CN1486367A - 新的果糖基氨基酸氧化酶 - Google Patents
新的果糖基氨基酸氧化酶 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1486367A CN1486367A CNA018221459A CN01822145A CN1486367A CN 1486367 A CN1486367 A CN 1486367A CN A018221459 A CNA018221459 A CN A018221459A CN 01822145 A CN01822145 A CN 01822145A CN 1486367 A CN1486367 A CN 1486367A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acid
- dna
- oxidase
- fructoamino
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010078123 amadoriase Proteins 0.000 title abstract 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 66
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 86
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 47
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 34
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 13
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 238000007669 thermal treatment Methods 0.000 claims description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 4
- MOOYVEVEDVVKGD-UHFFFAOYSA-N oxaldehydic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)C=O MOOYVEVEDVVKGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 69
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 58
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 43
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 43
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 28
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 21
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 15
- 102220369447 c.1352G>A Human genes 0.000 description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 101100351747 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) pfa-5 gene Proteins 0.000 description 9
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- YGUYJMQMTNJNFS-LPBLVHEISA-N fructosylglycine Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CNCC(O)=O YGUYJMQMTNJNFS-LPBLVHEISA-N 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 7
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 5
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical group 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 102220023258 rs387907548 Human genes 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- IRQRBVOQGUPTLG-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(n-ethyl-3-methylanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC=CC(C)=C1 IRQRBVOQGUPTLG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- POECFFCNUXZPJT-UHFFFAOYSA-M sodium;carbonic acid;hydrogen carbonate Chemical compound [Na+].OC(O)=O.OC([O-])=O POECFFCNUXZPJT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 3
- 108010064696 N,O-diacetylmuramidase Proteins 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SAHQGRZIQVEJPF-JXUBOQSCSA-N Ala-Thr-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN SAHQGRZIQVEJPF-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- IETUUAHKCHOQHP-KZVJFYERSA-N Ala-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)[C@@H](C)O)C(O)=O IETUUAHKCHOQHP-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- JUWQNWXEGDYCIE-YUMQZZPRSA-N Arg-Gln-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O JUWQNWXEGDYCIE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 2
- XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N Gly-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)CNC(=O)C[NH3+] XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 2
- SBVMXEZQJVUARN-XPUUQOCRSA-N Gly-Val-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SBVMXEZQJVUARN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- YAALVYQFVJNXIV-KKUMJFAQSA-N His-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 YAALVYQFVJNXIV-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- KFQDSSNYWKZFOO-LSJOCFKGSA-N His-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KFQDSSNYWKZFOO-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N Ser-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XSLXHSYIVPGEER-KZVJFYERSA-N Thr-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XSLXHSYIVPGEER-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- UKEVLVBHRKWECS-LSJOCFKGSA-N Val-Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N UKEVLVBHRKWECS-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 102220369445 c.668T>C Human genes 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- -1 ethyl methanesulfonic Chemical compound 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 102220004457 rs11567847 Human genes 0.000 description 2
- 102220023257 rs387907546 Human genes 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000148131 Colibacter Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H iron(3+) sulfate Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229910000360 iron(III) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 1
- 235000020712 soy bean extract Nutrition 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了具有优良的热稳定性的新的果糖基氨基酸氧化酶。此外，还公开了编码此新的果糖基氨基酸氧化酶的果糖基氨基酸氧化酶基因；其中的果糖基氨基酸氧化酶基因插入到载体中的重组DNA；含有此基因的转化体或转导体；以及制备新的果糖基氨基酸氧化酶的方法，其包括在培养基中培养上述的转化体或转导体以及从培养物中收集新的果糖基氨基酸氧化酶。
Description
发明领域
本发明涉及在高温下具有稳定性的新的果糖基氨基酸氧化酶、编码此新的果糖基氨基酸氧化酶的基因、以及制备此氧化酶的方法。
发明背景
在氧存在的条件下，果糖基氨基酸氧化酶通过氧化亚氨基二乙酸或其衍生物(也称为“Amadori化合物”)催化产生二羟乙酸或α-酮醛、α-氨基酸和过氧化氢的反应。果糖基氨基酸氧化酶是在真菌和细菌中发现的。本发明提出了利用这些酶测定食物中包含并在体内产生的Amadori化合物的分析方法(日本专利公开(Kokoku)No.5-33997，日本专利公开(Kokoku)No.6-65300，日本专利公开(Kokai)No.2-195900，日本专利公开(Kokai)No.3-155780，日本专利公开(Kokai)No.4-4874，日本专利公开(Kokai)No.5-192193，及日本专利公开(Kokai)No.6-4686)。
最近，在临床诊断领域中，HbAlc(糖基化血红蛋白)作为血糖控制标记已经吸引了研究者的注意力，其在诊断病理状况和控制糖尿病患者的症状方面具有重要性。作为快速且简单测定HbAlc的方法，本发明提出了利用果糖基氨基酸氧化酶进行的酶促测定方法并进行了实际应用。特别的，此方法包括利用蛋白酶等降解HbAlc，以及随后测定由此而释放的果糖基缬氨酸(亚氨基二乙酸的衍生物，其中缬氨酸的α-氨基进行了糖基化)。在作为此测定方法中的酶的多种果糖基氨基酸氧化酶中，在测定的快速和准确性方面，对底物果糖基缬氨酸具有高活性，而对ε-果糖基赖氨酸(一种Amadori化合物，其中赖氨酸的ε-氨基进行了糖基化)不具有活性的酶是尤其优良的。这样的酶的示例是源自棒状杆菌属细菌的果糖基氨基酸氧化酶。然而，在45℃下热处理10分钟可使上述果糖基氨基酸氧化酶失活90％或更多。由于其低耐热性，当其在试剂盒试剂中作为临床诊断用酶时，果糖基氨基酸氧化酶在其贮存稳定性方面存在问题。
发明简述
本发明的目的是克服传统的果糖基氨基酸氧化酶的这些缺陷，从而提供了在高温度范围内具有高稳定性的果糖基氨基酸氧化酶、编码此氧化酶的基因、以及制备此氧化酶的方法。
通过进行了与上述目的直接相关的广泛研究，我们通过发现，如通过修饰源自棒状杆菌的果糖基氨基酸氧化酶(日本专利公开(Kokai)No.11-155579)可获得在高温度范围内展示高稳定性的新的果糖基氨基酸氧化酶而完成了本发明。
也即，本发明为新的果糖基氨基酸氧化酶，其具有下列物理化学特性：
(a)作用和底物特异性：在氧存在下，通过氧化亚氨基二乙酸或其衍生物而催化产生二羟乙酸或α-酮醛、α-氨基酸和过氧化氢的反应，但不作用于ε-果糖基赖氨酸；
(b)最佳pH范围：7.5-8.5；
(c)稳定pH范围：5.0-10.0；
(d)作用的最佳温度范围：40℃-50℃；
(e)热稳定性：当在50℃下热处理10分钟时，展示出80％或更多的剩余活性；及
(f)分子量：约88,000(利用凝胶过滤确定)；约44,000(利用SDS-PAGE确定)。
进一步，本发明提供了具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的下列蛋白(a)、(b)或(c)：
(a)包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白；
(b)包含通过对SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列缺失、取代和/或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列并具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白；或
(c)包含展示出与SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列具有8 0％或更多同源性的氨基酸序列并具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白。
进一步，本发明提供了编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的下列蛋白(a)、(b)或(c)的基因：
(a)包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白；
(b)包含通过对SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列缺失、取代和/或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列并具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白；或
(c)包含展示出与SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列具有8 0％或更多同源性的氨基酸序列并具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白
进一步，本发明提供了包含编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的下列DNA(a)、(b)或(c)的基因：
(a)包含SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列的DNA；
(b)严格条件下与包含一种核苷酸序列的DNA杂交，并且编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的DNA，所述核苷酸序列互补于包含SEQ ID NO：4所表示的核苷酸序列的DNA的完整序列或具有其15个或更多核苷酸的一部分；或
(c)与包含DNA SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列的DNA的完整序列或具有其15个或更多核苷酸的一部分具有80％或更多同源性，并且编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的DNA。
进一步，本发明提供了重组DNA，其中上述基因是插入到载体DNA中的。
进一步，本发明提供了含有上述重组DNA的转化体或转导体。
进一步，本发明提供了制备新的果糖基氨基酸氧化酶的方法，该方法包括在培养基中培养上述转化体或转导体并从培养产物中收集新的果糖基氨基酸氧化酶。
附图简述
图1展示了本发明的氧化酶(4型)的最佳pH。
图2展示了本发明的氧化酶(4型)的最佳反应温度范围。
图3展示了本发明的氧化酶(4型)的稳定pH范围。
图4展示了本发明的氧化酶(4型)的热稳定性。
实施本发明的最佳方式
本发明的详细描述如下。
本发明中的新的果糖基氨基酸氧化酶(以下称作“本发明的氧化酶”)是具有下列物理化学特性的果糖基氨基酸氧化酶：
(a)作用和底物特异性：在氧存在下，果糖基氨基酸氧化酶通过氧化亚氨基二乙酸或其衍生物(Amadori化合物)催化下式表示的反应产生二羟乙酸或α-酮醛、α-氨基酸和过氧化氢。
在此式中，R1表示-OH，-[CH(OH)n]-CH2OH或-(CH2)n-CH3，n表示0-4的整数，R2表示α-氨基酸的侧链残基。只要其可用于快速而简单的检测在诊断糖尿病中重要的血糖对照标记HbAlc，那么具有上述作用和底物特异性的任何酶都可用于本发明中。这样的酶优选本发明中对果糖基缬氨酸具有高活性的氧化酶，并且尤其优选本发明中对果糖基缬氨酸具有高活性而不作用于或很难作用于ε-果糖基赖氨酸的氧化酶。这些具有上述作用和底物特异性的酶的示例包括源自棒状杆菌属细菌的果糖基氨基酸氧化酶(日本专利公开(Kokoku)No.6-65300)等。
(b)最佳pH范围：7.5-8.5
通过在37℃下并在每一pH下利用缓冲溶液如McIlvaine缓冲液(pH4.0-6.0)、100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0-8.5)或100mM碳酸氢钠碳酸盐缓冲液(pH9.0-10.0)进行酶反应发现了最佳pH。
(c)稳定pH范围：5.0-10.0
在每一pH下，利用缓冲溶液如McIlvaine缓冲液(pH3.0-6.0)、100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0-8.5)或100mM碳酸氢钠碳酸盐缓冲液(pH9.0-10.0)，通过测定在37℃下处理10分钟时酶的剩余活性发现了其稳定pH范围。
(d)作用的最佳温度范围：40℃-50℃
利用在下文中描述的活性测定方法中的反应溶液，在多种温度下测定酶的活性，从而发现了作用的最佳温度范围。
(e)热稳定性：当在50℃下热处理10分钟时，保留80％或更多的活性
利用100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0-8.5)在50℃处理10分钟后，测定酶的剩余活性。本发明中的酶是与传统的酶不同的新颖酶，尤其是由于其高温度范围内的高稳定性。本发明中的氧化酶为这样的酶的示例，其在上述处理条件下展示出50％或更高，优选80％或更高，尤其优选90％或更高的剩余活性。
(f)分子量：约88,000(利用凝胶过滤确定)；约44,000(利用SDS-PAGE确定)
按照标准方法，通过利用Sephadex G-200进行柱凝胶过滤和通过利用multi-ge110/20(Daiichi Pure Chemicals)进行SDS-PAGE分别发现了其分子量。
如上所述，本发明中的氧化酶在物理化学特性方面与任何已知的果糖基氨基酸氧化酶不同，因此是新的果糖基氨基酸氧化酶。尤其由于此氧化酶具有不作用于ε-果糖基赖氨酸且具有高热稳定性的特性，所以其显著优于已知的酶。因此，鉴于氧化酶具有优良的贮存稳定性，所以其可包含在试剂盒试剂中作为临床诊断用酶。
本发明中的氧化酶示例包括那些源自通过筛选天然生物体获得的多种生物体以及通过对传统的果糖基氨基酸氧化酶进行修饰而获得的氧化酶。特定示例是本发明中的下列氧化酶(a)、(b)或(c)：
(a)含有SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶；
(b)包含通过对SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列缺失、取代和/或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶；或
(c)包含展示出与SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列具有8 0％或更多同源性的氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶。
“缺失、取代和/或添加一个或几个氨基酸”指缺失、取代和/或添加任意数量的氨基酸，例如1-20，优选1-10，以及更优选1-5。
此外，只要与SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的同源性为80％或更多，那么“展示出80％或更多同源性”就没有特别限制。这样的同源性为，如80％或更多，优选90％或更多，以及最优选95％或更多。
含有编码本发明中的新的果糖基氨基酸氧化酶的果糖基氨基酸氧化酶基因示例(下文称作“本发明中的基因”)包括编码本发明的上述氧化酶(a)、(b)或(c)以及编码本发明的氧化酶的含有下列DNA(a)、(b)或(c)基因：
(a)含有SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列的DNA；
(b)在严格条件下与包含一种核苷酸序列的DNA杂交，并且编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的DNA，所述核苷酸序列互补于包含SEQ ID NO：4所表示的核苷酸序列的DNA的完整序列或其具有15个或更多核苷酸的一部分；或
(c)与包含DNA SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列的DNA的完整序列或其具有15个或更多核苷酸的一部分具有80％或更多同源性，并且编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的DNA。
此处，“在严格条件下杂交的DNA”指利用以DNA作为探针的方法，如菌落杂交、噬菌斑杂交或southern印记杂交获得的DNA。这些DNA的特定示例包括可通过在65℃下利用固定化有源自菌落或噬菌斑的DNA或DNA片段的滤膜进行杂交并在65℃下对滤膜进行冲洗而鉴定DNA。可按照分子生物学实验方法(WILEY Interscience，1989)等中现有的方法进行杂交。在严格条件下进行杂交的DNA的一个示例为与作为探针的DNA具有特定百分比或更高同源性的DNA。在本发明中，“含有展示出与核苷酸序列的完整序列或具有其15个或更多核苷酸的一部分具有80％或更多同源性的DNA”的同源性为，如80％或更多，优选90％或更多，以及最优选95％或更多。
下一步，描述了获取本发明中的氧化酶和本发明中的基因的方法。
本发明中的氧化酶可通过筛选源自微生物、动物或植物的酶来从自然界获得。也可利用如基因工程技术或突变处理等方法对具有与本发明中的酶不同的物理化学特性的果糖基氨基酸氧化酶(下文称作“具有不同特性的氧化酶”)进行修饰来获取本发明中的氧化酶。具有与本发明中的酶不同特性的氧化酶为，如上述已知的氧化酶等。其也可为通过筛选获得的新果糖基氨基酸氧化酶，以及通过利用基因工程技术等进行修饰获得的果糖基氨基酸氧化酶。已知的氧化酶的示例优选源自棒状杆菌属细菌的果糖基氨基酸氧化酶(日本专利公开(Kokoku)NO.6-65300)。
用于对具有不同特性的氧化酶的物理化学特性进行修饰的方法的示例包括：利用如紫外线、X-射线或放射性射线等对微生物等进行照射以产生氧化酶；或将微生物与诱变试剂如乙基甲烷磺酸、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍或亚硝酸进行接触；获取产生了本发明中的修饰后的氧化酶的微生物；并随后从已获得的微生物体中获取本发明中的氧化酶。
然而，一般来讲，可通过利用基因工程技术修饰编码具有不同特性的氧化酶等的基因来获取本发明中的氧化酶。作为编码具有与本发明中的酶不同特性的氧化酶的基因，只要通过修饰利用此基因可获得本发明中的氧化酶，那就可选用编码任何果糖基氨基酸氧化酶的任何基因。
利用常规的和通用的基因克隆方法获得了编码与本发明中应用的氧化酶具有不同特性的氧化酶基因。例如，利用标准方法，如分子生物学实验方法(WILEY Interscience，1989)等中现有的方法从能够生产具有不同特性的氧化酶的微生物体和多种细胞中提取染色体DNA或mRNA。进一步，可以mRNA为模板合成cDNA。构建了以此获得的染色体DNA或cDNA文库。下一步，在上述具有不同特性的上述氧化酶的氨基酸序列基础上合成了合适的探针DNA，随后利用此探针筛选染色体DNA或cDNA文库；或在上述氨基酸序列基础上制备了适当的引物DNA，利用适当的多聚酶链式反应(PCR法)如3’RACE或5’RACE法对含有靶基因片段的DNA进行扩增，随后将它们连接在一起，这样就获得了含有全长靶基因的DNA。这样获得的编码具有不同特性的氧化酶的基因的优选示例为源自棒状杆菌属细菌的果糖基氨基酸氧化酶基因(日本专利公开(Kokai)NO.11-155579)。在操作方面，可按照标准方法将这些基因优选的连接到多种载体上。例如，利用如QIAGEN(Qiagen)从含有编码具有不同特性的氧化酶且源自分离的棒状杆菌属物种菌株2.4.1的基因的重组质粒pFA5 DNA(日本专利公开(Kokai)NO.11-155579)中提取和纯化这些基因。此外，本发明中应用的载体DNA示例包括质粒载体DNA如pUC119(Takara Shuzo)、pBR322(TakaraShuzo)和pMAL-C2(NEW England Labs)以及细菌噬菌体载体DNA如λENBL3(Stratagene)和λDASHII(FUNAKOSHI)。特别的，例如优选pBluescriptIISK+(Stratagene)。
其次，可对编码利用上述方法获得的具有不同特性的氧化酶的基因进行修饰以获得本发明中的氧化酶。特别的，在本发明中，对编码具有不同特性的氧化酶的基因进行修饰造成了这些基因所翻译的具有不同特性的氧化酶的氨基酸序列改变。因此，在本发明中的氧化酶之外，获得了具有不同特性的未修饰的氧化酶和多种具有不同物理化学特性的果糖基氨基酸氧化酶。
没有对用于进行修饰且编码具有不同特性的氧化酶的基因进行特别限制。本发明的一个实施方案为编码具有不同特性的、源自棒状杆菌属物种菌株2.4.1(日本专利公开(Kokai)NO.11-155579，SEQ IDNO：3)的基因。进一步，另一方案为具有进行了修饰的核苷酸序列的基因，从而不具有或具有适于在宿主生物体内进行基因表达的氨基酸残基的添加、缺失或取代。
作为上述基因的修饰方法，可以选用任何已知方法。这些方法的示例包括可使上述重组质粒pFA5 DNA(日本专利公开(Kokai)NO.11-155579)与突变化学试剂如羟胺或亚硝酸进行接触的方法，或点突变法，如涉及利用PCR法这一已知的技术进行随机化修饰的突变方法、利用商业试剂盒引起定点取代或缺失突变的定点诱变、以及可选择性切割重组质粒DNA并去除或添加并连接选定的寡核苷酸的寡核苷酸诱变法。紧接上述处理，利用QIAGEN脱盐柱(Qiagen)等对重组DNA进行纯化，从而得到了多种重组DNA。
例如，利用这样获得的多种重组DNA对大肠杆菌K12，优选大肠杆菌JM109或DH5α(皆由TOYOBO制备)，或XL1-Blue(FUNAKOSHI)进行转化或转导，这样就获得了包含具有多种修饰的果糖基氨基酸氧化酶基因片段的重组DNA的转化体或转导体。至于转化体，例如具有本发明的靶物理化学特性(在高温度范围内具有稳定性)的转化体(产生本发明中的氧化酶的菌株)是选自已获得的转化体(其含有重组体质粒DNA，而此质粒DNA含有多种突变果糖基氨基酸氧化酶基因)。
其次，为了筛选产生本发明中的氧化酶的菌株，例如，可选用下列方法。首先，利用无菌绒布等从上文获得的转化体已在其上形成了菌落的LB琼脂培养基中获取了多个复制物，随后将它们转移到新鲜的琼脂培养基上进行培养。当琼脂培养基上复制平铺的菌落达到足够大小时，将在裂解试剂如溶菌酶中浸过的膜铺到培养基上。随后，将培养基在37℃下静置1小时进行裂解。此时，裂解后的粗酶液吸附到了膜上。将吸附有粗酶液的膜在55℃下静置1小时后，将膜置于用含有底物果糖基甘氨酸、过氧化物酶、TOOS及4-氨基安替比林的0.1M磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)浸没的膜上，随后观察紫色产生的程度。利用类似的方法也对产生未修饰的、具有不同特性的氧化酶的菌株进行紫色产生检验。因此，通过对比紫色的产生就可对靶转化体进行筛选。
可利用这种方式获得能够产生本发明中的氧化酶的转化体。示例为本发明中含有SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列的氧化酶，其是利用上述修饰方法对源自具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列棒状杆菌属细菌的果糖基氨基酸氧化酶(日本专利公开(Kokoku)NO.6-65300)进行修饰获得的。如果必要，可利用能够产生本发明中的氧化酶的转化体通过上述修饰方法对本发明中的基因进一步进行重复修饰，这样就能够得到具有高热抗性的、本发明的修饰后氧化酶和能够产生氧化酶的转化体。特别的，在本发明中，本发明中的氧化酶也包括，例如含有通过对SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列缺失、取代和/或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶，以及含有展示出与SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列具有80％或更多同源性氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶。一个特定示例为在实施例中描述的本发明的氧化酶(3型)。3型氧化酶通过对氨基酸残基进行取代而具有源自SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列并具有90％或更多同源性。进一步，这样获得的产生本发明的氧化酶的转化体示例为可产生本发明的氧化酶(4型)的大肠杆菌(E.coli)DH5α(pFAH5)，当在50℃下热处理10分钟时其具有90％的剩余活性，并且其具有SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列。
此外，本发明的基因的示例为上述本发明的氧化酶(4型)的基因(SEQ ID NO：4)。如上所述，含有包含编码SEQ ID NO：2的SEQ IDNO：4的基因的质粒pFAH5保藏(最开始的保藏日期：2000年11月22日)在国际专利生物保藏中心Depositary(IPOD)，通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，日本(Centra16，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)，保藏号为FERM BP-7378。本发明中的基因的进一步的示例为编码本发明中的氧化酶，例如含有通过对SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列缺失、取代和/或添加一或多个氨基酸而获得的氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶，以及含有展示出与SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列具有80％或更多同源性的氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶。本发明的基因的另一个示例为包含在严格条件下与包含一种核苷酸序列的DNA杂交，并且编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的DNA，所述核苷酸序列互补于包含SEQ IDNO：4所表示的核苷酸序列的DNA的完整序列或其具有15个或更多核苷酸的一部分，或者包含与包含DNA SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列的DNA的完整序列或其具有15个或更多核苷酸的一部分具有80％或更多同源性，并且编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的DNA。“具有15个或更多核苷酸的一部分”的特定示例包括SEQ ID NO：1-14的核苷酸序列，其为SEQ ID NO：4的部分序列。此外，另一含有展示出80％或更多同源性的核苷酸序列的DNA示例为包含利用定位于SEQ IDNO：3的151位核苷酸上游的核苷酸序列取代定位于SEQ ID NO：4的151位核苷酸上游的核苷酸序列而从SEQ ID NO：4得到的核苷酸序列的DNA，因为它编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
其次，本发明中的氧化酶是通过在培养基中培养能够产生本发明中的氧化酶的微生物并从培养物中收集果糖基氨基酸氧化酶来制备的。只要其能够产生本发明中的氧化酶，任何微生物可用来生产本发明中的氧化酶。这样的微生物的示例包括上文获得的且能够产生本发明中的氧化酶的转化体或转导体。例如，本发明中的氧化酶可利用能够产生本发明中的氧化酶且优选属于大肠杆菌属的转化体菌株来制备。上述微生物可利用固体培养法进行培养，但优选利用液体培养法进行培养。此外，用于培养上述微生物的培养基含有，如一或多种氮源，如酵母提取物、蛋白胨、肉提取物、玉米浆或大豆浸出物或小麦酒曲，其中添加有一或多种无机盐如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化铁、硫酸铁或硫酸锰。如果必要，培养基可适当的进一步添加糖、维生素等。此外，可适当调节培养基的初始pH为7-9。此外，优选通过具有通气和搅拌的浸没培养、振荡培养、静态培养等在30-42℃下，优选37℃培养6-24小时。为了从培养后的培养物中收集本发明中的氧化酶，应用了通用的测定法对收集的酶进行测定。例如，利用如过滤和离心并随后冲洗等方法从培养物溶液中分离微生物体。优选从微生物体中收集本发明中的氧化酶。在这种情况下，可完整使用微生物体。优选的，如通过利用多种破裂措施如超声波、弗氏压碎器、或dyno-mill进行微生物体破碎的方法、利用细胞壁裂解酶如溶菌酶裂解微生物细胞壁的方法或利用表面活性剂如Triton X-100从微生物体中提取酶的方法来从微生物体中收集本发明中的氧化酶。
为了从获得的粗酶液中分离本发明中的氧化酶，可选用通常用于酶纯化的方法来进行分离。例如，优选结合使用硫酸胺盐析、有机溶剂沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析、吸附层析和电泳。以这种方式，本发明中的氧化酶的纯化程度可达到在SDS-PAGE中几乎为一条单独的电泳条带。此外，按照它们的应用，适当结合利用上述方法，可以得到在纯化程度上有差别的酶样品。
测定本发明中的酶的活性的重要方法的示例包括用于测定酶反应中产生的过氧化氢量的方法以及用于测定酶反应中消耗的氧的量的方法。作为一个示例，下文展示了测定过氧化氢量的方法。在下文中，除非特别指出，果糖基甘氨酸用作测定本发明中的酶活性的底物。1单位(1U)酶效价定义为当以果糖基甘氨酸为底物进行测定时每分钟产生1μmol过氧化氢所需的酶量。
A.试剂制备
(1)试剂1：POD-4-AA溶液
将1.0kU过氧化物酶(TOYOBO，TYPE III)和100mg 4-氨基安替比林(Tokyo Kasei Kogyo)溶解在0.1M磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)中并稀释到1L。
(2)试剂2：TOOS溶液
将500mg TOOS(DOJINDO)溶解在离子交换水中并稀释到100mL。
(3)试剂3：底物溶液(150mM，终浓度：5mM)
将357mg果糖基甘氨酸溶解在离子交换水中并稀释到10ml。当利用果糖基缬氨酸和ε-果糖基赖氨酸作为底物时，这种情况下应用的溶液是通过将417mg果糖基缬氨酸或462mg ε-果糖基赖氨酸溶解在离子交换水中并稀释到10ml制得的。
B.测定方法
在添加了酶液并与溶液混合后，在37℃下加热(预热)5分钟。随后，向其中添加100ul试剂3并混合均匀。利用分光光度计(U-2000A，Hitachi)测定555nm下的吸光度。待测定的值是在混合后1-3分钟时间内每分钟555nm处吸光度值的变化。此外，除了添加的是100μl离子交换水而不是试剂3外，利用与上述相似的方法制备了对照溶液。随后，通过利用以前制备的过氧化氢标准溶液而不是试剂3以及利用离子交换水而不是酶溶液进行的检验制作了一个图来展示其与产生的色素体积的关系。利用此图，计算了在37℃下每分钟产生的过氧化氢的量(微摩尔)并将此值定义为酶溶液中的活性单位。
实施例
利用下列实施例对本发明进行更特别的描述。这些实施例没有用来限制本发明的技术领域的意图。
(A)制备重组质粒
分别制备了具有不同特性的氧化酶基因(具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的基因，编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的基因)的重组质粒DNA以及具有氧化酶基因的重组质粒DNA，其中已经对此基因编码氨基末端的核苷酸序列区进行了修饰以适于大肠杆菌利用密码子，从而提高基因在大肠杆菌中的表达量。为了制备下述的本发明中的氧化酶，可应用任何质粒。利用具有修饰的氧化酶基因的重组质粒DNA在大量生产本发明中的氧化酶方面是有效的。
(1)制备重组质粒pFA5 DNA
将含有上述氧化酶基因(含有SEQ ID NO：3所表示的核苷酸序列的基因)的重组质粒的大肠杆菌DH5α(pFA5)接种到20mlLB培养基(1％Bacto-Trypton，0.5％酵母提取物，及0.25％NaCl)中，随后在37℃下振荡培养20小时，以此来获得培养物。上述大肠杆菌DH5α(pFA5)保藏(最开始的保藏日期：1997年11月21日)在国际专利生物保藏中心Depositary(IPOD)，通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，日本(Centra 16，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)，保藏号为FERM BP-6182。将培养物在7000rpm下离心5分钟收集细菌，从而获得了菌体。随后利用QIAGEN tip-100(Qiagen)从菌体中提取并随后纯化重组质粒pFA5 DNA，这样获得了100μg重组质粒pFA5 DNA。
(2)制备在氨基末端侧链上具有修饰的核苷酸序列的重组质粒pFAN5 DNA
利用Sawaday Technology的客户合成服务获得了具有在SEQ IDNO：3的氨基末端核苷酸序列信息基础上设计用于大肠杆菌密码子使用的SEQ ID NO：4部分序列或其互补链，SEQ ID NO：5-12的核苷酸序列的寡核苷酸，以及具有设计来利用PCR法扩增SEQ ID NO：3的羧基末端的SEQ ID NO：13和14的核苷酸序列的寡核苷酸。利用T4多核苷酸激酶(Takara Shuzo)分别对SEQ ID NO：5-12的序列进行磷酸化。同时，以具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的pFA5 DNA为模板、SEQID NO：13和14为引物、以及Ex Taq多聚酶(Takara Shuzo)进行PCR反应，以此制备编码C末端侧的基因片段。此外，利用Nde I(Daiichi Pure Chemicals)和BamH I(Takara Shuzo)对片断进行消化。此外，利用Nde I对pUTE500k’DNA(在Journal ofBiotechnology
52(1996)11-20中有描述)进行消化后，通过BAP处理进行脱磷酸化(此处所用试剂由Takara Shuzo生产)。将适量的利用上述方法获得的6磷酸化寡核苷酸、源自pFA5 DNA的基因片断以及pUTE500k’DNA混合，随后利用连接试剂盒ver.2(Takara Shuzo)进行连接。将获得的质粒命名为pFAF5。此外，利用BamH I和Bgl II对质粒进行消化，并将其插入到在利用BamH I切割后利用BAP处理的pBluescript II SK+中。产物命名为pFAN5。随后，利用(1)中描述的方法制备了100μg pFAN5 DNA。
(B)制备本发明中的氧化酶及能够产生本发明中的氧化酶的转化体
(1)修饰方法(给予热抗性)
利用上述的100μg重组质粒pFAN5 DNA中的20μg重组质粒，按照D.M.Morrison(Enzymology，68，326-331，1979)中的方法对XL1-RED(STRATAGENE)(当进行增殖时，其可在质粒复制中产生错误，这样可很容易进行修饰)进行转化，这样获得了大约5000株转化体菌株。为了从所有克隆中收集质粒DNA，将QIAGEN sol I(Qiagen)接种到琼脂培养基上，利用涂布器将所有菌落耙到一起，然后利用吸管进行收集。随后，利用标准的QIAGEN法获得了100μg修饰后的重组质粒pFAN5 DNA。按照D.M.Morrison(Method inEnzymology，68，326-331，1979)中的方法，利用20ug pFAN5 DNA对大肠杆菌DH5a(TOYOBO)进行转化，随后获得了大约1000株具有修饰的质粒的转化体菌株。
(2)筛选可产生本发明的氧化酶的菌株
首先，利用无菌绒布在新琼脂培养基上复制平铺上述获得的所有转化体，随后在30℃下培养过夜。将浸泡在10mg/ml溶菌酶(Sigma)中的Hybond-N+(Amersham)置于获得的复制菌落上，同时要避免其间进入气泡，随后在37℃下静置30分钟。然后，从琼脂培养基中去除Hybond-N+，然后将其置于新的琼脂培养基上，其表面(粗酶液粘附其上)要置于前面，然后在55℃下处理1小时。同时，将Hybond-N+浸没于含有2mM果糖基甘氨酸、1mg/ml过氧化物酶(TOYOBO)、1mg/ml4-氨基安替比林(Tokyo Kasei)和10mg/ml TOOS(DOJINDO)的0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)中。将这样制备得到的Hybond-N+置于以前的Hybond-N+上，其已经置于菌落上的表面朝里，并随后在30℃下静置。然后，筛选出所有菌落中的展示出高水平显色的菌株。
将这样获得的10株显色菌株与液体在2ml LB培养基(添加有50μg氨苄青霉素)中进行培养，随后可产生包含在质粒中的修饰的果糖基氨基酸氧化酶。培养结束后，利用超声波将获得的培养产物破裂。在47℃下对0.5ml粗酶提取物处理10分钟，随后在12000rpm下离心5分钟，以此来收集上清液。对上清液和未处理的粗酶提取物的活性进行测定，这样就可计算得到剩余的活性比率(上清液中的活性/未处理粗酶液中的活性)。同样的，进行培养、提取、热处理和活性测定操作。对比修饰的氧化酶和具有不同特性的未修饰的氧化酶的剩余活性比率。因此，获得了具有改进的25％剩余活性的修饰的果糖基氨基酸氧化酶(1型)和产生氧化酶的大肠杆菌。
(3)修饰的积累
按照(A)(1)中描述的方法，从产生上步获得的(修饰后的)氧化酶(I型)的菌株中制备质粒DNA。按照(1)中的方法重新导入突变。随后，以以前获得的(修饰后的)氧化酶(I型)作为进行比较的对照，按照(2)中的方法进行筛选。当在47℃下进行10分钟热处理时，利用这样的方法获得的大肠杆菌产生的进一步修饰的果糖基氨基酸氧化酶(2型)展示出改进的70％的剩余活性比率。
利用可产生上述的进一步修饰的氧化酶(2型)的大肠杆菌重复了与上文类似的步骤。当在50℃下进行10分钟热处理时，利用这样的方法获得的大肠杆菌产生的本发明的氧化酶(3型)展示出改进的80％的剩余活性比率。利用可产生本发明中的氧化酶(3型)的大肠杆菌重复了与上文类似的步骤。当在50℃下进行10分钟热处理时，利用这样的方法获得的大肠杆菌DH5α(pFAH5)产生的本发明的氧化酶(4型)展示出改进的90％的剩余活性比率。编码本发明中的氧化酶(4型)的基因的质粒pFAH5保藏在国际专利生物保藏中心Depositary(IPOD)，通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，日本(Centra16，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)，保藏号为FERM BP-7378。
(4)鉴定修饰发生的位点
收集含有修饰的果糖基氨基酸氧化酶基因的质粒，随后利用370ADNA序列分析系统(Applied Biosystems)确定核苷酸序列。在核苷酸序列基础上，对修饰后的氨基酸残基进行鉴定。
因此，本发明中的氧化酶(4型)基因展示出具有SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列。此外，如SEQ ID NO：2所示，预测的氨基酸序列是通过利用甘氨酸取代60位的苏氨酸、利用甘氨酸取代188位的丙氨酸、利用亮氨酸取代244位的蛋氨酸、利用丝氨酸取代257位的天冬酰胺、利用蛋氨酸取代261位的亮氨酸而从SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列衍生获得的。同样的，证明本发明中的氧化酶(3型)是通过利用甘氨酸取代60位的苏氨酸、利用甘氨酸取代188位的丙氨酸、利用亮氨酸取代244位的蛋氨酸、利用蛋氨酸取代261位的亮氨酸而从SEQID NO：1表示的氨基酸序列衍生获得的。
(C)本发明中的氧化酶的制备及其物理化学特性
如上所述获得了产生本发明的氧化酶(4型)的转化体并将大肠杆菌DH5α(pFAH5)接种到10L LB-amp培养基中，随后在1L/min通气量和600rpm搅拌速度条件下，在30℃下利用罐发酵器振荡培养24小时。在7000rpm下将获得的10L培养物溶液离心10分钟以收集细菌，随后将细菌悬浮在1L 50mM磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)中。随后，利用超声波使菌体破裂并在10000rpm下离心10min以收集上清液，这样就制得了粗酶溶液。向此5kU粗酶溶液中添加氯化钾，使其终浓度达到0.1M。将此溶液吸附到已经利用含有0.1M氯化钾的50mM磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)平衡过的1L DEAE-Sephacel柱层析上，随后利用1L相同的缓冲溶液冲洗。然后，各利用10L含有0.2M氯化钾的50mM磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)及含有0.4M氯化钾的50mM磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)对酶活性部分进行梯度洗脱。活性部分的比活性为2.4U/OD280nm。
本发明中获得的氧化酶(4型)的物理化学特性如下。
(1)作用和底物特异性
以果糖基甘氨酸、果糖基缬氨酸和ε-果糖基赖氨酸为底物，利用上述的酶活性测定法测定了本发明中的酶的活性。本发明中的氧化酶作用于果糖基甘氨酸和果糖基缬氨酸，但不作用于ε-果糖基赖氨酸。
(2)最佳pH
在37℃的每一pH下，利用缓冲溶液如McIlvaine缓冲液(pH4.0-6.0)、100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0-8.5)或100mM碳酸氢钠碳酸盐缓冲液(pH9.0-10.0)进行酶反应。结果得到的相对活性如图1所示。如图1中所示，本发明中的氧化酶的最佳pH为7.5-8.5。
(3)作用的最佳温度范围
在多个温度下，利用与文中描述的酶活性测定方法中应用的反应溶液组成相同的反应溶液来测定酶活性。结果如图2所示。如图2所示，本发明中的氧化酶的最佳作用温度为40-50℃。
(4)稳定pH范围
在每个pH下，利用缓冲溶液如McIlvaine缓冲液(pH3.0-6.0)、100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0-8.5)或100mM碳酸氢钠碳酸盐缓冲液(pH8.5-10.0)在37℃下进行10min处理后，测定了本发明中的氧化酶的剩余活性。剩余活性结果如图3所示。如图3所示，本发明中的氧化酶的稳定pH为5.0-10.0。
(5)热稳定性
当利用100mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)在每个温度下进行10min处理时，热稳定性结果如图4所示。本发明中的氧化酶在45℃左右保持稳定。
(6)分子量
按照标准方法，通过利用Sephadex G-200进行的柱凝胶过滤法(在含有0.1M氯化钾的50mM磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)中)和通过利用multi-gel10/20(Daiichi Pure Chemicals)进行的SDS-PAGE发现了其分子量。本发明中的氧化酶的分子量约为88,000(利用凝胶过滤确定)或约为44,000(利用SDS-PAGE确定)。
(7)等电点
按照标准方法，利用等电聚焦法测定得到本发明中的氧化酶的等电点约为pH4.2。
工业实用性
按照本发明，提供了当作为临床诊断试剂中的酶时具有较高热稳定性的新的果糖基氨基酸氧化酶、编码此酶的基因、其中的基因插入到载体DNA中的重组DNA、包含此基因的转化体等、以及制备氧化酶的方法。因此，本发明是在工业上是有用的。
本说明书包含作为本申请优先权文件的日本专利申请No.2000-360590和2001-243049的说明书中公开的部分或全部内容。此处引用的所有出版物、专利和专利申请在此处都全文引用作为参考文献。
序列表<110>龟甲万株式会社<120>新的果糖基氨基酸氧化酶<130>PH-1294-PCT<140><141><150>JP 2000-360590<151>2000-11-28<150>JP-2001-243049<151>2001-08-10<160>14<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>372<212>PRT<213>棒状杆菌(Corynebacterium sp.)<400>1Met Ser Ser Thr Ala Thr Lys His Val Ala Val Ile Gly Gly Gly Ile1 5 10 15Leu Gly Val Ser Thr Ala Val His Leu Leu Arg Gln Gly Ala Thr Val
20 25 30Thr Leu Leu Thr Glu Gln Gly Leu Ala Ser Glu Ala Thr Gly Arg Ser
35 40 45Leu Ser Trp Leu Asn Ser Ala Gly Glu Arg Ser Thr Pro Tyr His Gln
50 55 60Leu Arg Ile Ala Gly Val Asp Arg Tyr Arg Thr Leu Phe Ala Ala Asp65 70 75 80Pro Ser Arg Glu Trp Leu Gln Phe Gly Gly Gly Leu Met Trp Asn Ala
85 90 95Ala Gly Glu Ser Glu Val Thr Lys Ala Arg His Ala Tyr Glu Lys Ser
100 105 110Ile Gly Tyr Asp Ser Gln Leu Leu Ala Pro Glu Glu Ile Gly Ser Val
115 120 125Thr Pro Gly Ile Asp Ala Ser Ala Val Pro Glu Asn Ala Ile Phe Asn130 135 140Pro Gly Glu Gly Trp Val Ser Leu Pro Asp Leu Val Asn Phe Leu Met145 150 155 160Glu Glu Phe His Ala Leu Gly Gly Gln Leu Val Leu Asn Ala Gly Lys
165 170 175Ala Ser Val Met Val Glu Gly Gly Arg Ala Thr Ala Val Glu Thr Ala
180 185 190Thr Gly Glu Thr Tyr Pro Ala Asp Ala Val Leu Val Ala Cys Gly Ala
195 200 205Ala Thr Pro Ala Val Val Lys Pro Leu Gly Val Glu Ile Pro Asn Gly210 215 220Ser Pro Val Ser Met Leu Val Val Thr Lys Pro Val Glu His Gln Val225 230 235 240Ala Ala Val Met Asn Thr Pro Arg Ala Ala Val Arg Pro Asn Pro Gly
245 250 255Asn Thr Phe Ala Leu Asp His Asp Trp Tyr Glu Gly His Ile Thr Glu
260 265 270His Ala Asp Gly Ser Phe Thr Ile Pro Asp Asp Val Val Gln Glu Leu
275 280 285Ala Asp Glu Ser Ser Lys Leu Ile Ala Gly Asn Pro Glu Leu Lys Pro290 295 300Ala Ser Trp Lys Ile Gly Tyr Lys Pro Ile Pro Gly Asp Gly Glu Pro305 310 315 320Val Phe Gly Glu Leu Gly Arg Val Pro Gly Cys Phe Val Ala Phe Thr
325 330 335His Ser Gly Ala Thr Leu Gly Leu Ile Ala Gly Glu Leu Leu Ser Gly
340 345 350Glu Ile Leu Thr Gly Asp Lys His Pro Met Phe Ala Thr Phe Arg Pro
355 360 365Gly Arg Phe Ser370<210>2<211>372<212>PRT<213>棒状杆菌(Corynebacterium sp.)<400>2Met Ser Ser Thr Ala Thr Lys His Val Ala Val Ile Gly Gly Gly Ile1 5 10 15Leu Gly Val Ser Thr Ala Val His Leu Leu Arg Gln Gly Ala Thr Val
20 25 30Thr Leu Leu Thr Glu Gln Gly Leu Ala Ser Glu Ala Thr Gly Arg Ser
35 40 45Leu Ser Trp Leu Asn Ser Ala Gly Glu Arg Ser Ala Pro Tyr His Gln
50 55 60Leu Arg Ile Ala Gly Val Asp Arg Tyr Arg Thr Leu Phe Ala Ala Asp65 70 75 80Pro Ser Arg Glu Trp Leu Gln Phe Gly Gly Gly Leu Met Trp Asn Ala
85 90 95Ala Gly Glu Ser Glu Val Thr Lys Ala Arg His Ala Tyr Glu Lys Ser
100 105 110Ile Gly Tyr Asp Ser Gln Leu Leu Ala Pro Glu Glu Ile Gly Ser Val
115 120 125Thr Pro Gly Ile Asp Ala Ser Ala Val Pro Glu Asn Ala Ile Phe Asn
130 135 140Pro Gly Glu Gly Trp Val Ser Leu Pro Asp Leu Val Asn Phe Leu Met145 150 155 160Glu Glu Phe His Ala Leu Gly Gly Gln Leu Val Leu Asn Ala Gly Lys
165 170 175Ala Ser Val Met Val Glu Gly Gly Arg Ala Thr Gly Val Glu Thr Ala
180 185 190Thr Gly Glu Thr Tyr Pro Ala Asp Ala Val Leu Val Ala Cys Gly Ala
195 200 205Ala Thr Pro Ala Val Val Lys Pro Leu Gly Val Glu Ile Pro Asn Gly
210 215 220Ser Pro Val Ser Met Leu Val Val Thr Lys Pro Val Glu His Gln Val225 230 235 240Ala Ala Val Leu Asn Thr Pro Arg Ala Ala Val Arg Pro Asn Pro Gly
245 250 255Ser Thr Phe Ala Met Asp His Asp Trp Tyr Glu Gly His Ile Thr Glu
260 265 270His Ala Asp Gly Ser Phe Thr Ile Pro Asp Asp Val Val Gln Glu Leu
275 280 285Ala Asp Glu Ser Ser Lys Leu Ile Ala Gly Asn Pro Glu Leu Lys Pro290 295 300Ala Ser Trp Lys Ile Gly Tyr Lys Pro Ile Pro Gly Asp Gly Glu Pro305 310 315 320Val Phe Gly Glu Leu Gly Arg Val Pro Gly Cys Phe Val Ala Phe Thr
325 330 335His Ser Gly Ala Thr Leu Gly Leu Ile Ala Gly Glu Leu Leu Ser Gly
340 345 350Glu Ile Leu Thr Gly Asp Lys His Pro Met Phe Ala Thr Phe Arg Pro
355 360 365Gly Arg Phe Ser
370<210>3<211>1116<212>DNA<213>棒状杆菌(Corynebacterium sp.)<400>3atgtcctcca ccgctaccaa gcatgtcgcc gtcattggcg gcggcatcct gggcgtctcc 60accgccgtcc acctgctccg ccaaggcgca acagtcaccc tcttgaccga acagggcctc 120gccagcgaag ccacgggccg gtccttgtcc tggctcaact ccgccgggga acgctccact 180ccctatcacc agctgcgcat cgctggcgtt gaccggtacc gcacgctgtt cgccgccgat 240cccagccggg aatggttgca gttcgggggc gggctcatgt ggaacgccgc cggggaaagt 300gaggtcacca aagcccggca cgcctacgag aagtccatcg gctacgactc ccaactgctg 360gcccctgaag aaatcggctc ggtcacgcca ggcatcgacg ccagtgccgt cccggagaac 420gcaatcttca atcctggcga gggctgggtc agcctgccgg acctggtgaa cttcctgatg 480gaggaattcc acgccctggg cggccagttg gtcctcaacg caggtaaagc ctcggtgatg 540gtcgagggcg gccgggctac cgcggtcgaa accgccaccg gtgaaaccta ccccgcggac 600gccgttctcg tagcctgcgg tgccgcgacg ccggccgtcg taaaaccgct cggggtcgag 660ataccgaacg gttccccggt ctccatgctg gttgttacca agcccgtgga gcaccaggtc 720gcggcagtga tgaatacgcc gcgcgctgcc gtgcgaccca atccgggtaa cacttttgcc 780ttggatcacg actggtatga agggcacatc actgagcacg cggacggttc gttcaccatc 840ccggatgatg tcgtccagga attggcagac gagtcatcca agctgatcgc aggaaacccc 900gagctcaagc cggcatcgtg gaagatcggt tacaagccga tcccgggcga cggcgaacca 960gtcttcgggg aactcggccg agtaccgggc tgcttcgtgg ctttcaccca ctcaggtgcc 1020accctgggcc tcatcgcagg cgaattgctc tccggggaga tcctgacggg ggacaagcac 1080cccatgttcg ccacgttccg gccgggccgg ttctcc 1116<210>4<211>1116<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的序列<400>4atgagcagca ctgctaccaa acatgtggcg gttattggtg gaggtattct gggtgttagc 60actgcggttc atctgctgcg tcaaggtgca actgttaccc tgctgaccga acagggtctg 120gcgagcgaag cgaccggtat atccctgtcc tggctcaact ccgccgggga acgctccgct 180ccctatcacc agctgcgcat cgctggcgtt gaccggtacc gcacgctgtt cgccgccgat 240cccagccggg aatggttgca gttcgggggc gggctcatgt ggaacgccgc cggggaaagt 300gaggtcacca aagcccggca cgcctacgag aagtccatcg gctacgactc ccaactgctg 360gcccctgaag aaatcggctc ggtcacgcca ggcatcgacg ccagtgccgt cccggagaac 420gcaatcttca atcctggcga gggctgggtc agcctgccgg acctggtgaa cttcctgatg 480gaggaattcc acgccctggg cggccagttg gtcctcaacg caggtaaagc ctcggtgatg 540gtcgagggcg gccgggctac cggcgtcgaa accgccaccg gtgaaaccta ccccgcggac 600gccgttctcg tagcctgcgg tgccgcgacg ccggccgtcg taaaaccgct cggggtcgag 660ataccgaacg gttccccggt ctccatgctg gttgttacca agcccgtgga gcaccaggtc 720gcggcagtgc tgaatacgcc gcgcgctgcc gtgcgaccca atccgggtag cacttttgcc 780atggatcacg actggtatga agggcacatc actgagcacg cggacggttc gttcaccatc 840ccggatgatg tcgtccagga attggcagac gagtcatcca agctgatcgc aggaaacccc 900gagctcaagc cggcatcgtg gaagatcggt tacaagccga tcccgggcga cggcgaacca 960gtcttcgggg aactcggccg agtaccgggc tgcttcgtgg ctttcaccca ctcaggtgcc 1020accctgggcc tcatcgcagg cgaattgctc tccggggaga tcctgacggg ggacaagcac 1080cccatgttcg ccacgttccg gccgggccgg ttctcc 1116<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的序列<400>5tatgagcagc actgctacca aaca 24<210>6<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的序列<400>6tgtggcggtt attggtggag gtattctggg tgttagca 38<210>7<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的序列<400>7ctgcggttca tctgctgcgt caaggtgcaa ctgttaccct gc 42<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的序列<400>8tgaccgaaca gggtctggcg agcgaagcga ccggta 36<210>9<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的序列<400>9accaataacc gccacatgtt tggtagcagt gctgctca 38<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的序列<400>10gcagcagatg aaccgcagtg ctaacaccca gaataccacc 40<210>11<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的序列<400>11gaccctgttc ggtcagcagg gtaacagttg caccttgac 39<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的序列<400>12gatctaccgg tcgcttcgct cgcca 25<210>13<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的序列<400>13gaagccacgg gcggatccct gtcctggctc aactccgcc 39<210>14<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的序列<400>14gggaattcca tatgctagga gaaccggccc ggccggaa 38
Claims (7)
1.具有下列物理化学特性的新的果糖基氨基酸氧化酶：
(a)作用和底物特异性：在氧存在下，通过氧化亚氨基二乙酸或其衍生物而催化产生二羟乙酸或α-酮醛、α-氨基酸和过氧化氢的反应，但不作用于ε-果糖基赖氨酸；
(b)最佳pH范围：7.5-8.5；
(c)稳定pH范围：5.0-10.0；
(d)作用的最佳温度范围：40℃-50℃；
(e)热稳定性：当在50℃下热处理10分钟时，展示出80％或更多的剩余活性；及
(f)分子量：约88,000(利用凝胶过滤确定)；约44,000(利用SDS-PAGE确定)。
2.具有果糖基氨基酸氧化酶活性的下列蛋白(a)、(b)或(c)：
(a)包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白；
(b)包含通过对SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列缺失、取代和/或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列并具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白；或
(c)包含展示出与SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列具有80％或更多同源性的氨基酸序列并具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白。
3.编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的下列蛋白(a)、(b)或(c)的基因：
(a)包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白；
(b)包含通过对SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列缺失、取代和/或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列并具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白；或
(c)包含展示出与SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列具有80％或更多同源性的氨基酸序列并具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白。
4.包含下列DNA(a)、(b)或(c)的基因：
(a)包含SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列的DNA；
(b)严格条件下与包含一种核苷酸序列的DNA杂交，并且编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的DNA，所述核苷酸序列互补于包含SEQ ID NO：4所表示的核苷酸序列的DNA的完整序列或具有其15个或更多核苷酸的一部分；或
(c)与包含DNA SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列的DNA的完整序列或具有其15个或更多核苷酸的一部分具有80％或更多同源性，并且编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的DNA。
5.一种重组DNA，其中权利要求3或4中的基因插入到载体DNA中。
6.含有权利要求5中的重组DNA的转化体或转导体。
7.制备新的果糖基氨基酸氧化酶的方法，该方法包括在培养基中培养权利要求6中的转化体或转导体并从培养产物中收集新的果糖基氨基酸氧化酶。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP360590/2000 | 2000-11-28 | ||
| JP2000360590 | 2000-11-28 | ||
| JP360590/00 | 2000-11-28 | ||
| JP243049/01 | 2001-08-10 | ||
| JP243049/2001 | 2001-08-10 | ||
| JP2001243049 | 2001-08-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1486367A true CN1486367A (zh) | 2004-03-31 |
| CN1243831C CN1243831C (zh) | 2006-03-01 |
Family
ID=26604679
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN01822145.9A Expired - Lifetime CN1243831C (zh) | 2000-11-28 | 2001-11-21 | 果糖基氨基酸氧化酶 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7091017B2 (zh) |
| EP (1) | EP1344828B1 (zh) |
| JP (1) | JP4133326B2 (zh) |
| CN (1) | CN1243831C (zh) |
| AU (1) | AU2002224060A1 (zh) |
| DE (1) | DE60139893D1 (zh) |
| WO (1) | WO2002044387A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104611319A (zh) * | 2015-01-26 | 2015-05-13 | 温州医科大学 | 一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004038033A1 (ja) * | 2002-10-23 | 2004-05-06 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | 脱フルクトシル化方法 |
| EP2520650A3 (en) * | 2006-04-25 | 2012-11-21 | Kikkoman Corporation | Eukaryotic amadoriase having excellent thermal stability, gene and recombinant DNA for the eukaryotic amadoriase, and process for production of eukaryotic amadoriase having excellent thermal stability |
| DE102006021401A1 (de) * | 2006-05-08 | 2007-12-13 | Henkel Kgaa | Amadoriasen in Wasch- und Reinigungsmitteln |
| US9701949B2 (en) | 2011-12-28 | 2017-07-11 | Kikkoman Corporation | Amadoriase with improved thermostability, gene and recombinant DNA for the amadoriase, and method for production of amadoriase with improved thermostability |
| CN103695380B (zh) * | 2013-12-27 | 2016-05-25 | 宁波美康生物科技股份有限公司 | 果糖氨基酸氧化酶、制备方法及含该酶的糖化白蛋白检测试剂盒 |
| US10533160B2 (en) | 2016-12-13 | 2020-01-14 | Industrial Technology Research Institute | Recombinant protein, and preparation method and application thereof |
| IT201700070452A1 (it) * | 2017-06-23 | 2018-12-23 | Fondazione St Italiano Tecnologia | Thermostabilized amadoriases and uses thereof |
| CN114350632A (zh) * | 2022-03-21 | 2022-04-15 | 南京巨匠生物科技有限公司 | 果糖基氨基酸氧化酶突变体及其应用和产品、基因、质粒和基因工程菌 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0665300B2 (ja) | 1985-05-22 | 1994-08-24 | 財団法人野田産業科学研究所 | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ |
| JPH11155579A (ja) | 1997-11-25 | 1999-06-15 | Kikkoman Corp | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造法 |
-
2001
- 2001-11-21 JP JP2002546735A patent/JP4133326B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-21 WO PCT/JP2001/010167 patent/WO2002044387A1/ja active Application Filing
- 2001-11-21 DE DE60139893T patent/DE60139893D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-21 AU AU2002224060A patent/AU2002224060A1/en not_active Abandoned
- 2001-11-21 EP EP01998165A patent/EP1344828B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-21 CN CN01822145.9A patent/CN1243831C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-21 US US10/416,537 patent/US7091017B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104611319A (zh) * | 2015-01-26 | 2015-05-13 | 温州医科大学 | 一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法 |
| CN104611319B (zh) * | 2015-01-26 | 2016-09-07 | 温州医科大学 | 一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002044387A1 (fr) | 2002-06-06 |
| AU2002224060A1 (en) | 2002-06-11 |
| EP1344828B1 (en) | 2009-09-09 |
| JPWO2002044387A1 (ja) | 2004-04-02 |
| DE60139893D1 (de) | 2009-10-22 |
| US20040115662A1 (en) | 2004-06-17 |
| EP1344828A1 (en) | 2003-09-17 |
| CN1243831C (zh) | 2006-03-01 |
| US7091017B2 (en) | 2006-08-15 |
| JP4133326B2 (ja) | 2008-08-13 |
| EP1344828A4 (en) | 2004-09-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPWO2010053161A1 (ja) | 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ | |
| EP0821064B1 (en) | Recombinant fructosyl amino acid oxidase | |
| JP6048850B2 (ja) | Ｄ−サクシニラーゼ、およびこれを用いたｄ−アミノ酸の製造方法 | |
| CN1486367A (zh) | 新的果糖基氨基酸氧化酶 | |
| CN1834236A (zh) | 野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶a变体及其应用 | |
| CN100335638C (zh) | 嗜热长链烷烃单加氧酶及其编码基因与应用 | |
| CN1239142A (zh) | 乳发酵短杆菌细胞色素bd型醌醇氧化酶基因 | |
| CN1055314C (zh) | 从葡聚糖明串珠菌克隆和过量表达葡糖－6－磷酸脱氢酶 | |
| CN104066843A (zh) | 新型l-氨基酸氧化酶、l-赖氨酸的测定方法、试剂盒和酶传感器 | |
| JPWO2015008637A1 (ja) | キサンチンオキシダーゼ遺伝子とそれをコードするアミノ酸配列 | |
| CN109715799A (zh) | 经修饰的肌氨酸氧化酶及其基因和制造方法 | |
| Gholizadeh et al. | Molecular cloning and expression in Escherichia coli of an active fused Zea mays L. D-amino acid oxidase | |
| CN109423483A (zh) | 葡萄糖氧化酶突变体 | |
| JP6130161B2 (ja) | 新規ｌ−アルギニン酸化酵素、ｌ−アルギニンの測定方法、ｌ−アルギニンの測定用キットおよびｌ−アルギニン測定用の酵素センサ | |
| JP3819969B2 (ja) | 組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ | |
| CN1457362A (zh) | 新型dna编码的d－酰化氨基酸水解酶以及将其用于生产d－氨基酸的方法 | |
| CN1270224A (zh) | 编码新的氨肽酶的dna分子和生产该氨肽酶的方法 | |
| JP4489598B2 (ja) | Ｄ−アミノアシラーゼ | |
| JP4639235B2 (ja) | Ｌ−カルニチン生合成関連遺伝子を含む腸内細菌属微生物、およびその微生物を用いたｌ−カルニチンの産生方法 | |
| CN1233832C (zh) | 制造l－肉毒碱的微生物学方法 | |
| JP5354710B2 (ja) | 高活性カタラーゼ産生微生物及びその使用 | |
| JP4150576B2 (ja) | 耐熱性ｌ−アミノ酸酸化酵素 | |
| KR100563820B1 (ko) | 트리페닐메탄 색소 환원효소 및 그 유전자 | |
| CN1661016A (zh) | 小麦高光效和抗逆相关的苹果酸脱氢酶、其编码基因及培育抗逆植物的方法 | |
| JP2009072196A (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CX01 | Expiry of patent term | ||
| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20060301 |