CN102260729B - 一种以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂的方法 - Google Patents

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一种以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂的方法，它涉及一种发酵生物絮凝剂的方法。它解决了现有生物絮凝剂的发酵方法存在能耗高、生产效率低、生产成本高、不适合大规模工业化发酵生产的问题。方法：一、放射根瘤菌和球形芽孢杆菌混合培养，得产絮菌种子液；二、黑曲霉培养为成熟的菌丝球；三、成熟的菌丝球与产絮菌种子液混合培养，得混合菌丝球；四、以24h为一个发酵周期，每一个发酵周期结束后将混合菌丝球取出倒入新鲜培养基中培养；五、重复操作步骤四30～35次即完成。本发明在保证絮凝率稳定的前提下，减少种子液需求量，降低生产成本，提高生产效率，降低生产能耗，对生物絮凝剂的大规模工业化生产具有重大意义。

Description

一种以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂的方法
技术领域
本发明涉及一种发酵生物絮凝剂的方法。
背景技术
生物絮凝剂(Bioflocculant，BF)是一类由微生物产生的天然生物高分子聚合物，对于液体中的细菌、细胞、固体颗粒、胶体颗粒等悬浮物具有絮凝和沉降功能。与化学絮凝剂相比，生物絮凝剂具备许多优点，如高效、无毒、发酵成本低、无二次污染、可生物降解、降解产物无害、产品易于固液分离等，新型环保的生物絮凝剂满足现今可持续发展的要求，对人类健康及环境保护都具有重要现实意义，已经成为絮凝剂研发的重要方向之一，是一类新型的绿色净水剂。
目前有关生物絮凝剂研究集中在生物絮凝剂产生菌的分离鉴定与培养、絮凝效能影响因素、絮凝机理以及絮凝剂的化学结构等方面，关于大规模发酵生产及实际应用的研究较少，现有生物絮凝剂的发酵方法，普遍存在能耗高、生产效率低、生产成本高的问题，不适合大规模工业化发酵生产。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有生物絮凝剂的发酵方法存在能耗高、生产效率低、生产成本高、不适合大规模工业化发酵生产的问题，而提供了一种以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂的方法。
以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂的方法按以下步骤进行：一、将放射根瘤菌和球形芽孢杆菌按1∶1体积比混合后接种到装有100mL产絮菌培养基的250mL三角瓶中，置于温度为20～30℃、转速为120～160r/min的摇床中培养18～30h，获得产絮菌种子液；二、将黑曲霉的孢子悬液接种到装有100mL菌丝球培养基的250mL三角瓶中，置于温度为28～32℃、转速为140r/min的摇床中培养1～7d，获得成熟的菌丝球；三、成熟的菌丝球用灭菌的磷酸盐溶液冲洗后加入到装有100mL产絮菌培养基的250mL三角瓶中，然后按照1％～10％的体积比加入产絮菌种子液，置于温度为25～35℃、转速为120～160r/min的摇床中培养18～30h，获得混合菌丝球；四、以24h为一个发酵周期，每一个发酵周期结束后将混合菌丝球取出倒入装有100mL新鲜产絮菌培养基的250mL三角瓶中，置于温度为25～35℃、转速为120～160r/min的摇床中培养24h；五、重复操作步骤四30～35次，即完成以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂；
其中步骤一中放射根瘤菌，属于Rhizobium radiobacter，保藏在美国模式培养物集存库，保藏编号为ATCC 4525；步骤一中球形芽孢杆菌，属于Bacillus sphaeicus，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 1.270；步骤二中黑曲霉，属于Aspergillus niger，保藏编号为CGMCC 3.3926。
本发明以菌丝球作为生物质载体，通过产絮菌(即放射根瘤菌和球形芽孢杆菌)与菌丝球(即黑曲霉)的混合培养使产絮菌吸附在菌丝球表面及内部孔隙中，获得混合菌丝球，达到了使游离态产絮菌固定化的目的，发酵过程中只需一次性投加产絮菌种子液，实现了生物絮凝剂的连续发酵生产。本发明以发酵液的絮凝率作为考察指标，24h为一个发酵周期，仅更换新鲜培养基，无二次投加产絮菌种子液，缩减了种子液准备时间，减少杂菌污染机会，节约生产成本，提高生产效率，降低生产能耗；固定化的产絮菌连续制备生物絮凝剂至少可达30～35个周期。本发明在保证絮凝率稳定的前提下，减少了种子液需求量，降低了生产成本，提高了生产效率(絮凝率为90％以上)，对生物絮凝剂的大规模工业化生产具有重大意义。
附图说明
图1为具体实施方式十三30个发酵周期中菌体生长情况及絮凝率变化图，其中▲表示产絮菌在30个发酵周期中的菌浊，柱形图□表示30个发酵周期中发酵液的絮凝率；图2为具体实施方式十三1个发酵周期中菌体生长、絮凝率及生物絮凝剂粗提物干重的变化图，其中▲表示产絮菌在固定化发酵过程中菌浊随发酵时间的变化，柱形图□表示发酵过程中絮凝率的变化，■表示生物絮凝剂粗提物的干重随发酵时间的变化。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂的方法按以下步骤进行：一、将放射根瘤菌和球形芽孢杆菌按1∶1体积比混合后接种到装有100mL产絮菌培养基的250mL三角瓶中，置于温度为20～30℃、转速为120～160r/min的摇床中培养18～30h，获得产絮菌种子液；二、将黑曲霉的孢子悬液接种到装有100mL菌丝球培养基的250mL三角瓶中，置于温度为28～32℃、转速为140r/min的摇床中培养1～7d，获得成熟的菌丝球；三、成熟的菌丝球用灭菌的磷酸盐溶液冲洗后加入到装有100mL产絮菌培养基的250mL三角瓶中，然后按照1％～10％的体积比加入产絮菌种子液，置于温度为25～35℃、转速为120～160r/min的摇床中培养18～30h，获得混合菌丝球；四、以24h为一个发酵周期，每一个发酵周期结束后将混合菌丝球取出倒入装有100mL新鲜产絮菌培养基的250mL三角瓶中，置于温度为25～35℃、转速为120～160r/min的摇床中培养24h；五、重复操作步骤四30～35次，即完成以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂；
其中步骤一中放射根瘤菌，属于Rhizobium radiobacter，保藏在美国模式培养物集存库，保藏编号为ATCC 4525；步骤一中球形芽孢杆菌，属于Bacillus sphaeicus，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 1.270；步骤二中黑曲霉，属于Aspergillus niger，保藏编号为CGMCC 3.3926。
本实施方式中放射根瘤菌、球形芽孢杆菌和黑曲霉均可以购买得到。
本实施方式中涉及的所有培养基均在112℃下灭菌30min。
本实施方式步骤三中磷酸盐溶液由0.2mol/L的Na2HPO4和0.2mol/L的NaH2PO4按体积比18∶7混合而成，pH值为7.2。
本实施方式步骤五重复操作步骤四30～35次，即可达到连续制备生物絮凝剂的目的，直至混合菌丝球破裂结束制备。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中置于温度为20℃、转速为160r/min的摇床中培养30h，获得产絮菌种子液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中置于温度为30℃、转速为120r/min的摇床中培养18h，获得产絮菌种子液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中置于温度为25℃、转速为140r/min的摇床中培养20h，获得产絮菌种子液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤二中置于温度为28℃、转速为140r/min的摇床中培养7d，获得成熟的菌丝球。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤二中置于温度为32℃、转速为140r/min的摇床中培养2d，获得成熟的菌丝球。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤二中置于温度为30℃、转速为140r/min的摇床中培养3d，获得成熟的菌丝球。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是步骤二中黑曲霉的孢子悬液的OD600值为0.5～1。其它步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤二中黑曲霉的孢子悬液接种采用的接种量为25～50μL。其它步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤一、三和四中产絮菌培养基成分相同，均是由8～12g的葡萄糖、4～6g的K2HPO4、1～3g的KH2PO4、0.1～0.3g的MgSO4·7H2O、0.05～0.15g的NaCl、0.4～0.6g的尿素和0.4～0.6g的酵母膏溶于1000mL的蒸馏水组成，调节pH到6.5～7.5。其它步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是步骤二中菌丝球培养基由8～10g的葡萄糖、0.5～1.5g的KH2PO4、0.8～1.2g的NH4Cl和0.2～0.6g的MgSO4溶于1000mL蒸馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式一至十之一相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十一之一不同的是步骤三中置于温度为30℃、转速为140r/min的摇床中培养25h，获得混合菌丝球。其它步骤及参数与具体实施方式一至十一之一相同。
具体实施方式十三：本实施方式以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂的方法按以下步骤进行：一、将放射根瘤菌和球形芽孢杆菌按1∶1体积比混合后接种到装有100mL产絮菌培养基的250mL三角瓶中，置于温度为25℃、转速为140r/min的摇床中培养25h，获得产絮菌种子液；二、将黑曲霉的孢子悬液接种到装有100mL菌丝球培养基的250mL三角瓶中，置于温度为30℃、转速为140r/min的摇床中培养3d，获得成熟的菌丝球；三、成熟的菌丝球用灭菌的磷酸盐溶液冲洗后加入到装有100mL产絮菌培养基的250mL三角瓶中，然后按照5％的体积比加入产絮菌种子液，置于温度为30℃、转速为140r/min的摇床中培养24h，获得混合菌丝球；四、以24h为一个发酵周期，每一个发酵周期结束后将混合菌丝球取出倒入装有100mL新鲜产絮菌培养基的250mL三角瓶中，置于温度为32℃、转速为140r/min的摇床中培养24h；五、重复操作步骤四30次，即完成以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂；
其中步骤一中放射根瘤菌，属于Rhizobium radiobacter，保藏在美国模式培养物集存库，保藏编号为ATCC 4525；步骤一中球形芽孢杆菌，属于Bacillus sphaeicus，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 1.270；步骤二中黑曲霉，属于Aspergillus niger，保藏编号为CGMCC 3.3926。
本实施方式即完成以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂，取发酵液，采用传统的混凝杯罐试验，测定其对1000mL高岭土悬液(5g/L)的絮凝率，其中生物絮凝剂发酵液投加量为10mL，pH为8，10％质量分数的CaCl2溶液投加量为1.5mL；在160r/min条件下搅拌120s，再以40r/min的速度搅拌120s后，室温下静沉20min，空白对照除不加生物絮凝剂发酵液之外其他处理都相同，测定上清液在波长550nm下的吸光度值，按照下式计算絮凝率；
Figure GDA00002500830300051
式中A——空白对照上清液的浊度
B——样品上清液的浊度
结果：如图1所示，30个发酵周期(即重复操作步骤四30次)中的絮凝率为90％以上，微小波动都在合理范围内，说明本实施方式可以连续且稳定的生产生物絮凝剂；本实施方式制备所得生物絮凝剂可使5g/L的高岭土悬液清澈透明，具有良好的絮凝效果，说明本实施方法式发酵所得的生物絮凝剂可用于进一步实际应用，为其大规模工业发酵奠定了基础。
本实施方式即完成以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂，取发酵液，采用有机溶剂法对发酵液中的生物絮凝剂进行粗提，具体操作是向发酵液中加入3倍体积的4℃下预冷乙醇，充分混合，在4℃下以9000r/min的转速离心20min分离得到白色絮状物质，即为粗提产物，烘干至恒重后称量即可得生物絮凝剂的干重；结果见图2，在一个发酵周期中随着培养时间的延长，产絮菌生物量、絮凝率及生物絮凝剂干重呈现相同的变化规律，先上升，在一段时间内维持稳定，然后下降；其中在培养时间为18～30h之间时，絮凝率具有较高水平，且生物絮凝剂产量也达到最大，根据实际需要，本实施方式选择24h作为连续发酵制备生物絮凝剂的一个周期。

Claims (8)

1.一种以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂的方法，其特征在于以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂的方法按以下步骤进行：一、将放射根瘤菌和球形芽孢杆菌按1∶1体积比混合后接种到装有100mL产絮菌培养基的250mL三角瓶中，置于温度为20～30℃、转速为120～160r/min的摇床中培养18～30h，获得产絮菌种子液；二、将黑曲霉的孢子悬液接种到装有100mL菌丝球培养基的250mL三角瓶中，置于温度为28～32℃、转速为140r/min的摇床中培养1～7d，获得成熟的菌丝球；三、成熟的菌丝球用灭菌的磷酸盐溶液冲洗后加入到装有100mL产絮菌培养基的250mL三角瓶中，然后按照1％～10％的体积比加入产絮菌种子液，置于温度为25～35℃、转速为120～160r/min的摇床中培养18～30h，获得混合菌丝球；四、以24h为一个发酵周期，每一个发酵周期结束后将混合菌丝球取出倒入装有100mL新鲜产絮菌培养基的250mL三角瓶中，置于温度为25～35℃、转速为120～160r/min的摇床中培养24h；五、重复操作步骤四30～35次，即完成以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂；
其中步骤一中放射根瘤菌，属于Rhizobium radiobacter，保藏在美国模式培养物集存库，保藏编号为ATCC 4525；步骤一中球形芽孢杆菌，属于Bacillus sphaeicus，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 1.270；步骤二中黑曲霉，属于Aspergillus niger，保藏编号为CGMCC 3.3926。
2.根据权利要求1所述的一种以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤一中置于温度为25℃、转速为140r/min的摇床中培养20h，获得产絮菌种子液。
3.根据权利要求1或2所述的一种以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤二中置于温度为30℃、转速为140r/min的摇床中培养3d，获得成熟的菌丝球。
4.根据权利要求3所述的一种以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤二中黑曲霉的孢子悬液的OD600值为0.5～1。
5.根据权利要求4所述的一种以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤二中黑曲霉的孢子悬液接种采用的接种量为25～50μL。
6.根据权利要求5所述的一种以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤一、三和四中产絮菌培养基成分相同，均是由8～12g的葡萄糖、4～6g的K2HPO4、1～3g的KH2PO4、0.1～0.3g的MgSO4·7H2O、0.05～0.15g的NaCl、0.4～0.6g的尿素和0.4～0.6g的酵母膏溶于1000mL的蒸馏水组成，调节pH到6.5～7.5。
7.根据权利要求6所述的一种以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤二中菌丝球培养基由8～10g的葡萄糖、0.5～1.5g的KH2PO4、0.8～1.2g的NH4Cl和0.2～0.6g的MgSO4溶于1000mL蒸馏水组成。
8.根据权利要求7所述的一种以菌丝球为载体发酵生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤三中置于温度为30℃、转速为140r/min的摇床中培养25h，获得混合菌丝球。
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