CN105543142A - 一种高效降低水体cod沼泽红假单胞菌的培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体公开了一种沼泽红假单胞菌的培养基。本发明所述沼泽红假单胞菌的培养基中添加了按如下组分配制而成的微量元素促生物母液：Na2EDTA500～503mg，FeSO4.7H2O200～203mg，ZnSO4.7H2O10～13mg，MnSO4.4H2O2～2.3mg，H3BO350～53mg，CoCl2.2H2O20～23mg，NiCl2.6H2O7～7.3mg，CuCl2.6H2O0.5～0.8mg，Na2MoO4.2H2O4～4.3mg，CaCl2200～203mg，水1L，pH4.4～4.7。本发明利用特殊的微量元素促生物母液，获得高效降低水体COD（化学需氧量）的沼泽红假单胞菌，从而达到降低养殖池塘的使用量，进而改善养殖环境，降低养殖成本的目的。经本发明培养基分离的菌种作用，水体COD的降低率可达到70.41%。

Description

一种高效降低水体COD沼泽红假单胞菌的培养基
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体地，涉及一种高效降低水体COD沼泽红假单胞菌的培养基。
背景技术
当前我国水产业迅猛发展，但由于长期养殖方式不当，导致池塘老化，水质恶化，有机物严重污染，COD（化学需氧量）大幅度升高，致病微生物大量繁殖，形成大量的鱼虾病害。因此寻求一种新型水质改良剂已是当务之急。
沼泽红假单胞菌是广泛存在于自然界的微生物，是一类以光为能源，利用自然界中的有机物、硫化物等为营养体，并能进行光合作用的生物。它不仅能净化水质，而且含有丰富的营养，可作为鱼虾的饵料添加剂，同时能促进水产品的繁殖，提高孵化率。沼泽红假单胞菌的多种良好性能已引起国内外广大学者的关注。但由于沼泽红假单胞菌在培养过程中易老化，需要不断更新发酵菌种，而从虾塘的污泥分离菌种是主要的方法。目前，分离培养用常规的培养基平板分离法，由于存在氧压力且普通培养基不易分离到COD降解能力强的高效沼泽红假单胞菌，往往得到的菌株对养殖池塘的有机物降解能力不强，导致沼泽红假单胞菌在养殖池塘的使用量要加倍，增加养殖成本，成为制约沼泽红假单胞菌生产的一个瓶颈。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种新型高效降低水体COD沼泽红假单胞菌的培养基，利用特殊的微量元素促生物母液，获得高效降低水体COD（化学需氧量）的沼泽红假单胞菌，从而达到降低养殖池塘的使用量，进而改善养殖环境，降低养殖成本的目的。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
一种高效降低水体COD沼泽红假单胞菌的培养基，所述培养基中添加了按如下组分配制而成的微量元素促生物母液：Na2EDTA500～503mg，FeSO4.7H2O200～203mg，ZnSO4.7H2O10～13mg，MnSO4.4H2O2～2.3mg，H3BO350～53mg，CoCl2.2H2O20～23mg，NiCl2.6H2O7～7.3mg，CuCl2.6H2O0.5～0.8mg，Na2MoO4.2H2O4～4.3mg，CaCl2200～203mg，水1L，pH4.4～4.7。
该微量元素促生物母液添加Ni和Ca元素，能有效激活沼泽红假单胞菌内降解有机污染物的酶，从而提高沼泽红假单胞菌的降低水体COD的能力。
优选地，所述培养基为富集培养基，所述富集培养基的配方为：NH4SO41～1.5g，MgCl20.2～0.5g，NaHCO35～5.3g，K2HPO40.5～0.8g，NaCl2～2.3g，酵母膏0.8～1.1g，微量元素促生物母液40～43ml，水1L，pH7.1～7.3。
优选地，所述培养基为分离培养基，所述分离培养基的配方为：NH4SO41～1.3g，MgCl20.2～0.5g，乙酸钠3～3.3g，NaHCO32.8～3g，K2HPO40.5～0.8g，NaCl1.9～2.2g，酵母膏0.4～0.7g，微量元素促生物母液19～22ml，琼脂19～22g，水1L，pH7.1～7.3。
一种利用上述培养基分离沼泽红假单胞菌的方法，包括如下步骤：
S1.富集培养：将虾塘黑色底泥或/和虾塘水与所述富集培养基混合，于27~30℃、40W白炽灯光照培养，培养物与光源距离15~18cm，三天后观察到光照的一侧呈现微红培养物，吸取该微红培养物与新鲜的富集培养基混合，培养70~73h；
S2.分离培养：将所述的分离培养基制成平板，干燥条件下在平板底部添加焦性没食子酸和碳酸钠，排空充氮气，取S1得到的呈棕红色的菌液于所述平板上穿刺培养，27~30℃、40W白炽灯光照培养96~100h，培养物与光源距离15~18cm，得到菌落呈圆形，棕红色，直径为1~4mm，作为纯菌种。
与现有技术相比，本发明有益效果在于：本发明提供了一种沼泽红假单胞菌的培养基，利用特殊的微量元素促生物母液，获得高效降低水体COD（化学需氧量）的沼泽红假单胞菌，从而达到降低养殖池塘的使用量，进而改善养殖环境，降低养殖成本的目的。经本发明培养基分离的菌种作用，水体COD的降低率可达到70.41%。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
富集培养基：NH4SO41g，MgCl20.2g，NaHCO35g，K2HPO40.5g，NaCl2g，酵母膏0.8g，微量元素促生物母液40ml，水1升，pH7.1。
分离培养基：NH4SO41g，MgCl20.2g，乙酸钠3g，NaHCO32.8g，K2HPO40.5g，NaCl1.9g，酵母膏0.4g，微量元素促生物母液19ml，水1升，pH7.1；分离培养基的配方中加入19克琼脂。
其中，微量元素促生物母液：Na2EDTA500mg，FeSO4.7H2O200mg，ZnSO4.7H2O10mg，MnSO4.4H2O2mg，H3BO350mg，CoCl2.2H2O20mg，NiCl2.6H2O7mg，CuCl2.6H2O0.5mg，Na2MoO4.2H2O4mg，CaCl2200mg，将所有成份溶解在1000ml水中，pH4.4，过滤除菌。
利用上述培养基分离沼泽红假单胞菌：
S1.沼泽红假单胞菌的富集培养：将虾塘黑色底泥20g和虾塘水30ml放入50ml的磨口玻璃瓶中，黑色底泥放底层，加入富集培养基，于27℃，40W白炽灯，培养物与灯距15CM光照培养，在三天内可见到液体培养基里和淤泥曝光的一侧呈现微红生长物，吸取1ml微红培养物接种于第二瓶富集培养基中，培养70h。
S2.沼泽红假单胞菌的分离培养：用平板倾注法厌氧分离；将所述的分离培养基制成平板放入干燥器中，在平板底部添加焦性没食子酸和碳酸钠混合物250克，用真空泵排除空气，再充入氮气，取S1得到的呈棕红色的菌液于所述平板上穿刺培养，27℃、40W白炽灯光照培养96h，培养物与光源距离15cm，得到菌落呈圆形，棕红色，直径约为1mm，作为纯菌种。
实施例2
富集培养基：NH4SO41.1g，MgCl20.3g，NaHCO35.1g，K2HPO40.6g，NaCl2.1g，酵母膏0.9g，微量元素促生物母液41ml，水1升，pH7.2。
分离培养基：NH4SO41.1g，MgCl20.3g，乙酸钠3.1g，NaHCO32.9g，K2HPO40.6g，NaCl2.0g，酵母膏0.5g，微量元素促生物母液20ml，水1升，pH7.23；分离培养基的配方中加入20克琼脂。
其中，微量元素促生物母液：Na2EDTA501mg，FeSO4.7H2O201mg，ZnSO4.7H2O11mg，MnSO4.4H2O2.1mg，H3BO351mg，CoCl2.2H2O21mg，NiCl2.6H2O7.13mg，CuCl2.6H2O0.68mg，Na2MoO4.2H2O4.13mg，CaCl2201mg，将所有成份溶解在1000ml水中，pH4.5，过滤除菌。
利用上述培养基分离沼泽红假单胞菌：
S1.沼泽红假单胞菌的富集培养：将虾塘黑色底泥21g和虾塘水31ml放入50ml的磨口玻璃瓶中，黑色底泥放底层，加入富集培养基，于28℃，40W白炽灯，培养物与灯距16cm光照培养，在三天内可见到液体培养基里和淤泥曝光的一侧呈现微红生长物，吸取1.1ml微红培养物接种于第二瓶富集培养基中，培养71h。
S2.沼泽红假单胞菌的分离培养：用平板倾注法厌氧分离；将所述的分离培养基制成平板放入干燥器中，在平板底部添加焦性没食子酸和碳酸钠混合物251.3克，用真空泵排除空气，再充入氮气，取S1得到的呈棕红色的菌液于所述平板上穿刺培养，28℃、40W白炽灯光照培养97h，培养物与光源距离16cm，得到菌落呈圆形，棕红色，直径约为2mm，作为纯菌种。
实施例3
富集培养基：NH4SO41.45g，MgCl20.35g，NaHCO35.25g，K2HPO40.7g，NaCl2.2g，酵母膏1.0g，微量元素促生物母液42ml，水1升，pH7.21。
分离培养基：NH4SO41.2g，MgCl20.4g，乙酸钠3.2g，NaHCO32.9g，K2HPO40.7g，NaCl2.1g，酵母膏0.6g，微量元素促生物母液21ml，水1升，pH7.25；分离培养基的配方中加入21克琼脂。
其中，微量元素促生物母液：Na2EDTA502mg，FeSO4.7H2O202mg，ZnSO4.7H2O12mg，MnSO4.4H2O2.2mg，H3BO352mg，CoCl2.2H2O22mg，NiCl2.6H2O7.23mg，CuCl2.6H2O0.78mg，Na2MoO4.2H2O4.13mg，CaCl2202.3mg，将所有成份溶解在1000ml水中，pH4.61，过滤除菌。
利用上述培养基分离沼泽红假单胞菌：
S1.沼泽红假单胞菌的富集培养：将虾塘黑色底泥22g和虾塘水32ml放入50ml的磨口玻璃瓶中，黑色底泥放底层，加入富集培养基，于29℃，40W白炽灯，培养物与灯距17CM光照培养，在三天内可见到液体培养基里和淤泥曝光的一侧呈现微红生长物，吸取1.3ml微红培养物接种于第二瓶富集培养基中，培养72h。
S2.沼泽红假单胞菌的分离培养：用平板倾注法厌氧分离；将所述的分离培养基制成平板放入干燥器中，在平板底部添加焦性没食子酸和碳酸钠混合物252克，用真空泵排除空气，再充入氮气，取S1得到的呈棕红色的菌液于所述平板上穿刺培养，29℃、40W白炽灯光照培养98h，培养物与光源距离17cm，得到菌落呈圆形，棕红色，直径约为3mm，作为纯菌种。
实施例4
富集培养基：NH4SO41.5g，MgCl20.5g，NaHCO35.3g，K2HPO40.8g，NaCl2.3g，酵母膏1.1g，微量元素促生物母液43ml，水1升，pH7.3。
分离培养基：NH4SO41.3g，MgCl20.5g，乙酸钠3.3g，NaHCO33g，K2HPO40.8g，NaCl2.2g，酵母膏0.7g，微量元素促生物母液22ml，水1升，pH7.3；分离培养基的配方中加入22克琼脂。
其中，微量元素促生物母液：Na2EDTA503mg，FeSO4.7H2O203mg，ZnSO4.7H2O13mg，MnSO4.4H2O2.3mg，H3BO353mg，CoCl2.2H2O23mg，NiCl2.6H2O7.3mg，CuCl2.6H2O0.8mg，Na2MoO4.2H2O4.3mg，CaCl2203mg，将所有成份溶解在1000ml水中，pH4.7，过滤除菌。
利用上述培养基分离沼泽红假单胞菌：
S1.沼泽红假单胞菌的富集培养：将虾塘黑色底泥23g和虾塘水33ml放入50ml的磨口玻璃瓶中，黑色底泥放底层，加入富集培养基，于30℃，40W白炽灯，培养物与灯距18cm光照培养，在三天内可见到液体培养基里和淤泥曝光的一侧呈现微红生长物，吸取1.4ml微红培养物接种于第二瓶富集培养基中，培养73h。
S2.沼泽红假单胞菌的分离培养：用平板倾注法厌氧分离；用平板倾注法厌氧分离；将所述的分离培养基制成平板放入干燥器中，在平板底部添加焦性没食子酸和碳酸钠混合物253克，用真空泵排除空气，再充入氮气，取S1得到的呈棕红色的菌液于所述平板上穿刺培养，30℃、40W白炽灯光照培养100h，培养物与光源距离18cm，得到菌落呈圆形，棕红色，直径约为4mm，作为纯菌种。
对比例1
本对比例与实施例1的富集培养基和分离培养基的组成大体相同，不同之处在于，所述培养基中的微量元素促生物母液的组成略有不同，本对比例的微量元素促生物母液将NiCl2.6H2O替换为Na2SeO3。利用培养基分离沼泽红假单胞菌的步骤与实施例1相同，得到的菌落呈圆形，酱红色，直径约为2~3mm，作为纯菌种。
应用例效果测定
（1）分离到的沼泽红假单胞菌数量
本实施例所分离出的菌株幼龄单个细胞呈杆形，偶见弯曲，极生鞭毛，革兰式阴性菌，细胞大小为0.6-0.9×1.2-2.0um，老龄菌株常形成玫瑰花形或集束形排列。菌株在光照厌氧培养下，繁殖速度很快，在扩大培养基中培养液颜色由淡粉红色逐渐变成棕红色；在固体培养基上，菌落成圆形，棕红色，直径约为1-4mm。该菌株对碳源的利用广泛，其中乙酸钠，苹果酸，丙酮酸对菌体生长有明显作用，氮源主要以氨盐作用较明显。对比例1所分离出的菌株形态与大小与本实施例相似，菌株在光照厌氧培养下，繁殖速度很快，在扩大培养基中培养液颜色由浅白色逐渐变成深红色；在固体培养基上，菌落成圆形，酱红色，直径约为2~3mm。该菌株对碳源的利用与本实施例不同，具体情况如表1所示：
表1实施例1~4与对比例1分离到沼泽红假单胞菌碳、氮源利用情况
分别采用本发明实施例1～4、对比例的培养基和常规培养基对样品分离，所述常规培养基的配方为:NH4Cl2.0g，MgSO41.0g，乙酸钾2.0g，NaHCO34g，KH2PO41.0g，NaCl3g，酵母膏1.0g，蛋白胨0.4g
实施例1~4得到的沼泽红假单胞菌数量远大于常规方法，测定结果见表2所示（结果是3次实验的平均值）。
表2不同方法分离到的沼泽红假单胞菌数量
从表2可知，经本发明分离方法的分离得到的沼泽红假单胞菌数量，远远高于常规方法和对比例1。说明本实施例的微量元素促生母液能显著促进沼泽红假单胞菌生长，提高其分离率。
（2）降低水体COD的效果
试验用虾塘的水，分别装入1000ml的玻璃烧瓶中，每瓶加入水样750ml，各瓶再分别加入10ml采用本发明实施例1～4所述方法和常规平板分离方法获得的沼泽红假单胞菌(菌含量为30亿/ml)，采用高锰酸钾氧化滴定法检测沼泽红假单胞菌加入前后的变化情况。采用本发明实施例1～4所述方法分离到的沼泽红假单胞菌的降低水体COD的能力明显高于常规方法。（见表3）
表3降低水体COD效果
综上所述，利用本发明的培养基能大幅度提高分离到的沼泽红假单胞菌数量，且本发明分离的菌株的降低水体COD的能力比常规的和对比例1的强很多。这将极有利于降低养殖企业和用户的水体净化成本，提高水产等产品的成活率，提高养殖效率。

Claims (3)

1.一种高效降低水体COD沼泽红假单胞菌的培养基，其特征在于，所述培养基中添加了按如下组分配制而成的微量元素促生物母液：Na2EDTA500～503mg，FeSO4.7H2O200～203mg，ZnSO4.7H2O10～13mg，MnSO4.4H2O2～2.3mg，H3BO350～53mg，CoCl2.2H2O20～23mg，NiCl2.6H2O7～7.3mg，CuCl2.6H2O0.5～0.8mg，Na2MoO4.2H2O4～4.3mg，CaCl2200～203mg，水1L，pH4.4～4.7。
2.根据权利要求1所述的沼泽红假单胞菌的培养基，其特征在于，所述培养基为富集培养基，所述富集培养基的配方为：NH4SO41～1.5g，MgCl20.2～0.5g，NaHCO35～5.3g，K2HPO40.5～0.8g，NaCl2～2.3g，酵母膏0.8～1.1g，微量元素促生物母液40～43ml，水1L，pH7.1～7.3。
3.根据权利要求1所述的沼泽红假单胞菌的培养基，其特征在于，所述培养基为分离培养基，所述分离培养基的配方为：NH4SO41～1.3g，MgCl20.2～0.5g，乙酸钠3～3.3g，NaHCO32.8～3g，K2HPO40.5～0.8g，NaCl1.9～2.2g，酵母膏0.4～0.7g，微量元素促生物母液19～22ml，琼脂19～22g，水1L，pH7.1～7.3。
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