CN114058653A - 一种生物合成法制备γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生物合成法制备γ‑氨基丁酸的方法，首先配制含谷氨酸脱氢酶菌株质量体积浓度0.15‑0.25％、谷氨酸钠20‑30g/L、pH值5.0‑5.5的初始转化液；初始转化液在30‑35℃下反应，反应过程中维持反应溶液导电率不高于40ms/cm。本发明以价格低廉、水溶性高的谷氨酸钠为γ‑氨基丁酸生物合成底物，通过降低反应溶液中Na+浓度可使以谷氨酸钠为底物的γ‑氨基丁酸转化量提高一倍以上，是一种成本低、产量高的γ氨基丁酸生物合成方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种生物合成法制备γ-氨基丁酸的方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-氨基丁酸)是L-谷氨酸脱去α-羧基的产物，是哺乳动物中枢神经系统的抑制性传递物质，用途广泛，可用于食品、饲料、医药和化工等行业中。γ-氨基丁酸，具有镇静神经、促进睡眠、降低血压、健脑益智、延缓衰老、健肝利肾等重要的生理功能。
目前，γ-氨基丁酸的生产方法主要包括化学合成法、植物富集法和生物合成法。其中，化学合成法成本较高且使用有机溶剂，甚至是强腐蚀、有毒溶剂，安全性能差。植物富集法含量较低，反应液成分复杂，产物提取十分困难；生物合成法安全性高，反应条件温和，提取工艺简单，有显著优势，其主要原理是利用含有L-谷氨酸脱羧酶的微生物使底物谷氨酸钠或者谷氨酸在L-谷氨酸脱羧酶的作用下脱去α-羧基制备成γ-氨基丁酸。
生物合成法虽然安全，其生产成本较高。为了进一步提高产量、降低成本，一些现有技术筛选催化活性更高的谷氨酸脱羧酶工程菌，如中国专利 CN108467860A公开了一种高产γ-氨基丁酸的方法，通过蛋白质工程改造谷氨酸脱羧酶基因后获得重组菌株，该重组菌株转化谷氨酸生产γ-氨基丁酸产量可以达到425.9g/L，谷氨酸摩尔转化率达到99％。一些现有技术则通过提高制备过程中谷氨酸脱羧酶催化效率的方式提高产量，如中国专利CN107574192A 公开了一种通过732阳离子交换树脂提高屎肠球菌谷氨酸脱羧酶转化活性的方法，通过以732阳离子交换树脂作为辅助催化剂提高屎肠球菌细胞谷氨酸脱氢酶转化活性，进而提高γ-氨基丁酸产量，降低生产成本。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种生物合成法制备γ-氨基丁酸的方法，可采用价格低廉的谷氨酸钠作为制备原料，降低生产成本的同时维持较高产量。
为了实现上述目的，本发明提供了一种生物合成法制备γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：
S1配制含谷氨酸脱氢酶菌株质量体积浓度0.15-0.25％、谷氨酸钠 20-30g/L、pH值5.0-5.5的初始转化液；
S2初始转化液在30-35℃下反应，反应过程中维持反应溶液的导电率不高于40ms/cm。
优选的，所述含谷氨酸脱氢酶菌株选自含谷氨酸脱氢酶的乳酸菌、唾液链球菌、戊糖片球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、短小乳杆菌中的一种或多种。
优选的，步骤S2中反应溶液的电导率维持在35-40ms/cm。
优选的，维持反应溶液导电率不高于40ms/cm的方法包括：取部分反应溶液进行电渗透，使溶液电导率低于40ms/cm，得到的处理液加入步骤S2的反应溶液中。
优选的，所述电渗透反应的反应电压为160-200V，反应电流为80-100A。
优选的，步骤S2还包括维持反应溶液：
a)谷氨酸钠浓度15-20g/L；
b)含谷氨酸脱氢酶的乳酸菌菌体质量体积浓度为0.15-0.25％。
优选的，步骤S2还包括不间断的取反应溶液进行电渗透，不间断的将处理液加入反应溶液；电渗透过程中，反应溶液进样量6-8m2/h。
优选的，所述方法还包括：
S3当反应溶液中的谷氨酸钠每小时消耗速度低于6g/L时停止添加谷氨酸钠，维持反应条件继续反应4h以上，得到第一产物。
优选的，所述方法还包括：
S4将第一产物离心取上清液，上清液以活性炭脱色后过滤，过滤液浓缩、降温结晶、干燥，得到γ-氨基丁酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
现在的主流生物合成法使用的底物是谷氨酸和谷氨酸钠两种，谷氨酸溶解度低，价格贵；谷氨酸钠溶解度高，并且市场价格约为谷氨酸的一半。虽然谷氨酸钠作为底物具有价格和溶解度上的优势，但谷氨酸钠为底物的γ-氨基丁酸转化量远远低于谷氨酸为底物时的γ-氨基丁酸转化量，不适宜大规模应用。
本发明以价格低廉、水溶性高的谷氨酸钠为γ-氨基丁酸生物合成底物，创造性的发现谷氨酸钠作为反应底物的γ-氨基丁酸转化量不高是由于反应过程中的Na+浓度过高抑制了谷氨酸脱氢酶活性，通过电渗透等方式降低反应溶液中Na+浓度可使以谷氨酸钠为底物的γ-氨基丁酸转化量提高一倍以上，是一种成本低、产量高的γ氨基丁酸生物合成方法。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。需要说明的是，基于本发明中的这些实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提供了一种生物合成法制备γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：
S1配制含谷氨酸脱氢酶菌株质量体积浓度0.15-0.25％、谷氨酸钠 15-20g/L、pH值5.0-5.5的初始转化液。
在本发明中，所述初始转化液中含谷氨酸脱氢酶菌株的菌体浓度优选为 0.18-0.22％(w/v)，更优选为0.2％；所述初始转化液中的谷氨酸钠含量优选为16-18g/L；所述初始转化液的pH值优选为5.2-5.4。在本发明的一些具体实施方式中，所述初始转化液由含谷氨酸脱氢酶菌株菌体浓度0.2％(w/v)、谷氨酸钠16-18g/L水溶液组成，pH值5.0-5.5。
本发明对含谷氨酸脱氢酶菌株无特殊限定，可以采用已知的含谷氨酸脱氢酶菌株或通过基因工程等方法改造的菌株，包括含谷氨酸脱氢酶的乳酸菌、唾液链球菌、戊糖片球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、短小乳杆菌中的一种或多种；在本发明的一些具体实施方式中采用了含谷氨酸脱氢酶的乳酸菌；优选的，所述含谷氨酸脱氢酶的乳酸菌按照下述方法培养：
S11将含谷氨酸脱氢酶的乳酸菌接种至种子培养基中，28-32℃培养 16-20h，得到种子培养液；按质量体积浓度计，所述种子培养基包括：葡萄糖 0.5-1％、蛋白胨0.5-1.0％、玉米浆干粉0.5-1.0％、硫酸镁0.02-0.05％、磷酸二氢钾0.02-0.05％、谷氨酸钠3-8％、吐温800.1-0.3％和余量的水，pH值 5.0-5.5；
S12按照2-5％(V/V)接种量将种子培养液接入发酵培养基中，28-32℃培养20-24h，得到发酵液；按质量体积浓度计，所述发酵培养基包括：葡萄糖 0.5-1％、蛋白胨0.5-1.5％、玉米浆干粉0.5-1.5％、硫酸镁0.02-0.1％、磷酸二氢钾0.02-0.1％、谷氨酸钠3-8％、吐温800.1-0.3％和余量的水，pH值5.0-5.5。
在本发明中，步骤S11中的培养时间优选为16-18h，培养温度优选为30℃；所述种子培养基优选的包括：葡萄糖0.5％、蛋白胨1％、玉米浆干粉1％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.025％、谷氨酸钠6％、吐温800.1％和余量的水，pH 值5.3。在本发明中，步骤S12中的接种量优选为3％，培养时间优选为24h，培养温度优选为30℃；所述发酵培养基优选的包括：葡萄糖0.5％、蛋白胨1.5％、玉米浆干粉1.5％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、谷氨酸钠6％、吐温800.1％和余量的水，pH值5.3。
在本发明中，按照步骤S11-S12得到的发酵液作为配制初始转化液前，优选的还包括如下步骤：S13将发酵液离心得到菌体，将菌体以水配制成菌悬液。
在本发明中，所述初始转化液的配制方法优选的包括：S14按照比例将含谷氨酸脱氢酶的乳酸菌的菌悬液与谷氨酸钠水溶液混合，调节pH值至5.0-5.5，得到初始转化液。在发明的一些具体实施方式中，所述转化液、种子培养基和 /或发酵培养基的pH值调节采用磷酸溶液。
S2初始转化液在30-35℃下反应，反应过程中维持反应溶液导电率不高于 40ms/cm。
本发明维持反应溶液电导率是为了解除以谷氨酸钠为底物转化γ-氨基丁酸时Na+对谷氨酸脱氢酶活性抑制。本发明优选的，步骤S2中反应溶液的电导率维持在35-40ms/cm。在本发明的一些具体实施例中采用电渗透方法维持反应溶液电导率，具体的包括以下步骤：
S21取部分反应溶液进行电渗透，使溶液电导率低于40ms/cm，得到的处理液加入步骤S2的反应溶液中。在本发明的一些具体实施方式中，所述电渗透反应的反应电压为160-200V，反应电流为80-100A。
在本发明中，通过步骤S21维持反应溶液电导率可以是间隔进行的，也可以是持续的。在本发明的一些具体实施例中，所述步骤S21包括不间断的取反应溶液进行电渗透，不间断的将处理液加入反应溶液；进一步优选的，所述电渗透过程中反应溶液进样量6-8m2/h。通过不间断的对反应溶液电渗透去除Na+，防止高浓度的Na+对谷氨酸脱氢酶活性抑制。为了实现上述不间断的电渗透反应，本发明优选的采用包括通过通道连接的转化反应器和电渗透装置进行反应，步骤S2所述反应溶液在转化反应器中进行转化反应，通道将反应液输送至电渗透装置中进行电渗透，再通过通道将处理液回输至转化反应器中。
在本发明中，步骤S2中的反应溶液优选的需要维持：反应溶液的：a)谷氨酸钠浓度15-20g/L；b)含谷氨酸脱氢酶的乳酸菌菌体浓度为0.15-0.25％； c)导电率不高于40ms/cm。本发明所述维持反应溶液的谷氨酸钠浓度15-20g/L 是为了补足反应底物；维持反应溶液中含谷氨酸脱氢酶的乳酸菌菌体浓度是为了维持谷氨酸脱氢酶的反应。总体来说，本发明在步骤S2中需要维持反应溶液的变量是为了保持一定的γ-氨基丁酸转化效率。
本发明所述反应优选的还包括如下步骤：
S3当反应溶液中的谷氨酸钠每小时消耗速度低于6g/L时停止添加谷氨酸钠，维持反应条件以及反应溶液导电率不高于40ms/cm的情况下继续反应4h 以上，得到第一产物。
S4将第一产物离心取上清液，上清液以活性炭脱色后过滤，过滤液浓缩、降温结晶、干燥，得到γ-氨基丁酸。
按照本发明提供的生物合成法制备γ-氨基丁酸可以完全使用价格低廉、水溶性好的谷氨酸钠作为反应底物，相较于常规方法可提高γ-氨基丁酸转化量1倍以上。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
S11种子培养：将葡萄糖0.5％、蛋白胨1％、玉米浆干粉1％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.025％、味精6％、吐温800.1％加入到纯化水中溶解，用磷酸调 pH值为5.5，分装，灭菌20min后，冷却，得到种子培养液。向种子培养基中接入含谷氨酸脱氢酶的乳酸菌菌种，30℃静置培养，培养18h后得到种子培养液液。
S12发酵培养：将葡萄糖0.5％、蛋白胨1.5％、玉米浆干粉1.5％、硫酸镁 0.1％、磷酸二氢钾0.025％、味精6％、吐温800.1％加入到纯化水中溶解，用磷酸调pH值为5.5，灭菌20min后，冷却，得到发酵培养基。按照3％接种量向发酵培养基中接入种子培养液，30℃静置培养，培养24h，得到发酵液。
S13将发酵液通过碟片分离机离心，得到的菌体用水稀释到0.15％(w/v) 的菌浓，加入谷氨酸钠配置成25g/L的水溶液，pH调节至5.3，得到初始转化液。
S21将转化罐与电渗透装置通过管道连接，向转化罐中加入初始转化液，转化过程中控制温度30-35℃，菌体浓度0.15-0.25％，谷氨酸添加量15-20g/L；同时，开启电渗透装置和管道，使反应溶液进入电渗透装置中发生电渗透反应，再通过管道将电渗透处理后的处理液回输至转化罐中，实现反应液在二者之间的循环。
其中，反应溶液进入电渗透装置的进料流量6-8m3/h、电压160-200、电流80-100A,控制转化液电导率低于40ms/cm,转化过程产生的Na+水溶液做废液处理；
S3循环37h后，底物谷氨酸钠的每小时消耗速度低于6g/L，停止加料，继续按照步骤S21循环6h，最终获得γ-氨基丁酸含量417g/L的第一反应液。
S4结晶：转化液碟片离心，上清液中加入3％的活性炭，60℃脱色30分钟，通过板框压滤，清液进入结晶罐真空浓缩、降温结晶，将晶体通过平板离心机离心，离心后的晶体进行烘干，烘干后纯度99.4％。
对比例1
除步骤S21按照下述步骤进行外，其余步骤均与实施例1相同：
S21向转化罐中加入初始转化液，转化过程中控制温度30-35℃，菌体浓度0.15-0.25％，谷氨酸浓度15-20g/L；
S3循环36h左右，底物谷氨酸钠的每小时消耗速度低于6g/L，停止加料，继续反应6h，获得第一反应液。
表1
| 项目 | 底物转化量(kg) | 结晶纯度 |
| 实施例1 | 1252 | 99.4％ |
| 对比例1 | 608 | 96.6％ |
实施例2
S11种子培养：将葡萄糖1％、蛋白胨0.5％、玉米浆干粉0.5％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.035％、味精5％、吐温800.2％加入到纯化水中溶解，用磷酸调 pH值为5.3，分装，灭菌20min后，冷却，得到种子培养液。向种子培养基中接入含谷氨酸脱氢酶的乳酸菌菌种，30℃静置培养，培养20h后得到种子培养液液。
S12发酵培养：将葡萄糖1％、蛋白胨1.0％、玉米浆干粉1.0％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.025％、味精6％、吐温800.1％加入到纯化水中溶解，用磷酸调 pH值为5.5，灭菌20min后，冷却，得到发酵培养基。按照4％接种量向发酵培养基中接入种子培养液，30℃静置培养，培养22h，得到发酵液。
S13将发酵液通过碟片分离机离心，得到的菌体用水稀释到0.18％(w/v) 的菌浓，加入谷氨酸钠配置成20g/L的水溶液，pH调节至5.2，得到初始转化液。
S21将转化罐与电渗透装置通过管道连接，向转化罐中加入初始转化液，转化过程中控制温度30-35℃，菌体浓度0.15-0.25％，谷氨酸添加量15-20g/L；同时，开启电渗透装置和管道，使反应溶液进入电渗透装置中发生电渗透反应，再通过管道将电渗透处理后的处理液回输至转化罐中，实现反应液在二者之间的循环。
其中，反应溶液进入电渗透装置的进料流量6-8m3/h、电压160-200、电流80-100A,控制转化液电导率低于40ms/cm,转化过程产生的Na+水溶液做废液处理；
S3循环34h后，底物谷氨酸钠的每小时消耗速度低于6g/L，停止加料，继续按照步骤S21循环4h，最终获得γ-氨基丁酸含量405g/L的第一反应液。
S4结晶：转化液碟片离心，上清液中加入4％的活性炭，60℃脱色30分钟，通过板框压滤，清液进入结晶罐真空浓缩、降温结晶，将晶体通过平板离心机离心，离心后的晶体进行烘干，烘干后纯度99.3％。
对比例2
除步骤S21按照下述步骤进行外，其余步骤均与实施例2相同：
S21向转化罐中加入初始转化液，转化过程中控制温度30-35℃，菌体浓度0.15-0.25％，谷氨酸浓度15-20g/L；
S3循环30h左右，底物谷氨酸钠的每小时消耗速度低于6g/L，停止加料，继续反应5h，获得第一反应液。
表2
| 项目 | 底物转化量(kg) | 结晶纯度 |
| 实施例2 | 1987 | 99.3％ |
| 对比例2 | 589 | 96.9％ |
实施例3
S11种子培养：将葡萄糖0.7％、蛋白胨0.7％、玉米浆干粉0.8％、硫酸镁 0.04％、磷酸二氢钾0.025％、味精3％、吐温800.1％加入到纯化水中溶解，用磷酸调pH值为5.2，分装，灭菌20min后，冷却，得到种子培养液。向种子培养基中接入含谷氨酸脱氢酶的乳酸菌菌种，30℃静置培养，培养18h后得到种子培养液液。
S12发酵培养：将葡萄糖0.8％、蛋白胨1.2％、玉米浆干粉1.2％、硫酸镁0.075％、磷酸二氢钾0.035％、味精6％、吐温800.1％加入到纯化水中溶解，用磷酸调pH值为5.0，灭菌20min后，冷却，得到发酵培养基。按照2％接种量向发酵培养基中接入种子培养液，30℃静置培养，培养22h，得到发酵液。
S13将发酵液通过碟片分离机离心，得到的菌体用水稀释到0.15％(w/v) 的菌浓，加入谷氨酸钠配置成30g/L的水溶液，pH调节至5.1，得到初始转化液。
S21将转化罐与电渗透装置通过管道连接，向转化罐中加入初始转化液，转化过程中控制温度30-35℃，菌体浓度0.15-0.25％，谷氨酸添加量15-20g/L；同时，开启电渗透装置和管道，使反应溶液进入电渗透装置中发生电渗透反应，再通过管道将电渗透处理后的处理液回输至转化罐中，实现反应液在二者之间的循环。
其中，反应溶液进入电渗透装置的进料流量6-8m3/h、电压160-200、电流80-100A,控制转化液电导率低于40ms/cm,转化过程产生的Na+水溶液做废液处理；
S3循环38h后，底物谷氨酸钠的每小时消耗速度低于6g/L，停止加料，继续按照步骤S21循环6h，最终获得γ-氨基丁酸含量425g/L的第一反应液。
S4结晶：转化液碟片离心，上清液中加入4％的活性炭，60℃脱色30分钟，通过板框压滤，清液进入结晶罐真空浓缩、降温结晶，将晶体通过平板离心机离心，离心后的晶体进行烘干，烘干后纯度99.7％。
对比例3
除步骤S21按照下述步骤进行外，其余步骤均与实施例3相同：
S21向转化罐中加入初始转化液，转化过程中控制温度30-35℃，菌体浓度0.15-0.25％，谷氨酸浓度15-20g/L；
S3循环32h左右，底物谷氨酸钠的每小时消耗速度低于6g/L，停止加料，继续反应7h，获得第一反应液。
表3
| 项目 | 底物转化量(kg) | 结晶纯度 |
| 实施例3 | 2024 | 99.7％ |
| 对比例3 | 625 | 97.2％ |
对比例1/2/3为以谷氨酸钠为底物的常规制备方法，实施例1/2/3与对比例1/2/3制备γ-氨基丁酸的对比表如表1/2/3所示。可以看到，本发明通过电渗透在γ-氨基丁酸制备过程进行电渗析能将以谷氨酸钠为底物时的底物转化量提高一倍以上，使采用谷氨酸钠这种价格低廉、水溶性高的底物为原料的生物合成工艺能够在实际生产中大规模应用，有效提高了γ-氨基丁酸的产量并降低其成本。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种生物合成法制备γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：
S1配制含谷氨酸脱氢酶菌株质量体积浓度0.15-0.25％、谷氨酸钠20-30g/L、pH值5.0-5.5的初始转化液；
S2初始转化液在30-35℃下反应，反应过程中维持反应溶液的导电率不高于40ms/cm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含谷氨酸脱氢酶菌株选自含谷氨酸脱氢酶的乳酸菌、唾液链球菌、戊糖片球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、短小乳杆菌中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中反应溶液的电导率维持在不高于40ms/cm。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，维持反应溶液电导率不高于40ms/cm的方法包括：
取部分反应溶液进行电渗透，使溶液电导率低于40ms/cm，得到的处理液加入步骤S2的反应溶液中。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述电渗透反应的反应电压为160-200V，反应电流为80-100A。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2还包括维持反应溶液：
a)谷氨酸钠浓度15-20g/L；
b)含谷氨酸脱氢酶的乳酸菌菌体质量体积浓度为0.15-0.25％。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2还包括不间断的取反应溶液进行电渗透，不间断的将处理液加入反应溶液；电渗透过程中，反应溶液进样量6-8m2/h。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
S3当反应溶液中的谷氨酸钠每小时消耗速度低于6g/L时停止添加谷氨酸钠，维持反应条件继续反应4h以上，得到第一产物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
S4将第一产物离心取上清液，上清液以活性炭脱色后过滤，过滤液浓缩、降温结晶、干燥，得到γ-氨基丁酸。
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