CN113308401A - 纳米硒合成菌、纳米硒合成菌的筛选方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种纳米硒合成菌、纳米硒合成菌的筛选方法及其应用，涉及微生物技术领域，所述纳米硒合成菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NanoSe.X11，保藏编号为CCTCC NO:M2021476，保藏时间为2021年4月28日。本发明提出的纳米硒合成菌，能够在高浓度的亚硒酸钠中生存，而且能够将亚硒酸钠中的四价硒转化为红色生物纳米硒，生成的生物纳米硒粒径尺寸小、具有较好的生物活性，有利于动物、人体对硒的吸收。

Description

纳米硒合成菌、纳米硒合成菌的筛选方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种纳米硒合成菌、纳米硒合成菌的筛选方法及其应用。
背景技术
硒是生态系统中非常重要的营养元素，也是人体必须的微量元素之一。 1957年，Schwarz确定硒是人和动物必需的营养元素。硒元素的一个显著特征就是其营养剂量和毒性剂量之间范围很窄。人体食物中硒含量少于 0.05mg/kg就会造成缺硒，大于5mg/kg又会产生中毒。硒在地球上分布不均匀，中国72％地区处于缺硒、低硒带，膳食中硒摄入量的不足严重影响着几亿人口的身体健康。缺硒会引起人类的克山病、大骨节病、癌症、糖尿病、心脑血管病、不育症等疾病，而适当地补硒可以防癌、抗肿瘤和抗衰老。
由于人体不能直接合成硒，通过饮食摄取硒是唯一途径。不同形态的硒在人体内的吸收、生物效应及毒性等也不同。常见的补硒产品大致分为兼具活性与毒性的硒化合物和毒性低的零价硒。有机硒类补硒品相对于无机硒来说，其生物活性和毒性有很大的改善，但其仍然面临诸多问题，如生物安全性、生产成本等制约了有机硒产品的进一步开发。
纳米尺寸单质硒的出现为硒类产品进一步研发带来了新的曙光，生物纳米硒是由微生物产生的，尺寸在纳米级别的单质硒形态，根据急性毒性(LD50) 数据显示，无机硒LD50＝15mg/kg，有机硒LD50＝30～40mg/kg，生物纳米硒 LD50＝113mg/kg，生物纳米硒是已发现毒性最低的硒形态。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种纳米硒合成菌、纳米硒合成菌的筛选方法及其应用，旨在提供一种纳米硒合成菌，高效合成毒性低的生物纳米硒。
为实现上述目的，本发明提出一种纳米硒合成菌，所述纳米硒合成菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NanoSe.X11，保藏编号为CCTCC NO: M2021476，保藏时间为2021年4月28日。
本发明进一步提出一种如上所述的纳米硒合成菌的筛选方法，包括以下步骤：
S10、将富硒土样与无菌磷酸盐缓冲液混合，形成悬浮液；
S20、将所述悬浮液加入培养基中扩培，得到菌种扩培液；
S30、将所述菌种扩培液接种到液体发酵培养基上，摇床培养，继代培养 3～5次后，接种到亚硒酸钠浓度为500～2500mg/L的第一硒选择培养基中，继续培养1～3天，得到初筛菌液；
S40、将所述初筛菌液用水稀释后，涂布在刚果红筛选纤维素琼脂培养基上，选取单个菌落，分离，进行甘油保菌，得分离菌种；
S50、将所述分离菌接种到亚硒酸钠浓度为25～35g/L的第二硒选择培养基中，培养1～3天，得到纳米硒合成菌。
可选地，在步骤S20中，所述培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨5～15g/L、酵母提取物2～8g/L、氯化钠2～8g/L。
可选地，在步骤S30中，所述液体发酵培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨5～15g/L、酵母提取物2～8g/L、NaCl 2～8g/L、Na2SeO3 0.1～0.2g/L。
可选地，在步骤S30中，所述菌种扩培液接种到液体发酵培养基上时，所述菌种扩培液的接种量为1％～5％。
可选地，在步骤S40中，所述刚果红筛选纤维素琼脂培养基包括以下浓度的组分：
KNO3 1～3g/L、KH2PO4 0.5～1.5g/L、MgSO4 0.2～0.8g/L、NaCl 0.5～1.5g/L、Na2HPO4 0.5～1.5g/L、CMC-Na 15～25g/L、Na2SeO3 0.5～2.5g/L、琼脂10～20g/L。
可选地，在步骤S40中，所述初筛菌液的稀释倍数为5～15倍。
可选地，在步骤S50中，所述分离菌的接种量为1％～5％。
可选地，在步骤S20中，扩培温度为35～40℃；和/或，
在步骤S30中，培养温度为35～40℃。
本发明进一步提出一种如上所述的纳米硒合成菌在制备纳米硒中的应用，采用所述纳米硒合成菌制备得到纳米硒。
本发明提出的纳米硒合成菌，通过培养、筛选以及纯化等步骤，从富硒土样中分离筛选出纳米硒合成菌，该纳米硒合成菌能够在高浓度的亚硒酸钠中生存，而且能够将亚硒酸钠中的四价硒转化为红色纳米单质硒，生成的纳米单质硒粒径尺寸小、具有较好的生物活性，为生物纳米硒，有利于动物、人体对硒的吸收，同时，该纳米硒合成菌具有一定的产纤维素酶的能力，将纤维素分解。本发明提出的纳米硒合成菌，能够将亚硒酸钠中的四价硒转化为红色生物纳米硒，生成的生物纳米硒粒径尺寸小、具有较好的生物活性，有利于动物、人体对硒的吸收。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中纳米硒合成菌合成纳米硒的效果对比图；
图2本发明实施例1中纳米硒合成菌的凝胶电流(SDS-PAGE)图；；
图3本发明实施例1中纳米硒合成菌的进化树图；
图4为硒标准曲线图；
图5为本发明实施例3制备的纳米硒的紫外光谱；
图6为本发明实施例3制备的纳米硒的XRD图；
图7为本发明实施例3制备的纳米硒的透射电镜；
图8为葡萄糖标准曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
纳米尺寸单质硒的出现为硒类产品进一步研发带来了新的曙光，生物纳米硒是由微生物产生的，尺寸在纳米级别的单质硒形态，根据急性毒性(LD50) 数据显示，无机硒LD50＝15mg/kg，有机硒LD50＝30～40mg/kg，生物纳米硒 LD50＝113mg/kg，生物纳米硒是已发现毒性最低的硒形态。
鉴于此，本发明提出一种纳米硒合成菌，旨在提供一种纳米硒合成菌，高效合成毒性低的生物纳米硒。本发明提出的纳米硒合成菌，已被送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国.武汉.武汉大学，分类名为地衣芽孢杆菌，其保藏编号为CCTCC NO:M2021476，保藏时间为2021年4月28日。
所述层出镰刀菌EF003的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，将所述基因序列与GenBank中的基因序列进行比对，使用MEGA-5对比对结果进行分析，所述纳米硒合成菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) NanoSe.X11。
本发明提出的纳米硒合成菌，通过培养、筛选以及纯化等步骤，从富硒土样中分离筛选出纳米硒合成菌，该纳米硒合成菌能够在高浓度的亚硒酸钠中生存，而且能够将亚硒酸钠中的四价硒转化为红色纳米单质硒，生成的纳米单质硒粒径尺寸小、具有较好的生物活性，为生物纳米硒，有利于动物、人体对硒的吸收，同时，该纳米硒合成菌具有一定的产纤维素酶的能力，将纤维素分解。本发明提出的纳米硒合成菌，能够将亚硒酸钠中的四价硒转化为红色生物纳米硒，生成的生物纳米硒粒径尺寸小、具有较好的生物活性，有利于动物、人体对硒的吸收。
在发明进一步提出一种如上所述的纳米硒合成菌的筛选方法，包括以下步骤：
S10、将富硒土样与无菌磷酸盐缓冲液混合，形成悬浮液。
富硒土样的来源，本发明不做限制，在本发明实施例中，收集了湖北恩施富硒矿床土和湖北恩施富硒茶田土两种富硒土样，以下给出步骤S10的一个具体实施例：
将两组土样分别放入烧杯中，加入无菌磷酸盐缓冲液悬浮，再加入玻璃珠，在常温、180r/min的环境下于摇床中振荡30min，静置，待砂砾和大颗粒沉降后收集悬浮液，将此悬浮液放入离心机以5000r/min离心10分钟，收集沉淀，将沉淀用5mL无菌磷酸盐缓冲液悬浮后放入4℃冰箱保存，其中湖北恩施富硒矿床土沉淀颜色为深黑色，湖北恩施富硒茶田土的颜色较浅，为黄褐色。
S20、将所述悬浮液加入培养基中扩培，得到菌种扩培液。
优选地，在本步骤中，所述培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨5～15g/L、酵母提取物2～8g/L、氯化钠2～8g/L。更优选地，所述培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L。此外，扩培温度优选为35～40℃，更优选为37℃，使得菌株生长良好。以下给出步骤S20的一个具体实施例：
取上述两组悬浮液2mL分别加入100mL培养基的三角瓶中扩培，在37℃、 180r/min的环境下于摇床中振荡培养2天，得到菌种扩培液。
S30、将所述菌种扩培液接种到液体发酵培养基上，摇床培养，继代培养 3～5次后，接种到亚硒酸钠浓度为500～2500mg/L的第一硒选择培养基中，继续培养1～3天，得到初筛菌液。
本步骤中，通过第一硒选择培养基进行初筛，初筛之前，先进行发酵培养，优选地，所述液体发酵培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨5～15g/L、酵母提取物2～8g/L、NaCl 2～8g/L、Na2SeO3 0.1～0.2g/L。更优选地，所述液体发酵培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L、 Na2SeO3 0.15g/L。初筛时，第一硒选择培养基中亚硒酸钠的浓度范围为500～2500mg/L，实际操作中，由于事先不知道纳米硒合成菌具体的耐硒的能力，在继代培养后，依次接种到亚硒酸钠浓度为500mg/L、1000mg/L、 1500mg/L、2000mg/L和2500mg/L的10mL第一硒选择培养基中，继续培养 48h，之后，从高到低检测第一硒选择培养基中是否有菌种存活，如果2500mg/L 的有存活，则选择其为初筛菌液，如果没有，则继续检测2000mg/L，依次类推。而在本发明实施例中，纳米硒合成菌的耐硒能力强，2500mg/L的有存活。
优选地，本步骤中培养温度35～40℃，更优选为37℃；菌种扩培液接种到液体发酵培养基上时，所述菌种扩培液的接种量为1％～5％，更优选为5％。
以下给出步骤S30的一个具体实施例：
取菌种扩培液分别以5％的接种量加入含50mL液体发酵培养基的三角瓶中，在37℃、180r/min的环境下于摇床中振荡培养2天。再以5％接种量继代培养4次后，接种到亚硒酸钠浓度为2500mg/L的10mL第一硒选择培养基中，继续培养48h，得到初筛菌液。
S40、将所述初筛菌液用水稀释后，涂布在刚果红筛选纤维素琼脂培养基上，选取单个菌落，分离，进行甘油保菌，得分离菌种。
在本步骤中，所述初筛菌液用水稀释时，稀释倍数优选为5～15倍，更优选为10倍。
所述刚果红筛选纤维素琼脂培养基包括以下浓度的组分：
KNO3 1～3g/L、KH2PO4 0.5～1.5g/L、MgSO4 0.2～0.8g/L、NaCl 0.5～1.5g/L、Na2HPO4 0.5～1.5g/L、CMC-Na 15～25g/L、Na2SeO3 0.5～2.5g/L、琼脂10～20g/L。
优选地，所述刚果红筛选纤维素琼脂培养基包括以下浓度的组分：
KNO3 2g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4 0.5g/L、NaCl 1g/L、Na2HPO4 1g/L、 CMC-Na 20g/L、Na2SeO3 2.5g/L、琼脂15g/L。
本步骤中主要筛选能够产纤维素酶的菌，优选地，刚果红筛选纤维素琼脂培养基中，进一步筛选硒耐受力较弱的纳米硒合成菌，使得得到的纳米硒合成菌对硒浓度的耐受性较为稳定。
以下给出步骤S40的一个具体实施例：
取初筛菌液用无菌水稀释10倍后涂布在刚果红筛选纤维素琼脂培养基上，在37℃恒温培养箱中培养48h，在培养结束后往培养皿中加入适量的刚果红溶液，染色1h后弃去染液，加入适量1mol/L的NaCl溶液，洗涤1h，根据菌落周围透明圈直径与菌落直径的比值大小选择菌株，选取比值大的多个菌落进一步分离并进行甘油保菌。
在本发明实施例中，筛选出了11个菌落。
S50、将所述分离菌接种到亚硒酸钠浓度为25～35g/L的第二硒选择培养基中，培养1～3天，得到纳米硒合成菌。
有些菌株的保存一段时间后，其活性可能会降低，为了得到性能和活性较为稳定的纳米硒合成菌，本步骤中，对得到的11个菌落做进一步的筛选，得到耐硒性能更好的纳米硒合成菌。
优选地，在本步骤，所述分离菌的接种量为1％～5％，更优选地，接种量为5％，得到的纳米硒合成菌的耐硒、产硒能力较强。
实际操作中，由于事先不知道纳米硒合成菌具体的耐硒的能力，分离出保藏在甘油管中的11株菌株以5％接种量依次接种到亚硒酸钠浓度为2.5g/L， 5g/L，7.5g/L，10g/L，12.5g/L，15g/L，17.5g/L，20g/L，22.5g/L，25g/L，27.5g/L，30g/L的5mL第二硒选择培养基中，在37℃、180r/min的环境下于摇床中振荡培养2天，之后，从高到低检测第二硒选择培养基中是否有菌种存活，如果有，则为目标菌株，如果没有，则继续检测低浓度。
以下给出步骤S50的一个具体实施例：
将所述分离菌接种到亚硒酸钠浓度为25～35g/L的第二硒选择培养基中，在37℃、180r/min的环境下于摇床中振荡培养1～3天，得到纳米硒合成菌。探究菌株的硒耐受能力，其NanoSe.X11号菌株最高可在亚硒酸钠浓度30g/L 的环境下生长，同时在发酵过程中将亚硒酸钠中的四价硒转化为红色纳米硒，即为纳米硒合成菌。
得到的纳米硒合成菌需要进行纯化与保藏，将其在平板划线纯化后挑取单菌落通过甘油保藏法保存菌种。
本发明进一步提出一种如上所述的纳米硒合成菌在制备纳米硒中的应用，采用所述纳米硒合成菌制备得到纳米硒。
所述纳米硒合成菌制备前，需要进行活化，具体地，将保藏在甘油中的纳米硒合成菌以5％接种量接种到含5mL富集培养基的试管中，将试管在 37℃、180r/min的环境下于摇床中振荡培养2天，得到菌种活化液。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1纳米硒合成菌的筛选
(1)将两组土样分别放入烧杯中，加入无菌磷酸盐缓冲液悬浮，再加入玻璃珠，在常温、180r/min的环境下于摇床中振荡30min，静置，待砂砾和大颗粒沉降后收集悬浮液，将此悬浮液放入离心机以5000r/min离心10分钟，收集沉淀，将沉淀用5mL无菌磷酸盐缓冲液悬浮后放入4℃冰箱保存，其中湖北恩施富硒矿床土沉淀颜色为深黑色，湖北恩施富硒茶田土的颜色较浅，为黄褐色。
(2)取上述两组悬浮液2mL分别加入100mL培养基的三角瓶中扩培，在37℃、180r/min的环境下于摇床中振荡培养2天，得到菌种扩培液。
(3)取菌种扩培液分别以5％的接种量加入含50mL液体发酵培养基的三角瓶中，在37℃、180r/min的环境下于摇床中振荡培养2天。再以5％接种量继代培养4次后，接种到亚硒酸钠浓度为2500mg/L的10mL第一硒选择培养基中，继续培养48h，得到初筛菌液。
(4)取初筛菌液用无菌水稀释10倍后涂布在刚果红筛选纤维素琼脂培养基上，在37℃恒温培养箱中培养48h，在培养结束后往培养皿中加入适量的刚果红溶液，染色1h后弃去染液，加入适量1mol/L的NaCl溶液，洗涤1h，根据菌落周围透明圈直径与菌落直径的比值大小选择菌株，选取比值大的多个菌落进一步分离并进行甘油保菌。
(5)将所述分离菌接种到亚硒酸钠浓度为25～35g/L的第二硒选择培养基中，在37℃、180r/min的环境下于摇床中振荡培养1～3天，得到纳米硒合成菌。探究菌株的硒耐受能力，其NanoSe.X11号菌株最高可在亚硒酸钠浓度 30g/L的环境下生长，同时在发酵过程中将亚硒酸钠中的四价硒转化为红色纳米硒，即为纳米硒合成菌。
将上述纳米硒合成菌加入5mL的亚硒酸钠浓度为20g/L的培养基中培养 (a)，并对设置亚硒酸钠浓度为20g/L的培养基的空白对照(b)；将上述纳米硒合成菌加入5mL包括蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L的培养基中(c)，并设置蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L的培养基的对照(d)，培养2天后，其照片如图1所示，从左至右依次为(a)、(b)、(c)、 (d)，通过对比可知，含有亚硒酸钠的(a)加入纳米硒合成菌并培养后，培养基变成了红色，说明有纳米硒的生成。
实施例2纳米硒合成菌菌种鉴定
提取上述纳米硒合成菌基因组DNA：参照购自北京索莱宝科技有限公司的细菌基因组提取试剂盒说明书提取纳米硒合成菌基因组DNA。通过PCR获得纳米硒合成菌的16SrDNA：PCR反应体系(25μl)：Template(0.5μl)、、Primerl1 (0.5μl)、Primerl2(0.5μl)、10*Buffer(2.5μl)、高保真快速DNA聚合酶(0.5μl)、 dNTP(0.5μl)、ddH2O(20μl)。PCR反应条件：95℃预变性(10min)、94℃变性(50s)、54℃退火(50s)、72℃延伸(90s)，35个循环。延伸后4℃保存。胶回收并测序：PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳后，在照胶仪中检测纳米硒合成菌的16SrDNA扩增结果，结果如图2所示。使用购自北京索莱宝科技有限公司的胶回收试剂盒，按照使用说明书进行胶回收。擎科生物科技有限公司测序。将所获测序结果与GenBank中的基因序列进行比对，使用 MEGA-5对比对结果进行分析。进化树图如图3所示。综合生理生化特性及分子生物学特性，确定纳米硒合成菌为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis) NanoSe.X11。
实施例3纳米硒合成菌制备纳米硒
(1)菌种活化：将实施例1中分离出保藏在甘油管中的纳米硒合成菌以 5％接种量接种到含5mL富集培养基的试管中，将试管在37℃、180r/min的环境下于摇床中振荡培养2天，得到菌种活化液。
(2)将菌种活化液加入到亚硒酸钠浓度为20g/L的5mL培养基试管中，培养基还包括以下浓度的组分：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L；
(3)将试管在37℃、180r/min的环境下于摇床中振荡培养2天后通过 8000rpm的转速离心5min收集沉淀物。沉淀重悬于2mL的无菌水中，将重悬物移至预制的蔗糖密度梯度管中(由质量分数50％、60％、70％三个梯度的蔗糖溶液制备)，以8000rpm的转速离心10min后，收集离心管底部红色沉淀。将得到的红色沉淀用无菌水反复吹洗后，进行冷冻干燥，得到纳米硒粉末。
1、纳米硒粉末中硒含量测定：
(1)绘制硒标准曲线
取0.05g硒单质，加入3mL混酸反应至澄清，定容到50mL备用。取1mL 于250mL容量瓶中并定容即得到硒对照品4ug/mL的溶液。分别取对照液 0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL、12.0mL，加入25mL蒸馏水，慢慢滴加氨水调PH至2。转入具塞锥形瓶中，再加入1％邻苯二胺盐酸盐试液(现配现用)，摇匀，避光反应2h；之后置于分液漏斗中，加入9.5mL甲苯，进行萃取。取甲苯层(上层)。用甲苯定容至10mL。用甲苯溶液将萃取液再稀释一倍，以甲苯为参比，用石英比色皿334nm测量9组的吸光度值，以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线如图4所示，数据如表1所示，硒标准曲线回归方程：Y＝0.1467X+0.00631， R2＝0.999。
表1硒标准曲线相关数据
Figure RE-GDA0003182352350000101
(2)硒含量测定
取5mg纳米硒置于50mL烧杯中，加入1mL浓硫酸和2mL浓硝酸硝化至澄清，90℃水浴2h，反应结束后冷却至室温，加入25ml蒸馏水，用氨水调 pH至2，加入2mL1％邻苯二胺试液(现配现用)，振摇、静置2h，置于100mL 分液漏斗中，加入9.5mL甲苯、萃取静置，分取甲苯层1mL，用甲苯定容至 10mL，最后使用石英比色皿在334nm处测硒反应液的吸光度，再根据吸光度确定硒含量，最终计算出纳米硒粉末中硒的质量分数(硒含量)。
表2硒含量相关数据
Figure RE-GDA0003182352350000102
表2中，菌株编号11为纳米硒合成菌合成的纳米硒，由表2可以看出，纳米硒合成菌合成的纳米硒含量较高，明显高于其他菌株合成的纳米硒。
纳米硒的表征
(1)紫外光谱分析
称取10mg纳米硒粉末，加1mL无菌水配置成浓度为10mg/mL的纳米硒溶液。以水作为空白对照，在200～800nm波长范围内进行紫外光谱扫描，确定纳米硒样品特征吸收峰，图5纳米硒的紫外光谱。请参阅图5，检测结果表明，纳米硒在210nm附近有一个吸收峰，表明形成了纳米硒(SeNPs)，并且获得的SeNPs具有球形或类球形的表面形态。单峰较尖锐，表明纳米硒的粒径分布较小，粒径均匀性较好。含有纳米硒的反应溶液呈橘红色，表明纳米硒为红色。
(2)X射线衍射仪分析
称取10mg纳米硒粉末到载样片上，将载样片放入X射线衍射仪，使用CuKα1射线，在5°到90°范围内，X射线衍射仪以5°/min的速度绘制XRD图谱。图6是纳米硒的XRD图。纳米硒在2θ角处有一个在20～30°范围内的特定衍射峰，该峰基本上与JCPDS卡号65-1290的衍射峰一致。可以推断出，所获得的颗粒是硒。图中的衍射峰非常宽，表明合成的纳米硒颗粒尺寸非常小，结晶度差并且是无定形的。形成无定形颗粒的可能原因是细菌代谢物中存在蛋白质，多糖和其他生物大分子的生物分子涂层。大分子含有羧基、羟基和其他化学基团，这些组分具有较高的电子密度或协调能力。然而，新形成的纳米硒是单质硒，其硒粒子有很高的表面自由能，具有独特的表面效应，它能将生物大分子吸附在其表面上，阻止并阻碍了晶体的生长，因此产生了无定形物质。
(3)透射电镜分析
称取10mg纳米硒样品到1.5mL离心管，加入1mL无水乙醇吹打均匀，超声15min使样品充分扩散在无水乙醇溶液中。夹取透射电镜载样片，滴加适量样品液在载样片上，待无水乙醇完全挥发后，进行电镜观察。图7实施例3制得的纳米硒的透射电镜图，从图7中可以观察到培养物中生成的纳米硒呈散状颗粒型，颗粒为球形，粒径主要分布在100～1000nm。经蔗糖密度梯度离心后的产物纯度高，未见完整细胞及细胞碎片。该结果表明，蔗糖密度梯度离心适合用于纳米硒的分离纯化。纳米硒粒径大小在100～1000nm有利于植物、动物、人类和微生物对硒的吸收。
实施例4纳米硒合成菌纤维素酶活测定
(1)葡萄糖标准曲线绘制：取试管分别加入1.0mg/mL的葡萄糖标准溶液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、 1.8mL、2.0mL，分别加蒸馏水2.0mL、1.8mL、1.6mL、1.4mL、1.2mL、1.0mL、 0.8mL、0.6mL、0.4mL、0.2mL、0.0mL，加DNS试剂3mL，混匀后在沸水浴中加热5min，取出立即用冷水冷却，用水定容至25mL，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线如图8 所示，数据如表3所示，葡萄糖标准曲线回归方程：Y＝0.5675X-0.0402， R2＝0.996。
表3葡萄糖标准曲线相关数据
浓度(mg/ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
吸光度 0.001 0.054 0.179 0.297 0.416 0.515
浓度(mg/ml) 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
吸光度 0.635 0.743 0.852 0.964 1.144
(2)内切型-β-葡聚糖酶酶活测定
取0.5mL的纳米硒合成菌产生的纤维素酶溶液，加1mL底物混匀，底物为以0.05M，PH4.8柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配置的羧甲基纤维素钠CMC-Na (1％)溶液，于50℃水浴30min，然后加入DNS显色液3mL，沸水浴10min，冷却，加蒸馏水补足25mL，540nm处测吸光度，同时用100℃煮沸10min后失活的酶液做对照，扣除本底。根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出纳米硒合成菌内切型-β-葡聚糖酶酶活值为1.94U/mL。
(3)外切型-β-葡聚糖酶酶活测定
其他步骤同内切型-β-葡聚糖酶酶活测定，只是底物为以0.05M，PH4.8 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配置的1％微晶纤维素溶液。测得纳米硒合成菌的外切型-β-葡聚糖酶酶活值为3.48U/mL。
(4)β-葡聚糖苷酶酶活测定
其他步骤同内切型-β-葡聚糖酶酶活测定，只是底物为以0.05M，PH4.8 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配置的1％水杨苷溶液。测得纳米硒合成菌的β-葡聚糖苷酶酶活值为1.56U/mL。
综上所述，本发明提出的纳米硒合成菌菌落呈白色圆形，能够在高浓度的亚硒酸钠中生存，而且能够将亚硒酸钠中的四价硒转化为红色纳米单质硒，生成的纳米单质硒粒径尺寸小、具有较好的生物活性，同时，该纳米硒合成菌具有一定的产纤维素酶的能力，将纤维素分解，能够广泛应用于生产中。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
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<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1451
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 1
ggcggtgggg ggtgcataat gcagtcgagc ggaccgacgg gagcttgctc ccttaggtca 60
gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120
aaccggggct aataccggat gcttgattga accgcatggt tccattatta aagggggctt 180
ttaactaccc ctttccgatg gacccgcggc gcattaacta attggtgagg gaacggctcc 240
cccaggggac gatgggtaac cgacctgaaa gggtgatcgg ccaccctggg actgaaaccc 300
ggcccagact cctacgggag ggagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360
ggaacaacgc cgcgggagtg atgaagggtt tccgatcgta aaactctggt ggtagggaaa 420
aacaagtacc ggtcgaatag ggcggtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480
actacctggc agcagccgcg gtaatacsta rgtggcaagc gttgkccgga attattgggc 540
gtaaagcgcg cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgkgaaa gcccccggct caaccgggga 600
gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660
ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac ccagtggcga aggcggactc tctggtctgt 720
aactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcgracagga ttagawwmcc tggtagtyca 780
cgccgtaaac gatgagtgct arkkgttaga gggwttcsgc cctttartgc tgcagcaaac 840
gcatwrmrcm ytcsscykgg grrktacggt yssmagactg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggtcttgaca tcctctgaca accctagaga tagggcttcc ccttcggggg cagagtgaca 1020
ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga 1140
caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200
cacgtgctac aatgggcaga acaaagggca gcgaagccgc gaggctaagc caatcccaca 1260
aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag 1320
taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380
acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccttttggag ccagccgccg 1440
agtatacagg g 1451

Claims (10)

1.一种纳米硒合成菌，其特征在于，所述纳米硒合成菌为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)NanoSe.X11，保藏编号为CCTCC NO:M2021476，保藏时间为2021年4月28日。
2.一种如权利要求1所述的纳米硒合成菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10、将富硒土样与无菌磷酸盐缓冲液混合，形成悬浮液；
S20、将所述悬浮液加入培养基中扩培，得到菌种扩培液；
S30、将所述菌种扩培液接种到液体发酵培养基上，摇床培养，继代培养3～5次后，接种到亚硒酸钠浓度为500～2500mg/L的第一硒选择培养基中，继续培养1～3天，得到初筛菌液；
S40、将所述初筛菌液用水稀释后，涂布在刚果红筛选纤维素琼脂培养基上，选取单个菌落，分离，进行甘油保菌，得分离菌种；
S50、将所述分离菌接种到亚硒酸钠浓度为25～35g/L的第二硒选择培养基中，培养1～3天，得到纳米硒合成菌。
3.如权利要求2所述的纳米硒合成菌的筛选方法，其特征在于，在步骤S20中，所述培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨5～15g/L、酵母提取物2～8g/L、氯化钠2～8g/L。
4.如权利要求2所述的纳米硒合成菌的筛选方法，其特征在于，在步骤S30中，所述液体发酵培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨5～15g/L、酵母提取物2～8g/L、NaCl 2～8g/L、Na2SeO3 0.1～0.2g/L。
5.如权利要求2所述的纳米硒合成菌的筛选方法，其特征在于，在步骤S30中，所述菌种扩培液接种到液体发酵培养基上时，所述菌种扩培液的接种量为1％～5％。
6.如权利要求2所述的纳米硒合成菌的筛选方法，其特征在于，在步骤S40中，所述刚果红筛选纤维素琼脂培养基包括以下浓度的组分：
KNO3 1～3g/L、KH2PO4 0.5～1.5g/L、MgSO4 0.2～0.8g/L、NaCl 0.5～1.5g/L、Na2HPO40.5～1.5g/L、CMC-Na 15～25g/L、Na2SeO3 0.5～2.5g/L、琼脂10～20g/L。
7.如权利要求2所述的纳米硒合成菌的筛选方法，其特征在于，在步骤S40中，所述初筛菌液的稀释倍数为5～15倍。
8.如权利要求2所述的纳米硒合成菌的筛选方法，其特征在于，在步骤S50中，所述分离菌的接种量为1％～5％。
9.如权利要求2所述的纳米硒合成菌的筛选方法，其特征在于，
在步骤S20中，扩培温度为35～40℃；和/或，
在步骤S30中，培养温度为35～40℃。
10.一种如权利要求1所述的纳米硒合成菌在制备纳米硒中的应用，其特征在于，采用所述纳米硒合成菌制备得到纳米硒。
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