BR112014029725B1

BR112014029725B1 - Usos de coronavírus respiratório canino para proteção contra infecções por b. bronchiseptica

Info

Publication number: BR112014029725B1
Application number: BR112014029725-8A
Authority: BR
Inventors: Shelly Lynn Shields; Omar Yousif Abdelmagid
Original assignee: Zoetis Services Llc
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2013-05-24
Publication date: 2023-09-26
Also published as: EP2854847A1; AU2013267716B2; MX2014014652A; NZ701930A; CA2874966A1; CA2874966C; JP6313752B2; BR112014029725A8; HK1206265A1; CN104411330B; US10632189B2; MX363510B; US20150157706A1; ES2748205T3; WO2013181086A1; JP2015518047A; EA201401202A1; EP2854847B1; EA032284B1; CN104411330A

Abstract

vacinação com coronavírus respiratório canino para proteção contra infecções por b. bronchiseptica. a presente invenção refere-se a composições, combinações, e métodos compreendendo coronavírus respiratório canino (crcov), que sejam eficazes para tratar ou prevenir infecções respiratórias associadas a patógenos secundários, tal como bordetella bronchiseptica, em animais.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se ao campo de imunologia, e em particular ao campo de composições imunogênicas e de vacina. Mais especificamente, a presente descrição refere-se a composições compreendendo preparação de Coronavírus Respiratório Canino (CRCoV) para o tratamento ou prevenção de doenças multifatoriais, particularmente compreendendo infecções bacterianas, em um cão.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] CRCoV é uma infecção respiratória altamente contagiosa que é espalhada por contato direto cão-cão, aerossóis de secreções respiratórias, e contato com ambientes contaminados ou pessoas contaminadas. Alguns cães têm uma doença moderada com sintomas consistindo em tosse, espirros e corrimento nasal, enquanto outros cães têm uma infecção subclínica sem sinais clínicos, eles ainda dispersam vírus que pode infectar outros cães. Os cães infectados com CRCoV podem progredir para pneumonia, particularmente se coinfec- tados com outros patógenos respiratórios.

[003] Os cães infectados com múltiplos patógenos respiratórios, particularmente tanto patógenos virais quanto patógenos bacterianos, podem contrair complexo de doença respiratória infecciosa canina (CIRDC), que é uma doença multifatorial altamente contagiosa comum em cães alojados em ambientes apinhados, tal como em centros de adoção de cães e centros de treinamento ou refeição. Os patógenos respiratórios vistos em cães infectados com CIRD incluem a bactéria Bordetella bronchiseptica (Bemis e outros, Lab. Anim. Sci., 29:48 a 52, 1977), coronavírus respiratório canino (CRCoV) (Erles e outros, Virology, 310(2):216 a 223, 2003), vírus da influenza canina (CIV) (Crawford e outros, Science, 310(5747):482 a 485, 2005), vírus da parainfluenza canina (CPIV) (Binn e outros, Exp. Biol. Med., 126:140 a 145, 1967), Mycoplasma cynos (Chalker e outros, Microbiology, 150:3491 a 3497, 2004), e adenovírus canino sorotipo 2 (CAV-2) (Ditchfield e outros, Can. Vet. J., 3:238 a 247, 1962). Até agora não surgiu nenhuma vacina contra todos ou a maioria dos patógenos mencionados anteriormente.

[004] A proteção contra CIRDC e outras doenças com múltiplos patógenos tem focado tradicionalmente na administração de uma vacina combinada que inclui imunógenos direcionados contra cada um dos potenciais patógenos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção consegue surpreendentemente o que foi previamente buscado em um produto multivalente através da administração de somente um único antígeno. Especificamente, ao administrar Coronavírus Respiratório Canino (CRCoV), as requerentes mostraram redução no estado da doença associada com patógenos não-CRCoV, ou seja, Bordetella bronchiseptica. Isso permite tanto a redução de um estado de doença multifacetada complexo com somente uma única composição monovalente quanto um aumento de imuno- genicidade, e potenciação de eficácia contra patógenos bacterianos em uma composição multivalente.

[006] Consequentemente, um aspecto da presente invenção fornece um método para tratar uma doença bacteriana em um cão, compreendendo administrar uma composição compreendendo coronavírus respiratório canino (CRCoV) ao cão. Em uma modalidade mais particular, a doença bacteriana é causada por ao menos um dentre: Bordetel- la bronchiseptica, Mycoplasma cynos (M. cynos) e Streptococcus equi., opcionalmente subespécies zooepidemicus. Em outra modalidade, a composição compreende ainda um veículo, diluente ou excipien-te farmaceuticamente aceitável.

[007] Em outra modalidade, a composição compreende ainda um ou mais imunógenos adicionais. Mais particularmente, os um ou mais imunógenos adicionais são selecionados a partir do grupo que consiste em vírus da parainfluenza canina (CPIV), adenovírus-2 canino (CAV-2), e vírus da influenza canina (CIV). Em outra modalidade, os um ou mais imunógenos adicionais são selecionados a partir do grupo que consiste em vírus do destempero canino (CDV), parvovírus canino (CPV), coronavírus canino entérico (CCV), adenovírus canino, Leptospira serovars, particularmente, Leptospira canicola, Leptospira grip- potyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, e Leptospira Bratislava, vírus do herpes canino, pneumovírus canino, organismos Leishmania, uma espécie Borrelia (spp.), espécie Mycoplasma, raiva, Ehrlichia canis, Bordetella bronchiseptica e qualquer combinação desses. Em outra modalidade, a composição consiste essencialmente em CRCoV e nenhum imunógeno adicional.

[008] Em outra modalidade, a composição tem uma duração de eficácia contra a doença bacteriana por um período de ao menos 3 meses, ou ao menos 6 meses, ou ao menos 12 meses.

[009] Outra modalidade da invenção fornece um método para proteger contra doença respiratória canina em um cão causada por infecções bacterianas compreendendo administrar coronavírus respiratório canino (CRCoV) ao cão.

[0010] Outra modalidade da invenção fornece um método para proteger contra uma doença respiratória canina multifatorial em um cão causada por infecções mistas virais e bacterianas compreendendo administrar coronavírus respiratório canino (CRCoV) ao cão.

[0011] Outra modalidade da invenção fornece um método para tratar uma doença causada por Bordetella bronchiseptica em um cão, compreendendo administrar uma composição compreendendo coro-navírus respiratório canino (CRCoV) ao cão.

[0012] Outra modalidade da invenção fornece um método para po- tenciar a eficácia de uma composição compreendendo um antígeno bacteriano em um cão, compreendendo coadministrar o coronavírus respiratório canino (CRCoV) ao cão. Outra modalidade da invenção fornece um método para aumentar a imunogenicidade de uma composição compreendendo um antígeno bacteriano em um cão, compreendendo coadministrar o coronavírus respiratório canino (CRCoV) ao cão. Em uma modalidade mais particular de qualquer um dos anteriores, o antígeno bacteriano é de Bordetella bronchiseptica.

[0013] Outra modalidade da presente invenção fornece um método ou uso da composição imunogênica de qualquer uma das modalidades anteriores para o tratamento ou prevenção de complexo de doença respiratória infecciosa canina (CIRDC), onde a composição trata ou previne a infecção a partir de uma pluralidade de patógenos respiratórios caninos. Outra modalidade fornece o uso ou método de administrar parenteralmente uma composição imunogênica como descrito aqui.

[0014] Outra modalidade fornece a fabricação de um medicamento compreendendo a composição imunogênica para o tratamento ou prevenção de infecção a partir de um patógeno respiratório canino em um cão.

[0015] Essas e outras modalidades, características e vantagens da invenção se tornarão claras a partir da descrição detalhada e nas reivindicações em anexo apresentadas abaixo. Entende-se que cada uma das modalidades anteriores e seguintes pode ser combinada em uma única modalidade.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0016] As definições abaixo se aplicam a essa descrição. Elas substituem quaisquer definições contraditórias contidas em cada refe- rência individual incorporada aqui por referência. As palavras não definidas têm o significado geralmente usado por um versado na técnica. Ademais, a menos que de outra forma exigido pelo contexto, termos singulares devem incluir pluralidades e termos plurais devem incluir o singular.

[0017] "Em torno" ou "aproximadamente", quando usados em conjunto com uma variável numérica mensurável, refere-se ao valor indicado da variável e todos os valores da variável que estão dentro do erro experimental do valor indicado (por exemplo, dentro de 95% de intervalo de confiança para a média), ou dentro de 10 porcento do valor indicado, seja qual for o maior. Se "aproximadamente" é usado em referência a intervalos de tempo em semanas, "aproximadamente 3 semanas" é 17 a 25 dias, e "aproximadamente 2 a aproximadamente 4 semanas" é 10 a 40 dias.

[0018] "Adjuvante", como usado aqui, refere-se a qualquer substância que serve como um estimulador não específico da resposta imune. Ver abaixo uma descrição adicional de adjuvantes.

[0019] O termo "animal", como usado aqui, inclui qualquer animal que é susceptível à infecção a partir de CRCoV e/ou complexo de doença respiratória canina, incluindo mamíferos, tanto domesticados quanto selvagens. Preferencialmente, o animal, como usado aqui, refere-se a um cão ou um humano.

[0020] "Anticorpo", como usado aqui, é qualquer polipeptídeo compreendendo um sítio de ligação ao antígeno independente da fonte, método de produção, ou outras características. Ele refere-se a uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento dessa que especificamente se liga a um antígeno como o resultado de uma resposta imune a esse antígeno. As imunoglobulinas são proteínas séricas compostas de cadeias de polipeptídeo "leves" e "pesadas" tendo regiões "constantes" e "variáveis" e são divididas em classes (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) com base na composição das regiões constantes. Um anticorpo que é "específico" para um dado antígeno indica que as regiões variáveis do anticorpo reconhecem e se ligam a um antígeno específico exclusivamente. O termo inclui, mas não está limitado a: anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo monoespecí- fico, anticorpo poliespecífico, anticorpo humanizado, um anticorpo te- tramérico, um anticorpo tetravalente, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo de cadeia simples, um anticorpo de domínio específico, um anticorpo de domínio simples, um anticorpo de domínio deletado, uma proteína de fusão, uma proteína de fusão ScFc, um anticorpo de cadeia simples, anticorpo quimérico, anticorpo sintético, anticorpo re- combinante, anticorpo híbrido, anticorpo mutado, e anticorpos enxertados com CDR. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas intactas derivadas de fontes naturais ou de fontes recombinantes, ou podem ser partes imunorreativas de imunoglobulinas intactas. Um "anticorpo" pode ser convertido em uma proteína de ligação ao antígeno, que inclui, mas não está limitado a fragmentos de anticorpo que incluem, mas não estão limitados a: um fragmento Fab, F(ab’)2, Fab’, Fv, um fragmento Fv de cadeia simples (ScFv), um fragmento Fd, um fragmento dAb, diacorpos, um peptídeo CRD3, um peptídeo FR3-CDR3- FR4 restrito, um nanocorpo, um nanocorpo bivalente, um pequeno imunofarmacêutico modular (SMIPs), e um minicorpo e qualquer um dos fragmentos mencionados acima e suas contrapartes química ou geneticamente manipuladas, bem como outros fragmentos de anticorpos que retêm função de ligação ao antígeno. Tipicamente, tais fragmentos compreenderiam um domínio de ligação ao antígeno. Como será reconhecido pelos versados na técnica, qualquer uma de tais moléculas pode ser elaborada (por exemplo, "linhagem germinativa") para diminuir sua imunogenicidade, aumentar sua afinidade, alterar sua es-pecificidade, ou para outros propósitos.

[0021] "Antígeno" ou "imunógeno", como usado aqui, refere-se a uma molécula que contém um ou mais epitopos (lineares, conformaci- onais ou ambos) que mediante exposição a um sujeito, induzirão uma resposta imune que é específica para esse antígeno. Um epitopo é o sítio específico do antígeno que se liga a um receptor de células T ou anticorpo específico, e tipicamente compreende aproximadamente 3 resíduos de aminoácido a aproximadamente 20 resíduos de aminoáci- do. O termo antígeno refere-se a antígenos de subunidade - antígenos separados e discretos a partir de um organismo integral com o qual o antígeno está associado por natureza - bem como bactérias mortas, atenuadas ou inativadas, vírus, fungos, parasitas e outros micróbios. O termo antígeno também refere-se a anticorpos, tal como anticorpos anti-idiotipo ou seus fragmentos, e a mimotopos de peptídeo sintético que podem imitar um antígeno ou determinante antigênico (epitopo). O termo antígeno também se refere a um oligonucleotídeo ou polinucleo- tídeo que expressa um antígeno ou determinante antigênico in vivo, tal como em aplicações de imunização com DNA.

[0022] "Antigenicidade", como usado aqui, refere-se à capacidade de uma proteína ou polipeptídeo de ser imunoespecificamente ligado por um anticorpo elevado contra a proteína ou polipeptídeo.

[0023] O termo "Bordetella bronchiseptica" ou "B. bronchoseptica" refere-se a: uma bactéria atenuada viva de Bordetella bronchiseptica, um extrato de célula integra morta (bacterina) de Bordetella bronchi- septica ou um extrato bacteriano celular de Bordetella bronchiseptica.

[0024] O termo "doença bacteriana" ou "infecção bacteriana" refere-se a uma doença que é ou causada diretamente por uma bactéria particular (por exemplo, B. bronchiseptica) ou exacerbada como um resultado do patógeno bacteriano em um estado de doença multifato- rial.

[0025] "Tampão" significa um sistema químico que previne a mu dança na concentração de outra substância química. Sistemas doadores ou aceptores de prótons servem como tampões, prevenindo mudanças consideráveis na concentração de íons de hidrogênio (pH). Um exemplo adicional de um tampão é uma solução contendo uma mistura de um ácido fraco e seu sal (base conjugada), ou uma base fraca e seu sal (ácido conjugado).

[0026] "Canino", como usado aqui, inclui o que é geralmente chamado de cão, mas inclui outros membros da família Canidae.

[0027] O termo "linhagem celular" ou "célula hospedeira", como usado aqui, significa uma célula procariótica ou eucariótica na qual um vírus pode replicar ou ser mantido.

[0028] O termo "coadministrar" refere-se à administração separada, sequencial ou simultânea. Os antígenos ou agentes coadministra- dos podem estar na mesma composição, tal como uma vacina combinada multivalente ou composições separadas compreendendo diferentes formas de dosagem.

[0029] O termo "cultura", como usado aqui, significa uma população de células ou micro-organismos crescendo na ausência de outras espécies ou tipos.

[0030] "Dose" refere-se a uma vacina ou composição imunogênica dada a um sujeito. Uma "primeira dose" ou "dose primária" refere-se à dose de tal composição dada no Dia 0. Uma "segunda dose" ou uma "terceira dose" ou uma "dose anual" refere-se a uma quantidade de tal composição dada subsequente à primeira dose, que pode ser, mas não se exige que seja a mesma vacina ou composição imunogênica da primeira dose.

[0031] Um "epitopo" é o sítio específico do antígeno que se liga a um receptor de células T ou anticorpo específico, e tipicamente compreende de aproximadamente 3 resíduos de aminoácido a aproximadamente 20 resíduos de aminoácido.

[0032] "Excipiente", como usado aqui, refere-se a um componente de veículo não reativo de uma vacina ou composição imunogênica que não é um antígeno. Excipientes preferenciais são aqueles conhecidos na técnica para injeção parenteral.

[0033] "Fragmento" refere-se a uma parte truncada de uma proteína ou gene. "Fragmento funcional" e "fragmento biologicamente ativo" referem-se a um fragmento que retém as propriedades biológicas da proteína de comprimento total ou gene.

[0034] "Homologia" ou "homologia percentual" refere-se à porcentagem de nucleotídeo ou resíduos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos ou similares ao resíduos na sequência(s) com- paradora(s) após alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para alcançar a homologia de sequência percentual máxima, e também considerando quaisquer substituições conservativas como parte da homologia de sequência.

[0035] "Homólogos" ou "espécies homólogas" incluem genes encontrados em duas ou mais espécies diferentes que possuem substancial homologia de sequência de polinucleotídeo, e possuem funções biológicas e/ou propriedades iguais ou similares. Preferencialmente, as sequências de nucleotídeos que representam espécies homólogas hibridizarão sob condições moderadamente rigorosas, como descrito aqui, por exemplo, e possuem atividades biológicas e/ou propriedades iguais ou similares. Em outro aspecto, os polinucleotídeos representando espécies homólogas compartilharão mais do que 60% de homologia de sequência, mais do que aproximadamente 70% de homologia de sequência, mais do que aproximadamente 80% de ho- mologia de sequência, mais do que aproximadamente 90% de homo- logia de sequência, mais do que aproximadamente 95% de homologia de sequência, mais do que aproximadamente 96% de homologia de sequência, mais do que aproximadamente 97% de homologia de se- quência, mais do que aproximadamente 98% de homologia de sequência, ou mais do que aproximadamente 99% de homologia de sequência.

[0036] "Identidade" ou "identidade percentual" refere-se à porcentagem de nucleotídeos ou aminoácidos na sequência candidata que são idênticos com os resíduos na sequência comparadora após alinhar ambas as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para alcançar a máxima identidade de sequência percentual, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência.

[0037] "Resposta imune", como usado aqui, em um sujeito refere- se ao desenvolvimento de uma resposta imune humoral, uma resposta imune celular, ou uma resposta imune humoral ou celular a um antíge- no. Uma "resposta imune humoral" refere-se a uma que é ao menos em parte mediada por anticorpos. Uma "resposta imune celular" é uma mediada por linfócitos T ou outros globos brancos ou ambos, e inclui a produção de citocinas, quimiocinas, e moléculas similares produzidas por células T ativadas, globos brancos ou ambos. As respostas imunes podem ser determinadas usando imunoensaios padrão e ensaios de neutralização, que são conhecidos na técnica.

[0038] "Imunogenicidade", como usado aqui, refere-se à capacidade de uma proteína ou polipeptídeo para produzir uma resposta imune direcionada especificamente contra uma bactéria ou vírus que causa a doença identificada.

[0039] Uma "composição imunogênica" é uma preparação contendo um imunógeno, incluindo, por exemplo, uma proteína, um peptídeo, uma célula integral, vírus inativado, subunidade ou atenuado, ou um polissacarídeo, ou uma combinação desses, administrados para estimular os sistemas imunes celulares e humorais do recebedor para um ou mais dos antígenos presentes na composição imunogênica. "Imuni- zação" é o processo de administrar uma composição imunogênica e estimular uma resposta imune ou imunogênica a um antígeno em um hospedeiro. Os hospedeiros preferenciais são mamíferos, tal como cães. Preferencialmente, a composição imunogênica é uma vacina.

[0040] "Quantidade imunologicamente protetora", como usado aqui, é uma quantidade de um antígeno eficaz para induzir uma resposta imunogênica no recebedor que é adequada para prevenir ou melhorar sinais ou sintomas da doença, incluindo efeitos colaterais ou complicações. Ou a imunidade humoral ou a imunidade mediada por célula ou ambas podem ser induzidas. A resposta imunogênica de um animal a uma composição pode ser avaliada, por exemplo, indiretamente através da medição de titulações de anticorpos, ensaios de pro-liferação de linfócitos, ou diretamente através de monitorar sinais e sintomas após provocação com cepa de ocorrência natural. A imunidade protetora conferida por uma composição ou vacina pode ser avaliada medindo, por exemplo, a redução de propagação de organismos de provocação, redução nos sinais clínicos tais como mortalidade, morbidez, temperatura, e condição física geral, saúde e desempenho do sujeito, redução de patologia, macroscópica e histopatologia em tecidos vitais. A resposta imune pode compreender, sem limitação, a indução de imunidade celular e/ou humoral. A quantidade de uma composição ou vacina que é terapeuticamente eficaz pode variar, dependendo do organismo particular usado, ou a condição do animal sendo tratado ou vacinado, e pode ser determinada por um veterinário.

[0041] Administração "intranasal", como usada aqui, refere-se à introdução de uma substância, tal como uma vacina ou outra composição, em um corpo de sujeito através ou por meio do nariz, e envolve transporte da substância principalmente através da mucosa nasal.

[0042] O termo "isolada" refere-se a uma substância que está ou na forma substancialmente pura, por exemplo, maior do que aproxi- madamente 95% de pureza, ou purificada ou enriquecida de alguma forma a partir de seu ambiente natural. O termo "isolada" abrange imunógenos que estão em solução com outros agentes/diluentes/ex- cipientes/adjuvantes/proteínas.

[0043] "Agente medicinal" refere-se a qualquer agente que é útil na prevenção, cura ou melhora de uma condição médica, ou na prevenção de alguma condição ou ocorrência fisiológica.

[0044] "Anticorpo monoclonal", como usado aqui, refere-se a anticorpos produzidos por uma única linhagem de células de hibridoma, todas direcionadas para um epitopo em um antígeno particular. O an- tígeno usado para fazer o anticorpo monoclonal pode ser fornecido como uma proteína isolada do patógeno ou o patógeno integral. Um ‘hibridoma" é uma linhagem de célula clonal que consiste em células híbridas formadas pela fusão de uma célula de mieloma e uma célula produtora de anticorpo específica. Em geral, os anticorpos monoclo- nais são de origem de camundongo. Entretanto, anticorpo monoclonal refere-se também a uma população clonal de um anticorpo produzido contra um epitopo particular de um antígeno produzido por tecnologia de exibição de fagos, ou método que é equivalente à exibição de fa- gos, ou células híbridas de origem não camundongo.

[0045] Administração "oral" ou "peroral", como usado aqui, refere- se à introdução de uma substância, tal como uma vacina ou outra composição, no corpo de um sujeito através ou por meio da boca e envolve engolir ou transportar através da mucosa oral (por exemplo, absorção sublingual ou bucal) ou ambos. A administração intratraqueal é também um meio de administração oral ou peroral.

[0046] A administração "oronasal", como usada aqui, refere-se à introdução de uma substância, tal como uma composição ou vacina, no corpo de um sujeito através ou por meio do nariz e da boca, e ocorreria, por exemplo, colocando-se uma ou mais gotículas no nariz. A administração oronasal envolve processos de transporte associados com a administração oral e intranasal.

[0047] A "administração parenteral", como usada aqui, refere-se à introdução de uma substância, tal como uma composição ou vacina, no corpo de um sujeito através ou por meio de uma via que não inclui o trato digestivo. A administração parenteral inclui a administração subcutânea, intramuscular, intra-arterial, e intravenosa. Com os propósitos desta descrição, a administração parenteral exclui as vias de administração que envolvem principalmente o transporte da substância através do tecido mucoso na boca, nariz, traqueia e pulmões.

[0048] O termo "patógeno" ou "micro-organismo patogênico", como usado aqui, significa um micro-organismo - por exemplo, CPIV, CAV-2, CRCoV, Mycoplasma cynos, CIV, ou Bordetella bronchiseptica - que é capaz de induzir ou causar uma doença, condição ou estado anormal em seu animal hospedeiro, preferencialmente uma doença respiratória, tal como CIRDC.

[0049] "Farmaceuticamente aceitável" refere-se a substâncias que, dentro do escopo de discernimento médico, são adequadas para uso em contato com os tecidos de sujeitos sem toxicidade indevida, irritação, resposta alérgica, e similares, proporcional a uma relação benefício-risco razoável, e eficaz para seu uso pretendido.

[0050] "Anticorpo policlonal", como usado aqui, refere-se a uma população mista de anticorpos feitos contra um patógeno ou antígeno particular. Em geral, a população contém uma variedade de grupos de anticorpos, cada grupo direcionado para um epitopo particular do pa- tógeno ou antígeno. Para produzir anticorpos policlonais, o patógeno integral, ou um antígeno isolado, é introduzido por inoculação ou infecção em um hospedeiro, que induz o hospedeiro a produzir anticorpos contra o patógeno ou antígeno.

[0051] O termo "polinucleotídeo", como usado aqui, significa uma molécula de polímero orgânico composta de monômeros de nucleotí- deo covalentemente ligados em uma cadeia. DNA (ácido desoxirribo- nucleico) e RNA (ácido ribonucleico) são exemplos de polinucleotídeos com função biológica distinta.

[0052] O termo "polipeptídeo", como usado aqui, significa uma molécula de polímero orgânico composta de dois ou mais aminoácidos ligados em uma cadeia.

[0053] A administração "respiratória", como usada aqui, refere-se à introdução de uma substância, tal como uma vacina ou outra composição, no corpo de um sujeito através ou por meio de inalação de uma substância nebulizada (atomizada). Na administração respiratória, o mecanismo de transporte primário envolve a absorção da substância atomizada através da mucosa na traqueia, brônquios, e pulmões e é então diferente da administração intranasal ou peroral.

[0054] Os termos "ligação específica", "se liga especificamente" e similares são definidos como duas ou mais moléculas que formam um complexo que é mensurável sob condições fisiológicas ou de ensaio e é seletivo. Um anticorpo ou outro inibidor é dito "se ligar especificamente" à proteína se, sob condições apropriadamente selecionadas, tal ligação não é substancialmente inibida, enquanto ao mesmo tempo, a ligação não específica é inibida. A ligação específica é caracterizada por alta afinidade e é seletiva para o composto ou proteína. A ligação não específica usualmente tem baixa afinidade. A ligação em anticorpos IgG, por exemplo, é geralmente caracterizada por uma afinidade de ao menos aproximadamente 10-7 M ou mais, tal como ao menos aproximadamente 10-8 M ou mais, ou ao menos aproximadamente 10-9 ou mais, ou ao menos aproximadamente 10-10 ou mais, ou ao menos aproximadamente 10-11 M ou mais, ou ao menos aproximadamente 1012 M ou mais. O termo é também aplicável onde, por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno é específico para um epitopo particular que não é executado por numerosos antígenos, caso no qual o antí- geno carregando o domínio de ligação ao antígeno geralmente não se ligará a outros antígenos.

[0055] "Fragmento imunogênico específico", como usado aqui, refere-se a uma parte de uma sequência que é reconhecida por um anticorpo ou célula T específica para essa sequência.

[0056] "Sujeito", como usado aqui, refere-se a qualquer animal tendo um sistema imune, que inclui mamíferos, tal como cães.

[0057] "Substancialmente idêntico", como usado aqui, refere-se a um grau de identidade de sequência de ao menos aproximadamente 90%, ao menos aproximadamente 95%, ao menos aproximadamente 96%, ao menos aproximadamente 97%, ao menos aproximadamente 98%, ou ao menos aproximadamente 99%.

[0058] "Vacina de subunidade" e "composição de subunidade", como usada aqui, refere-se a um tipo de vacina ou composição que inclui um antígeno, mas nem todos os antígenos, que são derivados de antígenos de um patógeno de interesse ou homólogos a antígenos de um patógeno de interesse, tal como um vírus, bactéria, parasita ou fungo. Tal composição ou vacina é substancialmente isenta de células de patógenos ou partículas patogênicas, ou o lisado de tais células ou partículas. Assim, uma vacina ou composição de subunidade pode ser preparada a partir de polipeptídeos imunogênicos ao menos parcialmente purificados, ou substancialmente purificados a partir do patóge- no ou seus análogos. Os métodos para obter um antígeno ou antíge- nos na vacina ou composição de subunidade incluem técnicas de purificação padrão, produção recombinante, ou síntese química. Uma "vacina de subunidade" ou "composição de subunidade" refere-se assim a uma vacina ou composição consistindo em um componente ou com-ponentes antigênicos definidos de um vírus, bactéria ou outro imunó- geno.

[0059] "TCID50" refere-se à "dose infectiva de cultura de tecido" e é definido como essa diluição de um vírus exigida para infectar 50% de um dado lote de culturas de células inoculadas. Vários métodos podem ser usados para calcular TCID50, incluindo o método de Spear- man-Karber, que é utilizado por todo esse relatório descritivo. Para uma descrição do método de Spearman-Karber, ver B. W. Mahy & H. O. Kangro, Virology Methods Manual 25-46 (1996).

[0060] "Agente Terapêutico", como usado aqui, refere-se a qualquer molécula, composto, vírus ou tratamento, preferencialmente um vírus atenuado ou morto, ou subunidade ou composto, que ajuda no tratamento de uma infecção, doença ou condição viral, bacteriana, pa- rasítica ou fúngica causada através disso.

[0061] "Quantidade terapeuticamente eficaz", como usada aqui, refere-se a uma quantidade de um antígeno ou vacina ou composição que induziria uma resposta imune em um sujeito (por exemplo, cão) recebendo o antígeno ou vacina ou composição que é adequada para prevenir ou melhorar os sinais ou sintomas de doença, incluindo efeitos colaterais ou suas complicações, causada por infecção com um patógeno, tal como um vírus, bactéria, parasita ou fungo. A imunidade humoral ou imunidade mediada por célula, ou tanto imunidade humoral quanto imunidade mediada por célula pode ser induzida. A resposta imunogênica de um animal a um antígeno, vacina, ou composição pode ser avaliada indiretamente através da medição de titulações de anticorpos, ensaios de proliferação de linfócitos, ou diretamente através de sinais de monitoramento e sintomas após provocação com a cepa de ocorrência natural. A imunidade protetora conferida por uma vacina ou composição pode ser avaliada através da medição da redução de propagação de organismo de provocação, e/ou redução nos sinais clínicos, tal como mortalidade, morbidez, temperatura, e condição física geral, saúde, e desempenho do sujeito. A quantidade de uma vacina ou composição que é terapeuticamente eficaz pode variar, dependendo do imunógeno particular usado, ou da condição do sujeito, e pode ser determinada por um versado na técnica.

[0062] "Tratar" ou "tratamento" de uma doença em um paciente refere-se a: inibir a doença ou interromper seu desenvolvimento; proteger contra a doença ou prevenir a doença de ocorrer em um paciente que é predisposto ou não exibiu ainda sintomas da doença; ou melhorar ou causar regressão da doença. Igualmente, os termos, "proteger", "protegendo", "proteção" e similares significam a redução ou eliminação de sinais clínicos da doença. Eles também significam a redução ou eliminação do agente(s) causador(es) da doença.

[0063] "Vacina" ou "composição de vacina", como usado aqui, refere-se a uma composição imunogênica selecionada a partir de um vírus ou bactéria, ou vivo modificado, atenuado, ou motor, ou uma vacina de subunidade, ou qualquer combinação dos mencionados anteriormente. A administração da vacina a um sujeito resulta em uma resposta imune. A vacina pode ser introduzida diretamente no sujeito por qualquer via de administração conhecida, incluindo parenteralmente, peroralmente, e similares. Os termos significam uma composição que impede ou reduz uma infecção, ou que impede ou reduz um ou mais sinais ou sintomas de infecção. Os efeitos de proteção de uma composição de vacina contra um patógeno são normalmente alcançados através da indução no sujeito de uma resposta imune. Geralmente falando, incidências abolidas ou reduzidas de infecção, melhora dos si-nais ou sintomas, ou eliminação acelerada do micro-organismo a partir dos sujeitos infectados são indicativas dos efeitos de proteção de uma composição de vacina. As composições de vacina da presente invenção fornecem efeitos de proteção contra infecções causadas por pató- genos de doença respiratória canina.

[0064] "Veterinariamente aceitável", como usado aqui, refere-se a substâncias que são, dentro do escopo do discernimento médico, adequadas para uso em contato com os tecidos de sujeitos veterinários sem toxicidade indevida, irritação, resposta alérgica, e similares, de acordo com uma relação benefício-risco razoável, e eficaz para seu uso pretendido.

[0065] "Veículo veterinariamente aceitável", como usado aqui, refere-se a um meio veículo que não interfere com a eficácia da atividade biológica do ingrediente ativo, e não é tóxico para o sujeito veterinário a quem ele é administrado.

Antígenos, Composições Imunogênicas, e Vacinas

[0066] A presente invenção fornece composições e vacinas imu- nogênicas compreendendo um ou mais vírus, particularmente CRCoV e opcionalmente bactérias ou subunidades que são adequadas para a administração a um cão para o tratamento contra uma doença, tal como CIRDC. O coronavírus respiratório canino (CRCoV) abrangido por esta invenção pode ser caracterizado como um coronavírus presente nos tratos respiratórios de cães com doença respiratória infecciosa. CRCoV é filogeneticamente mais intimamente relacionado a coronaví- rus bovino (BCoV), cepa de coronavírus humano (HCoV) OC43 e vírus da encefalomielite hemaglutinante (HEV), coronavírus canino entérico (CCoV) é somente distantemente relacionado a CRCoV.

[0067] Em uma modalidade preferencial, o CRCoV é o mesmo do descrito em US 2007-0098739, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência, em particular com relação a cepas de CRCoV e antígenos descritos aqui. Os fragmentos imunogênicos adequados de CRCoV são descritos em WO 2004/011651 (The Royal Veterinary College). Os fragmentos imunogênicos adequados de CRCoV incluem as proteínas de superfície Spike (S) e hemaglutinina-estearase (HE), a glicoproteí- na de membrana (M), e a proteína de nucleocapsídeo (N), ou porções imunogênicas desses. As proteínas HE e Spike tipo CRCoV descritas em WO 2004/011651 podem também ser adequadas como agentes que criam uma resposta imune contra CRCV. Os coronavírus intimamente relacionados, tal como coronavírus bovino e coronavírus humano, e seus fragmentos imunogênicos, podem também ser adequados como agentes que criam uma resposta imune contra CRCV. A descrição inteira de WO 2004/011651 com relação aos agentes que podem ser usados como um componente de vacina contra CRCV é incorporada aqui por referência. Outro exemplo de um CRCoV adequado para uso na presente invenção inclui uma cepa identificada como cepa de CRCoV 4182 (Erles e outros, Virus Res., 124: 78 a 87, 2007).

[0068] Os antígenos do vírus da influenza abrangidos por esta invenção podem ser qualquer cepa de vírus da influenza identificado, de qualquer pássaro ou mamífero, incluindo, mas não limitado a vírus de influenza tendo hemaglutinina subtipo H3 e neuraminidase subtipo N8, ou o subtipo H3N8, mais comumente chamado de um vírus H3N8. A influenza pode ser de origem de mamífero ou ave, incluindo, mas não limitado a suínos, equinos ou caninos. Em uma modalidade, um antí- geno de influenza canina é usado. Em uma modalidade, um antígeno de influenza equina é usado. Em uma modalidade, uma cepa tendo as glicoproteínas subtipo designado H3 ou N8 é usada. Em uma modalidade, uma cepa tendo glicoproteínas tanto subtipo H3 quanto subtipo N8 é usada.

[0069] Os antígenos de influenza abrangidos por esta invenção podem ser isolados de cães, cavalos, porcos, e aves, tanto domésticos quanto selvagens. Os animais escolhidos para coleta de amostras deveriam exibir síndromes clínicas agudas e/ou subagudas, que podem incluir sintomas respiratórios moderados a severos e febre. Os animais podem também exibir sinais de anorexia e letargia. Os métodos de iso-lamento de vírus são bem conhecidos pelos versados na técnica incluindo: inocular culturas de células de mamíferos ou aves, inocular ovos embrionados com amostras de muco nasal ou faringeal a partir de espécimes clínicos, coleta de aspirados da passagem nasal ou garganta, ou coletar tecidos tais como baço, pulmão, amídala e fígado e lavagem pulmonar. O efeito citopático do vírus pode ser observado na cultura celular. O fluido alantoico ou lisados celulares podem ser testados quanto à sua capacidade de aglutinar globos vermelhos humanos, de galinhas, perus, ou porquinhos-da-Índia, evidência presumida para a presença de um vírus influenza.

[0070] Um exemplo representativo de uma cepa de vírus da influenza canina (CIV) adequado para uso na presente invenção inclui uma cepa identificada como A/canine/Iowa/9A1/B5/08/D12, que foi depositado como PTA-7694 em 29 de junho de 2006 no American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. Uma cepa representativa do antígeno CIV é a cepa do vírus CIV na vacina comercial, Vanguard® CIV (Pfizer). Esta invenção também abrange vacinas compreendendo uma cepa identificada como Cepa da Influenza Equina A/Equine/2/Miami/1/63. Essa cepa é depositada no ATCC, com número de acesso VR 317. Exemplos adicionais de vírus de influenza para uso na presente invenção são A/canine/Iowa/13628/2005, A/Equine/Kentucky/1998, A/Equine/Kentucky/15/2002, A/Equine/Ohio/1/2003,A/Equine/Kentucky/1/1994, A/Equine/Massachusetts/213/2003,A/Equine/Wisconsin/2003, A/Equine/NewYork/1999, e A/Equine/Newmarket/A2/1993. Outras cepas preferenciais e/ou isolados de CIV incluem os descritos nas Patentes US. Nos. 7.959.929 (particularmente cepas e sequências HA identificadas como Jackson- ville/2005, Miami/2005, FL/242/03 e Florida/43/04), 7.384.642, 7.572.620 e 7.468.187, cujo conteúdo, incluindo todas as sequências, particularmente sequências de HA, e cepas, são aqui incorporadas por referência como se completamente apresentado aqui. Adicionalmente, uma cepa CIV adequada para uso aqui inclui o isolado CIV Colorado descrito em Barrell e outros, J. Vet. Intern. Med., 24 (6), 1524 a 1527 (2010), tendo número de acesso ADW41784.

[0071] O vírus da parainfluenza canina (CPIV) abrangido por essa invenção pode ser caracterizado como um dos vírus conhecidos como sendo um agente causador associado com tosse do canil. Uma cepa representativa do antígeno CPIV é a cepa de vírus CPI atenuado na vacina comercial, Vanguard® Plus 5 (Pfizer). Outra cepa representativa do antígeno CPIV é a cepa do vírus CPI atenuado tendo a designação de "NL-CPI-5" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA).

[0072] O adenovírus canino, tipo 2 (CAV-2) abrangido por esta invenção pode ser caracterizado como um dos vírus também conhecidos como sendo um agente causador associado com a tosse do canil. Uma cepa representativa do antígeno CAV-2 é a cepa do vírus CAV-2 na vacina comercial, Vanguard® Plus 5 (Pfizer). Uma cepa representativa do antígeno CAV-2 é a cepa CAV-2 atenuada designada como a cepa "Manhattan" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA).

[0073] O Mycoplasma cynos (M. cynos) abrangido por esta invenção é descrito em Chalker e outros, Microbiology, 150: 3491 a 3497, 2004 e é a única espécie de micoplasma geralmente associado com doença respiratória. As composições imunogênicas contra M. cynos são descritas em US. 2007/0098739, incorporada aqui por referência.

[0074] O componente Bordetella bronchiseptica abrangido por esta invenção pode ser caracterizado como o agente causador bacteriano associado com a tosse do canil. As composições imunogênicas e vacinas abrangidas pela presente invenção podem ser uma ou mais dentre: uma Bordetella bronchiseptica atenuada viva, uma baterina Borde- tella bronchiseptica ou um extrato bacteriano. Adicionalmente, a composição também inclui preferencialmente um antígeno de subunidade isolado de Bordetella bronchiseptica.

[0075] Em uma modalidade, a Bordetella bronchiseptica é preparada como um sonicado de célula integral purificado através de croma- tografia em coluna como fornecido no Pedido de Patente No. FR2571618, depositado em 12 de outubro de 1984. Outro exemplo representativo de uma Bordetella bronchiseptica é o extrato bacteriano BronchicinaTM CAe (Pfizer), que é preparado a partir de material anti- gênico extraído de células de Bordetella bronchiseptica. Outro exemplo de Bordetella bronchiseptica é a cepa de bronchiseptica atenuada viva B-C2 presente em Nobivac® e/ou a cepa de bronchiseptica viva a partir de Intra-Trac®, Bronchi-Shield®, NaramuneTM, Reombitek®, Uni- vac e/ou Kennel-JecTM.

[0076] Adicionalmente, uma subunidade pode também apresentar (isto é, suplementada), em combinação com o componente A de Bor- detella bronchiseptica. Um exemplo representativo da subunidade é um antígeno de pertactina isolado, preferencialmente, um antígeno de Bordetella bronchiseptica recombinante p68 que é reconhecido pelo anticorpo monoclonal específico de p68 Bord 2-7 (descrito em US. 7.736.658 incorporada aqui por referência) e em uma modalidade preferencial, tem uma sequência de aminoácido como apresentada em US. 7.736.658 ou tendo homologia com essa.

[0077] Os vírus abrangidos pela presente invenção podem ser propagados em células, linhagens celulares e células hospedeiras. As ditas células, linhagens celulares ou células hospedeiras podem ser, por exemplo, mas não limitadas a células de mamíferos e células não- mamíferos, incluindo células de insetos e plantas. As células, linhagens celulares e células hospedeiras, nas quais os vírus abrangidos pela presente invenção podem ser propagados, são prontamente co-nhecidas e acessíveis pelos versados na técnica.

[0078] As bactérias abrangidas pela presente invenção podem ser cultivadas e propagadas usando vários meios de cultura conhecidos pelos versados na técnica, incluindo tanto meios de cultivo de caldo (líquidos) e de ágar (sólidos, semissólidos). Algumas bactérias podem também ser cultivadas e propagadas em células de mamíferos ou células não-mamíferos.

[0079] Os vírus e as bactérias abrangidas pela presente invenção podem ser atenuados ou inativados antes do uso em uma composição ou vacina imunogênica. Os métodos de atenuação e inativação são bem conhecidos pelos versados na técnica. Os métodos para atenuação incluem, mas não estão limitados à passagem serial em cultura celular em uma linhagem celular adequada (vírus e algumas bacté-rias), à passagem serial em cultura de caldo (bactérias), irradiação ultravioleta (vírus e bactérias), e mutagênese química (vírus e bactérias). Os métodos para a inativação viral ou bacteriana incluem, mas não estão limitados ao tratamento com formalina, betapropiolactona (BPL) ou etilenoimina binária (BEI), ou outros métodos conhecidos pelos versados na técnica.

[0080] A inativação por formalina pode ser executada misturando- se a suspensão contendo o micro-organismo com formaldeído a 37% até uma concentração de formaldeído final de 0,5%. A mistura de mi- cro-organismo-formaldeído é misturada por agitação constante por aproximadamente 24 horas em temperatura ambiente. A mistura de micro-organismos inativados é então testada quanto a organismos vivos residuais por ensaio para crescimento em uma linhagem celular adequada ou meios de caldo.

[0081] Para alguns antígenos, a inativação por BEI pode ser executada misturando-se a suspensão contendo o micro-organismo da presente invenção com 0,1 M de BEI (2-bromo-etilamina em 0,175 N de NaOH) até uma concentração de BEI final de 1 mM. Para outros antígenos, a concentração de BEI final é 2 mM. Um versado na técnica saberia qual concentração apropriada usar. A mistura vírus-BEI é mis- tura por agitação constante por aproximadamente 48 horas em temperatura ambiente, seguida pela adição de 1,0 M de tiossulfato de sódio até uma concentração final de 0,1 mM. A misturação é continuada por mais duas horas. A mistura contendo o micro-organismo inativado é testado quando ao vírus vivo residual através de ensaio quanto ao crescimento em uma linhagem celular adequada ou meio de caldo.

[0082] As composições e vacinas imunogênicas abrangidas pela presente invenção podem incluir um ou mais veículos veterinariamente aceitáveis. Como usado aqui, um "veículo veterinariamente aceitável" inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, agentes de atraso de adsorção, e similares. Os diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol, e similares. Os agentes isotôni- cos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose, dentro outros conhecidos pelos versados na técnica. Os estabili- zantes incluem albumina, dentre outros conhecidos pelos versados na técnica. Os conservantes incluem mertiolato, dentre outros conhecidos na técnica.

[0083] O adjuvante pode ser metabolizável, com relação a adjuvantes consistindo de componentes que são capazes de serem meta- bolizados pela espécie alvo tal como adjuvantes baseados em óleo vegetal. Um adjuvante metabolizável pode ser um óleo metabolizável. Os óleos metabolizáveis são gorduras e óleos que ocorrem tipicamente em plantas e animais, e geralmente consistem amplamente de misturas de triacilgliceróis, também conhecidos como triglicerídeos ou gorduras neutras. Essas substâncias insolúveis em água não polares são triésteres de ácido graxo de glicerol. Os triacilgliceróis diferem de acordo com a identidade e localização de seus três resíduos de ácido graxo ou cadeias laterais.

[0084] O adjuvante pode também ser não metabolizável, com relação a adjuvantes consistindo em componentes que não podem ser metabolizados pelo corpo do sujeito animal ao qual a emulsão é administrada. Os óleos não metabolizáveis adequados para uso em composições da presente invenção incluem alcanos, alcenos, alcinos e seus ácidos e álcoois correspondentes, os éteres e ésteres desses, e suas misturas. Preferencialmente, os compostos individuais do óleo são compostos de hidrocarboneto leve, isto é, tais componentes têm 6 a 30 átomos de carbono. O óleo pode ser sinteticamente preparado ou purificado a partir de produtos de petróleo. Os óleos não metabolizá- veis preferenciais para uso em composições descritas aqui incluem óleo mineral, óleo de parafina e cicloparafinas, por exemplo. O termo "óleo mineral" refere-se a um óleo adjuvante não metabolizável que é uma mistura de hidrocarbonetos líquidos obtidos a partir de petrolato via uma técnica de destilação. O termo é sinonimo de "parafina lique-feita", "petrolato líquido" e "óleo mineral branco". O termo é também destinado a incluir "óleo mineral leve", isto é, óleo que é similarmente obtido por destilação de petrolato, mas que tem uma gravidade específica levemente menor do que o óleo mineral branco. O óleo mineral pode ser obtido a partir de várias fontes comerciais, por exemplo, J. T. Baker (Phillipsburg, PA), USB Corporation (Cleveland, OH). O óleo mineral leve está comercialmente disponível sob o nome DRAKEOL®.

[0085] Os adjuvantes incluem, mas não estão limitados ao sistema adjuvante Emulsigen (MVP Laboratories; Ralston, NE), o sistema adjuvante RIBI (Ribi Inc.; Hamilton, MT), sulfato de alumínio, gel de hidróxido de alumínio, emulsões de óleo em água, emulsões de água em óleo tal como, por exemplo, adjuvantes completos e incompletos de Freund, copolímero de bloco (CytRx; Atlanta, GA), SAF-M (Chiron; Emeryville, CA), adjuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc.; Cambridge, MA), GPI-0100 (Galenica Phar maceuticals, Inc.; Birmingham, AL) ou outras frações de saponina, monofosforil lipídio A, lipídio Avridina-adjuvante amina, enterotoxina lábil ao calor de E. coli (recombinante ou de outra forma), toxina da cólera, muramil dipeptídeo, esqualeno/copolímero de bloco plurôni- co/tensoativo (SP-óleo), sulfolipobeta-ciclodextrina (SL-CD), liposso- mos contendo um imunomodulador (por exemplo, CpG ou poli I:C), muramil dipeptídeo (MDP), iscomatrix (Quil A/fosfotidil colina), CpG/DEAE-dextrano/óleo mineral (TXO), CoG, triterpenoides (por exemplo, Quil A ou outra preparação de saponina purificada ou parcialmente purificada), esteróis (por exemplo, colesterol), agentes imu- nomoduladores (por exemplo, brometo de dimetil dioctadecil amônio - DDA), polímeros (por exemplo, ácido poliacrílico tal como CARBOPOL®, e estimuladores de Th2 (por exemplo, glicolipídios tais como Bay R1005®), e combinações desses, dentre muitos adjuvantes conhecidos pelos versados na técnica.

[0086] Exemplos não limitantes de várias combinações que podem ser usadas incluem um triterpenoide mais um esterol (por exemplo, Quil A/colesterol, também conhecido como QAC), um triterpenoide mais um esterol, um agente imunomodulador, e um polímero (por exemplo, Quil A/colesterol/DDA/CARBOPOL®, também conhecido como QCDC), e um triterpenoide mais um esterol, um agente imuno- modulador, um polímero, e um estimulador de Th2 (por exemplo, Quil A/colesterol/DDA/CARBOPOL®, e Bay R1005®, também conhecido como QCDCR).

[0087] As quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem ser prontamente determinadas pelos versados na técnica. Em uma modalidade, a presente invenção considera composições e vacinas imunogênicas compreendendo de aproximadamente 20 μg a aproximadamente 2000 μg de adjuvante. Em outra modalidade, o adjuvante é incluído em uma quan- tidade de aproximadamente 100 μg a aproximadamente 1500 μg, ou de aproximadamente 250 μg a aproximadamente 1000 μg, ou de aproximadamente 350 μg a aproximadamente 750 μg. Em outra modalidade, o adjuvante é incluído em uma quantidade de aproximadamente 500 μg/2 ml de dose da composição ou vacina imunogênica.

[0088] As composições e vacinas imunogênicas podem também incluir antibióticos. Tais antibióticos incluem, mas não estão limitados aos das classes de aminoglicosídeos, carbapenemas, cefalosporinas, glicopeptídeos, macrolidas, penicilinas, polipeptídeos, quinolonas, sul- fonamidas, e tetraciclinas. Em uma modalidade, a presente invenção considera composições e vacinas imunogênicas compreendendo de aproximadamente 1 μg/ml a aproximadamente 60 μg/ml de antibiótico. Em outra modalidade, as composições e vacinas imunogênicas com-preendem de aproximadamente 5 μg/ml a aproximadamente 55 μg/ml de antibiótico, ou de aproximadamente 10 μg/ml a aproximadamente 50 μg/ml de antibiótico, ou de aproximadamente 15 μg/ml a aproximadamente 45 μg/ml de antibiótico, ou de aproximadamente 20 μg/ml a aproximadamente 40 μg/ml de antibiótico, ou de aproximadamente 25 μg/ml a aproximadamente 35 μg/ml de antibiótico. Em ainda outra modalidade, as composições e vacinas imunogênicas compreendem menos de aproximadamente 30 μg/ml de antibiótico.

[0089] As composições e vacinas imunogênicas abrangidas pela presente invenção podem incluir uma ou mais moléculas de polinucle- otídeo codificando um vírus ou bactéria, ou proteína viral ou bacteria- na. As moléculas de DNA ou RNA podem ser usadas em composições ou vacinas imunogênicas. As moléculas de DNA ou RNA podem ser administradas ausentes de outros agentes, ou podem ser administradas junto com um agente que facilita a absorção celular (por exemplo, lipossomas ou lipídios catiônicos). O polinucleotídeo total na composição ou vacina imunogênica estará geralmente entre aproximadamente 0,1 μg/ml e aproximadamente 5,0 mg/ml. Em outra modalidade, o poli- nucleotídeo total na composição ou vacina imunogênica será de aproximadamente 1 μg/ml e aproximadamente 4,0 mg/ml, ou de aproximadamente 10 μg/ml e aproximadamente 3,0 mg/ml, ou de aproximadamente 100 μg/ml e aproximadamente 2,0 mg/ml. As vacinas e os procedimentos de vacinação que utilizam ácidos nucleicos (DNA ou mRNA) foram descritos na técnica, por exemplo, Pat. US. No. 5.703.055, Pat. U.S. No. 5.580.859, Pat. U.S. No. 5.589.466, todas as quais são incorporadas aqui por referência.

[0090] Em adição aos vírus ou bactérias descritos acima, as composições e vacinas imunogênicas abrangidas pela presente invenção podem incluir outros antígenos adicionais. Os antígenos podem estar na forma de uma preparação integral ou parcial inativada do microorganismo, ou na forma de moléculas antigênicas obtidas por técnicas de engenharia genética ou síntese química. Outros antígenos apropri-ados para uso de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados aos derivados de vírus patogênicos tais como vírus do destempero canino, vírus da herpes canina, vírus da influenza canina, vírus da raiva, bactérias patogênicas tais como Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohae- morrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira hardjobovis, Porphyromo- nas spp., Bacteriodes spp., Borrelia spp., Streptococcus spp., incluindo Streptococcus equi subspecies zooepidemicus, Ehrlichia spp., Myco-plasma spp., including Mycoplasma cynos, e Microsporum canis. Os antígenos podem também ser derivados de fungos patogênicos tais como Candida, protozoários tais como Cryptosporidium parvum, Ne- ospora caninum, Toxoplasma gondii, Eimeria spp., Babesia spp., Giar- dia spp., Leishmania spp., ou helmintos tais como Taenia, Cuterebra, Echinococcus, e Paragonimus spp.

Formas, Dosagens e Vias de Administração

[0091] As composições e vacinas imunogênicas abrangidas pela presente invenção podem ser administradas a animais para induzir uma resposta imune eficaz contra estados de doenças multipatogêni- cas associados com CRCoV e outro patógeno, tal com B. bronchisep- tica. Consequentemente, a presente invenção fornece métodos de estimulação de uma resposta imune eficaz através da administração a um animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição ou vacina imunogênica descrita aqui.

[0092] As composições e vacinas imunogênicas descritas aqui podem ser administradas a um animal para vacinar o animal contra CIRDC. As composições e vacinas imunogênicas podem ser administradas ao animal para prevenir ou tratar CIRDC no animal. Consequentemente, são descritos aqui métodos de vacinar um animal contra CIRDC, e prevenir ou tratar CIRDC, compreendendo administrar ao animal uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição ou vacina imunogênica descrita aqui.

[0093] As composições e vacinas imunogênicas abrangidas pela presente invenção podem ser produzidas em várias formas dependendo da via de administração. Por exemplo, as composições e vacinas imunogênicas podem ser produzidas na forma de soluções ou dispersões aquosas estéreis adequadas para uso injetável, ou produzidas em formas liofilizadas usando técnicas de secagem por congelamento. As composições e vacinas imunogênicas liofilizadas são tipicamente mantidas em aproximadamente 4°C, e podem ser reconstituídas em uma solução estabilizante, por exemplo, solução salina ou HEPES, com ou sem adjuvante. As composições e vacinas imunogênicas podem também ser produzidas na forma de suspensões ou emulsões.

[0094] As composições e vacinas imunogênicas da presente invenção incluem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais micro-organismos descritos acima. Os vírus e/ou bactérias purificadas podem ser usados diretamente em uma composição ou vacina imunogênica, ou podem ser atenuados, ou inativados. Tipicamente, uma composição ou vacina imunogênica contém entre aproximadamente 1 x io2 e aproximadamente 1 x io12 partículas virais ou bacteri- anas, ou entre aproximadamente 1 x io3 e aproximadamente 1 x 1011 partículas, ou entre aproximadamente 1 x 104 e aproximadamente 1 x 1010 partículas, ou entre aproximadamente 1 x 105 e aproximadamente 1 x 109 partículas, ou entre aproximadamente 1 x 106 e aproximadamente 1 x 108 partículas. A quantidade precisa de um micro-organismo em uma composição ou vacina imunogênica eficaz para fornecer um efeito protetor pode ser determinada por um versado na técnica.

[0095] As composições e vacinas imunogênicas geralmente compreendem um veículo veterinariamente aceitável, em um volume entre aproximadamente 0,5 ml e aproximadamente 5 ml. Em outra modalidade, o volume do veículo está entre aproximadamente 1 ml e aproximadamente 4 ml, ou entre aproximadamente 2 ml e aproximadamente 3 ml. Em outra modalidade, o volume do veículo está entre aproximadamente 1 ml, ou é aproximadamente 2 ml, ou é aproximadamente 5 ml. Os veículos veterinariamente aceitáveis adequados para uso nas composições e vacinas imunogênicas podem ser quaisquer dos descritos acima.

[0096] Os versados na técnica podem prontamente determinar se um vírus ou bactérias precisa ser atenuado ou inativado antes da administração. Em outra modalidade da presente invenção, um vírus ou bactéria pode ser administrado diretamente ao animal sem atenuação adicional. A quantidade de um micro-organismo que é terapeuticamen- te eficaz pode variar, dependendo do organismo particular usado, da condição do animal e/ou do grau de infecção, e pode ser administrado por um versado na técnica.

[0097] De acordo com os métodos da presente invenção, uma única dose pode ser administrada a animais, ou, alternativamente, duas ou mais inoculações podem acontecer com intervalos de aproximadamente duas a aproximadamente dez semanas. Regimes de reforço podem ser exigidos, e o regime de dosagem pode ser ajustado para fornecer imunização ótima. Os versados na técnica podem prontamente determinar o regime de administração ótima.

[0098] As composições e vacinas imunogênicas podem ser administradas diretamente na corrente sanguínea, no músculo, em um órgão interno, ou sob a pele. Os meios adequados para administração parenteral incluem administração intravenosa, intra-arterial, intramuscular e subcutânea. Os dispositivos adequados para a administração parenteral incluem injetores com agulha (incluindo microagulha) e inje- tores livres de agulha.

[0099] As formulações parenterais são tipicamente soluções aquosas que contêm excipientes tais como sais, carboidratos, proteínas, e agentes de tamponagem (preferencialmente em um pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 9, ou de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, ou de aproximadamente 5 a aproximadamente 7,5, ou de aproximadamente 6 a aproximadamente 7,5, ou de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5), mas para algumas aplicações, elas podem ser mais adequadamente formuladas como solução não aquosa estéril ou como uma forma seca para ser usada em conjunto com um veículo adequado tal como água livre de pirogênio estéril ou solução salina.

[00100] A preparação de formulações parenterais sob condições estéreis, por exemplo, por liofilização, pode ser prontamente executada usando técnicas farmacêuticas padrão bem conhecidas pelos versados na técnica.

[00101] A solubilidade dos materiais usados na preparação de solu- ções parenterais pode ser aumentada pelo uso de técnicas de formulação apropriadas conhecidas pelos versados na técnica, tal como a incorporação de agentes de acentuação de solubilidade, incluindo tampões, sais, tensoativos, lipossomas, ciclodextrinas, e similares.

[00102] As composições para administração parenteral podem ser formuladas para serem de liberação imediata ou modificada. As formulações de liberação modificada incluem liberação atrasada, sustentada, pulsada, controlada, direcionada e programada. Assim, as composições e vacinas imunogênicas podem ser formuladas como um sólido, semissólido, ou líquido tixotrópico para administração como um depósito implantado, fornecendo a liberação modificada das composições e vacinas imunogênicas.

[00103] Outros meios de administração de composição ou vacina imunogênica incluem a entrega por injeção com microagulha ou livre de agulha (por exemplo, PowderjectTM, BiojectTM, etc.).

[00104] Em casos onde a injeção subcutânea ou intramuscular é usada, uma formulação isotônica é preferencial. Geralmente, os aditivos para isotonicidade podem incluir cloreto de sódio, dextrose, mani- tol, sorbitol e lactose. Em casos particulares, as soluções isotônicas tais como solução salina tamponada com fosfato são usadas. As formulações podem abranger ainda estabilizantes tais como gelatina e albumina. Em algumas modalidades, um agente vasoconstritor é adi-cionado à formulação. As preparações farmacêuticas de acordo com a presente invenção são geralmente fornecidas estéreis e livres de piro- gênio. Entretanto, os versados na técnica bem sabem que as formulações para o veículo farmaceuticamente aceitável são aqueles veículos farmacêuticos aprovados nas regulações promulgadas pelo Departamento de Agricultura Americano, ou agência governamental equivalente em um país estrangeiro tal como Canadá ou México, ou qualquer uma das nações europeias, para qualquer vacina canina, composições e vacinas imunogênicas de subunidade de polipeptídeo (antígeno), vacinas de vetores de vírus recombinante, e vacinas de DNA. Então, o veículo farmaceuticamente aceito para a produção comercial das composições ou vacinas imunogênicas é um veículo que já é aprovado ou será aprovado pela agência governamental apropriada nos Estados Unidos da América ou país estrangeiro. As composições e vacinas imunogênicas podem ser ainda misturadas com um adjuvante que é farmaceuticamente aceitável. Em certas formulações das composições e vacinas imunogênicas, a composição ou vacina imunogênica é com-binada com outras composições ou vacinas imunogênicas caninas para produzir um produto polivalente que pode proteger os cães contra uma ampla variedade de doenças causadas por outros patógenos caninos.

Métodos de Detecção e Diagnóstico

[00105] A extensão e natureza das respostas imunes induzidas no animal podem ser avaliadas usando uma variedade de técnicas. Por exemplo, o soro pode ser coletado dos animais inoculados, e testado quanto à presença ou ausência de anticorpos específicos para os imunógenos. A detecção de linfócitos T citotóxicos (CTLs) em tecidos linfoides, indicativa da indução de uma resposta imune celular, pode ser alcançada por ensaios tais como proliferação de células T. As técnicas relevantes são bem descritas na técnica.

Kits

[00106] Na medida em que pode ser desejável administrar uma composição ou vacina imunogênica em combinação com composições ou compostos adicionais - por exemplo, com o propósito de tratar uma doença ou condição particular - está dentro do escopo da presente invenção que uma composição ou vacina imunogênica possa convenientemente ser incluída, ou combinada, na forma de um kit adequado para a administração ou coadministração das composições.

[00107] Assim, os kits abrangidos pela presente invenção podem compreender uma ou mais composições farmacêuticas separadas, ao menos uma das quais é uma composição ou vacina imunogênica de acordo com a presente invenção, e um meio para reter separadamente as ditas composições, tal como um recipiente, garrafa dividida, ou pacote dividido. Um exemplo de tal kit é uma seringa e agulha, e similar. Um kit da presente invenção é particularmente adequado para administrar diferentes formas de dosagem, por exemplo, oral ou parenteral, para administrar as composições separadas em diferentes intervalos de dosagem, ou para titular as composições separadas entre si. Para ajudar a administrar uma composição abrangida pela presente invenção, o kit tipicamente compreende orientações para administração.

[00108] Outro kit abrangido pela presente invenção pode compreender um ou mais reagentes úteis para a detecção de um animal infectado. O kit pode incluir reagentes para analisar uma amostra quanto à presença de micro-organismos integrais, polipeptídeos, epitopos ou sequências de polinucleotídeo. A presença de vírus, bactéria, polipep- tídeo, ou sequências de polinucleotídeo pode ser determinada usando anticorpos, PCR, hibridização, e outros métodos de detecção conhecidos pelos versados na técnica.

[00109] Outro kit abrangido pela presente invenção pode fornecer reagentes para a detecção de anticorpos contra epitopos particulares. Tais reagentes são úteis para analisar uma amostra quanto à presença de anticorpos, e são prontamente conhecidos e disponíveis para um versado na técnica. A presença de anticorpos pode ser determinada usando métodos de detecção padrão conhecidos pelos versados na técnica.

[00110] Em certas modalidades, os kits podem incluir um conjunto de instruções impressas, ou um rótulo indicando que o kit é útil para a detecção de animais infectados.

Anticorpos

[00111] Os anticorpos podem ou ser monoclonais, policlonais ou recombinantes. Os anticorpos podem ser preparados contra o imunó- geno ou uma porção dele. Por exemplo, um peptídeo sintético com base na sequência de aminoácido do imunógeno, ou preparado de forma recombinante por técnicas de clonagem, ou o produto gênico natural e/ou partes desse podem ser isoladas e usadas como o imunógeno. Os imunógenos podem ser usados para produzir anticorpos por tecnologia de produção de anticorpos padrão bem conhecida pelos versados na técnica. Os fragmentos de anticorpos podem também ser preparados a partir dos anticorpos por métodos conhecidos pelos versados na técnica, e incluem fragmentos Fab, F(ab’)2 e Fv.

[00112] Na produção de anticorpos, a triagem pelo anticorpo desejado pode ser executada por métodos padrão em imunologia conhecidos na técnica. Em geral, ELISAs e Western blotting são os tipos preferenciais de imunoensaios. Ambos os ensaios são bem conhecidos pelos versados na técnica. Tanto anticorpos policlonais quanto anticorpos monoclonais podem ser usados nos ensaios. O anticorpo pode ser ligado a um substrato de suporte sólido, conjugado com uma porção detectável, ou ser ligado e conjugado como é bem conhecido na técnica. A ligação dos anticorpos a um substrato de suporte sólido é também conhecida na técnica. As porções detectáveis consideradas para uso na presente invenção podem incluir, mas não estão limitadas a marcadores fluorescentes, enzimáticos e radioativos tal como biotina, ouro, ferritina, fosfatase alcalina, b-galactosidase, peroxidase, urease, fluoresceína, rodamina, trítio, 14C e iodação.

[00113] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, mas não limitada a eles.

Exemplos Exemplo 1. Infecção experimenta de cães com CRCV usando aeros-solização intranasal.

[00114] Cinquenta cães, determinados como estando em boa saúde geral, e negativos para anticorpos contra coronavírus respiratório canino (CRCoV) antes do Dia 0, como determinado por ensaio de anticorpo fluorescente (IFA), foram incluídos no estudo. Os animais foram também confirmados livres de CRCoV como determinado por isolamento de vírus de aspirado orofaríngeo no Dia 0.Tabela 1. Modelo de estudo.

[00115] O isolato CRCoV designado Max foi usado como o material de provocação, e foi obtido após uma única passagem nas células HRT18G. O material de provocação foi titulado em células HRT18G, e determinado como tendo uma dose infeciosa de 107,1 TCID50/mL. O isolato CRCoV designado CRCoV NP787 foi também usado como o material de provocação, e foi obtido após duas passagens em células HRT18G. O material de provocação foi titulado em células HRT18G, e determinado como tendo uma dose infecciosa de 106,5 TCID50/mL.

[00116] Os animais foram observados uma vez ao dia a partir do Dia -3. Os pesos corporais foram determinados no Dia -1. Uma amostra de sangue foi coletada a partir de cada animal no Dia 0 antes da provocação. As temperaturas timpânicas foram determinadas no Dia - 2, Dia -1, e Dia 0 antes da provocação. Dois conjuntos de aspirados orofaríngeos foram coletados a partir de cada cão antes da provocação no Dia 0. Um conjunto de aspirados foi coletado em tubos VTM (meios de transporte viral) para isolamento do vírus CRCoV, e o outro conjunto foi coletado em meios Amies (isolamento bacteriano). Dois conjuntos de aspirados nasais foram coletados a partir de cada cão antes da provocação no Dia 0, um em tubos VTM para isolamento de vírus CRCoV, e o outro em meios Amies para isolamento bacteriano. Os animais foram observados uma vez ao dia no Dia -2, Dia -1 e Dia 0 antes da provocação, quanto a sinais clínicos de doença respiratória.

[00117] Os estoques de vírus de provocação de CRCoV foram descongelados, e apropriadamente diluídos até a dose de provocação esperada (106,0 TCID50/cão). Cinco cães foram provocados ao mesmo tempo, por aerossolização contendo 5x106,0 TCID50 até a dose de provocação alvo de 1x10A6 TCID50 por cão. O material de provocação foi mantido em gelo até a inoculação de provocação. Aos cães a partir dos grupos de tratamento T01 e T02 foi administrada solução salina por aerossolização em uma câmara Plexiglass por um total de 30 minutos no Dia 0. Esses grupos foram provocados primeiro para evitar contaminação cruzada. Aos cães a partir dos grupos de tratamento T03 e T04 foi administrado isolato CRCoV Max por aerossolização em uma câmara Plexiglass por um total de 30 minutos no Dia 0. Aos cães dos grupos de tratamento T05 e T06 foi administrado CRCoV NP787 por aerossolização em uma câmara Plexiglass por um total de 30 minutos no Dia 0. A titulação pós-provocação média para CRCoV (Max) foi 105,2TCID50/mL, e a titulação pós-provocação média para CRCoV (NP787) foi 104,7TCID50/mL.

[00118] As temperaturas timpânicas foram determinadas diariamente após a provocação do Dia 0 ao Dia 14. As observações clínicas foram executadas uma vez ao dia por aproximadamente 30 minutos do Dia 0 ao Dia 14. Aspirados nasais foram coletados de cada cão em tubos VTM para isolamento de vírus CRCoV do Dia 0 ao Dia 10. Aspirados orofaríngeos foram coletados a partir de cada cão em tubos VTM no Dia 2, Dia 3 e Dia 4. Uma amostra de sangue para sorologia foi coletada de cada animal no Dia 4 e no Dia 14.

[00119] A necropsia foi executada nos grupos de tratamento T01, T03 e T05 no Dia 4 pós-provocação, e nos grupos de tratamento T02, T04 e T06 no Dia 14 pós-provocação. Os animais foram eutanizados com uma superdose de barbiturato de sódio. Na necropsia, um pulmão completo foi assepticamente removido e colocado no pano estéril. Para determinar a quantidade total de consolidação pulmonar cada lobo do pulmão foi pontuado para consolidação separadamente. A traqueia foi transeccionada e o lúmen avaliado quanto à patologia macroscópica. Todos os tecidos foram avaliados e classificados por um patologista veterinário certificado.

[00120] Após os pulmões terem sido classificados, o lobo pulmonar caudal direito foi lavado em aproximadamente 30,0 mL de VTM (sem antibiótico ou antimicótico) via o plexo brônquico. O meio VTM foi lentamente aspirado de volta para a seringa enquanto massageando delicadamente o tecido do pulmão. Os fluidos lavados foram aliquotados e testados quanto à bacteriologia, e quanto ao isolamento de vírus CRCoV.

[00121] Amostras de tecido foram coletadas a partir da traqueia, cavidade nasal (incluindo a seção ciliada), e lobo cranial direito. Dois conjuntos de amostras de tecido foram coletados a partir da traqueia e da cavidade nasal. Um conjunto foi testado quando ao isolamento de vírus CRCoV, e o outro conjunto preparado para histopatologia. Três conjuntos de amostras de tecido foram coletados a partir do lobo pulmonar cranial direito, o primeiro conjunto foi testado quanto à bacterio-logia, o segundo conjunto foi testado quando ao isolamento de vírus CRCoV, e o terceiro conjunto preparado para histopatologia.

[00122] Aspirados nasais e orofaríngeos, amostras de tecido, e lavagens pulmonares foram testados quanto ao isolamento de virus CRCoV usando células HRT18G. Em resumo, as amostras foram processadas e inoculadas em frascos contendo monocamadas de células HRT18G. Os frascos inoculados foram incubados por duas semanas em uma incubadora umidificada de CO2 a 35-37°C. Os frascos inoculados foram amostrados em uma e duas semanas pós-inoculação, à medida que as amostras foram inoculadas em 4 poços de uma placa com 96 poços semeada com células HRT18G. As placas inoculadas foram incubadas em uma incubadora umidificada de CO2 por 5 a 7 dias a 35-37°C. No fim do período de incubação, monocamadas celulares nas placas com 96 poços foram fixadas com uma solução à base de acetona, e lavadas com água. A presença de CRCoV foi determinada por coloração de anticorpo fluorescente usando um anticorpo conjugado a FITC específico de CRCoV, e observada sob um microscópio epi- fluorescente.

[00123] As amostras de soro foram testadas quanto aos anticorpos de CRCoV por IFA. Em resumo, as células HRT18G foram semeadas em placas com 96 poços, e infectadas com CRCoV com uma diluição de vírus para alcançar 50-200 células infectadas por poço. As placas infectadas foram fixadas com uma solução à base de acetona e enxaguadas. As amostras de soro de teste foram diluídas 2 vezes direta-mente nas placas fixadas com CRCoV. As placas foram incubadas por 40 a 60 minutos. As placas foram enxaguadas, e anticorpo conjugado a FITC de IgG anticanino de coelho foi adicionado. As placas foram incubadas por 40 a 60 minutos. Após a incubação, as placas foram enxaguadas e examinadas sob um microscópio epifluorescente. A titulação de anticorpo foi determinada como a recíproca da mais alta diluição de soro exibindo intensidade de fluorescência típica (+1) ou mais.

[00124] As amostras de soro foram testadas quanto aos anticorpos neutralizantes de soro de CRCoV por neutralização de soro. Em resumo, as células HRT18G foram semeadas em placas de cultura de te- cido de 96 poços na densidade apropriada, e incubadas por 3 a 5 dias a 35-37°C em uma incubadora umidificada de CO2. Quando a mono- camada celular alcançou 100% de confluência, os poços foram enxaguados com meio e pré-tratados com meio suplementado com tripsina por 1 hora na incubadora. Duas diluições de cada soro de teste foram preparadas, e incubadas com 50-300 TCID50 CRCoV por 40 a 60 minutos em temperatura ambiente. As misturas vírus-soro de cada diluição em soro foram inoculadas em quatro poços. As placas foram incubadas por 5 a 7 dias em 35-37°C em uma incubadora umidificada de CO2. Após incubação, o meio foi descartado, e as monocamadas celulares foram fixadas com uma solução à base de acetona. O fixador foi descartado e as placas foram enxaguadas. A presença de CRCoV foi determinada por imunofluorescência, usando um anticorpo conjugado a FITC específico de CRCoV, sob um microscópio de epifluorescência. A titulação de anticorpo neutralizante de soro foi determinada como a recíproca da mais alta diluição em soro que neutralizou o vírus em 50% dos poços.

[00125] As variáveis de eficácia primárias foram a presença/ausên- cia de epitélio ciliado traqueal danificado classificado com grau > 1 (histopatologia da traqueia), e isolamento de vírus. Nenhum teste baseado em hipótese foi conduzido. As distribuições de frequência dos escores de histopatologia (gravidade, distribuição, processo e cílios) da traqueia, cavidade nasal, e lobo pulmonar cranial, foram calculadas para cada grupo de tratamento. Em adição, o epitélio ciliado traqueal foi classificado ainda como normal (0 e 1) ou anormal (2, 3, e 4). As distribuições de frequência dessa variável foram calculadas para cada tratamento. As distribuições de frequência da presença ou ausência de isolamento de vírus CRCoV a partir dos aspirados nasais e orofarín- geos foram calculadas para cada grupo de tratamento e ponto no tempo. O número de dias que um animal teve vírus CRCoV detectado nos aspirados nasais pós-provocação ((vírus detectado no último dia - vírus detectado no primeiro dia) + 1, a menos que nenhum vírus seja detectado] foi calculado para cada animal. O número de dias com vírus detectado a partir dos aspirados nasais foi resumido para cada tratamento, com estatísticas descritivas que incluíam média, mediana, desvio padrão, mínimo e máximo. As distribuições de frequência da pre- sença/ausência de isolamento de vírus a partir da lavagem e dados de tecido foram calculadas para cada grupo de tratamento. As estatísticas descritivas de titulações de anticorpos (IFA e SN), incluindo a média geométrica, mínimo e máximo, foram calculadas para cada tratamento e ponto no tempo. As distribuições de frequência de cada observação clínica (corrimento nasal, tosse, espirro, corrimento ocular, conjuntivite, e depressão) foram calculadas para cada grupo de tratamento e ponto no tempo. As estatísticas descritivas foram calculadas para temperatura, incluindo média, desvio padrão, mínimo e máximo para cada tratamento e ponto no tempo. Adicionalmente, as temperaturas foram classificadas como < 37,0°C, 37,0 - 39,5°C, 39,6 a 40,0°C, 40,1 a 41,0°C e 41,1 a 42,0°C. As distribuições de frequência foram calculadas para cada tratamento e tempo dessa nova variável. As distribuições de frequência de presença/ausência de cada teste foram calculadas para cada tratamento e tempo.

[00126] Resultados. Todos os cães tiveram resultado negativo quanto ao isolamento de vírus CRCoV a partir de amostras de aspirado nasal e orofaríngeo coletadas no Dia 0 (antes da administração de provocação). Todos os cães tiveram resultado negativo (titulação IFA < 40) para anticorpos de CRCoV por ensaio de fluorescência indireta, e negativo (titulação SN 3) para anticorpos de CRCoV por ensaio de neutralização em soro, a partir de amostras de soro coletadas no Dia 0 (antes da administração de provocação). Todos os cães tiveram resultado negativo para Bordetella bronchiseptica e para Pasteurella sp a partir de aspirados nasais e orofaríngeos coletados no Dia 0, mas Mycoplasma sp, Staphylococcus intermedius e Streptococcus canis foram isolados de aspirados nasais e orofaríngeos em níveis diferentes no Dia 0. Cães saudáveis frequentemente detêm esses microorganismos como parte de sua flora normal no trato respiratório superior, entretanto.

[00127] A maioria dos sinais clínicos pós-provocação para os animais administrados com isolato CRCoV Max (grupos de tratamento T03 e T04) e isolato CRCoV NP787 (grupos de tratamento T05 e T06), foram de suave a moderado, e incluiu corrimento nasal, tosse, espirro e corrimento ocular. A conjuntivite nunca foi observada, e um único cão apresentou depressão. Pareceu não haver grandes diferenças entre os dois isolados de provocação (CRCoV Max e CRCoV NP787) associados com a patogenicidade dos sinais clínicos observados para os gr upos de tratamento T03 e T04 (provocados com isolato CRCoV Max), e para os grupos de tratamento T05 e T06 (provocados com iso- lato CRCoV NP787).

[00128] Alguns cães, administrados com placebo (solução salina) nos grupos de tratamento T01 e T02, apresentaram corrimento ocular suave e moderado durante a fase de provocação do estudo. Entretanto, todos esses cães já apresentavam corrimento ocular suave antes do Dia 0 de provocação. As temperaturas timpânicas pós-provocação foram normais (< 39,4°C) para todos os cães provocados com o isolato CRCoV Max (grupos de tratamento T03 e T04) e para todos os cães provocados com isolato CRCoV NP787 (grupos de tratamento T05 e T06). Alguns cães, administrados com placebo em grupos de tratamento T01 e T02, apresentaram hipertermia (> 39,5°C) em algum ponto durante a fase de provocação do estudo. Entretanto, todos os cães estavam perfeitamente normais e saudáveis, e concluiu-se posteriormente que o termômetro timpânico usado para os grupos de tratamen-to T01 e T02 estava subindo.

[00129] Em resumo, devido à intensidade suave de sinais clínicos de CRCoV, e devido à ausência de hipertermia nos cães provocados (isolato CRCoV Max e isolato CRCoV NP787), esses dois critérios não parecem ser suficientes para caracterizar e medir a intensidade da doença sob condições laboratoriais.

[00130] O número médio de dias de isolamento de vírus CRCoV de aspirados nasais para o grupo de tratamento T03 (isolato CRCoV Max, Dia de necropsia 4) foi 4, e para o grupo de tratamento T04 (isolato CRCoV Max, Dia de necropsia 14) foi 6. O número médio de dias de isolamento de vírus CRCoV de aspirados nasais para o grupo de tratamento T05 (isolato CRCoV NP787, Dia de necropsia 4) foi 2, e para o grupo de tratamento T06 (isolato CRCoV NP787, Dia de necropsia 14) foi 5. Quatro cães administrados com o placebo (solução salina) a partir do grupo de tratamento T02 foram positivos para o isolamento de vírus CRCoV a partir de aspirados nasais em torno do Dia 6, Dia 7 e Dia 8 pós-provocação. Nenhum desses animais apresentou quaisquer sinais clínicos que sugerem infecção por CRCoV durante a fase pós- provocação. Na necropsia, no Dia 14 pós-provocação, três cães T02 tiveram escores de pulmão suaves. A avaliação ciliar foi considerada normal para todos esses animais. Nenhum isolamento de CRCoV foi obtido a partir do pulmão, lavagem pulmonar, cavidade nasal e traqueia para todos esses animais, e por essa razão, é improvável que o isolato CRCoV de ocorrência natural fosse contaminado cruzado no ambiente com animal administrado com placebo (solução salina). Em adição, os resultados de isolamento de vírus CRCoV positivos foram somente encontrados na segunda passagem em células HRT18G. Uma possibilidade é que as amostras foram contaminadas cruzadas na fase de teste em laboratório.

[00131] O número médio de dias de isolamento de vírus CRCoV a partir de aspirados orofaríngeos para o grupo de tratamento T03 (isola- to CRCoV Max, Dia de necropsia 4) foi 2, e para o grupo de tratamento T04 (isolato CRCoV Max, Dia de necropsia 14) foi 2. O número médio de dias de isolamento de vírus CRCoV a partir de aspirados orofarín- geos para o grupo de tratamento T05 (isolato CRCoV NP787, Dia de necropsia 4) foi 0, e para o grupo de tratamento T04 (isolato CRCoV NP787, Dia de necropsia 14) foi 1. A média numericamente mais alta de dias de isolamento de CRCoV foi obtida a partir de aspirados coletados a partir da cavidade nasal usando o isolato CRCoV Max como o organismo de provocação (grupos de tratamento T03 e T04). Conclusão, os aspirados nasais coletados durante a fase mais precoce de infecção pareceram muito mais prováveis de resultar isolamento de vírus CRCoV positivo a partir de cães provocados com o isolato CRCoV Max.

[00132] Nenhum isolamento de vírus CRCoV foi observado a partir do tecido pulmonar coletado a partir de cães provocados com placebo (solução salina). O isolamento de vírus CRCoV positivo a partir de tecido pulmonar foi observado em 10 dos 10 cães (100%) na necropsia no dia 4 para o grupo de tratamento T03 (isolado de CRCoV Max). O isolamento de vírus CRCoV positivo de tecido pulmonar foi observado em 7 dos 10 cães (70%) na necropsia no dia 4 para o grupo de tratamento T05 (isolato CRCoV NP787). Nenhum isolamento de vírus CRCoV foi obtido a partir de tecido pulmonar coletado no Dia de necropsia 14 para o grupo de tratamento T04 (isolato CRCoV Max) ou para o grupo de tratamento T06 (isolato CRCoV NP787).

[00133] Nenhum isolamento de vírus CRCoV foi observado a partir de lavagem pulmonar coletada de cães desafiados com placebo (salina). Isolamento positivo do vírus CRCoV a partir de lavagem pulmonar foi observado em 10 dos 10 cães (100%) na necropsia no dia 4 para o grupo de tratamento T03 (isolato CRCoV Max) e grupo de tratamento T05 (isolato CRCoV NP787). Nenhum isolamento de vírus CRCoV foi obtido a partir da lavagem pulmonar coletada na necropsia no dia 14 para o grupo de tratamento T04 (isolato CRCoV Max) ou grupo de tratamento T06 (isolato CRCoV NP787).

[00134] Nenhum isolamento de vírus CRCoV foi observado a partir da cavidade nasal coletada a partir dos cães provocados com placebo (solução salina). O isolamento de vírus CRCoV positivo a partir da cavidade nasal foi observado em 10 dos 10 cães (100%) na necropsia no dia 4 para o grupo de tratamento T03 (isolato CRCoV Max) e o grupo de tratamento T05 (isolado CRCoV NP787). Nenhum isolamento de vírus CRCoV foi obtido a partir da cavidade nasal coletada na necropsia no dia 14 para o grupo de tratamento T04 (isolato CRCoV Max) ou grupo de tratamento T06 (isolato CRCoV NP787).

[00135] Nenhum isolamento de vírus CRCoV foi observado a partir da traqueia coletada a partir de cães provocados com placebo (solução salina). O isolamento de vírus CRCoV positivo a partir da traqueia foi observado em 10 dos 10 cães (100%) na necropsia no dia 4 para o grupo de tratamento T03 (isolato CRCoV Max) ou grupo de tratamento T05 (isolato CRCoV NP787). Nenhum isolamento de vírus CRCoV foi obtido a partir da traqueia coletada na necropsia no dia 14 para o grupo de tratamento T04 (isolato CRCoV Max) e para o grupo de tratamento T06 (isolato CRCoV NP787).

[00136] Ambos os isolados de provocação (CRCoV Max e CRCoV NP787) foram isolados com sucesso a partir do pulmão, cavidade nasal e traqueia coletados na necropsia no Dia 4. Nenhum isolamento de vírus CRCoV foi obtido a partir do pulmão, lavagem pulmonar, cavidade nasal e traqueia coletados na necropsia no Dia 14 para ambos os isolados de provocação (CRCoV Max e CRCoV NP787). Conclusão, o pulmão, lavagem pulmonar, cavidade nasal e traqueia coletados du-rante a fase mais precoce de infecção pareceram mais prováveis de resultar em isolamento de vírus CRCoV positivo.

[00137] Nenhuma mudança patológica clinicamente significativa foi observada no epitélio ciliado do tecido pulmonar. A maior parte dos cães em todos os grupos de tratamento foram classificados em grau 0. Um único cão no grupo de tratamento T03 (isolato CRCoV Max) na necropsia no Dia 4 foi classificado em grau 1.

[00138] Nenhuma mudança patológica clinicamente significativa foi observada no epitélio ciliado da cavidade nasal para os grupos de tratamento T01 e T02 (solução salina) na necropsia nos dias 4 e 14, respectivamente. Para o grupo de tratamento T03 (isolato CRCoV Max) na necropsia no Dia 4, todos os 10 cães exibiram patologia grau 2 ou superior. Para o grupo de tratamento T04 (isolato CRCoV Max) na necropsia no Dia 14, 6 dos 10 cães (60%) exibiram patologia grau 2 ou superior. Para o grupo de tratamento T05 (isolato CRCoV NP787) na necropsia no Dia 4, 9 dos 10 cães (90%) exibiram patologia grau 2 ou superior. Para o grupo de tratamento T06 (isolato CRCoV NP787) na necropsia no Dia 14, 7 dos 10 cães (70%) exibiram patologia grau 2.

[00139] Nenhuma mudança patológica clinicamente significativa foi observada no epitélio ciliado da traqueia para os grupos de tratamento T01 e T02 (solução salina) na necropsia nos Dias 4 e 14, respectivamente. Para o grupo de tratamento T03 (isolato CRCoV Max) na necropsia no Dia 4, 7 dos 10 cães (70%) exibiram patologia grau 2 ou superior. Para o grupo de tratamento T04 (isolato CRCoV Max) na necropsia no Dia 14, todos os 10 cães (100%) exibiram patologia grau 1. Para o grupo de tratamento T05 (isolato CRCoV NP787) na necropsia no Dia 4, todos os 10 cães (100%) exibiram patologia grau 2 ou superior. Para o grupo de tratamento T06 (isolato CRCoV NP787) na necropsia no Dia 14, todos os 10 cães (100%) exibiram patologia grau 1. Nenhuma mudança patológica de grau 2 ou superior foi observada no pulmão de animais provocados com ambos os isolados de provocação (CRCoV Max e CRCoV NP787). As mudanças patológicas de grau 2 ou superior no epitélio ciliado da cavidade nasal e traqueia foram observadas em animais provocados com ambos os isolados de provocação (CRCoV Max e CRCoV NP787). A maioria das mudanças patológicas (grau 2 ou superior) na cavidade nasal e na traqueia foi observada na necropsia no Dia 4. Conclusão, foi observado dano no epitélio ciliado na cavidade nasal e na traqueia de animais provocados com ambos os isolados (CRCoV Max e CRCoV NP787) e esses aspectos patológicos pareceram mais pronunciados durante a fase mais precoce de infecção (Dia 4 da necropsia).

[00140] O aspecto histopatológico mais proeminente foi inflamação multifocal do pulmão, cavidade nasal e traqueia, em diferentes graus.

[00141] Todos os cães tiveram resultado negativo (< 40 IFA) para anticorpos de CRCoV por ensaio de fluorescência indireta a partir de amostras de soro coletadas no Dia 4. Todos os cães provocados com placebo (solução salina) tiveram resultados negativos (< 40 IFA) para anticorpos CRCoV por ensaio de fluorescência indireta a partir de amostras de soro coletadas no Dia 14. Os cães no grupo de tratamento T04 (isolato CRCoV Max), na necropsia no Dia 14, tiveram 1040 titulações de anticorpo IFA de média geométrica a partir de amostras de soro coletadas. Os cães no grupo de tratamento T06 (isolado CRCoV NP787), na necropsia no dia 14, tiveram 1689 titulações de anticorpo IFA de média geométrica a partir de amostras de soro coletadas.

[00142] Todos os cães tiveram resultado negativo (titulação SN 3) para anticorpos neutralizantes de CRCoV por ensaio de neutralização em soro a partir de amostras de soro coletadas no Dia 4. Todos os cães provocados com placebo (solução salina) tiveram resultados negativos (titulação SN 3) para anticorpos neutralizantes de CRCoV por ensaio de neutralização de soro a partir de amostras de soro coletadas no Dia 14. Os cães no grupo de tratamento T04 (isolato CRCoV Max), na necropsia no dia 14, tiveram 100 titulações de anticorpo SN de média geométrica a partir de amostras de soro coletadas. Os cães no grupo de tratamento T06 (isolato CRCoV NP787), na necropsia no Dia 14, tiveram 34 titulações de anticorpos SN de média geométrica a partir de amostras de soro coletadas.

[00143] Todos os cães tiveram resultado negativo para Bordetella bronchiseptica, Pasteurella sp, Staphylococcus intermedius e Streptococcus canis a partir de lavagem pulmonar e tecido pulmonar coletado em necropsia no Dia 4 ou no Dia 14. O Mycoplasma sp foi isolado a partir de lavagem pulmonar de 2 cães administrados com solução salina de placebo (grupos de tratamento T01 e T02). O Mycoplasma sp foi isolado de lavagem pulmonar de 3 cães administrados com isolato CRCoV Max (grupo de tratamento T03). O Mycoplasma sp foi também isolado a partir do isolado de tecido pulmonar de 1 cão administrado com isolato CRCoV Max (grupo de tratamento T03). Esses cães não tiveram indicação de pneumonia bacteriana na necropsia. Todos os cães tiveram resultado negativo para isolamento de vírus CRCoV a partir de aspirados nasais e orofaríngeos coletados no Dia 0 (antes da administração de provocação). Todos os cães tiveram resultados negativos para anticorpos de CRCoV (IFA e SN) a partir de amostras de soro coletadas no Dia 0 (antes da administração de provocação). Todos os cães tiveram resultado negativo para anticorpos de CRCoV (IFA e SN) a partir de amostras de soro coletadas no Dia 0 (antes da administração de provocação). Todos os cães tiveram resultado nega-tivo para anticorpos CRCoV (IFA e SN) a partir de amostras de soro coletadas no Dia 0 (antes da administração de provocação). Todos os cães tiveram resultado negativo para Bordetella bronchiseptica a partir de aspirados nasais e orofaríngeos coletados no Dia 0 (antes da administração de provocação). Assim, os critérios de inclusão para o estudo foram alcançados.

[00144] Conclusões. Todos os cães provocados com isolato CRCoV Max tiveram resultado positivo para isolamento de vírus de aspirados nasais e orofaríngeos durante a fase pós-provocação. Todos os cães provocados com isolato CRCoV NP787 tiveram resultados positivos para isolamento de vírus de aspirados nasais, e 40 a 50% dos cães tiveram resultado positivo para isolamento de vírus de aspirados orofaríngeos durante a fase de pós-provocação. Então, esse estudo tem uma provocação válida.

[00145] Todos os cães provocados com isolato CRCoV Max tiveram resultado positivo para isolamento de vírus a partir do pulmão, lavagem pulmonar, cavidade nasal e traqueia na necropsia no Dia 4. Todos os cães provocados com isolato CRCoV NP787 tiveram resultado positivo para isolamento de vírus a partir da lavagem pulmonar, cavidade nasal, traqueia, e 70% dos cães com resultados positivos para isolamento de vírus a partir do pulmão na necropsia no Dia 4. Mais uma vez, isso confirma que esse estudo tem uma provocação válida.

[00146] A maior parte dos sinais clínicos pós-provocação para os animais administrados com isolato CRCoV Max (grupos de tratamento T03 e T04) e isolato CRCoV NP787 (grupos de tratamento T05 e T06) foi de suave a moderada, e incluiu corrimento nasal, tosse, espirro e corrimento ocular. Conjuntivite e hipertermia (> 39,5°C) nunca foram observadas, e um único cão apresentou depressão. Sinais clínicos e temperaturas timpânicas não pareceram ser suficientes para caracterizar e para medir a intensidade da doença induzida por CRCoV sob condições laboratoriais.

[00147] A média numericamente mais alta de dias de isolamento de CRCoV foi obtida a partir de aspirados coletados a partir da cavidade nasal usando o isolato CRCoV Max. Os aspirados nasais coletados durante a fase mais precoce de infecção pareceram mais prováveis de resultar em isolamento de vírus CRCoV positivo.

[00148] Ambos os isolados de provocação (CRCoV Max e CRCoV NP787) foram isolados com sucesso a partir do pulmão, lavagem pulmonar, cavidade nasal e traqueia coletados na necropsia no Dia 4. Nenhum isolamento de vírus CRCoV foi obtido a partir do pulmão, lavagem pulmonar, cavidade nasal e traqueia coletados na necropsia no Dia 14 para ambos os isolados de provocação (CRCoV Max e CRCoV NP787). Conclusão, amostras do pulmão, lavagem pulmonar, cavidade nasal e traqueia coletadas durante a fase mais precoce de infecção parecem mais prováveis de resultar em isolamento de vírus CRCoV positivo.

[00149] Nenhuma mudança patológica de grau 2 ou superior foi observada no pulmão de animais provocados com ambos os isolados de provocação (CRCoV Max e CRCoV NP787). Mudanças patológicas de grau 2 ou superior no epitélio ciliado da cavidade nasal e traqueia foram observadas em animais administrados com qualquer isolado de provocação (CRCoV Max e CRCoV NP787). A maior parte das mudanças patológicas (grau 2 ou superior) na cavidade nasal e na traqueia foi observada na necropsia no Dia 4. Conclusão, dano no epité- lio ciliado foi observado na cavidade nasal e na traqueia de animais provocados com os isolados (CRCoV Max e CRCoV NP787), e esses aspectos patológicos pareceram mais pronunciados durante a fase mais precoce de infecção (necropsia Dia 4).

[00150] Todos os cães tiveram resultados negativos para Bordetella bronchiseptica, Pasteurella sp, Staphylococcus intermedius e Streptococcus canis a partir de lavagem pulmonar e tecido pulmonar coletados ou no Dia 4 ou no Dia 14 da necropsia. Mycoplasma sp foi isolado dos pulmões (lavagem ou tecido) a partir de 6 cães; entretanto, nenhuma pneumonia bacteriana foi observada na necropsia. No geral, CRCoV foi o único patógeno isolado a partir do trato respiratório, e pa-rece ser responsável pelos sinais clínicos observados e histopatologia.

[00151] Conclusão, o isolato CRCoV Max ou o isolato CRCoV NP787, administrado por aerossolização, resultou em infecção viral e replicação viral no hospedeiro natural. CRCoV foi isolado de aspirados nasais, aspirados orofaríngeos, pulmão, lavagem pulmonar, cavidade nasal e traqueia de cães provocados. A maior parte dos sinais clínicos foi suave, e não relevante à caracterização da doença. Entretanto, o dano no epitélio ciliado da traqueia e cavidade nasal pareceu ser pa-râmetros consistentes usados para caracterizar a doença sob condições laboratoriais. O modelo de provocação de CRCoV e os isolados de provocação são adequados para uso em estudos de eficácia de vacinas para a fração CRCoV.

Exemplo 2. Desenvolvimento de modelo de infecção dupla por Coro- navírus Respiratório Canino (CRCoV) e Bordetella bronchiseptica.

[00152] Trinta cães, todos em boa saúde geral, foram incluídos no estudo. Todos os animais tiveram resultado negativo para anticorpos para CRCoV, como determinado por ensaio de anticorpo imunofluo- rescente (IFA) em titulação IFA < 40 em pré-triagem, e negativo (3 titulações SN) para anticorpos neutralizantes em soro para CRCoV antes da provocação de CRCoV (Dia 0). Todos os cães tiveram também resultado negativo para isolamento de CRCoV a partir de aspirados nasais antes da provocação de CRCoV (Dia 0). Nenhum animal foi vacinado contra Bordetella, e todos tiveram baixas titulações de anticorpo (titulação MAT < 16) para Bordetella como determinado pelo Teste de Microaglutinação (MAT) antes da provocação de Bordetella (Dia 3). Todos estavam também livres de Bordetella, como determinado por teste de isolamento de aspirado nasal bacteriano, antes da provocação de CRVoV (Dia 0).Tabela 2. Modelo de estudo

[00153] O isolado CRCoV, designado Max, foi usado como o material de provocação. O vírus foi propagado e titulado em células HRT18G, e determinado como tendo uma titulação de 107,1 TCID50/mL. A cepa Bihr cat de Bordetella bronchiseptica foi usada como o material de provocação.

[00154] Os animais foram observados ao menos uma vez ao dia a partir da chegada até o Dia -3. As amostras de sangue foram coletadas no Dia 0 antes da administração de provocação de CRCoV, e no Dia 3, antes da administração de provocação com Bordetella. As temperaturas timpânicas foram determinadas no Dia -2, Dia -1, e no Dia 0. Três tipos de aspirados nasais foram coletados a partir de cada cão antes do dia de provocação 0: um foi coletado em tubos de meio de transporte de frasco (VTM) para isolamento de vírus CRCoV; o segundo coletado em meio Amies para exame bacteriano; e o terceiro coletado em Caldo de Triptose Fosfato (TPB) para isolamento de Bordetel- la. Um conjunto adicional foi coletado no Dia 3 antes da administração de provocação de Bordetella, para isolamento de Bordetella. Os cães foram observados duas vezes ao dia no Dia -2, no Dia -1, e no Dia 0 (antes da administração de provocação), para sinais clínicos de doença respiratória para estabelecer os valores de base.

[00155] No Dia 0, aos cães no grupo de tratamento T01 foi administrada solução salina por aerossolização em uma câmara Plexiglass por aproximadamente 30 minutos. Também no Dia 0, aos cães no grupo de tratamento T03 foi administrado CRCoV por aerossolização em uma câmara Plexiglass por aproximadamente 30 minutos. No Dia 3, os cães nos grupos de tratamento T02 e T03 foram provocados com Bor- detella por aerossolização na câmara Plexiglass por 30 minutos.

[00156] As observações clínicas (aproximadamente 30 minutos) foram executadas uma vez no Dia 0, e então duas vezes ao dia (aproximadamente 30 minutos cada sessão) do Dia 1 ao Dia 23. No Dia 3, as observações foram executadas antes e após a provocação com Bordetella. No Dia 24, uma única observação foi executada. As temperaturas timpânicas foram determinadas diariamente após a provocação com CRCoV do Dia 0 ao Dia 24. Dois tipos de aspirados nasais foram coletados de cada cão após a administração de provocação: um coletado em tubos VTM para isolamento de vírus CRCoV do Dia 1 ao Dia 10; e o segundo coletado em Caldo de Triptose Fosfato (TPB) para isolamento de Bordetella, começando no Dia 6, isolando duas vezes por semana ou três semanas, e então no Dia 24. Outro conjunto de amostras de aspirado foi coletado antes da necropsia no Dia 24 em meio Amies, sem carvão, para exame bacteriano. Amostras de sangue (aproximadamente 6 mL) para sorologia foram coletadas em tubos SST no Dia 3, antes da provocação com Bordetella, e no Dia 24.

[00157] A necropsia foi executada no Dia 34 pós-provocação. Os cães foram eutanizados com uma superdose de barbiturato de sódio. Na necropsia, um pulmão completo foi assepticamente removido e colocado em um pano estéril. Para determinar a quantidade total de consolidação pulmonar, cada lobo pulmonar foi classificado separadamente. A traqueia foi transeccionada, e o lúmen avaliado quanto à patologia macroscópica. Todos os tecidos foram avaliados e classificados por um patologista veterinário certificado. Após os pulmões terem sido classificados, o lobo pulmonar caudal direito foi lavado por lavagem aproximadamente 30,0 mL de VTM (sem antibiótico ou antimicótico) via o plexo brônquico. O meio VTM foi lentamente aspirado de volta para a seringa enquanto massageando delicadamente o tecido pulmonar. Os fluidos lavados foram aliquotados e testados quanto à bacteriologia, bem como quanto ao isolamento de vírus CRCoV. As amostras de tecido foram coletadas a partir da traqueia, cavidade nasal (incluindo a seção ciliada), e o lobo cranial direito. Dois conjuntos de amostras de tecido foram coletados a partir da traqueia e da cavidade nasal. Um conjunto foi testado quanto ao isolamento de vírus CRCoV, e o outro conjunto preparado para histopatologia. Dois conjuntos de amostras de tecido foram coletados a partir do lobo pulmonar cranial direito. O primeiro conjunto foi testado quanto à bacteriologia, e o segundo conjunto foi testado quanto ao isolamento de vírus CRCoV. Um conjunto de amostras de tecidos, coletadas a partir do lobo pulmonar intermediário esquerdo, foi preparado para histopatologia.

[00158] Aspirados nasais, para isolamento de Bordetella, foram coletados no Dia 0 antes de provocação com CRCoV, no Dia 3, antes da provocação com Bordetella, começando no Dia 6 e isolando duas vezes por semana por três semanas, e no Dia 24. Dois aspirados Cal- giswab foram usados por cão, um aspirado por cada narina. O sangue para sorologia (CRCoV by IFA / SN, e Bordetella por MAT) foi coletado antes da provocação com CRCoV (Dia 0), antes da provocação com Bordetella (Dia 3), e no fim do estudo (Dia 24). Aproximadamente 6 mL de sangue foram coletados a partir de cada cão em cada ponto no tempo. O soro foi separado a partir do sangue integral, e decantado em dois criofrascos. Aspirados Dacron estéreis foram usados para coleta de aspirado nasal para isolamento de vírus. Os aspirados foram coletados no Dia 0 antes da provocação com CRCoV, no Dia 3, antes da provocação com Bordetella, e do Dia 1 ao Dia 10. Um aspirado foi delicadamente inserido em cada narina (um aspirado por cão) e então colocado em tubos de coleta estéreis contendo aproximadamente 3 mL de Meio de Transporte Viral (VTM suplementado com antibióticos). Os aspirados nasais foram coletados de cada cão no Dia 0 (antes da administração de provocação) e no Dia 24 (antes da necropsia). Os aspirados foram colocados em meio de transporte Amies sem carvão.

[00159] Para o ensaio de anticorpo para Bordetella, anticorpos de aglutinação para Bordetella foram determinados pelo Teste de (Mi- cro)Aglutinação (MAT) de Antígeno Particulado. Em resumo, duas diluições seriais de soro de teste, soro positivo conhecido, soro negativo foram preparadas usando placa de microtitulação de fundo em "v", usando solução salina normal contendo tween 20 a 0,05% como o di- luente. As amostras de soro foram adicionadas como 50 μL por poço. 50 μL de antígeno para Bordetella foram adicionados a cada poço e misturados durante 60 segundos no misturador de placa de microtitu- lação. As placas foram incubadas a 37 ± 2°C por 2 horas e então por 20-48 horas a 2-8°C. As placas foram lidas visualmente em um visor espelhado. As titulações foram expressas como a recíproca da mais alta diluição mostrando aglutinação completa.

[00160] Para o ensaio de anticorpo fluorescente indireto de CRCoV, amostras de soro foram tituladas para anticorpos anti-CRCoV por IFA. Em resumo, células HRT-18G foram semeadas em placas com 96 poços e infectadas com uma quantidade ótima de CRCoV, para obter entre 50 e 200 células infectadas por poço. As placas infectadas foram fixadas com fixador à base de acetona, enxaguadas e armazenadas. As amostras de soro de teste foram serialmente diluídas 2 vezes dire-tamente nas placas fixadas por antígeno, e incubadas por 40 a 60 minutos. O soro de teste foi descartado, as placas foram enxaguadas, e conjugado FA de IgG anticanino de coelho foi adicionado e incubado por 40 a 60 minutos. Os poços foram então enxaguados e as placas foram examinadas quanto à fluorescência sob o microscópio. A titula ção de anticorpo foi determinada como a recíproca da mais alta diluição em soro típica (+1) ou fluorescência mais intensa.

[00161] Para o ensaio de neutralização em soro de CRCoV, as titulações do anticorpo neutralizante em soro de CRCoV foram determinadas em células HRT-18G. Em resumo, as células HRT-18G foram semeadas em placas de cultura de tecido com 96 poços na densidade apropriada e incubadas em uma incubadora de CO2 a 36°C ± 1 por 3 a 5 dias. Quando as monocamadas celulares nos poços foram 100% confluentes, os poços foram enxaguados com meio, e pré-tratados com meios suplementados com tripsina por ao menos 1 hora na incubadora. Duas diluições de cada soro de teste foram preparadas, e incubadas com 50-422 TCID50 CRCoV por 40 a 60 minutos em temperatura ambiente. As misturas de vírus-soro de cada diluição em soro foram inoculadas em dois poços. As placas foram incubadas em uma incubadora umidificada de CO2 (3-5% de CO2) a 35-37°C por 5 a 7 dias. Quando a incubação estava completa, as placas foram fixadas, coloridas com anticorpo conjugado a FITC específico de CRCoV, e examinadas sob um microscópio epifluorescente. A titulação de anticorpo neutralizante em soro foi determinada como a recíproca da mais alta diluição em soro que neutralizou o vírus em 50% dos poços.

[00162] Para isolamento de CRCoV, aspirados nasais, tecidos e amostras de lavagem pulmonar foram ensaiados quanto à presença de CRCoV em células HRT-18G. Em resumo, as amostras foram processadas e inoculadas em frascos semeados com células HRT-18G. As amostras nasais foram inoculadas em frascos T-25. Amostras de tecido e lavagem pulmonar foram inoculadas em frascos T-150. Os frascos inoculados foram incubados de um dia pra o outro em uma incubadora de CO2 a 36°C ± 1. Então, soro bovino fetal (FBS) foi adicionado a cada frasco (80 μL por frasco T-25 ou 500 μL por frasco T- 150). Os frascos foram incubados por aproximadamente 7 dias em uma incubadora de CO2 a 36°C ± 1. As amostras foram então coletadas e inoculadas em células HRT em placas com 96 poços. Quatro poços da placa foram inoculados com 120 μL/poço e mais 4 poços foram inoculados com 30 μL/poço. As placas com 96 poços foram incubadas por 5 a 7 dias em uma incubadora de CO2 a 36°C ± 1, e então fixadas com fixador à base de acetona, e então coloridas com CRCoV FA (todos os poços). A presença de vírus na amostra foi declarada quando a fluorescência típica (células FA-positivas de CRCoV) foi observada sob o microscópio.

[00163] Para titulação de vírus de provocação com CRCoV, a titulação do material de provocação foi determinada em HRT-18G. Em resumo, as células HRT-18G foram semeadas em placas de cultura de tecido com 96 poços na densidade apropriada, e incubadas em uma incubadora de CO2 a 36°C ± 1 por 3 a 5 dias. Quando a monocamada de célula foi 100% confluente, os poços foram enxaguados com meio, e pré-tratados com meio suplementado com tripsina por 1 hora na in-cubadora de CO2. A amostra de teste diluída serialmente dez vezes foi inoculada nos poços em 6 replicados por diluição. As placas foram incubadas em uma incubadora umidificada de CO2 (3-5% de CO2) por 5 a 7 dias a 35-37°C. Após incubação, o meio foi descartado, e as células foram incubadas por 20 a 40 minutos com fixador à base de acetona em temperatura ambiente. O fixador foi descartado, e as placas foram enxaguadas duas vezes com água. O anticorpo conjugado a FITC para CRCoV foi adicionado aos poços, e incubado por 40 a 60 minutos em temperatura ambiente. Quando a incubação estava completa, os poços foram enxaguados duas vezes com água antes de as placas serem observadas sob um microscópio epifluorescente quanto à presença de células infectadas com CRCoV. O ponto final a 50% para a infectividade foi calculado usando o método de Spearman-Karber e a titulação de vírus foi expressada como log10 TCID50/mL.

[00164] Amostras de aspirados nasais, tecido pulmonar e de lavagem pulmonar foram avaliadas quanto à presença de Bordetella bron- chiseptica, Mycoplasma sp., Streptococcus canis, Staphylococcus in- termedius, e Pasteurella sp. de acordo com procedimentos padrão.

[00165] Lâminas para tecidos da cavidade nasal, pulmão e traqueia foram preparadas, e avaliadas quanto a lesões histopatológicas por um patologista certificado.

[00166] Os critérios para um teste válido são que todos os animais no estudo precisam ser: (i) isentos de CRCoV por isolamento do vírus no Dia 0; (ii) soronegativos para CRCoV no Dia 0; (iii) isentos de Bor- detella nos Dias 0 e 3 (antes da provocação com Bordetella) por isolamento bacteriano a partir de aspirados nasais; e (iv) susceptíveis à Bordetella antes da provocação, como determinado pela titulação de anticorpo MAT permanecendo < 16 no Dia 0. Sinais clínicos respiratórios, incluindo tosse, foram os critérios principais usados para julgar a extensão da doença. O isolamento bacteriano foi a variável secundária de suporte.

[00167] Distribuições de frequência de observações clínicas (corrimento nasal, tosse, espirro, corrimento ocular, ânsia de vômito, depressão e respiração) foram calculadas para cada ponto no tempo e tratamento. O número e a porcentagem de períodos de observação pós-provocação que um animal teve um sinal clínico particular (corrimento nasal, tosse, espirro, corrimento ocular, ânsia de vômito, de-pressão e respiração), e o número de dias pós-provocação com um sinal clínico particular (corrimento nasal, tosse, espirro, corrimento ocular, ânsia de vômito, depressão e respiração), foram calculados para cada animal. Estatísticas descritivas para os períodos de tempo percentuais com sinais clínicos, e a duração de cada sinal clínico, incluindo a média, mediana, desvio padrão, mínimo e máximo, foram calculadas para cada tratamento. Os animais foram classificados como tendo uma febre (> 39,5°C) ou não tendo uma febre (< 39,5°C) em cada dia. As distribuições de frequência de febre/sem febre foram calculadas para cada tratamento e ponto no tempo. As distribuições de frequência da presença ou ausência de isolamento de CRCoV a partir de aspirados nasais foram calculadas para cada grupo de tratamento e ponto no tempo. O número de dias que um animal teve CRCoV detectado nos aspirados nasais pós-provocação (vírus no primeiro dia detectado até vírus no último dia detectado) foi calculado para cada animal. Os meios de tratamento, médias, desvio padrão, mínimos e máximos foram calculados. As distribuições de frequência da presen- ça/ausência de isolamento de vírus a partir de lavagem pulmonar, pulmões, cavidade nasal, e traqueia foram calculadas para cada grupo de tratamento. As distribuições de frequência de isolamento bacteriano (positivo/negativo) foram calculadas para cada tratamento e ponto no tempo. Foi também determinado para cada animal se ou não ele teve bactéria isolada pós-provocação, e uma distribuição de frequência dessa foi calculada para cada tratamento. As distribuições de frequência de cada tipo de escore histopatologia para a traqueia, cavidade nasal, e lobo pulmonar intermediário esquerdo, foram calculadas para cada grupo de tratamento. Em adição, a avaliação dos cílios traqueais foi ainda classificada como normal/não histologicamente relevante (0 e 1), ou anormal/histologicamente relevante (2, 3 e 4), e as distribuições de frequência dessa foram calculadas para cada tratamento.

[00168] O envolvimento do pulmão total, discreto e difuso foi calculado com a seguinte equação:

[00169] Envolvimento percentual = 0,53 [(0,35 x lobo cranial direito) + (0,15 x lobo intermediário direito) + (0,40 x lobo caudal direito) + (0,10 x lobo acessório)] + 0,47 [(0,30 x lobo cranial esquerdo) + (0,25 x lobo intermediário esquerdo) + (0,45 x lobo caudal esquerdo)]

[00170] As estatísticas descritivas incluindo a média, mediana, des- vio padrão, mínimo e máximo foram calculadas para cada tratamento e tipo de envolvimento do pulmão. As distribuições de frequência da presença de lesões macroscópicas, descoloração e secreções aumentadas foram calculadas para cada grupo de tratamento. A média geométrica de tratamento, mínimo e máximo das titulações de anticorpos foram calculados para cada ponto no tempo. As distribuições de frequência da presença/ausência de Bordetella foram calculadas para cada grupo de tratamento e ponto no tempo.

[00171] Resultados. Todos os cães tiverem resultados negativos (titulação IFA < 40) para anticorpos de CRCoV por ensaio fluorescente indireto, e negativos (titulação SN 3) para anticorpos de CRCoV por ensaio de neutralização em soro a partir de amostras de soro coletadas no Dia 0 (antes da provocação). Todos os cães tiveram resultados negativos para CRCoV por isolamento do vírus a partir de amostras de aspirado nasal coletadas no Dia 0 (antes da provocação). Todos os cães tiveram resultado negativo para anticorpos de Bordetella (< 16) por teste de microaglutinação a partir de amostras de soro coletadas no Dia -21 e no Dia 0 (antes da provocação). Todos os cães tiveram resultado negativo para Bordetella e Pasteurella sp. A partir de aspirados nasais coletados antes da administração de provocação (Dia 0). Mycoplasma sp., Staphylococcus pseudintermedius e Streptococcus canis foram isolados a partir de aspirados nasais em diferentes níveis no Dia 0. (Esses variaram entre 0 e 80%, com porcentagens para S. pseudintermedius sendo as mais altas, em 50-80%). Entretanto, cães saudáveis frequentemente detêm esses micro-organismos como parte de sua flora normal no trato respiratório superior. Assim, os critérios de inclusão foram alcançados.

[00172] As titulações conduzidas em amostras de provocação com CRCoV coletadas durante a provocação confirmaram que 104,5 TCID50 foi aerossolizado por cão na câmara. A contagem em placa executada no início e no fim da inoculação de provocação confirmou que uma média de 5 x 108 CFU Bordetella foram aerossolizados por cão na câmara.

[00173] As temperaturas timpânicas pós-provocação foram normais (< 39,4°C) para todos os grupos de tratamento. A média, desvio padrão, mediana, mínimo e máximo foram calculados para cada sinal clínico individual (corrimento nasal, tosse, espirro, corrimento ocular, ânsia de vômito, depressão e respiração) para determinar se houve qualquer diferença entre o grupo de tratamento T02 (Bordetella) e o grupo de tratamento T03 (CRCoV e Bordetella). Houve um aumento nos períodos de tempo percentuais com corrimento nasal para os cães no grupo de tratamento T03 (CRCoV e Bordetella, média = 38,3) comparado com os cães no grupo de tratamento T02 (Bordetella, média = 7,2). Houve também um aumento nos períodos de tempo percentuais com corrimento ocular para os cães no grupo de tratamento T03 (CRCoV e Bordetella, média 25,1) comparado com os cães no grupo de tratamento T02 (Bordetella, média = 9,6).

[00174] Todos os cães no grupo de tratamento T01 (placebo, solução salina), grupo de tratamento T02 (Bordetella), e grupo de tratamento T03 (CRCoV e Bordetella) tiveram resultados negativos (titulação IFA < 40) para os anticorpos de CRCoV por ensaio fluorescente indireto, e negativos (titulação SN 3) para os anticorpos de CRCoV por ensaio de neutralização em soro a partir de amostras de soro coletadas no Dia 3. Todos os cães no grupo de tratamento T01 (placebo, solução salina) e no grupo de tratamento T02 (Bordetella) tiveram resultado negativo (titulação IFA < 40) para os anticorpos de CRCoV por ensaio fluorescente indireto, e negativos (titulação SN 3) para anticorpos de CRCoV por ensaio de neutralização em soro a partir de amostras de soro coletadas no Dia 24. Todos os cães no grupo de trata-mento T03 (CRCoV e Bordetella) tiveram resultados positivos para an- ticorpos de CRCoV por ensaio fluorescente indireto (média geométrica da titulação IFA = 3151,7), e positivos para anticorpos de CRCoV por ensaio de neutralização em soro (média geométrica de titulação SN = 361,8) a partir de amostras de soro coletadas no Dia 24.

[00175] Todos os cães no grupo de tratamento T01 (placebo, solução salina), grupo de tratamento T02 (Bordetella), e grupo de tratamento T03 (CRCoV e Bordetella) tiveram resultados negativos para anticorpos de Bordetella (< 8) por MAT a partir de amostras de soro coletadas no Dia 3. Todos os cães no grupo de tratamento T01 (Placebo, Solução salina) tiveram resultados negativos para anticorpos de Bordetella (8) por MAT a partir de amostras de soro coletadas no Dia 24. A maior parte dos cães (8 dos 10) no grupo de tratamento T02 (Bordetella), e todos os cães no grupo de tratamento T03 (CRCoV e Bordetella), tiveram anticorpos de Bordetella (16) por MAT (média geométrica da titulação MAT para T02 e T03 = 13,9) a partir de amostras de soro coletadas no Dia 24.

[00176] O número médio de dias de isolamento de vírus CRCoV a partir de aspirados nasais foi 0 para o grupo de tratamento T01 (placebo, solução salina), 0 para o grupo de tratamento T02 (Bordetella), e 6 para o grupo de tratamento T03 (CRCoV e Bordetella). CRCoV não foi isolado a partir da lavagem pulmonar, tecido do pulmão, cavidade nasal, ou traqueia na necropsia no Dia 24 a partir de qualquer um dos grupos de tratamento.

[00177] Bordetella foi isolada a partir de aspirados nasais coletados nos Dias 6, 9, 13, 16, 20, 23 e 24 a partir do grupo de tratamento T02 (Bordetella) e grupo de tratamento T03 (CRCoV e Bordetella). Todos os cães no grupo de tratamento T01 (placebo, solução salina) tiveram resultados negativos para isolamento de Bordetella a partir da lavagem pulmonar e tecido pulmonar coletados no Dia 24. Todos os cães no grupo de tratamento T02 (Bordetella) e no grupo de tratamento T03 (CRCoV e Bordetella) tiveram resultados positivos para Bordetella a partir da lavagem pulmonar e tecido pulmonar coletados no Dia 24. Todos os cães no grupo de tratamento T02 (Bordetella) e no grupo de tratamento T03 (CRCoV e Bordetella) tiveram resultados positivos para Bordetella a partir da lavagem pulmonar e tecido pulmonar coletados no Dia 24. Mycoplasma sp., Staphylococcus pseudintermedius e Streptococcus canis foram isolados a partir de aspirados nasais em diferentes níveis no Dia 24. Todos os cães no grupo de tratamento T01 (placebo, solução salina), grupo de tratamento T02 (Bordetella) e no grupo de tratamento T03 (CRCoV e Bordetella) tiveram resultados negativos para Pasteurella sp. no Dia 24. Um único cão no grupo de tratamento T03 (CRCoV e Bordetella) teve Mycoplasma sp. isolado a partir da lavagem pulmonar. Todos os cães no grupo de tratamento T01 (placebo, solução salina), grupo de tratamento T02 (Bordetella) e no grupo de tratamento T03 (CRCoV e Bordetella) tiveram resultados negativos para Pasteurella sp., Staphylococcus pseudintermedius, e Streptococcus canis a partir da lavagem pulmonar e a partir do tecido pulmonar na necropsia no Dia 24.

[00178] Os animais provocados com CRCoV e Bordetella (grupo de tratamento T03) tiveram uma incidência e gravidade mais altas em lesões pulmonares macroscópicas e microscópicas do que os animais provocados somente com Bordetella (grupo de tratamento T02) e os animais provocados com solução salina (placebo) (grupo de tratamento T01). As lesões traqueais e nasais microscópicas tiveram similar prevalência e gravidade nos grupos de tratamento T02 e T03. A incidência e a gravidade de lesões pulmonares observadas em animais com provocação dupla sugeriram que a infecção com CRCoV predispõe os cães a desenvolverem pneumonia após a infecção com Borde- tella. Entretanto, esses dados têm que ser correlacionados com análises bacterianas e virais bem como com a apresentação de sinais clíni-cos em animais infectados.

[00179] Conclusões. Os critérios de inclusão foram alcançados, pelo fato de que: (i) todos os cães estavam saudáveis e não receberam quaisquer vacinações para Bordetella; (ii) todos os cães tiveram resultados negativos para anticorpos para CRCoV (titulação IFA < 40), e negativos (titulação SN 3) para anticorpos neutralizantes de soro para CRCoV antes da provocação; (iii) todos os cães tiveram resultados negativos para isolamento de CRCoV a partir de aspirados nasais antes da provocação; e (iv) todos os cães tiveram baixas titulações de anticorpos (titulação MAT < 8) para Bordetella, e estavam isentos de isolamento de Bordetella a partir de aspirados nasais antes da provocação. As provocações foram consideradas satisfatórias, uma vez que: (i) todos os cães provocados com CRCoV tiveram resultados positivos para isolamento de vírus CRCoV a partir de aspirados nasais (Dia 24); e (ii) todos os cães provocados com Bordetella tiveram resultados positivos para o isolamento das bactérias a partir dos aspirados nasais (Dia 9).

[00180] As temperaturas timpânicas pós-provocação foram normais (< 39,4°C) para os grupos de tratamento T01 (placebo, solução salina), T02 (Bordetella) e T03 (CRCoV e Bordetella). Com relação aos sinais clínicos que foram atribuídos durante a fase pós-provocação (corrimento nasal, tosse, espirro, corrimento ocular, ânsia de vômito, depressão e respiração), aumentos foram observados nos períodos de tempo percentuais com corrimento nasal para os cães no grupo de tratamento T03 (CRCoV e Bordetella, média = 38,3) comparado com os cães no grupo de tratamento T02 (Bordetella, média = 7,2), e nos períodos de tempo percentuais com corrimento ocular para os cães no grupo de tratamento T03 (CFCoV e Bordetella, média = 25,1) comparado com os cães no grupo de tratamento T02 (Bordetella, média = 9,6). Os outros sinais clínicos (tosse, espirro, ânsia de vômito, depres- são, e respiração) não pareceram ser diferentes quando comparando o grupo de tratamento T02 (Bordetella) ao grupo de tratamento T03 (CRCoV e Bordetella).

[00181] Todos os cães nos grupos de tratamento T02 (Bordetella) e T03 (CRCoV e Bordetella) tiveram resultados positivos para Bordetella a partir de lavagens pulmonares, e do tecido pulmonar coletado no fim do estudo (Dia 24). CRCoV não foi isolado a partir de amostras de lavagens pulmonares, tecido pulmonar, cavidade nasal ou traqueal do grupo de tratamento T03 (CRCoV e Bordetella) coletados no fim no estudo (Dia 24). Estudos internos anteriores demonstraram que CRCoV é mais prontamente isolado de lavagem pulmonar e tecido pulmonar dentro da primeira semana pós-provocação. Todos os cães no grupo de tratamento T01 (placebo, solução salina), T02 (Bordetella) e T03 (CRCoV e Bordetella) tiveram resultados negativos para Pasteu- rella sp., Staphylococcus pseudintermedius, Mycoplasma sp. (exceto por um cão do grupo de tratamento T03) e Streptococcus canis a partir da lavagem pulmonar e tecido pulmonar coletados no fim do estudo (Dia 24). As médias de consolidação pulmonar total, difusa e discreta foram mais altas para os animais provocados com CRCoV e Bordetella (grupo de tratamento T03). A incidência e a gravidade das lesões pulmonares observadas nesses animais sugeriram que a infecção com CRCoV predispõe os cães a desenvolver pneumonia após a infecção com Bordetella.

[00182] No geral, o corrimento nasal/ocular e os dados da necropsia parecem indicar que a pré-infecção de cães com CRCoV aumenta a incidência e a gravidade de doença respiratória mediante uma infecção secundária por Bordetella.

Exemplo 3. Eficácia de uma Vacina para CRCoV contra Provocação Dupla com CRCoV e Bordetella bronchiseptica.

[00183] Sessenta cães, todos com boa saúde geral, foram incluídos no estudo. Nenhum animal recebeu vacinação para Bordetella, e como determinado pelo Teste de MicroAglutinação (MAT), todos tiveram baixos níveis de anticorpos (titulação MAT < 8) para Bordetella bronchi- septica antes da vacinação (Dia 0). Todos os animais também estavam isentos de B. bronchiseptica, como determinado por um teste de isolamento de aspirado nasal bacteriano antes da vacinação (Dia 0). Todos os cães tiveram também resultados negativos para anticorpos contra CRCoV como determinado por ensaio de anticorpo imunofluo- rescente (IFA) em titulação IFA < 40, bem como determinado por neutralização em soro (titulação SN < 11) antes da vacinação no Dia 0. Todos os cães foram confirmados isentos de CRCoV por isolamento de vírus de aspirado nasal antes da vacinação no Dia 0.Tabela 3. Modelo de estudo.1. Produto Veterinário Investigacional (IVP) ou Produto de controle (CP) - chamados juntos de IVP.2. Subcutaneamente

[00184] O isolado CRCoV, designado Max, foi usado como o material de provocação neste estudo. O estoque de vírus foi produzido na primeira passagem na linhagem de células HRT-18G com uma titulação de 107,1 TCID50/mL. A cepa Bihr cat de Bordetella bronchiseptica também foi usada como o material de provocação neste estudo.

[00185] Os animais foram observados quanto à saúde geral uma vez ao dia, da chegada até a provocação (Dias -7 a 42). Nos dias de vacinação (Dias 0 e 21), os animais foram observados duas vezes (antes e após a vacinação). Amostras de sangue para sorologia foram coletadas a partir de todos os animais no estudo nos Dias 0 e 21 (antes da vacinação), Dia 42 (antes da provocação), e no Dia 65. Três tipos de aspirados nasais foram coletados a partir de cada cão. Os aspirados nasais foram coletados em tubos de Meio de Transporte de Vírus (VTM) para isolamento de vírus CRCoV no Dia 0, antes da vacinação, Dia 42, antes da provocação, e uma vez ao dia do Dia 43 ao Dia 52. Aspirados nasais foram coletados em tubos contendo Caldo de Triptose Fosfato (TPB) para isolamento de Bordetella. Os aspirados foram coletados no Dia 0 antes da vacinação, Dia 45 antes da provo-cação, e duas vezes por semana por 3 semanas após a provocação e no Dia 65. Os aspirados nasais foram coletados em meio Amies sem carvão, para exame bacteriológico antes da provocação no Dia 42. As temperaturas timpânicas foram coletadas começando no Dia -1; antes e 3 a 6 horas após a vacinação nos Dias 0 e 21, Dias 1 a 7, e Dias 22 a 28. As temperaturas timpânicas foram coletadas uma vez ao dia do Dia 40 ao 65. Nos dias de provocação (Dias 42 e 45), duas coletas foram feitas, pré-provocação e 3 a 6 horas após a provocação.

[00186] Os animais foram examinados na região do ombro apropriada nos Dias 0 e 21 antes da vacinação, para assegurar que não há lesões preexistentes em áreas do sítio de injeção. Aos animais foi administrada a vacina nos Dias 0 e 21, de acordo com o modelo de estudo mostrado na Tabela 3. As vacinas foram administradas subcutane- amente a cada cão na região do ombro direito para a primeira vacina- ção, e na região do ombro esquerdo para a segunda vacinação. A potência da vacina para CRCoV foi determinada pelo teste ELISA antes da vacinação. Os animais foram observados aproximadamente 5 horas pós-vacinação nos Dias 0 e 21, e uma vez ao dia nos Dias 1 a 7 e 22 a 28. No Dia 42, os estoques de vírus de provocação CRCoV foram descongelados, e apropriadamente diluídos para preparar uma sus-pensão viral para entregar uma dose de provocação alvo de 1 x 106 por cão. Os materiais de provocação foram mantidos em gelo até a inoculação de provocação. No Dia 45, o estoque de cepa Bihr cat de B. bronchiseptica foi usado para preparar o material de provocação. Na etapa final da preparação de suspensão de provocação, a concentração de organismo foi ajustada para fornecer uma dose de provocação alvo de 103 CFU por cão (T01/T02), 105 CFU por cão (T03/T04), e 107 CFU por cão (T05/T06). Os materiais de provocação foram mantidos em gelo até a inoculação de provocação.

[00187] No Dia 42, aos cães a partir de todos os grupos de tratamento foi administrado o vírus por aerossolização em uma câmara Plexiglass. No Dia 45, os cães dos grupos de tratamento apropriados foram provocados com o nível atribuído de B. bronchiseptica, por ae- rossolização em uma câmara Plexiglass. Para o grupo de provocação T04, um animal foi removido a partir do estudo antes da provocação.

[00188] Os animais foram observados duas vezes ao dia (de manhã e à noite), por aproximadamente 30 minutos cada sessão, nos Dias 40, 41 e 42, antes da provocação, quanto aos sinais clínicos de doença respiratória. Observações clínicas foram executadas duas vezes ao dia (de manhã e à noite), aproximadamente 30 minutos cada sessão, do Dia 42 ao Dia 64. Nos Dias 42 e 45, as observações ocorreram antes da provocação, e 3 a 6 horas à administração pós-provocação. No Dia 65, somente uma observação (de manhã) foi executada. A necropsia foi executada em todos os animais no Dia 65 como parte da avaliação do estudo. Na necropsia, um pulmão completo foi assepti- camente removido e colocado em um pano estéril. Os lobos pulmonares foram avaliados macroscopicamente, e uma estimativa da porcentagem de volume de pulmão afetado foi avaliada. A avaliação do tecido foi executada por um patologista certificado por ACVP. Para determinar a porcentagem de volume de pulmão afetado, cada lobo pulmonar foi classificado quanto à porcentagem de tecido afetado por mudanças macroscópicas, que podem incluir, mas não estão limitadas à descoloração (mudança na cor), falha ao contrair, ou mudança na textura (firme/consolidado, elástico/borrachoso, duro, ou rugoso). As porcentagens de envolvimento por lesões discretas ou difusas foram estimadas. A traqueia foi transeccionada, e o lúmen avaliado quanto à patologia macroscópica. Dois tipos de amostras de tecido (seções) foram coletados a partir da traqueia e da cavidade nasal - uma para isolamento de vírus, outra para seção para histopatologia. O lobo pulmo-nar cranial direito foi dividido em duas seções, uma para isolamento de vírus e uma para uma amostra bacteriológica. O lobo pulmonar intermediário esquerdo integral foi assepticamente seccionado no plexo brônquico e coletado para histopatologia. Após todas as outras amostras (isolamento de vírus e bacteriologia) terem sido coletadas, o lobo foi inflado com aproximadamente 20 a 30 mL de formalina tamponada a 10% antes de ser colocado em um recipiente de formalina.

[00189] As amostras de soro foram tituladas quanto aos anticorpos específicos de CRCoV por IFA para triagem de animal, e por neutralização em soro (SN) para todas as outras amostras (Dias 0, 21, 42, e 65), de acordo com procedimentos padrão.

[00190] As amostras de soro de triagem foram tituladas quanto aos anticorpos para CRCoV por IFA. Em resumo, as células HRT-18G foram semeadas em placas com 96 poços, e infectadas com uma quantidade ótima de CRCoV para obter entre 50 e 200 células infectadas por poço. As placas infectadas foram fixadas com fixador à base de acetona, enxaguadas e armazenadas. As amostras de soro de teste foram diluídas serialmente duas vezes diretamente nas placas fixadas com antígeno, e incubadas por 40 a 60 minutos. O soro de teste foi descartado, as placas foram enxaguadas e o conjugado FA IgG anticanino de coelho foi adicionado e incubado por 40 a 60 minutos. Os poços foram então enxaguados, e as placas foram examinadas quanto à fluorescência sob o microscópio. A titulação de anticorpo foi determinada como a recíproca da mais alta diluição em soro exibindo fluorescência típica (+1) ou mais intensa.

[00191] As titulações de anticorpo neutralizante em soro para CRCoV foram determinadas em células HRT-18G. Em resumo, as células HRT-18G foram semeadas em placas de cultura de tecido com 96 poços na densidade apropriada e incubadas em uma incubadora de CO2 a 36°C ± 1 por 3 a 5 dias. Quando as monocamadas celulares nos poços foram 100% confluentes, os poços foram enxaguados com meio e pré-tratados com meio suplementado com tripsina por ao menos 1 hora na incubadora. Duas diluições de cada soro de teste foram preparadas e incubadas com 50-422 TCID50 CRCoV por 40 a 60 minutos em temperatura ambiente. As misturas de vírus-soro de cada diluição em soro foram inoculadas em dois poços. As placas foram incubadas em uma incubadora umidificada de CO2 (3 a 5% de CO2) a 35-37°C por 5 a 7 dias. Quando a incubação estava completa, as pla-cas foram fixadas, coloridas com anticorpo conjugado a FITC específico para CRCoV, e examinadas sob um microscópio epifluorescente. A titulação de anticorpo neutralizante em soro foi determinada como a recíproca da mais alta diluição em soro que neutralizou o vírus em 50% dos poços. Os anticorpos aglutinantes para B. bronchiseptica foram determinados pelo Teste de (Micro)Aglutinação de Antígeno Parti- culado (MAT), de acordo com o procedimento padrão. Em resumo, di luições em série duas vezes do soro de teste, soro positivo conhecido e soro negativo foram feitas em placas de microtitulação de fundo em v, usando solução salina normal contendo Tween 20 a 0,05% como o diluente. As amostras de soro foram adicionadas em 50 μL por poço. Um volume de 50 μL de antígeno para B. bronchiseptica foi adicionado a cada poço, e misturado por 60 segundos em um misturador de placa de microtitulação. As placas foram incubadas a 37 ± 2°C por 2 horas, e então as placas foram armazenadas por 20 a 48 horas a 2-8°C. As placas foram lidas visualmente em um visor espelhado. A titulação é expressa como a recíproca da mais alta diluição mostrando completa aglutinação. Aspirados nasais e tecidos foram ensaiados quanto à presença de CRCoV em células HRT-18G. Em resumo, as amostras foram processadas, e inoculadas em frascos semeados com células HRT-18G. As amostras nasais foram inoculadas em frascos T-25. As amostras de tecido e lavagem pulmonar foram inoculadas em frascos T-150. Os frascos inoculados foram incubados de um dia para o outro em uma incubadora de CO2 a 36°C ± 1. Então, soro bovino fetal (FBS) foi adicionado a cada frasco (80 μL por frasco T-25 ou 500 μL por frasco T-150). Os frascos foram incubados por aproximadamente 7 dias em uma incubadora de CO2 a 36°C ± 1. As amostras foram então obtidas e inoculadas em células HRT em placas com 96 poços. Quatro poços da placa foram inoculados com 120 μL/poço, e mais 4 poços foram inoculados com 30 μL/poço. As placas com 96 poços foram inoculadas por 5 a 7 dias em uma incubadora de CO2 a 36°C ± 1, fixadas com um fixador à base de acetona, e então coloridas com FA CRCoV (todos os poços). A presença de vírus na amostra foi declarada quanto à fluorescência típica (células positivas FA CRCoV) foi observada sob o microscópio.

[00192] A titulação do material de provocação foi determinada em HRT-18G. Em resumo, as células HRT-18G foram semeadas em pla- cas de cultura de tecido com 96 poços na densidade apropriada, e incubadas em uma incubadora de CO2 a 36°C ± 1 por 3 a 5 dias. Quando a monocamada celular foi 100% confluente, os poços foram enxaguados com meio, e pré-tratados com meio suplementado com tripsina por 1 hora na incubadora de CO2. A amostra de teste diluída serialmente dez vezes foi inoculada nos poços, em 6 replicados por diluição. As placas foram incubadas em uma incubadora umidificada de CO2 (35% de CO2) por 5 a 7 dias em 35-37°C. Após a incubação, o meio foi descartado, e as células foram incubadas por 20 a 40 minutos com fixador à base de acetona em temperatura ambiente. O fixador foi descartado, e as placas foram enxaguadas duas vezes com água. O anticorpo conjugado a FITC para CRCoV foi adicionado aos poços, e incubado por 40 a 60 minutos em temperatura ambiente. Quando a in-cubação estava completa, os poços foram enxaguados duas vezes com água antes de as placas serem observadas sob um microscópio epifluorescente quanto à presença de células infectadas com CRCoV. O ponto final a 50% para a infectividade foi calculado usando o método de Spearman-Karber, e a titulação do vírus foi expressa como log10 TCID50/mL.

[00193] O isolamento de Bordetella bronchiseptica a partir de aspirados nasais foi executado de acordo com procedimentos padrão. Cada amostra foi testada qualitativamente (presença ou ausência) quanto a B. bronchiseptica. Aspirados nasais e amostras de tecido de pulmão foram avaliados quanto à presença de B. bronchiseptica, Mycoplasma sp., Streptococcus canis, Staphylococcus intermedius, and Pasteurella sp. de acordo com procedimentos padrão. Lâminas para cavidade nasal, pulmão, e tecidos traqueais foram preparadas, e avaliadas quanto a lesões histopatológicas por um patologista certificado por ACVP.

[00194] A porcentagem de períodos de observação pós-provocação que um animal tossiu e teve corrimento nasal, bem como a duração de dias pós-provocação com tosse e corrimento nasal, foram calculadas para cada animal. A porcentagem transformada por raiz quadrada do arco seno de períodos de observação e duração foi analisada com um modelo misto linear geral separadamente para cada dose de provocação (T01 vs T02, T03 vs T04, e T05 vs T06). O efeito fixo no modelo foi tratamento, e os efeitos aleatórios foram bloqueio e residual. Em adição à média dos mínimos quadrados, erros padrão, e limites de confiança de 90%, os mínimos e máximos de tratamento foram calculados. A média dos mínimos quadrados, erros padrão, e limites de confiança foram transformados de volta como apropriado. As distribuições de frequência da presença ou ausência de isolamento de vírus CRCoV a partir de aspirados nasais foram calculadas para cada grupo de tratamento e ponto no tempo. O número de dias que um animal teve vírus CRCoV detectado nos aspirados nasais pós-provocação (vírus no primeiro dia detectado até vírus no último dia detectado) foi calculado para cada animal. As distribuições de frequência da presen- ça/ausência de isolamento de vírus a partir de dados de tecido foram calculadas para cada grupo de tratamento. As distribuições de frequência de isolamento de B. bronchiseptica a partir de aspirados foram calculadas para cada tratamento. As distribuições de frequência de isolamento e B. bronchiseptica a partir de aspirados nasais foram calculadas para cada tratamento e ponto no tempo. O número de dias que um animal teve bactéria detectada nos aspirados nasais pós- provocação (vírus no primeiro dia detectado até o vírus no último dia detectado) foi calculado para cada animal. Estatísticas descritivas do número de dias incluindo a média, desvio padrão, mínimo e máximo foram calculadas para cada tratamento. As distribuições de frequência de observações clínicas (espirro, corrimento ocular, ânsia de vômito, depressão e respiração) foram calculadas para cada ponto no tempo e tratamento. Os animais foram classificados como tendo uma febre (> 39,5°C) ou não tendo uma febre (< 39,5°C) em cada dia. As distribuições de frequência de febre/sem febre foram calculadas para cada tratamento e ponto no tempo.

[00195] O envolvimento do pulmão total, discreto e difuso foi calculado com a seguinte equação:

[00196] Envolvimento percentual = 0,53 [(0,35 x lobo cranial direito) + (0,15 x lobo intermediário direito) + (0,40 x lobo caudal direito) + (0,10 x lobo acessório)] + 0,47 [(0,30 x lobo cranial esquerdo) + (0,25 x lobo intermediário esquerdo) + (0,45 x lobo caudal esquerdo)].

[00197] O envolvimento de porcentagem transformada de raiz quadrada do arco seno foi analisado com um modelo misto linear geral separadamente para cada dose de provocação (T01 vs T02, T03 vs T04, e T05 vs T06). O efeito fixo no modelo foi tratamento, e os efeitos aleatórios foram bloqueio e residual. Em adição à média dos mínimos quadrados, erros padrão, e limites de confiança de 90%, os mínimos e máximos de tratamento foram também calculados. As médias de mínimos quadrados, erros padrão e limites de confiança foram transformados de volta. As distribuições de frequência de presença de lesões macroscópicas, descoloração e secreções aumentadas foram calculadas para cada grupo de tratamento. As distribuições de frequência de observações no sítio de injeção (inchaço e dor) foram calculadas para cada ponto no tempo e tratamento. As estatísticas descritivas, incluindo a média geométrica, mínimo e máximo das titulações de anticorpos, serão calculadas para cada grupo de tratamento e ponto no tempo.

[00198] Resultados. Não houve dor ou febre (> 39,5°C) relatadas em qualquer um dos cães após a vacinação. A maior parte dos vacinados (T02, T04, T06) foram relatados como tendo coceira no momento da vacinação. Inchaços na região da injeção foram relatados na maior parte dos vacinados, mas esses inchaços se resolveram para a maioria dos cães em 3 dias ou menos. Três cães foram relatados com reações de hipersensibilidade durante as 3-6 horas após a observação da 2a vacinação. Dois dos cães foram tratados com Difenidramina para reverter os sintomas.

[00199] A vacina para CRCoV induziu respostas de anticorpo neu- tralizante em soro nos cães vacinados após a primeira dose, indicando a imunização ativa. A média geométrica da resposta de neutralização em soro (SN) aumentou após a segunda vacinação para um GMT > 955 nos grupos vacinados (T02, T04, T06) comparado com < 4 nos grupos de controle com solução salina (T01, T03, T04), indicando efeito de reforço da vacina. Uma resposta SN anamnésica robusta (GMT > 11146) foi alcançada nos vacinados quando comparado com os controles com solução salina (GMT < 446) após provocação (Dia 65), indicando a resposta de memória imune eficaz.

[00200] A eficácia da vacina para CRCoV foi avaliada contra uma titulação de dose de provocação dupla. O nível de dose de provocação com CRCoV (confirmado em 105,5TCID50 / cão) foi mantido constante, enquanto a dose de provocação com B. bronchiseptica foi dada em um alvo mínimo de 103 CFU por cão (confirmado em 5,4 x 103) para os grupos T01 e T02, um alvo médio 105 (confirmado em 4,2 x 105) para os grupos T03 e T04, e um alvo máximo de 107 (confirmado em 4,3 x 107) para os grupos T05 e T06, para assegurar a indução de doença clínica ótima. Os dados de isolamento de organismo CRCoV e Borde- tella pós-provocação indicaram que a infecção foi alcançada em cães inoculados nos três níveis de dosagem. Entretanto, com base no nível de doença clínica induzido nos cães, como discutido abaixo, a menor dose de provocação com Bordetella foi determinada como a dose ótima para avaliar a eficácia da vacina. Os cães provocados com controle (solução salina) (T01, T03, e T05) exibiram uma ampla gama de sinais clínicos respiratórios, incluindo tosse. Os vacinados (T02) tiveram redução significativa na duração e períodos percentuais com tosse (valores-p 0,0470 e 0,0033, respectivamente), quando comparado com os controles (T01) no grupo de provocação com baixa dose. A média dos mínimos quadrados (LS) para a duração e a média LS transformada novamente para o período percentual com tosse no grupo de controle (T01) foram 10,8 e 14,7, comparado com 5,3 e 2,4 nos vacinados (T02), respectivamente. A tosse diminui entre os vacinados e controles à medida que a dose de provocação é aumentada, igualmente devido à superprovocação. Os dados de tosse indicam claramente que a vacina para CRCoV foi capaz de induzir imunidade suficiente para reduzir a tosse induzida por provocação dupla no grupo de dose de provocação ótima. Os dados de corrimento nasal mostraram que os vacinados (T02) reduziram significativamente o período percentual com corrimento nasal (média 4,6) quando comparado com os controles (média 17,4), com o valor-p 0,0299 no grupo de provocação de dose baixa. Como discutido para a tosse, a redução no corrimento nasal entre os vacinados e controles diminui à medida que uma dose de su- perprovocação é alcançada. Os dados de descarga nasal indicam claramente a eficácia da vacina contra o corrimento nasal no grupo de dose de provocação ótima. Um total de 5 cães foi relatado como tendo temperaturas de > 39,5°C para um dia cada durante o período pós- provocação - quatro a partir dos grupos de controle com solução salina, e um a partir de um grupo vacinado (T02; Dia 44). Enquanto os dados mostram menos animais com febre nos vacinados comparado com os controles na dose baixa, a febre não é conhecida como um critério consistente para CRCoV, Bordetella ou a provocação dupla. Então, ele não foi usado para julgar a eficácia da vacina.

[00201] A avaliação de necropsia macroscópica dos órgãos respiratórios foi executada por um patologista certificado por ACVP no Dia 65. O exame revelou que o aspecto de necropsia principal foi a consolidação pulmonar. Isso é consistente com os aspectos do estudo de pro- vocação dupla anterior. Então, a consolidação pulmonar foi usada como um critério para julgar a eficácia da vacina. Redução significativa de consolidação pulmonar discreta (percentual médio 0,9 vs. 4,02) e total (percentual médio 1,44 vs. 7,7) foi observada nos vacinados, quando comparado com os controles no grupo de provocação de dose baixa, valores-p 0,0457 e 0,093, respectivamente. Consistente com os sinais clínicos, a redução efetuada pela vacina diminui à medida que a dose de provocação é aumentada, e uma superprovocação é alcançada. É importante notar que não houve envolvimento por outros pató- genos respiratórios nos tecidos pulmonares, como confirmado pelos resultados de exame bacteriológico, isto é, lesões pulmonares relatadas foram especificamente os resultados da provocação dupla. Os dados sugerem que a infecção anterior com o vírus predispõe os cães impactando em suas defesas imunes inatas, levando à infecção bacte- riana mais invasiva. Um padrão típico de infecção por vírus-bactéria que ocorre frequentemente no campo que leva ao desenvolvimento de pneumonia em cães no complexo de doença respiratória canina (CIRD), ou em gado no complexo de doença respiratória bovina (BRDC), e possivelmente também em outras espécies de animais. Os dados obtidos nesse estudo indicam que a vacina foi capaz de proteger os cães reduzindo a ocorrência de broncopneumonia causada pela provocação dupla em cães vacinados, quando comparado com os controles na dose de provocação ótima.

[00202] Com base em análises patológicas macroscópicas e microscópicas, a vacinação com CRCoV protegeu claramente os cães reduzindo a incidência e a gravidade de broncopneumonia causada por provocação intranasal dupla controlada com 103 CFU de B. bron- chiseptica e 106 TCID50 de CRCoV. O efeito protetor é reduzido quando a dose de provocação com B. bronchiseptica é aumentada em 105 CPU ou mais, talvez devido à avassaladora resposta imune inata e adaptativa. Ademais, os aspectos patológicos correlacionados com a redução nos sinais clínicos respiratórios relatados nos cães vacinados.

[00203] Não houve vírus isolado a partir dos tecidos no Dia 65 (23 dias após a provocação com CRCoV) como esperado, devido à rápida natureza de desenvolvimento da infecção viral. A vacina protegeu os cães reduzindo a duração da descamação nasal nos vacinados (T02) quando comparado com os controles com solução salina (T01), indicando a capacidade da vacina de reduzir a infecção no grupo de dose de provocação ótima.

[00204] Em resumo, os dados de sinais clínicos (tosse, corrimento nasal) e lesões pulmonares (consolidação, histopatologia) obtidos a partir deste estudo demonstram inequivocamente a proteção conseguida a partir da vacina para CRCoV monovalente contra uma provocação dupla com CRCoV - B. bronchiseptica. Esses dados indicam coletivamente que a vacina para CRCoV monovalente foi capaz de induzir a imunidade de proteção nos cães vacinados que resultou em redução da doença respiratória (tosse, corrimento nasal) e pneumonia (consolidação pulmonar) causada por uma provocação dupla com CRCoV - B. bronchiseptica. Então, os dados fornecem prova da utilidade de uma vacina para CRCoV em reduzir a doença respiratória nos cães após uma infecção por CRCoV inicial, e subsequente infecção bacteriana.

Claims

1. Uso de um coronavírus respiratório canino (CRCoV), caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para tratar uma doença bacteriana em um cão, em que a doença bac- teriana é causada por Bordetella bronchiseptica.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda um ou mais imunó- genos adicionais.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o um ou mais imunógenos são selecionados dentre o grupo que consiste em vírus parainfluenza canina (CPIV), adenovírus-2 canino (CAV-2) e vírus influenza canina (CIV).

5. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o um ou mais imunógenos adicionais são selecionados dentre o grupo que consiste em vírus do destempero canino (CDV), parvovírus canino (CPV), coronavírus canino entérico (CCV), adenoví- rus canino, Leptospira serovars, particularmente, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, e Leptospira Bratislava, vírus do herpes canino, pneumovírus canino, organismos Leishmania, uma espécie Borrelia (spp.), espécie Mycoplasma, raiva, Ehrlichia canis, Bordetella bronchiseptica e qualquer combinação desses.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a composição consiste essencialmente em CRCoV e nenhum imunógeno adicional.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a composição tem uma duração de eficácia contra a doença bacteriana por um período de ao menos 6 meses.

8. Uso de um coronavírus respiratório canino (CRCoV), caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para proteger contra doença respiratória canina em um cão causada por infecções bacterianas, em que a infecção bacteriana é causada por Bordetella bronchiseptica.

9. Uso de um coronavírus respiratório canino (CRCoV), caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para proteger contra doença respiratória canina multifatorial em um cão causada por infecções mistas virais e bacterianas, em que a infecção bacteriana é causada por Bordetella bronchiseptica.

10. Uso de um coronavírus respiratório canino (CRCoV), caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição de vacina para aumentar a imunogenicidade de uma composição para prevenção de infecções bacterianas em um cão, em que a vacina compreende um antígeno bacteriano que é Bordetella bronchiseptica.