介的脱氢酶及其基质用测定试剂
CN110291185B (zh) * 2017-07-14 2022-08-09 泰尔茂株式会社 血糖值测定芯片及血糖值测定装置套组
CN108120794A (zh) * 2017-12-21 2018-06-05 深圳市赛亿科技开发有限公司 一种智能杯子及其检测饮料中葡萄糖浓度的方法
WO2021158973A1 (en) 2020-02-06 2021-08-12 Trustees Of Boston University Enzyme-based electrochemical nicotine biosensor
WO2021221752A2 (en) 2020-02-06 2021-11-04 Trustees Of Boston University High throughput assay for identifying microbial redox enzymes
WO2023074454A1 (ja) 2021-10-28 2023-05-04 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 酸化還元酵素及び補酵素を含む反応系を用いた処理装置並びにその制御方法
WO2023074455A1 (ja) 2021-10-28 2023-05-04 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 処理装置の制御方法、酵素電極及び処理装置

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3479522D1 (en) * 1983-12-16 1989-09-28 Medisense Inc Assay for nucleic acids
US5205920A (en) * 1989-03-03 1993-04-27 Noboru Oyama Enzyme sensor and method of manufacturing the same
US6852502B1 (en) * 1995-06-06 2005-02-08 Bioveris Corporation Electrochemiluminescent enzyme biosensors
JP3267936B2 (ja) 1998-08-26 2002-03-25 松下電器産業株式会社 バイオセンサ
DE60018039T2 (de) * 1999-11-22 2005-09-29 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd., Kadoma Sensor und verfahren zum messen von cholesterin
AU1099102A (en) * 2000-10-31 2002-05-15 Koji Sode Novel glucose dehydrogenase and process for producing the dehydrogenase
ATE505724T1 (de) * 2001-09-14 2011-04-15 Arkray Inc Verfahren, gerät und vorrichtung zur konzentrationsmessung

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8562815B2 (en) 2011-09-08 2013-10-22 Korea Institute Of Geoscience And Mineral Resources Glucose sensor having titanium dioxide-graphene composite
KR20150112875A (ko) 2014-03-28 2015-10-07 에스케이이노베이션 주식회사 이중 전극쌍을 이용한 전기화학 바이오 센서
WO2020235919A1 (ko) * 2019-05-20 2020-11-26 서강대학교 산학협력단 탄소나노튜브를 포함하는 생체신호 측정용 전기화학적 바이오 센서 및 이의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
CN102533939A (zh) 2012-07-04
EP1522592A4 (en) 2006-07-19
CN1662660A (zh) 2005-08-31
JPWO2003106702A1 (ja) 2005-10-13
EP1522592B1 (en) 2008-08-06
DE60322708D1 (de) 2008-09-18
CN102533939B (zh) 2013-11-20
WO2003106702A1 (ja) 2003-12-24
US20080131919A1 (en) 2008-06-05
AU2003241683A1 (en) 2003-12-31
JP4621841B2 (ja) 2011-01-26
EP1522592A1 (en) 2005-04-13
US7341846B2 (en) 2008-03-11
KR100729307B1 (ko) 2007-06-15
US7824881B2 (en) 2010-11-02
US20060035300A1 (en) 2006-02-16
ATE403742T1 (de) 2008-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100729307B1 (ko) 글루코스 탈수소효소를 이용한 글루코스 농도 측정방법 및글루코스 센서
JP4352153B2 (ja) 薄型分析用具
EP1398386B1 (en) Mediator stabilized reagent compositions and methods for their use in electrochemical analyte detection assays
JP4385219B2 (ja) 濃度測定方法
US8062490B2 (en) Reagent compositions for use in electrochemical detection
WO2005066638A1 (ja) 試薬部の配置を改良した分析用具および分析方法
US8871069B2 (en) Low total salt reagent compositions and systems for biosensors
CN1938589B (zh) 用于实现用于生物传感器的基于阈值的校正函数的方法和装置
US20090071823A1 (en) Disposable enzymatic sensor for liquid samples
JP2006017720A (ja) レドックス試薬システム用酵素の特性決定方法、電気化学セルおよびこれを備えるシステム
Arai et al. Electrochemical characteristics of glucose oxidase immobilized in poly (quinone) redox polymers
US20220112536A1 (en) Oxygen-insensitive electrochemical biosensor and methods of use thereof
AU2012268873B2 (en) Improved reagent compositions for use in electrochemical detection
JP2004317359A (ja) バイオセンサおよび酵素保存方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
G170 Re-publication after modification of scope of protection [patent]
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130531

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140602

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150601

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160603

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170602

Year of fee payment: 11