CN111375631A - 假单胞菌及该菌修复铬污染土壤的微生物原位固化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种假单胞菌，分类命名为：Pseudomonas sp GRINML7，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2018年10月15日，保藏编号为：CCTCC NO：M2018674。利用该菌处理铬污染土壤，可以在中性及偏碱性pH下将六价铬离子还原为三价铬；在适宜的pH下，该菌可在好氧条件下，将六价铬离子转化为三价铬离子生成氢氧化铬沉淀，有效还原固化六价铬离子，且绿色环保无二次污染等特点，为铬污染土壤微生物还原固化修复提供可操作工艺。

Description

假单胞菌及该菌修复铬污染土壤的微生物原位固化方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，涉及一种假单胞菌(Pseudomonas sp)属细菌、其培养方法以及利用该菌修复铬污染土壤微生物还原固化的过程。
背景技术
在铬盐(以重铬酸钠计)生产过程中会产生含铬废渣，这些废渣因数量大、污染重、治理难度大而备受关注。我国多数铬盐厂由于管理不善、设备老化、车间跑冒滴漏现象严重，造成了大量含铬“三废”经过长期风吹雨淋进入周围环境，导致厂区周围土壤严重污染。国内仅有数个规模较小的铬污染场地开展了相应的治理工作。其中修复铬污染土壤最重要是还原固化六价铬离子为三价氢氧化铬沉淀。铬污染土壤的修复方法主要有化学法和生物法，目前开展的研究中普遍采用化学还原法，主要利用铁屑、硫酸亚铁、硫化物或其他一些容易得到的化学还原剂(也可以辅以一定的粘合剂)将六价铬还原为三价铬，形成难溶的化合物，从而降低铬在环境中的迁移性和生物可利用性，减轻铬污染的危害。化学还原法修复铬污染土壤的示范工程已在华盛顿州Frontier Hard Chrome公司完成，该方法已经在实际工程中得到应用。然而向土壤中投加的还原剂易造成土壤的二次污染，且化学还原法处理后生成的三价铬易被氧化为六价铬，因此如何保证六价铬长效还原固定是该技术的难点。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株高效的假单胞菌，该菌种可有效还原固化六价铬离子，并在适宜的pH下，还原六价铬离子形成氢氧化铬沉淀。
本发明的第二个目的是提供一种可以富集、分离、培养该细菌的培养基。
本发明的第三个目的是提供一种利用该菌修复铬污染土壤微生物原位固化的方法。
为了实现上述目的，本发明提供一株假单胞菌，该菌分类命名为：Pseudomonas spGRINML7，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2018年10月15日，保藏编号为：CCTCC NO：M2018674。
该假单胞菌可以在高pH下可有效还原固化六价铬离子；在pH为偏碱性时，该菌可将六价铬离子形成氢氧化铬沉淀。
本发明还提供用于分离培养如上述假单胞菌的培养基(简称：分离培养基)，该培养基配方为：蛋白胨1.2g/L，乳酸钠1mL/L，KH2PO4 3g/L，K2HPO4 4g/L，MgSO4·7H2O 0.02g/L，K2Cr2O7 1000mg/L，微量元素母液0.1mL/L；调pH为8，1000mL蒸馏水、琼脂粉20g/L；其中，微量元素母液配方为：H3BO3 6g/L，CoCl2·6H2O 4g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，MnCl2·4H2O0.6g/L，Na2MoO4·7H2O 0.6g/L，NiCl2·6H2O 0.4g/L，CuCl2·2H2O 0.2g/L。
配制时将琼脂粉以外的成分混合均匀后加入琼脂粉，调pH为8，121℃下灭菌30分钟，然后倒平板。
本发明还提供用于富集培养如上所述假单胞菌的培养基(简称：富集培养基)，该培养基配方为：酵母浸粉2g/L，蛋白胨1.6g/L，K2HPO4 4g/L，MgSO4·7H2O 0.02g/L，微量元素母液0.1mL/L，K2Cr2O7 1000mg/L，1000mL蒸馏水，调pH为8。
微量元素母液：H3BO3 6g/L，CoCl2·6H2O 4g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，MnCl2·4H2O0.6g/L，Na2MoO4·7H2O 0.6g/L，NiCl2·6H2O 0.4g/L，CuCl2·2H2O 0.2g/L。
配制时将各成分混合均匀，121℃下灭菌30分钟。
本发明还提供如上所述假单胞菌的富集培养方法，将所述假单胞菌菌种接种入富集培养基中，在30℃的培养温度下，140rpm摇床培养培养至菌液浓度为108个/mL。
本发明还提供一种修复铬污染土壤的微生物原位固化方法，包括如下步骤：
1)将pH8-10的铬污染土壤添加到300mL三角瓶中30g，加入培养基100mL；
2)将上述假单胞菌采用如上述方法进行富集培养后，接种至添加有铬污染土壤的三角瓶中；
3)用NaOH调节pH至8，于30℃，160rpm摇床修复；
4)在修复过程中每24小时检测三角瓶中pH和Eh变化，连续运行30天。
优选地，步骤2)中所述假单胞菌的接种量为10％。
所述假单胞菌为经过驯化筛选出高效还原菌，用于修复铬污染土壤绿色环保，经济高效且无二次污染。
铬污染土壤在本发明所提供的假单胞菌的还原作用下生成的氢氧化铬沉淀在土壤中比较稳定，不易迁移且生物可利用性较弱。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一株假单胞菌菌株GRINML7，利用该菌处理铬污染土壤，可以在pH在7～10下将六价铬离子还原固化为氢氧化铬沉淀；在适宜的pH下，该菌可在好氧条件下，将六价铬离子转化为三价铬离子生产氢氧化铬沉淀，实现了修复铬污染土壤的目的。
附图说明
图1为本发明所提供假单胞菌菌株的单菌落照片。
图2为本发明所提供假单胞菌菌株的显微镜下照片。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明所提供的假单胞菌，该菌分类命名为：Pseudomonas sp GRINML7，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2018年10月15日，保藏编号为：CCTCC NO：M2018674。
该假单胞菌分离自西宁中星化工厂铬渣厂废水中。
用于分离培养上述假单胞菌的培养基(简称：分离培养基)，配方为：
蛋白胨1.2g/L，乳酸钠1mL/L，KH2PO4 3g/L，K2HPO4 4g/L，MgSO4·7H2O 0.02g/L，K2Cr2O7 1000mg/L，微量元素母液0.1mL/L；调pH为8，1000mL蒸馏水、琼脂粉20g/L；其中，微量元素母液：H3BO3 6g/L，CoCl2·6H2O 4g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，MnCl2·4H2O 0.6g/L，Na2MoO4·7H2O 0.6g/L，NiCl2·6H2O 0.4g/L，CuCl2·2H2O 0.2g/L。
配制时将琼脂粉以外的成分混合均匀后加入琼脂粉，调pH8，121℃下灭菌30分钟。按上述比例配置100ml培养基，每20mL倒一块平板。
用于富集培养如上所述假单胞菌的培养基(简称：富集培养基)，配方为：酵母浸粉2g/L，蛋白胨1.6g/L，K2HPO4 4g/L，MgSO4·7H2O 0.02g/L，微量元素母液0.1mL/L，K2Cr2O71000mg/L，1000mL蒸馏水，调pH为8；其中，微量元素母液：H3BO3 6g/L，CoCl2·6H2O 4g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，MnCl2·4H2O 0.6g/L，Na2MoO4·7H2O 0.6g/L，NiCl2·6H2O 0.4g/L，CuCl2·2H2O 0.2g/L。
配制时将各成分混合均匀，调pH8，121℃下灭菌30分钟。
实施例1假单胞菌的获取和鉴定
本发明提供的假单胞菌的获得方法为：
1)在100mL含所述假单胞菌水样中加入0.3g酵母粉，在30℃，摇床100rpm轻轻震荡富集培养1周，利用显微镜检测判断细菌生长情况；水样取自西宁中星化工厂铬渣厂废水。细菌生长至测量细菌培养液在600nm处的吸光值，得到的OD600的数值在0.6-0.8之间。
2)采用膜过滤将上述培养液中的细菌过滤，并将细菌用20mL无菌水洗下。以10％的接种量分别接种于多个100mL富集培养基中，30℃度进行培养，并设置不接种对照(CK)。160rpm摇床培养两周后观察细菌生长情况。
3)将富集培养基液梯度稀释1、2、3、4、5(分别对应10-1，10-2，10-3，10-4，10-5)，分别取100μL稀释液涂布在分离培养基配制的平板上，45℃培养三天。挑单菌落进行进一步平板划线，分离得到单菌落。挑取单菌落后，转入新的固体培养基平板中，利用平板划线分离法继续进行分离培养，直至获得单菌落。
用三区纯化法画线得到假单胞菌的单菌落形态如图1；显微镜观察菌体形态，菌体形态如图2所示。
用16S rDNA克隆文库技术分析鉴定菌种。将1mL菌液离心得到菌泥，提取总DNA，利用PCR技术以原核生物通用引物27f和1492r扩增16S rDNA片段。PCR产物纯化后与Promega的T-easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α。挑取的乳白色菌落通过菌落PCR确定阴性菌落，经酶切分型，对4个克隆测序。所得序列经Blast比较表明，该菌株为Pseudomonas属细菌，命名为Pseudomonas sp GRINML7。
实施例2假单胞菌进行修复铬污染土壤微生物固化
1)将西宁中星化工厂铬渣以液固比为3：1，添加到300mL三角瓶中修复铬污染土壤。
该废渣基本参数如下：pH8.8；CrT：2480mg/L；Cr6+：328mg/L。
2)将本发明提供的假单胞菌的菌株Pseudomonas sp GRINML7，接种在富集培养基中，30℃摇床160rpm培养至菌浓度为108个/mL；然后将菌液接种300mL三角瓶内，接种量为培养基的10％。
3)在修复过程中每24小时检测三角瓶中pH和Eh变化，整个工艺连续运行30天。
设置不添加假单胞菌为对照组，加入假单胞菌为修复组。修复组和对照组三角瓶中内固液分离后，沉淀固体经XRD检测为原铬渣成分MgO、Mg(OH)2以及Cr(OH)3。
取固液分离反应器出水分析，六价铬离子去除率94％。
所用固液分离反应器为常规固液分离反应器。
生物法治理重金属污染因其绿色环保、经济高效且无二次污染等优点被国内外科研人员广泛关注。本发明提供的新分离的假单胞菌及修复铬污染土壤微生物原位固化的方法，在适宜的pH下，在假单胞菌菌株可在好氧条件下，可有效还原固化六价铬离子，溶液中的六价铬离子可形成的三价氢氧化铬沉淀，将沉淀进行固液分离，该菌除了氢氧化铬沉淀产生的代谢产物还可以螯合少量游离的六价铬离子，可为我国普遍存在的铬渣污染问题的解决提供新的理论基础和修复手段。

Claims (6)

1.一株假单胞菌，其特征在于，该菌分类命名为：Pseudomonas sp GRINML7，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2018年10月15日，保藏编号为：CCTCC NO：M2018674。
2.用于分离培养如权利要求1所述假单胞菌的培养基，其特征在于，该培养基配方为：蛋白胨1-3g/L，乳酸钠1-3mL/L，KH2PO4 4-6g/L，K2HPO4 2-5g/L，MgSO4·7H2O 0.01-1g/L，K2Cr2O7 1000mg/L，微量元素母液0.1-0.5mL/L，琼脂粉20-30g/L，加入1000mL蒸馏水，调pH为8-10；
其中，该微量元素母液配方为：H3BO3 6g/L，CoCl2·6H2O 4g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，MnCl2·4H2O 0.6g/L，Na2MoO4·7H2O 0.6g/L，NiCl2·6H2O 0.4g/L，CuCl2·2H2O 0.2g/L。
3.用于富集培养如权利要求1所述假单胞菌的培养基，其特征在于，该培养基配方为：酵母浸粉1-5g/L，蛋白胨1-3g/L，K2HPO4 3-8g/L，MgSO4·7H2O 0.01-1g/L，微量元素母液0.1-0.5mL/L，K2Cr2O7 1000mg/L，1000mL蒸馏水，调pH为8-10；
其中，该微量元素母液配方为：H3BO3 6g/L，CoCl2·6H2O 4g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，MnCl2·4H2O 0.6g/L，Na2MoO4·7H2O 0.6g/L，NiCl2·6H2O 0.4g/L，CuCl2·2H2O 0.2g/L。
4.用于富集培养权利要求1所述假单胞菌的方法，其特征在于，将如权利要求1所述假单胞菌接种入如权利要求2所述的培养基中，在30-35℃的培养温度下，120-160rpm摇床培养至菌浓度达到108个/mL。
5.一种修复铬污染土壤的微生物原位固化方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将pH8-10的铬污染土壤添加到300mL三角瓶中30g，加入如权利要求3所述培养基100mL；
2)将权利要求1所述假单胞菌采用如权利要求3所述的方法进行富集培养后，接种至添加有铬污染土壤的三角瓶中；
3)用NaOH调节pH至8，于30℃，160rpm摇床修复；
4)在修复过程中每24小时检测三角瓶中pH和Eh变化，连续运行30天。
6.如权利要求5所述修复铬污染土壤的方法，其特征在于，步骤2)中所述假单胞菌的接种量为10％。
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