CN1570081A - 一种鞘鞍醇杆菌及用它制备糖蛋白类生物絮凝剂的方法 - Google Patents

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Abstract

一种嗜温鞘鞍醇杆菌BF－QSH7，其特征是保藏单位为武汉保藏中心，保藏号为M.204033。它可用于制备糖蛋白类生物絮凝剂，制备时向淀粉废水中加入(NH4) 2SO4、K2HPO4和MgSO4作为发酵培养基，经高温蒸汽灭菌后接入含有嗜温鞘鞍醇杆菌的种子培养基进行发酵培养，发酵培养温度为25℃－35℃，通气，搅拌，培养20－48h后离心分离，收集菌体，以稀盐酸抽提菌体，提取液减压浓缩后，加入丙酮或乙醇沉降，离心收集沉淀，真空干燥即得生物絮凝剂的粗品。以淀粉废水为原料可大大降低生产成本，而且发酵时间短，提取工艺简单，该生物絮凝剂具有多个活性位点，絮凝活性高，絮凝对象广泛，使用条件粗放。

Description

一种鞘鞍醇杆菌及用它制备糖蛋白类生物絮凝剂的方法
技术领域
本发明涉及嗜温鞘鞍醇杆菌(Sphingobacterium thalpophilum)BF-QSH7及用它从淀粉废水中制备一种新型糖蛋白类生物絮凝剂SPB-1的方法。
背景技术
絮凝剂广泛应用于污水处理、食品生产及生物发酵等工业领域，但目前所广泛使用的无机和有机合成高分子絮凝剂的残留物往往引起环境污染问题，甚至对人类具有致癌、致畸等毒性作用，已被许多国家禁止或限量使用。因此人们把目光转向开发高效、安全无毒、不污染环境的新型絮凝剂。
生物絮凝剂主要是由微生物在特定培养条件下所分泌产生的具有絮凝活性的高分子生物聚合物，具有安全无毒，对环境友好等优点。目前美国、日本、英国等数十个国家对生物絮凝剂进行了研究，筛选出多种絮凝剂产生菌，并在絮凝条件、机理、产絮凝剂的基因控制、絮凝剂的纯化、性质以及应用方面进行了一系列的工作。Takeda等人从土壤中分离出红平红球菌(R.erythropolis)S-l菌株，由其产生的蛋白类絮凝剂NOC-1，处理各种废水效果显著，但因生产成本高而未获得广泛应用。(M.Takena，R.Kurane，J.Kiozumi，I.Nakamura，Agri.Biol.Chem.1991，55(10)：2663-2664)。目前用于制备生物絮凝剂的菌种大都以葡萄糖、果糖、蔗糖、乙醇等有机物为碳源，以牛肉膏、蛋白胨、酵母汁等为氮源，生产成本高，从而大大限制了在工业上的广泛应用。
淀粉广泛应用于食品、化工、造纸、医药、纺织等工业领域，在其生产过程中会产生大量的高浓度有机废水，直接排放不仅会造成严重的环境污染，而且会造成资源的浪费。各国都在寻求处理淀粉废水的有效途径，研究较多的是利用淀粉废水米生产酵母、霉菌、细菌的单细胞，还未见有利用淀粉废水制备生物絮凝剂的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种嗜温鞘鞍醇杆菌BF-QSH7及用它从淀粉废水中制备高活性、低成本的新型糖蛋白类生物絮凝剂SPB-1的方法，它能弥补现有技术的上述不足。
一种嗜温鞘鞍醇杆菌编号为BF-QSH7，其特征是保藏单位为武汉中国典型微生物培养物保藏中心，保藏号为M.204033。
嗜温鞘鞍醇杆菌BF-QSH7用于制备糖蛋白类生物絮凝剂。
一种用嗜温鞘鞍醇杆菌BF-QSH7制备糖蛋白类生物絮凝剂的方法，其特征是向淀粉废水中加入(NH4)2SO4、K2HPO4和MgSO4作为发酵培养基，经高温蒸汽灭菌后接入含有嗜温鞘鞍醇杆菌的种子培养基进行发酵培养，发酵培养温度为25-35℃，通气，搅拌，培养20-48h后将发酵液离心分离，收集菌体，以稀盐酸抽提菌体，提取液减压浓缩后，加入丙酮或乙醇沉降，离心收集沉淀，真空干燥即得生物絮凝剂的粗品，经超滤、透析、真空干燥后得到生物絮凝剂的纯品。
本发明的优点在于：(1)所选育的嗜温鞘鞍醇杆菌BF-QSH7能以淀粉废水为主要原料制备具有高絮凝活性的生物絮凝剂SPB-1，而且发酵时间短，提取工艺简单，可大大降低生产成本；(2)所制备的生物絮凝剂SPB-1是一种具有多个活性位点的高分子糖蛋白类物质，絮凝活性高，絮凝对象广泛，使用条件粗放；(3)淀粉废水经发酵提取生物絮凝剂后，有机负荷大大减小，有利于后续处理，为高浓度淀粉废水的处理提供了方便。
附图说明
附图1为生物絮凝剂SPB-1经酸解和硅烷化后的GC-MS图。图中1、2、3、4分别表示样品中所含的四种糖组分，即D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖和塔罗糖。
附图2为糖组分1的MS图与标准谱库中D-Glucopyranose的MS图谱。图中a为样品的MS图，b为对应的标准MS图，匹配率为92％。
附图3为糖组分2的MS图与标准谱库中D-Galactopyranose的MS图谱。图中a为样品的MS图，b为对应的标准MS图，匹配率为86％。
附图4为糖组分3的MS图与标准谱库中D-Mannopyranose的MS图谱。图中a为样品的MS图，b为对应的标准MS图，匹配率为91％。
附图5为糖组分4的MS图与标准谱库中Talose的MS图谱。图中a为样品的MS图，b为对应的标准MS图，匹配率为91％。
附图6为生物絮凝剂SPB-1的红外光谱图
具体实施方式
本发明中所用的嗜温鞘鞍醇杆菌(S.thalpophilum)编号为BF-QSH7，它分离自污水处理厂的活性污泥中，菌种保藏采用营养琼脂培养基。该菌株在营养琼脂平板上培养时，菌落呈圆形，边缘整齐，向上凸起，表面光滑，润湿，室温下放置3天后呈黄色；菌体为直杆状，无芽孢，无鞭毛，有荚膜；菌体内脂质含鞘氨醇磷脂。该菌株主要生理生化特性见表1。
表1菌株BF-QSH7主要生理生化特性
生化特征 结果 生化特征 结果
脲酶 + 葡萄糖 +
接触酶 + D-阿拉伯糖 +
氧化酶 + 果糖 +
O/F -/+ 半乳糖 +
淀粉水解 + 乳糖 +
NO3-还原 - 蔗糖 +
七叶苷水解 + 纤维二糖 +
赖氨酸脱羧酶 - 麦芽糖 +
鸟氨酸脱羧酶 - 海藻糖 +
精氨酸脱羧酶 - 木糖 +
吲哚产生 - H2S产生 -
乙酸盐 - 产多黏菌素B +
丙二酸盐 - V-P -
制备糖蛋白类生物絮凝剂时，向每升自来水中加入葡萄糖20.0g、酵母膏0.5g、(NH4)2SO42.0g、K2HPO45.0g、MgSO4 0.2g、NaCl 0.1g得到种子培养基，每升淀粉废水(取自山东省诸城市兴贸有限公司玉米淀粉厂，废水水质分析结果见表2)中加入(NH4)2SO42.0g、K2HPO41.5g、MgSO40.2g得到发酵培养基。将菌种从营养琼脂斜面转接到上述的种子培养基，200rpm，30℃条件下摇床培养12h，使菌体细胞密度达到106-107个/ml，然后以5％(v/v)的接种量接到上述发酵培养基。发酵培养时温度为30℃、通气量为0.51/min、搅拌速度为300rpm、pH为6.5-7.0、培养时间为24h。
本发明中所述的发酵培养基中所用的三种无机盐的用量可依次为0.5-4.0g、1.0-3.0g、0.1-0.2g，其中(NH4)2SO4可改用NH4NO3或尿素；所述的接种量可为2-10％。
培养好的发酵液以10000rpm离心20min收集菌体，每升发酵液可获得15.8g湿菌体，用0.2mol/l的盐酸抽提三次，合并提取液，减压蒸馏至原体积的十分之一后，4℃下加入2倍体积的冷丙酮或乙醇并放置4h，6000rpm离心10min，收集沉淀，真空干燥得到浅黄色粉末状物质，为本发明的絮凝剂粗品，收率为每升发酵液2.69g。
将所得絮凝剂粗品悬浮于100mM的磷酸盐缓冲液(pH为7.4)中，超滤(10KDa)浓缩，蒸馏水透析后，冷冻干燥，得浅黄色粉末状物质。将所得粉末状物质再溶于上述磷酸盐缓冲液中，同上操作，超滤浓缩并冷冻干燥，即可得到生物絮凝剂的纯品(SPB-1)，收率为每升发酵液1.07g。
本发明的生物絮凝剂SPB-1的总糖含量采用硫酸-苯酚法测定为81.9％，蛋白质含量采用考马斯亮兰法测定为8.4％。将SPB-1酸解和硅烷化后利用GC-MS测定单糖的组成及含量，结果见附图1、2、3、4、5。从图中可以看出，糖的组分为D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖和塔罗糖，它们的质量比约为4∶5∶5∶1；将SPB-l碱解后以氨基酸自动分析仪测定其中蛋白质的氨基酸组成，结果表明SPB-1中含天门冬氨酸(2.05％)、丝氨酸(2.45％)、甘氨酸(15.57％)、丙氨酸(16.49)、缬氨酸(11.66)、异亮氨酸(3.17％)、亮氨酸(9.80％)、酪氨酸(1.29％)、苯丙氨酸(5.44％)、赖氨酸(9.74)、组氨酸(0.98％)、精氨酸(6.01％)、脯氨酸(15.3％)等多种氨基酸；红外光谱分析结果见附图6。从该图中可以看出，该生物絮凝剂为一种具有羟基、酰胺基等多个活性吸附位电的糖蛋白类化合物。凝胶渗透色谱法测定结果表明其分子量在3×106-6×106之间。
本发明所得到的生物絮凝剂SPB-1能有效絮凝高龄土悬液，硅藻土悬液、泥浆水、活性污泥，在使用浓度为5.0mg/l时，对其中悬浮颗粒物的去除率都在95.0％以上；各种阳离子共存时(包括Na+、K+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Fe3+、Al3+)不能增强其絮凝活性，甚或有抑制作用；该生物絮凝剂可在较宽的pH范围内保持其絮凝活性，在pH为1-11对高龄土悬液的絮凝活性都在90％以上。
发酵制备絮凝剂前后废水水质的变化见表2。从表2可以看出，通过发酵培养、离心分离菌体、提取絮凝剂等步骤之后，CODCr、BOD5和淀粉的去除率分别达到85.0％、86.0％和97.7％，水体中有机负荷大大减少，有利于后续处理。
表2发酵制备絮凝剂前后废水水质
              CODCr    BOD5   淀粉    总氮     总磷
项目
              (mg/l)    (mg/l)  (mg/l)  (mg/l)   (mg/l)
处理前        15369     8967    7654    304      491
处理后        2311      1254    179     102      96
去除率(％)    85.0      86.0    97.7    66.4     80.4

Claims (3)

1.一种嗜温鞘鞍醇杆菌编号为BF-QSH7，其特征是保藏单位为武汉中国典型微生物培养物保藏中心，保藏号为M.204033。
2、嗜温鞘鞍醇杆菌BF-QSH7用于制备糖蛋白类生物絮凝剂。
3、一种用嗜温鞘鞍醇杆菌BF-QSH7制备糖蛋白类生物絮凝剂的方法，其特征是向淀粉废水中加入(NH4)2SO4、K2HPO4和MgSO4作为发酵培养基，经高温蒸汽灭菌后接入含有嗜温鞘鞍醇杆菌的种子培养基进行发酵培养，发酵培养温度为25-35℃，通气，搅拌，培养20-48h后将发酵液离心分离，收集菌体，以稀盐酸抽提菌体，提取液减压浓缩后，加入丙酮或乙醇沉降，离心收集沉淀，真空干燥即得生物絮凝剂的粗品，经超滤、透析、真空干燥后得到生物絮凝剂的纯品。
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