CN105779325A

CN105779325A - 一种脂肪酸芽孢杆菌及利用该菌原位成矿治理矿山重金属污染的方法

Info

Publication number: CN105779325A
Application number: CN201410822912.7A
Authority: CN
Inventors: 刘兴宇; 刘文彦; 陈勃伟; 尹思源
Original assignee: Beijing General Research Institute for Non Ferrous Metals
Current assignee: GRIMN Engineering Technology Research Institute Co Ltd
Priority date: 2014-12-25
Filing date: 2014-12-25
Publication date: 2016-07-20

Abstract

本发明提供一种脂肪酸芽孢杆菌，菌种分类名称为：脂环酸杆菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-B，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2012年12月26日，保藏编号：CGMCC No.7039。该菌可在酸环境下生长，利用该菌及外加碳源，可还原环境体系中的三价铁离子(Fe³⁺)并降低环境电位，将体系中的硫酸盐还原为负二价硫离子(S^2-)，与重金属离子结合，原位成矿形成不溶金属硫化物；从而实现矿山重金属污染的微生物修复。

Description

一种脂肪酸芽孢杆菌及利用该菌原位成矿治理矿山重金属污染的方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种脂肪酸芽孢杆菌Alicyclobacillus属细菌，其培养方法以及利用该菌原位成矿治理矿山重金属污染的方法。

背景技术

已知黄铁矿是有色金属硫化矿山的模式矿物之一，在中性甚至碱性环境中，只要黄铁矿暴露在空气中或含溶解氧的地下水与矿石接触，矿石就会缓慢氧化产生二价铁离子(Fe²⁺)。此时，由于pH较高，二价铁离子可迅速氧化成为三价铁离子(Fe³⁺)，而三价铁离子的存在，会加速黄铁矿的氧化过程，并使pH迅速下降，当pH进一步下降至3.5以下，在微生物的催化作用下，会进一步源源不断地产生三价铁离子，并使得黄铁矿等硫化矿的氧化速率进一步提高。因此，三价铁离子是氧化硫化矿产生重金属污染的关键因素，抑制三价铁离子的产生，可以降低环境电位并减少重金属溶出。

另一方面，大部分金属硫化物均不溶于水，因此，若能在重金属污染环境中生成负二价硫离子(S^2-)，则负二价硫离子可与重金属结合，形成不溶金属硫化物，从而清除重金属污染。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株高效的脂肪酸芽孢杆菌菌种，该菌种可显著降低黄铁矿的溶解率，并还原硫酸根离子(SO₄ ^2-)为负二价硫离子(S^2-)，与重金属形成金属硫化物。

本发明的第二个目的是提供一种可以获取、鉴定培养该脂肪酸芽孢杆菌的培养基。

本发明的第三个目的是提供一种可以富集、分离培养该脂肪酸芽孢杆菌的培养基。

本发明的第四个目的是提供一种利用该菌及碳源原位修复矿山重金属污染的方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一种脂肪酸芽孢杆菌，该菌种分类名称为：脂环酸杆菌(Alicyclobacillussp.)Biometek-B，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2012年12月26日，保藏编号：CGMCCNo.7039。

如上所述的脂肪酸芽孢杆菌是纯菌株，利用16SrDNA克隆文库技术鉴定该菌株表明，该菌株属于Alicyclobacillus属。

如上所述的脂肪酸芽孢杆菌可利用碳源还原三价铁为二价铁，还原SO₄ ^2-为S^2-，降低溶液电位并减少硫化矿溶解。

用于获取、鉴定培养如上所述脂肪酸芽孢杆菌的培养基，该培养基的配方为：0.25g酵母粉、0.5g蛋白胨、0.25gNaCl、1000mL蒸馏水，混匀后添加结冷胶30g/L，调pH至3.0，以下称为固体培养基。

用于富集、分离培养如上所述脂肪酸芽孢杆菌的培养基，该培养基的配方为：0.25g酵母粉、0.5g蛋白胨、0.25gNaCl、1000mL蒸馏水，调pH至3.0，以下称为液体培养基。

如上所述脂肪酸芽孢杆菌的富集、分离培养方法，将所述脂肪酸芽孢杆菌菌种接种入如上所述的液体培养基中，在40-50℃的培养温度下，摇床培养5-10天。

一种利用如上所述脂肪酸芽孢杆菌对有色金属矿山废石堆和尾矿库进行重金属污染微生物原位修复的方法，将所述脂肪酸芽孢杆菌的菌种，采用如上所述的方法进行富集培养后，接种至有色金属硫化矿山废石堆及尾矿库，定期补加如上所述的培养基。

如上所述脂肪酸芽孢杆菌的获得方法为：

(1)按照如上所述的菌种固体培养基配方比例配置100mL培养基，调pH为3.0，121℃下灭菌25分钟，之后每10mL倒一块平板。

(2)将100mL含所述脂肪酸芽孢杆菌水样加入0.3g酵母粉，在45℃轻轻震荡富集培养1周，利用显微镜检测判断细菌生长情况。利用分光光度计测量细菌培养液在600nm处的吸光值，当测得的OD600的数值如果在0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，即可进行下一步操作。

(3)过滤收集脂肪酸芽孢杆菌，接种于100mL液体培养基中，45℃进行富集培养。将富集的脂肪酸芽孢杆菌涂布于上述固体培养基平板，并挑单菌落进行进一步平板划线。分离出的单菌落采用下面(4)(5)所述方法进行进一步鉴定。

(4)纯化分离后的单菌落利用扫描电镜进行菌种形态观察；

(5)采用16SrDNA克隆文库技术对分离纯菌株进行鉴定，鉴定结果表明该菌株属于Alicyclobacillus属。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一株菌株Biometek-B，该菌可利用碳源，还原环境体系中的三价铁离子并降低环境电位，将体系中的硫酸盐还原为负二价硫离子(S^2-)，与重金属离子结合，原位成矿形成不溶金属硫化物，并清除重金属污染。

附图说明

图1为本发明菌种的扫描电镜照片。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明所涉及的脂肪酸芽孢杆菌已进行保藏，其菌种分类名称为：脂环酸杆菌(Alicyclobacillussp.)Biometek-B，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2012年12月26日，保藏编号：CGMCCNo.7039。

本发明所述脂肪酸芽孢杆菌的培养方法如下：

首先配制获取、鉴定培养脂肪酸芽孢杆菌的固体培养基：称取0.25g酵母粉、0.5g蛋白胨、0.25gNaCl、1000mL蒸馏水，混匀后添加结冷胶30g/L。按比例配制100mL培养基，调pH为3.0，121℃灭菌25分钟，灭菌后每10mL倒一块平板。

其次配制富集、分离培养脂肪酸芽孢杆菌的液体培养基：称取0.25g酵母粉、0.5g蛋白胨、0.25gNaCl、1000mL蒸馏水，调pH至3.0。按比例配置100mL培养基，调pH为3.0，121℃灭菌25分钟后备用。

本发明所获得的含脂肪酸芽孢杆菌水样，是取自江西德兴铜矿含铜酸性废水。将100mL水样加入0.3g酵母粉，在45℃摇床50rpm震荡培养1周，利用显微镜检测判断细菌生长情况。利用分光光度计测量细菌培养液在600nm处的吸光值，当测得的OD600的数值在0.6-0.8之间时，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，采用0.2μm过滤膜将上述培养液中的细菌过滤，并将细菌用20mL无菌蒸馏水洗下。以5％的接种量分别接种于多个100mL液体培养基中，45℃进行培养，并设置不接种对照即空白对照(CK)。100rpm培养两周后观察细菌生长情况。将上述培养液梯度稀释1、2、3、4、5(分别对应10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5)，分别取100μL稀释液涂固体培养基平板，45℃培养三天，得到单菌落。

用扫描电镜观察菌体形态，菌体形态如图1所示。

用16SrDNA克隆文库技术分析鉴定菌种。将单菌落利用液体培养基培养后收集菌液，取1mL菌液离心得到菌泥，提取总DNA，利用PCR技术以原核生物通用引物530f和1490r扩增16SrDNA片段。PCR产物纯化后与Promega的T-easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α。挑取的白色菌落通过菌落PCR确定阳性菌落，经酶切分型，对4个克隆测序。所得序列经Blast比较表明，该菌株为Alicyclobacillus属细菌，命名为Biometek-B，与电镜观察菌体结果一致。

实施例1：

用两个300mL烧瓶分别装入150mL矿山酸性废水及15g黄铁矿、15g辉铜矿。其中一个烧瓶中接入鉴定后菌落富集培养并离心获得的脂肪酸芽孢杆菌Biometek-B菌泥，另一个为空白对照。摇床培养30天测试黄铁矿及辉铜矿溶出率，结果发现接种Biometek-B细菌的烧瓶比起空白对照烧瓶，黄铁矿溶出率降低90％，辉铜矿溶出降低85％，电位降低10％，三价铁离子浓度低95％，置于溶液上方的醋酸铅试纸全部变为黑色。

本实施例模拟硫化矿山废石堆环境，在有水浸泡条件下，废石堆中黄铁矿氧化溶出产酸，而投加本发明菌种，可使黄铁矿溶出受到抑制。从而证明本发明菌种确实具有还原环境体系中的三价铁离子、还原硫酸根为S^2-离子、降低环境电位、原位成矿治理重金属污染的能力。

Claims

1.一种脂肪酸芽孢杆菌，其特征在于，其菌种分类名称为：脂环酸杆菌(Alicyclobacillussp.)Biometek-B，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2012年12月26日，保藏编号：CGMCCNo.7039。

2.用于获取、鉴定培养如权利要求1所述脂肪酸芽孢杆菌的培养基，其特征在于，取0.25g酵母粉、0.5g蛋白胨、0.25gNaCl、1000mL蒸馏水，混匀后添加结冷胶30g/L，调pH至3.0。

3.用于富集、分离培养如权利要求1所述脂肪酸芽孢杆菌的培养基，其特征在于，取0.25g酵母粉、0.5g蛋白胨、0.25gNaCl、1000mL蒸馏水，调pH至3.0。

4.如权利要求1所述脂肪酸芽孢杆菌的富集、分离、培养的方法，其特征在于，将所述脂肪酸芽孢杆菌菌种接种入如权利要求3所述的培养基中，在40-50℃的培养温度下，摇床培养5-10天。

5.一种利用权利要求1所述脂肪酸芽孢杆菌对有色金属矿山废石堆和尾矿库进行重金属污染微生物原位修复的方法，其特征在于，将权利要求1所述脂肪酸芽孢杆菌的菌种，采用如权利要求3所述的方法进行富集培养后，接种至有色金属硫化矿山废石堆或尾矿库。

6.如权要求5所述的方法，其特征在于，接种硫化矿山的接种量为每m³面积3L。

7.如权要求5所述的方法，其特征在于，接种所述菌种后，若pH降低0.5，则继续补加培养基，补加量为每m³面积3L。