CN111518929A - 牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重pcr快速诊断试剂盒 - Google Patents

牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重pcr快速诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒。所述试剂盒的PCR引物为牛支原体oppD基因序列、牛多杀性巴氏杆菌Pm‑kmt基因序列、牛结核分枝杆菌IS6110基因序列的特异性引物。本发明通过对单一PCR进行优化后建立了三重PCR，通过优化试验，确定该三重PCR的最佳扩增条件为：94℃10min预变性；94℃1min，58℃50s,72℃1min，循环30次；72℃10min延伸。本发明提供的试剂盒，可用于牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌单一和混合感染的鉴别诊断。试验结果证明试剂盒具有准确、快速、特异强、灵敏度高的特点，能有效检出牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌，具有较好的重复性。

Description

牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快 速诊断试剂盒
技术领域
本发明属于动物疾病检测技术领域，尤其是牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒。
背景技术
牛呼吸道疾病是养牛生产中的一种重要疾病，其特点为发病率和死亡率均高，给养牛生产带来严重的经济损失，让全世界养牛业都深受其害。
牛呼吸道疾病病原复杂，主要由牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌等病原菌引起。牛支原体病常常继发或混合感染牛多杀性巴氏杆菌，从而加重病情，感染牛呼吸急促、流涎、发烧、肺炎、急性胃肠炎以及内脏器官广泛出血，严重的造成死亡。牛结核分枝杆菌主要是呼吸道传播的慢性消耗性疾病，病牛在初期食欲正常，主要呈现顽固性的咳嗽，后期肺部病变严重时，表现呼吸困难，咳嗽加重，流脓性鼻汁，胸部听诊有干性或湿性特征，有时可听到摩擦音。病畜日渐消瘦，贫血等。在临床和病理解剖情况下，三种疾病病原难以区分，容易混淆，且确诊采用的实验室诊断方法有细菌学检测、病原菌分离培养、生化试验、动物回归试验、免疫学诊断等，但时间长、操作繁琐、准确性低，很难适应临床快速诊断的需要。目前也有关于多种呼吸道病原菌的检测研究，但没有关于牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌这3种病菌的同时检测研究。
如公开号为C110016512A的专利公开了一种同时检测三种牛呼吸道病原体的多重荧光定量PCR检测试剂盒及方法；其中所述的三种牛呼吸道病原体为牛分枝杆菌、牛支原体、牛肺炎克雷伯菌；根据牛分枝杆菌的特异性序列229bp序列、牛支原体的uvrC基因和牛肺炎克雷伯菌的khe基因设计并且合成了3组特异性引物和探针。检测方法包括：建立带牛分枝杆菌、牛支原体和牛肺炎克雷伯菌检测标准曲线；提取待测样品的总DNA，以提取的总DNA为模板进行荧光定量PCR；用得到的Cq值或荧光信号的变化，实现对牛分枝杆菌、牛支原体和牛肺炎克雷伯菌的定性检测，在根据荧光信息后按强度和标准曲线，得出待测样品中所含牛分枝杆菌、牛支原体和牛肺炎克雷伯菌的拷贝数，实现定量检测。该专利的公开的方法虽然实现了牛分枝杆菌、牛支原体、牛肺炎克雷伯菌的定量检测，但是时间长、操作繁琐，不适合用于临床快速诊断的需要。
又如公开号为CN108277288A公开的牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒；通过对牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌进行比较基因组学分析，筛选出其种间特异基因；多重PCR反应最佳退火温度为54.5℃；最佳循环次数30次；可同时进行三种病原菌的检测；多杀性巴氏杆菌最低检测浓度10-2ng/μL，溶血曼氏杆菌最低检测浓度10-1ng/μL，牛支原体最低检测浓度101ng/μL；构建的特异基因PCR-ELISA检测方法。该专利提供的PCR-ELISA检测方法实现了牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌的快速诊断；但是检测灵敏度较差；而且不能实现牛结核分枝杆菌的检测。
牛结核分枝杆菌可引起人畜共患牛结核病。牛结核病被世界动物卫生组织列为必须报告的动物疫病，我国将其列为二类疫病。我国目前常用PPD技术检测牛结核分枝杆菌，PPD是一种相当复杂的混合物，包含多种抗原成分；而PPD中很多蛋白成分和其他分枝杆菌及一些无关细菌有交叉反应，特异性较差；而且PPD检测技术工作量大、试验时间长、操作繁琐。因此，同时实现牛结核分枝杆菌和其他牛呼吸道病病原菌的快速、准确检测，对畜牧业的发展、人类健康具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒。
牛呼吸道疾病主要由牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌等病原菌引起。本发明研究者根据PCR技术原理，分别针对牛支原体oppD基因序列、牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因序列、牛结核分枝杆菌IS6110基因序列设计了特异性引物，建立了检测这三种疾病的快速、准确、简便的三重PCR诊断方法，该三重PCR可用于牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌单一和混合感染的鉴别诊断，能直接或在支原体增菌24小时出结果，单一PCR检测方法与三重PCR检测方法符合率高达100％，这显著地加快了临床样本诊断速度，可望为牛呼吸系统疾病的流行病学调查及诊断提供实用技术，具有推广应用价值。
具体是通过以下技术方案实现的：
牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒，所述试剂盒包括以下引物：
牛支原体上引物：5′-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3′
牛支原体下引物：5′-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3′
牛多杀性巴氏杆菌上引物：5′-GCTGACATTACTGCTCTATCCGCTAT- 3′
牛多杀性巴氏杆菌下引物：5′-GACGGCTAACATCATCATCCAA-3′
牛结核分枝杆菌上引物:5′-GATGGCGAACTCAAGGAGCACA-3′
牛结核分枝杆菌下引物：5′-ACTGAGATCCCCTATCCGTATGGT-3′。
优选地，所述试剂盒还包括：阴性对照、阳性质粒模板、DL2000 Marker、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠、Premix Taq、TE缓冲溶液。
优选地，所述试剂盒包括：阳性质粒模板240μL，阴性对照240 μL，Premix Taq1mL，牛支原体上下引物各40μL，牛多杀性巴氏杆菌上下引物各40μL，牛结核分枝杆菌上下引物各40μL，DL2000 Marker为100μL，10mg/ml蛋白酶K400μL，10％十二烷基硫酸钠2mL， TE缓冲溶液2mL。
需要说明的是，TE缓冲溶液是按照常规方法进行配置。
优选地，所述阴性对照为ddH2O。
优选地，所述阳性质粒模板包括牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌的DNA模板。
优选地，所述试剂盒的PCR扩增体系为：Premix Taq为50μL，阳性质粒DNA模板12μL，20μM的牛支原体上引物、牛支原体下引物、牛多杀性巴氏杆菌上引物、牛多杀性巴氏杆菌下引物、牛结核分枝杆菌上引物、牛结核分枝杆菌下引物各2μL，ddH2O补足至100μL。
优选地，所述试剂盒的扩增程序为：94℃预变性10min；94℃ 1min，58℃50s,72℃1min，循环30次；72℃10min延伸。
优选地，所述试剂盒的扩增产物采用2％琼脂糖凝胶电泳检测。
优选地，所述电泳检测：在226bp、478bp和638bp处显示出目的产物条带，则表明检测病原菌为牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的试剂盒，能从牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的混合模板中同时扩增出牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌特异性目的条带；且各引物与模板之间没有明显的互相干扰。同时，其它的病原菌魏氏梭菌、禽源多杀性巴氏杆菌、猪源支原体、放线杆菌、嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、牛衣原体、羊衣原体、金葡萄球菌的DNA为模板，进行PCR扩增试验时，均未出现目的条带。
本发明提供的试剂盒，能对同一样本中的3种病原菌进行扩增，特异性强，对大肠杆菌等6种常见牛病原菌检测为阴性，对牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌和牛结核分枝杆菌的最低检测DNA浓度分别为： 3.075×10pg/mL,1.605×102fg/mL,5.306×10pg/mL。
本发明提供的试剂盒检测牛支原体肺炎鼻拭子，单一牛支原体P CR与该三重PCR检测方法阳性符合率为100％，牛肺样本单一PCR检测方法与该三重PCR检测方法阴性符合率为100％，牛支原体肺炎鼻拭子24 小时预增菌后，检出阳性样本49头份，预增菌后牛支原体阳性符合率为91.8％；牛结核分枝杆菌单一PCR与该三重PCR检出阳性符合率为 100％，与结核菌素检出的阳性符合率为92.3％。
本发明提供的试剂盒，可用于牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌单一和混合感染的鉴别诊断。试验结果证实该试剂盒具有准确、快速、特异强、灵敏度高的特点，能有效检出牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌，具有较好的重复性。
附图说明
图1为不同退火温度下三重PCR检测结果，M：Marker DL2000；1：阴性对照；2：52℃；3：54℃；4：55℃；5.57℃；6：59℃；7：60℃； 8：61℃；9：62℃。
图2为牛支原体单一PCR特异性试验结果，M：Marker DL2000；1：阴性对照；2：标准支原体；3：支原体分离株；4：牛多杀性巴氏杆菌；5：牛结核分枝杆菌；6：放线杆菌；7：魏氏梭菌；8：禽源多杀性巴氏杆菌；9：猪源支原体；10：嗜血杆菌；11：大肠杆菌；12：沙门氏菌；13：牛源衣原体；14：羊源衣原体；15：金葡萄球菌。
图3为牛结核分枝杆菌单一PCR特异性试验结果，M：Marker DL2000；1：阴性对照；2：标准牛结核分枝杆菌；3：牛结核分枝杆菌分离株；4：牛多杀性巴氏杆菌；5：牛支原体；6：放线杆菌；7：魏氏梭菌；8：禽源多杀性巴氏杆菌；9：猪源支原体；10：嗜血杆菌；11：大肠杆菌；12：沙门氏菌；13：牛源衣原体；14：羊源衣原体； 15：金葡萄球菌。
图4为多杀性巴氏杆菌单一PCR特异性试验结果，M：Marker DL2000；1：阴性对照；2：标准牛多杀性巴氏杆菌；3：牛多杀性巴氏杆菌分离株；4：牛结核分枝杆菌；5：牛支原体；6：放线杆菌；7：魏氏梭菌；8：禽源多杀性巴氏杆菌；9：猪源支原体；10：嗜血杆菌；11：大肠杆菌；12：沙门氏菌；13：牛源衣原体；14：羊源衣原体； 15：金葡萄球菌。
图5为三重PCR特异性试验结果，M：Marker DL2000；1：阴性对照；2：三种病原菌混合模板；3：牛多杀性巴氏杆菌分离株；4：牛结核分枝杆菌；5：牛支原体；6：放线杆菌；7：魏氏梭菌；8：禽源多杀性巴氏杆菌；9：猪源支原体；10：嗜血杆菌；11：大肠杆菌； 12：沙门氏菌；13：牛源衣原体；14：金葡萄球菌。
图6为三重PCR敏感性试验结果，M：Marker DL2000；1：阴性对照；2：混合模板的原液；3：混合模板的10-1倍稀释；4：混合模板的 10-2倍稀释；5：混合模板的10-3倍稀释；6：混合模板的10-4倍稀释；7：混合模板的10-5倍稀释；8：混合模板的10-6倍稀释。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
1、试验材料
1.1菌株
牛支原体菌株由华中农业大学动物医学院惠赠；多杀性巴氏杆菌 (cvcc1663)、牛结核分枝杆菌参考菌株〔编号为93006(4)〕、魏氏梭菌、禽源多杀性巴氏杆菌均购自中国兽医微生物菌种保藏中心；猪源支原体、放线杆菌、嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、牛衣原体、羊衣原体、金葡萄球菌DNA模板均由贵州省畜牧兽医研究所畜禽疫病研究室提供。
1.2生化试剂及主要仪器
Lab-Aid 820核酸提取Mini试剂盒(试剂条、磁棒套、缓冲液ATL、洗脱液等)、DTT试剂均购自厦门致善生物科技股份有限公司； Goldview核酸染料、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠、EDTA、Tris-HcL、琼脂糖、DL2000 Marker、Premix Taq Version 2.0(E×Taq Version2.0plus dye)、去离子水均购自天根生化科技[北京]有限公司；PPLO 肉汤培养基、PPLO固体培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；改良罗氏培养基购自杭州创新生物检控技术有限公司；特级马血清、酵母粉、精氨酸胰蛋白胨购自北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖、酚红、琼脂粉等(国产试剂)。
核酸提取仪，厦门百维信生物科技有限公司(Lab-Aid 820)；电子天平，美国奥豪斯(AR2140)；高速离心机，北京大龙(D3024)； pH测量仪，梅特勒-托利多(Delta 320A/c)；梯度PCR扩增仪，德国 BIOMETRA；电泳仪，北京六一生物科技有限公司DDY-10C；紫外透射仪、凝胶成像仪，美国伯乐BIO-RAD Gel Doc XR；超纯水器，中国台湾艾科蒲(ATZ-10-T)；紫外可见光度计，德国进口(Implen NanoPhotomet)；移液器产自芬兰；移液头、PCR离心管产自美国。
2、试验方法
2.1引物的设计与合成
牛支原体oppD基因在牛支原体中高度保守且是牛支原体的特异性基因。2015年袁海文等对牛支原体贵州流行株oppD/F基因进行了克隆、测序、及序列分析研究，研究表明牛支原体贵州株与湖北株、重庆株及内蒙古株亲缘关系最近，与牛支原体国际标准株PG45处于同一进化分支上，但已呈现进化差异性，而与其他支原体如无乳支原体、关节炎支原体、鳄鱼支原体亲缘关系较远，与丝状支原体丝状亚种SC 型标准株亲缘关系更远，ATP结合蛋白oppD/F基因和DNA聚合酶Ⅲ基因为目标基因的PCR，已证实能够较好地区别牛支原体与牛无乳支原体的感染。
2008赵自云等研究，插入序列6110是结核分支杆菌基因组中的一个多拷贝的保守片段，该序列作为扩增靶序列，可以得到较高的敏感性和特异性，是分子生物学方法研究结核杆菌的首选片段。多杀性巴氏杆菌是具有异质性特征的病原亚种群，常引起多种动物以败血症和呼吸系统疾患为主的疾病。
Kmt基因是多杀性巴氏杆菌的种特异性片段，因此，利用Kmt基因的PCR扩增法来检测多杀性巴氏杆菌现已被国内外学者普遍认可。
综上所述，本发明采用牛支原体oppD基因序列、牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因序列、牛结核分枝杆菌IS6110基因序列设计特异性引物。在对单一PCR进行优化后建立了三重PCR，通过优化试验，确定该三重PCR的最佳扩增条件，并在临床应用上取得了较好的效果。
本发明分别针对牛支原体oppD基因序列(扩增片段为226bp， Genbank上的登录号为AF130119.1)，牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因序列(扩增片段为638bp，登录号为AF016259.1)，牛结核分枝杆菌 IS6110基因序列(扩增片段为478bp，登录号为X57835.2)，应用Primer Primer5.0基因分析软件设计了特异性引物，均由宝生物工程(大连) 有限公司合成，具体引物如下：
牛支原体上引物：5′-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3′
牛支原体下引物：5′-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3′
牛多杀性巴氏杆菌上引物：5′-GCTGACATTACTGCTCTATCCGCTAT-3′
牛多杀性巴氏杆菌下引物:5′-GACGGCTAACATCATCATCCAA-3′
牛结核分枝杆菌上引物:5′-GATGGCGAACTCAAGGAGCACA-3′
牛结核分枝杆菌下引物:5′-ACTGAGATCCCCTATCCGTATGGT-3′。
2.2模板处理及基因组提取
2.2.1参考菌株DNA的提取
牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌、魏氏梭菌、禽源多杀性巴氏杆菌(牛支原体采用PPLO培养基，牛多杀性巴氏杆菌采用LB培养基，牛结核分枝杆菌采用改良罗氏培养基进行培养)，取培养菌液1500μL于1.5mL的离心管中，置100℃水浴锅中煮沸5分钟，取出后10000r/min离心2分钟，弃上清，收集沉淀。将试剂条的左边第一孔溶液取出加入到收集的沉淀中，用移液管反复吹打使沉淀物充分悬浮，处理完毕后，将之取出在试剂条的左边第一孔中，同时加入30μL 配制好的DTT溶液，混匀。将试管条架放入核酸提取仪中,试管条架推到位，按核酸提取Mini试剂盒使用说明书中核酸提取仪操作步骤进行即可。猪源支原体、放线杆菌、嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、牛衣原体、羊衣原体、金葡萄球菌DNA模板均由贵州省畜牧兽医研究所畜禽疫病研究室提供。
2.2.2组织样本DNA的提取
取样本组织少许，采用灭菌手术剪将组织剪碎，加入900μL生理盐水，反复冻融3次，然后5000r/min离心5分钟，取700～900μL上清液，加入蛋白酶K 20μL，100μL10％SDS液，55℃水浴箱中加热30分钟至组织消化完全，取出冷却。将核酸提取Mini试剂条在桌面轻轻磕碰，使各试剂落入管底，然后将试剂条放在试管条架上，撕去封管膜，在试剂条左边第一孔中加入完全消化的组织液200μL和30μLDTT溶液，混匀。将试管条架放入核酸提取仪中,试管条架推到位，按核酸提取Mini 试剂盒使用说明书中核酸提取仪操作步骤进行即可。
2.2.3牛全血样本DNA的提取
取待检样本全血1mL于1.5mL离心管中，10000r/min离心2～5分钟，弃上清液，沉淀采用生理盐水清洗2次，弃上清液。加入TE缓冲溶液200μL，蛋白酶K 40μL，裂解液160μL，充分混匀，60℃水浴作用15～20分钟，加入无水乙醇200μL，充分摇匀，简短离心去除管盖内壁的水珠。将上述溶液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)12000r /min离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入500μL70％乙醇，12000r/min离心30秒，倒掉废液，用同样方法，采用70％乙醇，再清洗一次，去废液。将吸附柱放入收集管中，12000r /min离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱放置室温中5～10分钟，晾干。将晾干的吸附柱放入一个干净的收集管中，加入TE缓冲溶液60-100μL，室温放置5分钟，12000r/min离心2分钟，将溶液收集到冷藏管中，即为提取的DNA模板，-20℃保存，备用。
2.3三重PCR体系的建立
2.3.1单一PCR体系的建立
25μL初始反应体系：Premix Taq(E×Taq Version 2.0plus dye) 为12.5μL，牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌DNA模板为2μL，分别加入对应的特异性引物各1μL，加入ddH2O至25μL。同时设阴性对照组。设置扩增初始扩增程序：94℃5min预变性；94℃40s， 57℃40s,72℃60s，循环30次；72℃7min延伸。同时在选择最佳的退火温度时,设置了梯度PCR，并对引物浓度、Mg2+浓度、模板DNA用量等重要参数进行优化试验，反应结束后将扩增产物取5～7μL进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。
2.3.2三重PCR体系的建立
100μL初始反应体系：Premix Taq为50μL，牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌DNA模板各4μL，三对引物上、下引物各2μL，加入ddH2O至100μL。同时设阴性对照组(ddH2O)。
根据单一PCR体系，设置初始扩增程序：94℃10min预变性；94℃ 1min，58℃50s,72℃1min，循环30次；72℃10min延伸。同时在选择最佳的退火温度时，设置了梯度PCR，并对引物浓度、Mg2+浓度、模板 DNA用量等重要参数进行优化试验，反应结束后将扩增产物取5～7μL 进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。
2.4三重PCR特异性试验
2.4.1单一PCR特异性试验
分别用牛支原体菌株、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌、魏氏梭菌、禽源多杀性巴氏杆菌、猪源支原体、放线杆菌、嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、牛衣原体、羊衣原体、金葡萄球菌DNA为模板，加入相应的单一PCR引物，按照单一PCR反应体系进行扩增和凝胶电泳检测。
2.4.1三重PCR特异性试验
依次牛支原体菌株、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌、魏氏梭菌、禽源多杀性巴氏杆菌、猪源支原体、放线杆菌、嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、牛衣原体、羊衣原体、金葡萄球菌DNA为模板，分别加入单种引物各1μL，或者3种引物等体积混合物6μL。单一PCRDNA模板量为2μL，加入ddH2O至25μL，同时设阴性对照组(ddH2O)。三重PCR DNA模板量各为4μL，加入ddH2O至100μL，同时设阴性对照组 (ddH2O)。
2.5三重PCR敏感性试验
将上述PCR检测重复3次，以验证本方法的重复性。
2.6三重PCR检测临床样本试验
对从养牛场采集的阳性分离培养的细菌样本，经增菌培养后，提取DNA模板，采用三重PCR进行检测，并比较检测率；或对结核菌素阳性样本全血，提取的DNA模板采用三重PCR进行检测，并比较检测率；或对采集的组织样本(牛肺、鼻拭子等),提取的DNA模板采用三重PCR 进行检测，并比较检测率。
2.7三重PCR产物克隆测序及分析
将三重PCR扩增片段经胶回收，送生工生物工程(上海)股份有限公司，进行克隆和测序，并用BLAST程序对GenBank数据库进行序列的同源性比对。
3、试验结果
3.1三重PCR反应体系的优化
3.1.1三重PCR反应的最佳温度
不同退火温度对三重PCR检测结果的影响如图1所示，从图1可知，三重PCR反应在退火温度为52.5℃～62℃时，都能得到比较清晰的PCR 产物扩增条带，在退火温度为52.5℃～62℃区域内，影响不大。因此，确定该三重PCR退火温度为58℃。
3.1.2其它三重PCR反应条件
反应体系为100μL，三重PCR可出现清晰的扩增条带。在Mg2+浓度为3mM时，可得到均一、稳定、清晰的扩增条带。比较各引物浓度的扩增效果，结果确定该三重PCR反应的最适合的浓度分别是：oppD为 20μM，Pm-kmt为20μM，IS6110为20μM。菌株模板DNA用量为4μL，退火温度为58℃，循环数为30时，扩增出来的PCR产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，能够形成明亮、清晰、均一的目的条带。
3.2特异性试验结果
3.2.1单一PCR特异性结果
牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌三种细菌单一PCR 试验结果分别如图2、图3、图4所示，从图2、图3、图4中可知，本发明所设计的牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌特异性引物均能扩展出相应的目标条带，分别是：226bp、478bp和638bp，与预期大小相符合。
3.2.2三重PCR特异性结果
三重PCR特异性结果如图5所示，从图中可知，该三重PCR反应体系能从混合模板和单独模板中同时扩增出牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌特异性目的条带，各引物与模板之间没有明显的互相干扰。同时，其它的病原菌魏氏梭菌、禽源多杀性巴氏杆菌、猪源支原体、放线杆菌、嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、牛衣原体、羊衣原体、金葡萄球菌DNA为模板，进行PCR扩增试验时，均未出现目的条带，说明该三重PCR特异性良好。
3.3三重PCR敏感性试验结果
按10倍稀释法对DNA模板进行稀释后，进行PCR敏感性试验，结果显示：单一PCR检测牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌对应的浓度分别是：3.075×102ng/mL、1.605×102ng/mL和5.306 ×10ng/mL，采用三重PCR进行敏感性试验时，按10倍稀释法对DNA模板进行稀释后，各取4μL模板混合，加入多重PCR反应体系，进行PCR 扩增试验后，三种菌DNA模板最高稀释倍数分别是10-4倍、10-6倍和10-4倍，对应的牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的DNA模板浓度分别是：3.075×10pg/mL,1.605×102fg/mL,5.306×10pg/ mL,三重PCR较单一PCR的灵敏度降低了100倍。
3.4序列测定与分析
分别将扩增的牛支原体oppD基因的226bp片段、牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因的638bp片段、牛结核分枝杆菌IS6110基因478bp片段送检测序，测序结果分别与GenBank中已发表的牛支原体oppD基因(登录号：AF130119.1)，牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因(登录号：AF016259.1)，牛结核分枝杆菌IS6110基因(登录号：X57835.2)中相应片段进行同源性比对，发现核苷酸序列同源性均为98％以上，表明该三重PCR扩增产物的序列是正确的。
3.5临床样本检测
试验将从我省引进的能繁母牛隔离场采集到的163头份牛鼻拭子，进行了单一牛支原体PCR试验，同时采用建立的牛支原体三重PCR 进行检查，其中单一牛支原体检测出阳性样本45头，牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌三重PCR检测出阳性样本45头。同上将采集的牛鼻拭子进行24小时增菌后，采用PCR方法进行检查，检出阳性样本49头份，与未培养的样本阳性符合率为91.8％。
将从凯里屠宰场采集到的10头份牛肺进行检测，单一PCR为阴性，三重PCR为阴性，将从黔西牛场采集到的病死牛肺1份，检测出单一多杀性巴氏杆菌阳性，同时采用三重PCR检测，巴氏杆菌也检测出阳性。
将某牛场采集到的牛结核PPD阳性样本13份，经牛结核单一PCR 检测12份为阳性，该试验采用牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌三重PCR检测出阳性样本12头。
在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。
序列表
序列表
序列表sequence listing
<110>贵州省畜牧兽医研究所
<120>一种检测牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三
重PCR 引物及方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgtgactac ttcaccctga t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tagaccgact atttcacctt c 21
<210> 3
<211> 26
2
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctgacatta ctgctctatc cgctat 26
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gacggctaac atcatcatcc aa 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gatggcgaac tcaaggagca ca 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
actgagatcc cctatccgta tggt

Claims (9)

1.牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下引物：
牛支原体上引物：5′-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3′
牛支原体下引物：5′-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3′
牛多杀性巴氏杆菌上引物：5′-GCTGACATTACTGCTCTATCCGCTAT-3′
牛多杀性巴氏杆菌下引物：5′-GACGGCTAACATCATCATCCAA-3′
牛结核分枝杆菌上引物:5′-GATGGCGAACTCAAGGAGCACA-3′
牛结核分枝杆菌下引物：5′-ACTGAGATCCCCTATCCGTATGGT-3′。
2.如权利要求1所述的检测牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阴性对照、阳性质粒模板、DL2000Marker、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠、Premix Taq、TE缓冲溶液。
3.如权利要求1或2所述的检测牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：阳性质粒模板240μL，阴性对照240μL，Premix Taq 1mL，牛支原体上下引物各40μL，牛多杀性巴氏杆菌上下引物各40μL，牛结核分枝杆菌上下引物各40μL，DL2000 Marker为100μL，10mg/ml蛋白酶K400μL，10％十二烷基硫酸钠2mL，TE缓冲溶液2mL。
4.如权利要求2所述的检测牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为ddH2O。
5.如权利要求2所述的检测牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述阳性质粒模板包括牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌的DNA模板。
6.如权利要求1或2所述的检测牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒，所述试剂盒的PCR扩增体系为：Premix Taq为50μL，阳性质粒模板12μL，20μM的牛支原体上引物、牛支原体下引物、牛多杀性巴氏杆菌上引物、牛多杀性巴氏杆菌上引物、牛结核分枝杆菌上引物、牛结核分枝杆菌下引物各2μL，ddH2O补足至100μL。
7.如权利要求2所述的检测牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序为：94℃预变性10min；94℃1min，58℃50s,72℃1min，循环30次；72℃10min延伸。
8.如权利要求2所述的检测牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增产物采用2％琼脂糖凝胶电泳检测。
9.如权利要求7所述的检测牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述电泳检测：在226bp、478bp和638bp处显示出目的产物条带，则表明检测病原菌为牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌。
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