CN112342150B - 一种石油降解菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从含油污泥中筛选的石油降解菌及其应用，属于含油污泥降解的微生物学技术领域。该菌株为腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)SYb，保藏编号：CGMCC No.17505。本发明从含油污泥中提取石油降解菌，提取成本较低，方法简单可行。本发明接种3％石油降解菌到pH为7.5‑8，氮磷比为6:1，盐度为1.0％，添加含油污泥(初始含油量为723.172mg L‑1)的MM培养基中培养，30d后含油污泥中石油烃类去除率达到65.894％，降解效果显著。

Description

一种石油降解菌及其应用
技术领域
本发明属于含油污泥降解的微生物学技术领域，具体涉及一种石油降解菌及其应用。
背景技术
当今，社会、环境与经济之间建立平衡发展的关系，早已成为全球普遍重视与亟待解决的重要问题。油田系统产生的含油污泥是一种含有大量的沥青质、重金属、病原菌、微量的放射性元素以及水、其他有机无机化合物牢固粘结在一起的乳化体系。近几年，含油污泥与炼化“三泥”的年产量已超过100万吨，含油污泥的危险特性被定义为毒性与易燃性，并被收录到《国家危险废物名录》中。随着国家对环保的要求日益严格以及监管制度的逐步完善，由含油污泥而引起的环境问题越发的显著。
上世纪八十年代以来，国外许多发达国家就已经意识到环境保护的重要性，对含油污泥的处理也越来越重视，技术也得到快速发展。通过研究含油污泥的组成结构等，研制了许多有效的处理含油污泥的工艺，其中属美国、荷兰、加拿大等国，技术相对比较成熟。国外运用最多的技术为生物处理法、高温裂解法和机械脱水法。
国内对含油污泥的处理起步较晚，地区主要在新疆等油田，不论是对含油污泥的处理利用技术上还是水平上，都与国外发达国家存在巨大差异。由于国内在开采、炼油等工艺上存在些许不足，导致含油污泥的组分比国外更为复杂，更难处理。目前我国处理污泥以稳定化、无害化为目的。国内正在吸取国外的相关技术经验，结合中国国情，开发出具有中国特色的处理含油污泥的技术和工艺，且取得了一定进展。国内的主要处理含油污泥的技术有：生物处理法、填埋、焚烧、固化、生产建材等，但仍然受限于技术的不成熟，含油污泥的处理依旧是国内环境保护的难题之一。
生物处理法是一种较为有效的处理含油污泥的技术，即利用微生物，将含油污泥中的石油烃类作为唯一碳源，进行降解，使其完全碳化，最终转化为二氧化碳和水的过程，其中可以降解含油污泥中高分子烃类的微生物称为石油降解菌。生物处理法的优点如下：一、微生物本身就是大自然的分解者，对环境的污染小，其最终产物只有二氧化碳、水和生物能等物质，不会对环境造成二次污染；二、费用较低；三、处理效果好；四、不需要加入化学试剂，消耗的能源少。但同时生物法也存在不足之处：一方面，处理周期较长，往往需要几十天的培养和处理，对于自然条件的限制也较大；另一方面，生物处理法也没能将含油污泥中的石油资源加以利用，浪费了资源。因此，本发明研究从含油污泥中筛选出具有降解效果的石油降解菌。
发明内容
本发明以油田系统产生的含油污泥为原料，从中筛选分离出能够高效降解石油烃类(石油烃，即总石油烃，指石油中发现的含有碳氢化合物的混合物，用TPH来衡量这类物质的总量)的石油降解菌，并提供利用所述菌株进行降解含油污泥的方法。
本发明的一个目的是提供一种石油降解菌。
技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明所提供的石油降解菌为腐败希瓦氏菌属Shewanella putrefaciens，命名为SYb，其保藏编号为CGMCC No.17505。
本发明的石油降解菌SYb，菌落很小，圆形，边缘整齐，颜色为乳白色，半透明，菌落表面光滑且凸起，革兰氏染色结果表明其为阴性菌。经过对该菌株的16S rDNA的鉴定与序列分析，表明该菌株为腐败希瓦氏菌属Shewanella putrefaciens，该菌株的核苷酸序列如Seq ID No：1所示。
本发明的石油降解菌SYb，现保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心(CGMCC)，保藏时间为：2019年4月1日，保藏编号：CGMCC No.17505，分类命名为腐败希瓦氏菌Shewanellaputrefaciens。
本发明的石油降解菌提取自南京金陵石化浮渣油泥。
本发明石油降解菌SYb的获取方法，包括以下步骤：
(1)称量10g含油污泥样品，将其加入已灭过菌且石油浓度为500mg·L-1的250mL无机盐MM液体培养基中，用玻璃棒搅拌让含油污泥样品与培养基充分混匀，使微生物尽可能的分散。
(2)在温度为30℃，转速为100r·min-1的条件下进行富集培养，一个周期培养4-7d。具体培养时间可根据微生物生长的好坏与否，即培养液的浑浊程度，做出调整。
(3)培养一个周期后，用移液枪从富集培养液中吸取出5％的量，转接入新鲜的分离筛选培养基中，并且逐渐增加每次培养基中的石油烃类浓度到750mg·L-1、1000mg·L-1。在与上述条件相同的情况下，继续培养一个周期。
(4)将步骤(3)重复三次，期间可通过观察培养液中石油层是否减少来判断石油烃类物质的降解情况。
(5)经过三个周期的富集驯化，用移液枪吸取500μL的培养液于油平板上，涂布器使用前用酒精灯灼烧灭菌，冷却后左手拿平板，右手拿涂布器沿一个方向画圈，多次涂布，之后将其倒置放在在30℃的光照恒温培养箱中培养2d。期间可观察单菌落周围的分解圈，若是分解圈大，则说明该菌株的降解能力好，反之亦然。
(6)选择代表性较好、形态特征一致的单菌落，用接种环在平板中挑取少量的菌种，在LB培养基上轻轻地划线，使得初始聚集在一起的细胞渐渐稀释，最后为单个分散的细胞，达到分离纯化的目的。
(7)多次重复上述(5)、(6)步骤。
(8)最终将选出后的菌株接种到斜面固体MM培养基上保存，首先放置在光照恒温培养箱中培养48h使其活化，然后在4℃的冰箱里保藏，待用。
本发明还提供了上述石油降解菌在降解含油污泥中的应用。
所述石油降解菌对含油污泥中石油烃类的降解条件为25-30℃、pH为7.5-8。
所述石油降解菌降解含油污泥的方法，按照下述步骤进行：
(1)菌株的活化：将石油降解菌SYb从斜板上接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，25-30℃、100r min-1恒温振荡培养48h，制成菌液；
(2)菌株降解过程：取上述菌液接种到每250mL已添加2.5g含油污泥的无机盐MM液体培养基中，pH为7.5-8，氮磷比为6:1，盐度为1.0％，接种量为3％，25-30℃、100r min-1恒温振荡培养30d，即能够高效的降解石油烃。
所述牛肉膏蛋白胨液体培养基组成为：牛肉膏2g，鱼粉蛋白胨4g，氯化钠3g，蒸馏水1000mL，用1mol·L-1的NaOH将pH调节至7.5-8。
所述MM液体培养基组成为：KH2PO40.5g，MgSO40.5g，NaCl 3g，CaCl20.1g，FeSO4·7H2O 0.2g，微量元素1mL，60％的乳酸钠溶液6mL，去离子水1000mL，用1mol·L-1的NaOH将pH调节至7.5-8。
所述微量元素组分为：维C 5g，MnSO410mg，K2HPO42g，NH4Cl(尿素)5g，硫酸盐铁盐4g，去离子水1000ml。
有益效果：
(1)本发明从含油污泥中分离筛选出一株高效的石油降解菌株SYb，为腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)，氮磷比为6:1，盐度为1.0％，接种3％此菌株到pH为7.5-8，添加含油污泥(初始含油量为723.172mg L-1)的MM培养基中培养，30d后石油烃类去除率达到65.894％，降解效果显著。本发明提供了一种新的石油降解菌菌种，为含油污泥的微生物修复提供理论参考。
(2)本发明从油田系统产生的含油污泥中提取石油降解菌，提取成本较低，方法简单可行。
(3)本发明考察了不同盐度、pH、氮磷比、接菌量条件下，对石油降解菌SYb降解石油烃的影响，为含油污泥的微生物修复应用提供参考。
附图说明
图1为菌株的平板划线图；
图2为菌株的菌落形态图；
图3为菌株的扫描电镜图；
图4为实施例3中含油污泥的石油烃含量变化图。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
本发明实施例使用的牛肉膏蛋白胨液体培养基组成为：牛肉膏2g，鱼粉蛋白胨4g，氯化钠3g，蒸馏水1000mL，用1mol·L-1的NaOH将pH调节至7.5-8。
本发明实施例使用的MM液体培养基组成为：KH2PO40.5g，MgSO40.5g，NaCl 3g，CaCl20.1g，FeSO4·7H2O 0.2g，微量元素1mL，60％的乳酸钠溶液6mL，去离子水1000mL，用1mol·L-1的NaOH将pH调节至7.5-8。
所述微量元素组分为：维C 5g，MnSO410mg，K2HPO42g，NH4Cl(尿素)5g，硫酸盐铁盐4g，去离子水1000ml。
本发明实施例中含油污泥来源于南京金陵石化浮渣油泥。
本发明实施例采用红外测油仪测定培养液中含油量，所述含油量是指用四氯化碳萃取出的液体培养基中石油烃的量。
实施例1：石油降解菌的分离与筛选
(1)称量10g含油污泥样品，将其加入已灭过菌且石油浓度为500mg·L-1的250mL无机盐MM液体培养基中，用玻璃棒搅拌让含油污泥样品与培养基充分混匀，使微生物尽可能的分散。
(2)在温度为30℃，转速为100r·min-1的条件下进行富集培养，一个周期培养4-7d。具体培养时间可根据微生物生长的好坏与否，即培养液的浑浊程度，做出调整。
(3)培养一个周期后，用移液枪从富集培养液中吸取出5％的量，转接入新鲜的分离筛选培养基中，并且逐渐增加每次培养基中的石油烃类浓度到750mg·L-1、1000mg·L-1。在与上述条件相同的情况下，继续培养一个周期。
(4)将步骤(3)重复三次，期间可通过观察培养液中石油层是否减少来判断石油烃类物质的降解情况。
(5)经过三个周期的富集驯化，用移液枪吸取500μL的培养液于油平板上，涂布器使用前用酒精灯灼烧灭菌，冷却后左手拿平板，右手拿涂布器沿一个方向画圈，多次涂布，之后将其倒置放在在30℃的光照恒温培养箱中培养2d。期间可观察单菌落周围的分解圈，若是分解圈大，则说明该菌株的降解能力好，反之亦然。
(6)选择代表性较好、形态特征一致的单菌落，用接种环在平板中挑取少量的菌种，在LB培养基上轻轻地划线，使得初始聚集在一起的细胞渐渐稀释，最后为单个分散的细胞，达到分离纯化的目的。
(7)多次重复上述(5)、(6)步骤。
(8)最终将选出的菌株接种到斜面固体MM培养基上保存，首先放置在光照恒温培养箱中培养48h使其活化，然后在4℃的冰箱里保藏，待用。该菌株即为石油降解菌SYb。平板划线图如图1所示。
实施例2：石油降解菌SYb形态观察、生理生化实验及DNA鉴定：
(1)将挑选出来的优势菌株分离纯化，并进行革兰氏染色、显微镜观察及电镜观察。经形态观察，菌落培养24h后，降解菌的菌落较小，圆形，边缘整齐，颜色为乳白色，菌落表面光滑且凸起，菌落形态图如图2；电镜观察显示，菌株为短杆型，扫描电镜图谱如图3；革兰氏染色结果表明其为阴性菌。
(2)根据《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)中的鉴定项目和鉴定方法进行实验。生理生化特征如下：
表1石油降解菌SYb的生理生化特征
Figure BDA0002157176310000061
注:“+”表示阳性，“—”表示阴性。
(3)发明人对上述筛选到的石油降解菌进行了16S rDNA测序，其核苷酸序列如SeqID No：1所示，所测得的16S rDNA序列进行BLAST比对，表明该菌株为腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)。现保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心(CGMCC)，保藏时间为：2019年4月1日，保藏编号：CGMCC No.17505，建议的分类命名为腐败希瓦氏菌Shewanellaputrefaciens。
实施例3：利用上述石油降解菌降解含油污泥中石油烃类的应用
将石油降解菌SYb从斜板上接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、100r min-1恒温振荡培养48h，制成菌液；
取上述菌液接种到250mL已添加2.5g含油污泥的无机盐MM液体培养基中，pH为7.5-8，氮磷比为6:1，盐度为1.0％，接种量3％，30℃、100r min-1恒温振荡培养，每隔4d取样，采用红外测油仪测定培养液中含油量，考察菌株30d的降解效果。降解结果显示：30d内菌株能把含油污泥从初始含油量723.172mg L-1降解到246.645mg L-1，降解率为65.894％，降解效果显著。含油污泥的含油量变化见图4。
实施例4：
将石油降解菌SYb从斜板上接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、100r min-1恒温振荡培养48h，制成菌液；
取上述菌液接种到250mL已添加2.5g含油污泥的无机盐MM液体培养基中，pH为7.5-8，盐度(MM液体培养基中NaCl的量)为0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、1.0％、3.0％、5.0％、8.0％，接种量5ml，30℃、100r min-1恒温振荡培养，每隔4d取样，采用红外测油仪测定培养液中含油量，考察菌株30d的降解效果。降解结果显示：盐度为0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、1.0％、3.0％、5.0％、8.0％时，30d内菌株能把含油污泥初始含油量为723.172mg L-1，降解到528.116mg L-1、499.448mg L-1、451.319mg L-1、383.394mg L-1、294.426mg L-1、373.454mg L-1、557.183mg L-1、667.293mg L-1，可见盐度为1.0％，降解效果显著。
实施例5：
将石油降解菌SYb从斜板上接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、100r min-1恒温振荡培养48h，制成菌液；
取上述菌液接种到250mL已添加2.5g含油污泥的无机盐MM液体培养基中，pH为3、4、5、6、7、8、9、10，盐度为1.0％，接种量5ml，30℃、100r min-1恒温振荡培养，每隔4d取样，采用红外测油仪测定培养液中含油量，考察菌株30d的降解效果。降解结果显示：pH为3、4、5、6、7、8、9、10时，30d内菌株能把含油污泥初始含油量为723.172mg L-1，降解到698.514mg L-1、579.412mg L-1、415.129mg L-1、287.346mg L-1、278.612mg L-1、252.233mg L-1、536.175mg L-1、624.307mg L-1，可见pH为8时，降解效果显著。
实施例6：
将石油降解菌SYb从斜板上接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、100r min-1恒温振荡培养48h，制成菌液；
取上述菌液接种到250mL已添加2.5g含油污泥的无机盐MM液体培养基中，pH为7，盐度为1.0％，氮磷比为空白、6:1、10:1、30:1、50:1，接种量5ml，30℃、100r min-1恒温振荡培养，每隔4d取样，采用红外测油仪测定培养液中含油量，考察菌株30d的降解效果。降解结果显示：氮磷比(氮源通过在MM液体培养基中添加NH4Cl体现，氮磷比为液体培养基中NH4Cl中NH4+离子与KH2PO4中PO4 3-离子的质量的比例)为空白、6:1、10:1、30:1、50:1时，30d内菌株能把含油污泥初始含油量为723.172mg L-1，降解到558.930mg L-1、260.693mg L-1、377.144mg L-1、414.111mg L-1、498.331mg L-1，可见氮磷比为6:1时，降解效果显著。
实施例7：
将石油降解菌SYb从斜板上接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、100r min-1恒温振荡培养48h，制成菌液；
取上述菌液接种到250mL已添加2.5g含油污泥的无机盐MM液体培养基中，pH为7，盐度为1.0％，氮磷比为6:1，接种量1.0％、2.0％、3.0％、5.0％、10.0％，30℃、100r min-1恒温振荡培养，每隔4d取样，采用红外测油仪测定培养液中含油量，考察菌株30d的降解效果。降解结果显示：接种量为1.0％、2.0％、3.0％、5.0％、10.0％时，30d内菌株能把含油污泥初始含油量为723.172mg L-1，降解到495.875mg L-1、415.686mg L-1、260.481mg L-1、224.526mg L-1、220.457mg L-1，可见接菌量为3％、5％、10％时，降解效果均很显著且差异不大，因此接菌量为3％时，不会造成不必要的浪费、更合理。
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。
序列表
<110> 中国石油化工股份有限公司
<120> 一种石油降解菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1089
<212> DNA
<213> 腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)
<400> 1
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cgcgctttac gcccaataat ttccggataa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc 960
tggcacgtag ttagccgtgc tttctggtta ggtaccgtca ggtgccagct atcactagca 1020
cttgtctccc taacacagag ttttacgact cgaaagcctt catcactcac gcgcgttgct 1080
ccgtcagac 1089

Claims (4)

1.一种石油降解菌，其特征在于，所述石油降解菌为腐败希瓦氏菌属Shewanellaputrefaciens，命名为SYb，其保藏编号为CGMCC No.17505。
2.权利要求1所述的石油降解菌在降解含油污泥中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述石油降解菌对含油污泥中石油烃类的降解条件为25-30℃、pH为7.5-8。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述石油降解菌降解含油污泥的方法，按照下述步骤进行：
（1）菌株的活化：将石油降解菌SYb从斜板上接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，25-30℃、100 r min-1恒温振荡培养48h，制成菌液；
（2）菌株降解过程：取上述菌液接种到每250 mL已添加2.5g含油污泥的无机盐MM液体培养基中，pH为7.5-8，氮磷比为6:1，盐度为1.0%，25-30℃、100 r min-1恒温振荡培养30 d，即能够高效的降解石油烃；
所述牛肉膏蛋白胨液体培养基组成为：牛肉膏2g，鱼粉蛋白胨4g，氯化钠3g，蒸馏水1000mL，用1mol·L-1的NaOH将pH调节至7.5-8；
所述MM液体培养基组成为：KH2PO4 0.5g，MgSO4 0.5g，NaCl 3g，CaCl2 0.1g，FeSO4·7H2O 0.2g，微量元素1mL，60%的乳酸钠溶液6mL，去离子水1000mL，用1mol·L-1的NaOH将pH调节至7.5-8。
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