CN109970844A

CN109970844A - 丝状支原体丝状亚种p35脂蛋白及其在诊断牛传染性胸膜肺炎中的应用

Info

Publication number: CN109970844A
Application number: CN201910194597.0A
Authority: CN
Inventors: 辛九庆; 李媛
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2019-07-05
Anticipated expiration: 2039-03-14
Also published as: CN109970844B

Abstract

本发明公开了一种丝状支原体丝状亚种P35脂蛋白及其在诊断牛传染性胸膜肺炎中的应用。本发明通过筛选获得了一个免疫原性良好的Mmm脂蛋白，命名为P35，实验证明，rP35蛋白能够与CBPP阳性血清发生反应且与牛源性其他3种常见支原体感染样品血清不发生交叉反应，具有良好的特异性。此外，本发明还提出了一种用于诊断牛传染性胸膜肺炎的试剂盒，并建立了基于该试剂盒的ELISA检测方法，并对反应进行条件优化，确定了其cut off值。经过ELISA实验证明，本发明建立的ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性以及重复性，能够用于牛传染性胸膜肺炎高效、快速的诊断。本发明的提出为牛传染性胸膜肺炎的诊断提供了新的技术手段。

Description

丝状支原体丝状亚种P35脂蛋白及其在诊断牛传染性胸膜肺炎中的应用

技术领域

本发明涉及一种丝状支原体丝状亚种脂蛋白及其在检测丝状支原体丝状亚种以及诊断牛传染性胸膜肺炎中的应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

牛传染性胸膜肺炎(contagious bovine pleuropneumonia,CBPP)是由丝状支原体丝状亚种(Mycoplasma mycoides subsp.Mycoides Small Colony,Mmm)感染引起牛的一种烈性传染疾病。该病被OIE规定为必需要报道的疾病。上世纪50-70年代我国曾爆发严重的CBPP，造成了巨大的经济损失，哈尔滨兽医研究所的兽医工作者经过长期艰苦卓越的斗争消灭了该病，2011年，经OIE认可我国为无牛传染性胸膜肺炎(简称“牛肺疫”)国家。成为世界上第七个无牛肺疫的国家。我国虽已消灭了CBPP，但是周边国家都是发病国家，对于牛群监测，防止疫病的发生仍责任重大。本实验室作为牛传染性胸膜肺炎国家参考实验室，每年会对该病进行全国范围的监测，并且一直致力与CBPP诊断试剂的研发工作。

有效的诊断技术对于控制CBPP起着至关重要的作用。控制CBPP最重要的一点是建立一个高效的Mmm的检测方法，要求该方法能同时检测到发病牛群和亚临床感染牛群体内携带的Mmm。在诊断CBPP技术方面，金标准依然是病原分离，此方法耗时耗力且需要配备专业实验室以及专业人员进行。并且培养物还需要PCR确认，PCR检测方法虽然灵敏性和特异性较好，但需要专业设备和专业人员操作，不适用于大范围的检测样本。ELISA方法因其高敏感性、强特异性及短时间内检测大量样品的特点成为研究的重点，已被广泛应用于实验室检测。目前国际认可的血清学技术为OIE推荐的补体结合反应(CFT)和竞争性酶联免疫吸附试验(cELISA)，CFT有其自身的缺陷，敏感性并不高，cELISA仅用于流行病学调查，cELISA试剂盒价格昂贵，且完全依赖进口，受制于他人，目前国内未见有CBPP的ELISA试剂盒。

本发明利用生物信息分析选定CBPP其中的一个脂蛋白P35，然后用基因重组技术，在体外通过原核表达系统得到大量重组蛋白并利用Ni-柱进行纯化，以该纯化后的重组蛋白作为包被抗原,建立初步的间接ELISA方法，以此来鉴定此重组蛋白的免疫源性，为牛传染性胸膜肺炎血清学方法的建立、疫苗的研制提供了新的技术手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够高效、准确检测丝状支原体丝状亚种(Mycoplasma mycoides subsp.Mycoides Small Colony,Mmm)的方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

丝状支原体丝状亚种(Mycoplasma mycoides subsp.Mycoides Small Colony,Mmm)的脂蛋白在对牛的感染过程中起关键作用，我们通过比对基因序列发现牛支原体和CBPP的同源性并不高，但是在实际研究中发现两者的交叉反应比较严重，为筛选免疫原性良好的Mmm脂蛋白，本发明利用生物学软件对全基因序列进行分析，选定其中一个大小为540bp的脂蛋白，并将其命名为P35，在选定的蛋白中只有P35蛋白具有良好的特异性。我们通过PCR扩增该基因并进行原核表达、获得重组蛋白(rP35)，然后采用rP35蛋白作为抗原，进行微量包被验证，发现rP35蛋白能够与CBPP阳性血清发生反应且与牛源性其他3种常见支原体感染样品血清不发生交叉反应。然后本发明建立了间接ELISA方法并对反应进行条件优化，再确定其cut off值。本发明使用S/P值对检测结果判断并将数据汇集到MedCalc之后确定其cut off值，该方法从理论上显著的减少实验人员操作过程与计算过程的误差，更为科学与方便。经过ELISA实验证明，该蛋白具有良好的免疫原性特异性、敏感性以及重复性，因此，rP35蛋白具有对研发牛传染性胸膜肺炎病免疫诊断试剂有潜在价值。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种具有免疫原性的丝状支原体丝状亚种脂蛋白，命名为P35，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码所述的丝状支原体丝状亚种脂蛋白的核苷酸序列也在本发明的保护范围之内。优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，本发明还提出了所述的丝状支原体丝状亚种脂蛋白在制备诊断牛传染性胸膜肺炎药物中的应用。

其中，所述的牛传染性胸膜肺炎是由丝状支原体丝状亚种感染引起的。

一种用于诊断牛传染性胸膜肺炎的试剂盒，所述的试剂盒中含有所述的丝状支原体丝状亚种脂蛋白包被的酶标板。

其中，优选的，所述的试剂盒中还含有辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG，包被缓冲液、洗涤液、稀释液、TMB显色液以及终止液。

其中，优选的，所述的试剂盒用于诊断牛传染性胸膜肺炎时，按照以下步骤进行：

(1)包被：用包被缓冲液将丝状支原体丝状亚种脂蛋白稀释后，加入酶标板中的反应孔中，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用洗涤液洗3次，每次3分钟；

(2)加样：加稀释后的待检血清样品加入上述已包被的反应孔中，置37℃孵育，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；

(3)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG，37℃孵育，洗涤；

(4)加底物液显色：于各反应孔中加入TMB显色液，37℃10～30分钟；

(5)终止反应：于各反应孔中加入终止液；

(6)结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，测各孔OD值，计算S/P值＝(样品OD-阴性OD)/(阳性OD-阴性OD)。

其中，优选的，丝状支原体丝状亚种脂蛋白的包被浓度为0.15μg/mL；待检血清样品的稀释度为1:80，孵育时间为1h；辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG的稀释度为1:8000，孵育时间为1h；TMB显色时间为10min。

其中，优选的，结果判定中，cut-off值为0.36。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、本发明通过筛选获得了一个免疫原性良好的Mmm脂蛋白，命名为P35，实验证明，rP35蛋白能够与CBPP阳性血清发生反应且与牛源性其他3种常见支原体感染样品血清不发生交叉反应，具有良好的特异性；

2、本发明提出了一种用于诊断牛传染性胸膜肺炎的试剂盒，并建立了基于该试剂盒的ELISA检测方法，并对反应进行条件优化，确定了其cut off值。经过ELISA实验证明，本发明建立的ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性以及重复性，能够用于牛传染性胸膜肺炎高效、快速的诊断。

附图说明

图1为目的基因的扩增；

M：DL2000DNA Mark 1：PCR阴性2：目的基因；

图2为pET-28a-p35PCR鉴定与双酶切鉴定；

1：PCR阴性2:p35PCR鉴定；M1:DL2000DNAmark；M2:DL5000DNAmark；3:p35双酶切鉴定；

图3为P35蛋白的可溶性表达鉴定；

M:蛋白Mark；1：rP35蛋白上清液2：rP35蛋白沉淀

图4为rP35蛋白免疫原性的功能的验证；

图5为血清样品S/P值的分布；

图6为敏感性实验结果；

图7为特异性实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1具有免疫原性的丝状支原体丝状亚种脂蛋白的筛选及ELISA检测方法的建立

1.材料

1.1菌株与血清：CBPP的疫苗株Ben-1由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离并保存；CBPP阳性血清70份、CBPP阴性血清70份、牛鼻支原体(MB)、牛无乳支原体(Ma)阳性血清、牛支原体(Mb)阳性血清、口蹄疫(FMD)阳性血清、牛病毒性腹泻(BVDV)阳性血清、牛传染性鼻气管炎(IBRV)阳性血清、以及重组质粒pET-28a、感受态细胞DH5α和BL21均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所制备并保存。博日DNA提取试剂盒、博日DNA柱式胶回收试剂盒，购自哈尔滨牧乐生物技术有限公司。

1.2试剂：限制性核酸内切酶BamH I、Sal I、DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司，辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG、底物显色液(TMB)购自Sigma公司；酶标板购自Jetbiofil公司；LB液体培养基、Kan⁺琼脂LB平板、50×TAE电泳缓冲液贮存液、IPTG、1％琼脂糖凝胶、20×磷酸盐缓冲液(PBS)、包被缓冲液、洗涤液、封闭液、终止液均由本实验室制备。

2.方法

2.1引物的设计

参考Mmm Ben-1株的全基因组序列,设计一对引物P1/P2，以Ben-1株的DNA为模版进行PCR扩增。

2.2重组质粒的构建与鉴定

将PCR产物回收,经Bam HⅠ和SalⅠ双酶切，克隆于pET-28a中再转化至DH5α感受态细胞中构建重组表达质粒pET-28a-p35,进行PCR和双酶切和鉴定后再送往擎科公司测序鉴定。

2.3目的基因的表达及纯化将重组质粒

pET-28a-p35转至大肠杆菌表达菌BL21中，培养菌液OD值至0.6～0.8时,加入IPTG至终浓度为1mmol/L,37℃诱导约6h。菌体用灭菌的PBS(pH＝7.4)洗三次后进行超声破碎，4℃离心机进行离心(8000r，15min)，经12％电泳鉴定，蛋白为可溶性表达，然后取菌体上清液进行NI柱纯化。

2.4rP35蛋白的免疫原性的鉴定

对纯化后的rP35蛋白进行微量包被制成ELISA板，对CBPP阳性血清和健康的阴性牛血清以及牛鼻支原体(MB)阳性血清、牛无乳支原体(Ma)阳性血清、牛支原体(Mb)阳性血清进行ELISA实验。

2.5间接ELISA的建立及最适反应条件

将纯化好的rP35蛋白采用方阵法确定抗原最佳包被浓度(1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560倍稀释)、血清最佳稀释度(1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280倍稀释)、辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG最佳稀释度(1:5 000、1:8 000、1:10000、1:16000、1:20000、1:32000、1:40000倍稀释)、TMB显色时间(15min、10min、5min)、反应时间(0.5h、1h、2h)以及反应温度(室温、37℃、4℃)。

2.6临界值的确定

用上述已确定的最佳ELISA反应条件对70份已知阴性血清与70份已知阳性的血清进行ELISA实验，并设立阴性和阳性对照。并且计算出S/P值(样品OD-阴性OD)/(阳性OD-阴性OD)将数值用MedcAlc软件进行统计学的点交式分析和ROC式分析，确定cut off值。

2.7敏感性和特异性实验

将1份CBPP的阳性血清进行(1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280)稀释，采用该间接ELISA方法进行测定，计算能够检出阳性结果的最高稀释度。

2.8特异性实验

利用建立的ELISA方法分别检测Ma，Mb，FMD、MB、BVDV、IBRV等的阳性血清，判断是否有交叉反应。

2.9重复性

以建立的ELISA方法对随机选取的8份血清，每份样品重复3孔，进行批内重复性试验；对上述8份血清样品进行3次ELISA检测，进行批间重复性试验。

3.结果

3.1以Mmm的Ben-1株DNA为模板，利用引物P1/P2经PCR扩增,得到大小约540bp的目的片段。将目的基因克隆于pET-28a中构建重组表达质粒pET-28a-p35(图1)。同时，测序结果显示目的基因片段为540bp(SEQ ID NO.1所示)与预期大小一致。

3.2重组质粒的构建与鉴定

将培养好的pET-28a-p35菌液为模版进行PCR鉴定，用核酸限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ对重组质粒pET-28a-p35进行双酶切鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳观察，在第三泳道可见大小为5000bp左右的质粒pET-28a和大小为540bp的p35基因两条DNA片段，鉴定结果均为阳性(图2、图3)。重组质粒pET-28a-p35测序结果与Mmm基因组参考序列进行比对分析后，相似性为100％。

3.3蛋白的可溶性表达

对诱导后菌体裂解液的“上清”成分和“沉淀”成分的SDS凝胶电泳分析，结果显示该重组蛋白以上清的形式表达，且大小为36kDa左右。

3.4rP35蛋白免疫原性的鉴定

用微量包被的ELISA板对CBPP阳性血清和健康的阴性牛血清以及牛鼻支原体(MB)阳性血清、牛无乳支原体(Ma)阳性血清、牛支原体(Mb)阳性血清进行ELISA实验，结果发现，rP35蛋白能够与CBPP阳性血清发生阳性反应且与牛源性其他3种常见支原体感染疾病不发生交叉反应(图4)。

3.5最适反应条件的确定

采用棋盘测定法进行ELISA条件优化，结果如表1所示。

表1最适条件的确定

3.6临界值的确定

将70份已知的阴性血清与阳性血清，用制备好的ELISA板进行检测并将S/P值进行了生物统计学软件进行分析，确定其cut off值为0.36(图5)。

3.7敏感性实验

采用建立的ELISA方法对不同稀释度的阳性血清进行检测，结果显示最大稀释度为1:640，表明该方法的敏感性为良好(图6)。

3.8特异性实验

本发明建立的ELISA方法在与牛源性其它疾病阳性血清交叉反应性方面，均不与牛源性其它疾病阳性血清样品包括Ma、Mb、FMD、MB、BVDV、IBRV等的阳性血清发生交叉反应，表明该方法具有良好特异性(图7)。

3.9重复性

对上述8份血清样品进行3次ELISA检测，进行批间重复性试验，结果如表2所示。

表2重复性结果

实施例2试剂盒的组成及使用方法

1、试剂盒的组成

(1)包被缓冲液(pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):

NaCO₃ 1.59克，NaHCO₃ 2.93克，加蒸馏水至1000ml；

(2)洗涤液(pH7.4 0.15M PBS)：

KH₂PO₄ 0.2克，Na₂HPO₄·12H2O 2.9克，NaCl 8.0克，KCl 0.2克，Tween-20 0.05v/v％，加蒸馏水至1000ml；

(3)稀释液：

牛血清白蛋白(BSA)0.1克，加洗涤液至100ml；

(4)终止液(2M H₂SO₄)；

(5)TMB(四甲基联苯胺)显色液；

(6)rP35蛋白，按照实施例1制备；

(7)辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG；

(8)酶标板；

(9)正常牛血清和CBPP阳性对照血清。

2、使用方法

(1)包被：用包被缓冲液将丝状支原体丝状亚种脂蛋白rP35蛋白稀释为0.15μg/mL，按照0.1ml/孔加入酶标板中的反应孔中，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用洗涤液洗3次，每次3分钟；

(2)加样：加稀释度为1:80的待检血清样品加入上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1h，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；

(3)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的稀释度为1:8000的辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG，37℃孵育1h，洗涤；

(4)加底物液显色：于各反应孔中加入TMB显色液，37℃10分钟；

(5)终止反应：于各反应孔中加入终止液；

(6)结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，测各孔OD值，计算S/P值＝(样品OD-阴性OD)/(阳性OD-阴性OD，cut-off值为0.36。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）

<120> 丝状支原体丝状亚种P35脂蛋白及其在诊断牛传染性胸膜肺炎中的应用

<130> KLPI180983

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 540

<212> DNA

<213> Mycoplasma mycoides subsp. Mycoides Small Colony

<400> 1

ttgaaaaaac tattaactat tttaagttca tttggtttaa ttgctacaac tggtgctagt 60

gtagtagctt gtaaaaatga tcaatcaatt tctttacaac ctaagaaatc agaaaatgaa 120

agtttaggtt ctgctacaaa agaagaaaag aaagaagaaa aaactgataa taatcaacca 180

agtagtttga aatctacaga agatcaaaat acaagtttaa cttctactcc agataataag 240

gagttgggta gtacaggttc aattcaaaat aaagaagaag aagtaacaaa aattaaggga 300

cagttagaaa aattaaaaga gtcagagcaa aaagctaaag ttttactaaa gcaaattgaa 360

gaaggcaaca ataaagcaaa agaagctgct gaacaagaaa aaattagaaa tgaattagaa 420

aaattaaatg cacaaaaacc taagattgaa gaagcattaa aacaaataga agaaactaaa 480

aagcaactag aagctaaatt acaatctcta caaactaata ctactgaatc ttctaattaa 540

<210> 2

<211> 179

<212> PRT

<213> Mycoplasma mycoides subsp. Mycoides Small Colony

<400> 2

Leu Lys Lys Leu Leu Thr Ile Leu Ser Ser Phe Gly Leu Ile Ala Thr Thr Gly Ala Ser 20

Val Val Ala Cys Lys Asn Asp Gln Ser Ile Ser Leu Gln Pro Lys Lys Ser Glu Asn Glu 40

Ser Leu Gly Ser Ala Thr Lys Glu Glu Lys Lys Glu Glu Lys Thr Asp Asn Asn Gln Pro 60

Ser Ser Leu Lys Ser Thr Glu Asp Gln Asn Thr Ser Leu Thr Ser Thr Pro Asp Asn Lys 80

Glu Leu Gly Ser Thr Gly Ser Ile Gln Asn Lys Glu Glu Glu Val Thr Lys Ile Lys Gly 100

Gln Leu Glu Lys Leu Lys Glu Ser Glu Gln Lys Ala Lys Val Leu Leu Lys Gln Ile Glu 120

Glu Gly Asn Asn Lys Ala Lys Glu Ala Ala Glu Gln Glu Lys Ile Arg Asn Glu Leu Glu 140

Lys Leu Asn Ala Gln Lys Pro Lys Ile Glu Glu Ala Leu Lys Gln Ile Glu Glu Thr Lys 160

Lys Gln Leu Glu Ala Lys Leu Gln Ser Leu Gln Thr Asn Thr Thr Glu Ser Ser Asn 179

Claims

1.一种具有免疫原性的丝状支原体丝状亚种(Mycoplasma mycoides subsp.MycoidesSmall Colony,Mmm)脂蛋白，命名为P35，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述的丝状支原体丝状亚种脂蛋白的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1所述的丝状支原体丝状亚种脂蛋白在制备诊断牛传染性胸膜肺炎药物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的牛传染性胸膜肺炎是由丝状支原体丝状亚种感染引起的。

6.一种用于诊断牛传染性胸膜肺炎的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求1所述的丝状支原体丝状亚种脂蛋白包被的酶标板。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG，包被缓冲液、洗涤液、稀释液、TMB显色液以及终止液。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，用于诊断牛传染性胸膜肺炎时，按照以下步骤进行：

(5)终止反应：于各反应孔中加入终止液；

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，丝状支原体丝状亚种脂蛋白的包被浓度为0.15μg/mL；待检血清样品的稀释度为1:80，孵育时间为1h；辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG的稀释度为1:8000，孵育时间为1h；TMB显色时间为10min。

10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，结果判定中，cut-off值为0.36。