CN109055582A - 一种牛支原体病pcr快速诊断试剂盒 - Google Patents

一种牛支原体病pcr快速诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及病毒核酸检测领域，具体涉及一种牛支原体病PCR快速诊断试剂盒。本发明的牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，包括：4000μL TBS液，800μL蛋白酶K，3200μL裂解液，24mL漂洗剂，200μL PCR酶，140μL DL2000 Marker，20μL上引物，20μL下引物，40μL阳性对照，40μL阴性对照，1200μL TE缓冲液，20个吸附柱；引物浓度为20μM，漂洗剂用时现配，所述上引物的序列为：5’‑ACGTGACTACTTCACCCTGAT‑3’，所述下引物序列为：5’‑TAGACCGACTATTTCACCTTC‑3’，它可从牛肺、鼻拭子临床样本中直接检测到牛支原体病病原核酸，试剂盒的灵敏度为1pg，整个检测过程从开始到出结果仅需3.5小时。本发明的试剂盒具有快速、灵敏性高、特异性强等特点，且不需要考虑菌体死活、抗体产生等因素，对牛支原体感染的诊断、防治与预后评估具有重要意义。

Description

一种牛支原体病PCR快速诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒核酸检测领域，具体涉及一种牛支原体病PCR快速诊断试剂盒。
背景技术
牛支原体是危害养牛业的一种重要的致病性支原体，除能导致牛肺炎、乳腺炎、关节炎外，还导致角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种疾病。
1961年，美国人Hale首次从患乳腺炎的牛乳中分离得到牛支原体，1976年报道其与牛呼吸系统疾病有关。目前，该病原在世界范围内普遍存在。欧洲每年约有25％～33％的犊牛肺炎是由牛支原体引起的，相当于每年损失1.44～1.92亿欧元，其中英国每年有190万头牛患牛支原体肺炎，死亡达15.7万头。美国每年由于牛支原体导致的牛呼吸系统疾病和乳腺疾病所造成损失达1.40亿美元，牛场感染率可达70％。
在我国，自2008年以来，我国大部分省地区新从外地引进肉牛爆发了以坏死性肺炎为主要特征的“传染性牛支原体肺炎”疫情，多数牛在运输到目的地后1～2周左右发病，发病率为50％～100％，病死率高达10％～50％，给我国肉牛养殖业造成了巨大的经济损失。随着我国肉牛养殖规模的不断壮大，北牛南运、北繁南育，引进国外种牛日益普遍，肉牛的各种疾病也随之而来，肉牛支原体病的发生呈逐年上升趋势。而大多数的肉牛支原体病伴有多病原混合感染现象出现，临床上难以及时鉴别诊断，细菌学培养分离鉴定，程序繁琐、培养周期长，免疫学诊断虽然操作简单，但具有抗体依耐性，特别是在感染早期，血清中抗体水平低，检测的敏感性低，达不到早期诊断的目的，延误防治时机，给肉牛业造成巨大的经济损失。而PCR诊断技术具有敏感、特异的特点，能快速、准确地检测病原核酸，且不考虑菌体死活、抗体产生等因素，并可对疾病早期进行诊断，为防治该病争取到了最佳的治疗时机。
因此，寻找一种快速、灵敏性高、特异性强的牛支原体病PCR快速诊断试剂盒是当务之急。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，具体是通过以下技术方案得以实现的：
一种牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，该试剂盒包括：4000μL TBS液，800μL蛋白酶K，3200μL裂解液，24mL漂洗剂，200μL PCR酶，140μL DL2000Marker，20μL上引物，20μL下引物，40μL阳性对照，40μL阴性对照，1200μL TE缓冲液，20个吸附柱；引物浓度为20μM，漂洗剂用时现配，所述上引物的序列为：5’-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3’，所述下引物序列为：5’-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3’。
所述TBS液，是10mmoL/L的Tris含0.9％NaCL，用1N HCl调pH至7.4。
所述蛋白酶K，用TE溶液配制成20mg/mL的溶液。
所述裂解液，是由10mM Tris-HCL、1mM EDTA、2.5M NaCL以及占裂解液总体积5％的SDS组成的混合溶液。
所述漂洗剂，是采用ddH2O配制的70％的乙醇。
所述TE缓冲液，是由10mM的Tris-HCL及1mM的EDTA组成的混合溶液，混合溶液的PH值为7.8。
所述PCR酶的组成包括：10mM的Tris-HCL(pH8.3)、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2及0.05U Polymerase/μL。
所述阴性对照为超纯水，阳性对照为牛支原体DNA模板。
目前，用于牛支原体诊断方法很多，包括：分离培养法、免疫学方法和核酸诊断技术。
在标本中分离培养出支原体对于牛支原体感染的诊断有决定性意义，结合生化鉴定技术，可作为实验室诊断牛支原体感染的基本诊断技术，但不能作为确定感染的最终检测方法和结果。这是由于牛支原体培养要求条件高、程序繁琐、培养周期相对较长，且两种鉴别法的特异性、敏感性较差，不能与其他支原体进行区别鉴定。
免疫学诊断技术虽然操作简单，但仍存在缺陷。其具有抗体依耐性，特别是在感染早期，血清中抗体水平低，检测的敏感性低，因此达不到早期诊断的目的；由于牛支原体与其他种类支原体、细菌存在着某些结构或功能相似的抗原蛋白，会出现免疫交叉反应，使检测方法的特异性降低。虽然免疫组织化学法可以规避上述缺点，但是该法只能针对局部小块病变组织，如果病灶选择偏差或病情轻微时，免疫组化将很难检测到病原体。
综上所述，核酸诊断技术是牛支原体感染较为理想的诊断方法。Hotzel和Ayling是最早采用扩增16s rRNA的PCR法进行牛支原体的病原学鉴定，由于PCR技术存在种间交叉反应，特别是牛支原体与牛无乳支原体有很高同源性，早期扩增牛支原体16srRNA的PCR法较难区分牛支原体感染或牛无乳支原体感染。Cai等应用杂交探针和退火温度建立扩增16srRNA基因序列的实时PCR法，可有效与牛无乳支原体区别鉴定，且灵敏度较高，特异性较强。研究人员通过扩增牛支原体uvrC基因所建立的PCR技术，可直接用于临床患病牛及带菌牛的奶样和鼻拭子中牛支原体病原学鉴定，特异性较强，可区别包括牛乳支原体在内的多种致病性支原体。ATP结合蛋白oppD/F基因和DNA聚合酶Ⅲ基因为目标基因的PCR，已证实能够较好地区别牛支原体与牛无乳支原体的感染。
本发明的牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，是根据牛支原体OPPD/F基因序列保守区间设计引物，通过优化反应条件，建立了牛支原体PCR诊断方法，通过对工艺流程的探索，自主研发出了牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，可从牛肺、鼻拭子临床样本中直接检测到牛支原体病病原核酸，试剂盒的灵敏度为1pg，整个检测过程从开始到出结果仅需3.5小时。本发明的试剂盒具有快速、灵敏性高、特异性强等特点，且不考虑菌体死活、抗体产生等因素，对牛支原体感染的诊断、防治与预后评估具有重要意义。
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
本发明的牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，包括：4000μL TBS液，800μL蛋白酶K，3200μL裂解液，24mL漂洗剂，200μLPCR酶，140μL DL2000Marker，20μL上引物，20μL下引物，40μL阳性对照，40μL阴性对照，1200μLTE缓冲液，20个吸附柱；引物浓度为20μM，漂洗剂用时现配，所述上引物的序列为：5’-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3’，所述下引物序列为：5’-tagaccgactatttcaccttc-3’，它可从牛肺、鼻拭子临床样本中直接检测到牛支原体病病原核酸，试剂盒的灵敏度为1pg，整个检测过程从开始到出结果仅需3.5小时。本发明的试剂盒具有快速、灵敏性高、特异性强等特点，且不需要考虑菌体死活、抗体产生等因素，对牛支原体感染的诊断、防治与预后评估具有重要意义。
附图说明
图1是牛支原体PCR反应结果，其中M为Marker DL2000组结果；1为阴性对照组结果；2为标准阳性组结果；3为肺阳性样本组结果；4为鼻拭子阳性样本组结果。
图2是敏感性试验结果，其中M为Marker DL2000组结果；1为阴性对照组结果；2为牛支原体标准DNA浓度1μg组结果；3为牛支原体标准DNA浓度100ng组结果；4为牛支原体标准DNA浓度10ng组结果；5为牛支原体标准DNA浓度1ng组结果；6为牛支原体标准DNA浓度100pg组结果；7为牛支原体标准DNA浓度10pg组结果；8为牛支原体标准DNA浓度1pg组结果。
图3是特异性试验结果，其中M为Marker DL2000组结果；1为阴性对照组结果；2为标准阳性组结果；3为嗜血杆菌组结果；4为魏氏梭菌组结果；5为肠杆菌组结果；6为多杀性巴氏杆菌组结果；7为沙门氏菌组结果；8为牛结核分枝杆菌组结果。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
一种牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，该试剂盒包括：4000μL TBS液，800μL蛋白酶K，3200μL裂解液，24mL漂洗剂，200μL PCR酶，140μL DL2000Marker，20μL上引物，20μL下引物，40μL阳性对照，40μL阴性对照，1200μL TE缓冲液，20个吸附柱；引物浓度为20μM，漂洗剂用时现配，所述上引物的序列为：5’-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3’，所述下引物序列为：5’-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3’。
所述TBS液，是10mmoL/L的Tris含0.9％NaCL，用1N HCl调pH至7.4。
所述蛋白酶K，用TE溶液配制成20mg/mL的溶液。
所述裂解液，是由10mM Tris-HCL、1mM EDTA、2.5M NaCL以及占裂解液总体积5％的SDS组成的混合溶液。
所述漂洗剂，是采用ddH2O配制的70％的乙醇。
所述TE缓冲液，是由10mM的Tris-HCL及1mM的EDTA组成的混合溶液，混合溶液的PH值为7.8。
所述PCR酶的组成包括：10mM的Tris-HCL(pH8.3)、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2及0.05U Polymerase/μL。
所述阴性对照为超纯水，阳性对照为牛支原体DNA模板。
使用实施例1进行如下实验
1.材料的制备
1.1参考菌株：标准牛支原体菌株(Mycoplasma bovis ATCC 25025)购自上海柯维化学技术有限公司，嗜血杆菌、魏氏梭菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、结核分枝杆菌均由本所重大疫病检测室采集到的病料所提模板而得。
1.2主要试剂
1.2.1 PCR试剂盒：
为实施例1的牛支原体病PCR快速诊断试剂盒。其中引物(浓度为20μM，用TE溶液配制)，是根据牛支原体OPPD/F基因序列，应用PrimerPrimer5.0基因分析软件进行引物设计并合成，PCR扩增出一长度为226bp大小的特异片段，该序列在Genbank上的登录号为AF130119.1。引物序列如下：
上引物：5’-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3’
下引物：5’-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3’
由宝生物工程(大连)有限公司合成。
1.2.2支原体培养基：PPLO肉汤培养基和PPLO固体培养基。
PPLO肉汤培养基的配制：将葡萄糖2.5g，PPLO肉汤粉10.5g，酵母粉2.5g，溶于445mL超纯水中116℃灭菌20分钟后，添加马血清50mL，10％精氨酸5mL，8万单位/mL青霉素溶液5mL，1％酚红溶液500μL，置4℃保存备用。
PPLO固体培养基的配制：将葡萄糖2.5g，PPLO肉汤粉10.5g，酵母粉2.5g，琼脂粉7.5g，溶于440mL超纯水中116℃灭菌20分钟后，添加马血清50mL，10％精氨酸10mL，8万单位/mL青霉素溶液5mL，浦置平板，待培养基凝固后，置4℃保存备用。
10％精氨酸溶液：将10％精氨酸溶于80mL双蒸水中，轻轻搅拌至完全溶解后加双蒸水定容至100mL，0.22μM滤膜过滤后置4℃保存备用。
1.3样本的采集
无菌采集疑似牛支原体肺炎病死牛肺，采用棉签采集疑似牛支原体肺炎鼻涕(鼻拭子)，用冷藏箱带到实验室，待培养及提取DNA模板用。
1.4样本中支原体病原的分离培养
1.4.1病死牛肺支原体的分离培养：将无菌采集疑似牛支原体肺炎病死牛肺置于平皿中，用手术剪刀取中间没有污染部分，进行组织研磨，待细碎，采用孔径为0.45μM滤膜过滤后接种于PPLO肉汤培养基中，5％CO2、37℃恒温培养48小时以上，培养基由红变黄，转接于PPLO固体培养基中，5％CO2、37℃恒温培养72h后，在固体培养基上有针尖大小的菌落生长普通光学显微镜下可看到菌落呈原形，边缘整齐，具有典型的“油煎蛋状”形态。
1.4.2牛鼻拭子支原体的分离培养：采用1mL生理盐水将鼻拭子浸润，尽量将药棉棒上的鼻涕清洗在试管里，弃去药棉棒，采用孔径为0.45μM滤膜过滤上述鼻涕溶液后接种于PPLO肉汤培养基中，5％CO2、37℃恒温培养48小时以上，培养基由红变黄，转接于PPLO固体培养基中，5％CO2、37℃恒温培养72h后，在固体培养基上有针尖大小的菌落生长普通光学显微镜下可看到菌落呈原形，边缘整齐，具有典型的“油煎蛋状”形态。
1.5样本DNA的提取
1.5.1组织样本肺的DNA提取：取样本肺少许，采用灭菌手术剪刀将肺剪碎，加入900μL生理盐水，反复冻融3次，然后5000r/min离心5分钟，取700～900μL上清液，加入蛋白酶K 20μL，100μL10％SDS液，55℃水浴箱中加热30分钟，取出冷却，取200μL于1.5mL的离心管中，加入40μL蛋白酶K和160μL裂解液充分混匀，70℃水浴作用20分钟，取出，加入无水乙醇200μL，充分摇匀，然后倒入吸附柱里，离心2分钟，去上清，加入500μL清洗剂进行清洗，10000r/min，离心1分钟，反复清洗两次，然后将倒掉了清洗剂吸附柱10000r/min，再离心2分钟，取出吸附柱，置室温5分钟，将清洗剂完全晾干。再将吸附柱放入另一个干净的收集管中，加入60μLTE缓冲液，室温放置2～5分钟，10000r/min，离心2分钟。为了获得更多的DNA模板，可将离心过的溶液再加在吸附柱里，同样室温放置2～5分钟，10000r/min，离心2分钟。然后将提取得到的DNA模板用加样枪转入存放DNA模板的离心管里。
1.5.2牛鼻拭子样本DNA的提取：用1mLddH2O将鼻拭子完全浸润，尽量将药棉棒上的鼻涕清洗在试管里，弃去药棉棒，将试管里的溶液全部移入1.5mL的离心管中，10000r/min离心2分钟，弃上清，收集沉淀。在离心管中加入200μLTBS液、40μL蛋白酶K，摇匀，再加入160μL裂解液充分混匀，70℃水浴作用20分钟，取出，加入无水乙醇200μL，充分摇匀，然后倒入吸附柱里，离心2分钟，去上清，加入500μL清洗剂进行清洗，10000r/min，离心1分钟，反复清洗两次，然后将倒掉了清洗剂吸附柱10000r/min，再离心2分钟，取出吸附柱，置室温5分钟，将清洗剂完全晾干。再将吸附柱放入另一个干净的收集管中，加入60TE缓冲液，室温放置2～5分钟，10000r/min，离心2分钟。为了获得更多的DNA模板，可将离心过的溶液再加在吸附柱里，同样室温放置2～5分钟，10000r/min，离心2分钟。然后将提取得到的DNA模板用加样枪转入存放DNA模板的离心管里。
1.5.3分离培养菌株DNA的提取：取1.4.2的培养菌液1500μL于1.5mL的离心管中，10000r/min离心2分钟，弃上清，收集沉淀。在离心管中加入200μLTBS液、40μL蛋白酶K，摇匀，再加入160μL裂解液充分混匀，70℃水浴作用20分钟，取出，加入无水乙醇200μL，充分摇匀，然后倒入吸附柱里，离心2分钟，去上清，加入500μL清洗剂进行清洗，10000r/min，离心1分钟，反复清洗两次，然后将倒掉了清洗剂吸附柱10000r/min，再离心2分钟，取出吸附柱，置室温5分钟，将清洗剂完全晾干。再将吸附柱放入另一个干净的收集管中，加入60TE缓冲液，室温放置2～5分钟，10000r/min，离心2分钟。为了获得更多的DNA模板，可将离心过的溶液再加在吸附柱里，同样室温放置2～5分钟，10000r/min，离心2分钟，然后将提取得到的DNA模板用加样枪转入存放DNA模板的离心管里。
1.5.4参考菌株DNA的提取：标准牛支原体菌株、嗜血杆菌、魏氏梭菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、结核分枝杆菌DNA模板的提取，与上述1.5.3方法相同。
2.对得到的DNA进行测定：
2.1牛支原体特异性片段的PCR扩增
采用提取的DNA模板，利用合成的引物在PCR酶的作用下进行扩增。反应体系和条件如下：PCR酶为10μL，支原体标准菌株DNA模板2μL，鼻拭子和肺样本提取的DNA模板各2μL，上下引物各1μL，加入ddH2O至25μL，在Tgradient96扩增仪下进行如下循环：94℃变性5分钟，94℃30秒，52℃30秒，72℃90秒，30个循环，最后72℃延伸5分钟。反应结束后将扩增产物取5μL进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。电泳检测显示约在226bp处，出现一条PCR目标带，其结果如图1所示，与预计的结果非常接近。并且将该PCR扩增片段经胶回收，送大连宝生物工程有限公司测序，结果表明，扩增片段分别为牛肺炎支原体的特异性条带。
2.2 PCR法扩增的敏感性的测定
采用TU-1800spc紫外可见光光度计，取OD值为260nm，将牛支原体DNA模板稀释100倍，进行浓度的测量。根据模板浓度(μg/μL)＝A260×稀释倍数×50/1000的方法进行计算。测得牛支原体标准DNA模板的平均OD260值为0.633nm，根据模板浓度的计算方法进行计算，结果得实验提取的牛支原体标准DNA模板的含量为0.5μg/μL。在进行敏感性试验时，按对数稀释法对DNA模板进行稀释后，取2μL模板进行扩增，则牛支原体标准DNA浓度依次为1μg，100ng，10ng，1ng，100pg，10pg，1pg，然后进行测定，结果如图2，可检出的牛支原体标准DNA模板的含量最小是1pg，即本发明的牛支原体病PCR快速诊断试剂盒的灵敏度为1pg。
2.3 PCR法扩增的特异性测定
分别用标准牛支原体菌株、嗜血杆菌、魏氏梭菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、结核分枝杆菌DNA为模板，进行PCR扩增。然后进行测定，结果如图3，除牛支原体出现扩增带，其它的菌株未见特异性226bp片段扩增。说明本发明的牛支原体病PCR快速诊断试剂盒具有良好的特异性。
2.4试剂盒的保存期检测
将实施例1的试剂盒分别在4℃、－20℃条件下保存1月、3月、6月、1年后，对阳性样品进行检测，结果表明，在4℃保存1年条带较淡，4℃保存1月、3月、6月对条带亮度无影响，－20℃保存1月、3月、6月、1年均对条带亮度无影响。说明本发明在4℃下的保质期约为1年，－20℃下的保质期更长。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：4000μL TBS液，800μL蛋白酶K，3200μL裂解液，24mL漂洗剂，200μLPCR酶，140μL DL2000Marker，20μL上引物，20μL下引物，40μL阳性对照，40μL阴性对照，1200μL TE缓冲液，20个吸附柱；引物浓度为20μM，漂洗剂用时现配，所述上引物的序列为：5’-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3’，所述下引物序列为：5’-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3’。
2.根据权利要求1所述的牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述TBS液，是10mmoL/L的Tris含0.9％NaCL，用1N HCl调pH至7.4。
3.根据权利要求1所述的牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K，用TE溶液配制成20mg/mL的溶液。
4.根据权利要求3所述的牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述裂解液，是由10mM Tris-HCL、1mM EDTA、2.5M NaCL以及占裂解液总体积5％的SDS组成的混合溶液。
5.根据权利要求1所述的牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述漂洗剂，是采用ddH2O配制的70％的乙醇。
6.根据权利要求1所述的牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述TE缓冲液，是由10mM的Tris-HCL及1mM的EDTA组成的混合溶液，混合溶液的PH值为7.8。
7.根据权利要求1所述的牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述PCR酶的组成包括：10mM的Tris-HCL(pH8.3)、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2及0.05U Polymerase/μL。
8.根据权利要求1所述的牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为超纯水，阳性对照为牛支原体DNA模板。
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