JP2013522209A - 二次病原体に起因する疾患から保護するための方法 - Google Patents

Abstract

一次病原体に対する抗原を含むワクチンを提供すること、および一次病原体に対する免疫学的に有効量のワクチンを動物に投与することを含む、二次病原体に起因する疾患から動物を保護するための方法

Description

関連出願の相互参照

本特許出願は、２０１０年３月１０日出願の米国仮特許出願６１／３１２，３８０号に基づく米国特許法第１１９条下での優先権を主張し、その開示内容は内容全体が参照され本明細書で援用される。

一次病原体に対するワクチン投与により、二次病原体すなわち日和見感染菌に起因する疾患から保護されることが見出された。例えば、二次病原体に対し免疫することによってイヌは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ（Ｓ．ｅｑｕｉ）等の二次病原体に起因する疾患から保護された。

Ｓ．ｅｑｕｉはイヌ感染性呼吸器疾患（ＣＩＲＤ）と関係づけられてきたが、ＣＩＲＤは主として飼い犬で発症する多因子性感染症と認識されてきた（Ｃｈａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ９５（２００３）：１４９−１５６）。しかしながらＳ．ｅｑｕｉは、無症状で健康な飼い犬以外の犬から単離され得ることが見出された。Ｓ．ｅｑｕｉは、他の病原体と組み合されて、ＣＩＲＤの重篤化のみに関与している。

イヌインフルエンザ（ＣＩＶ）は、ウマインフルエンザウイルスと相同性が高いＨ３Ｎ８ウイルスとして同定された。イヌインフルエンザは、一定の犬種において病原性の強いことが見出されている。例えば、それはフロリダ州ジャクソンビルの飼育場で数匹の競走犬グレーハウンドが死亡した集団発生の原因であることが分かっている。暴露されたイヌの１００％が感染するにも拘わらず、８０％だけに感染の臨床徴候が現れることが見出された。さらに、ＣＩＶに暴露されたイヌ数匹が肺炎の臨床徴候を有する急性疾患にかかるが、ほとんどのイヌは、１０から２１日間持続する咳嗽等の軽い症候群になるにすぎない。

発明者らは、Ｓ．ｅｑｕｉとＣＩＶの双方の重篤性がこれら病原体の同時感染によって高められることを見出した。

二次病原体に起因する疾患からイヌを保護する方法には、一次病原体に対するワクチンを投与することが含まれる。好ましい一実施態様において、保護すべきイヌをＣＩＶワクチンにより免疫し、それによってＳ．ｅｑｕｉ等の二次病原体に起因する疾患からイヌを保護する。結果として、イヌはＣＩＶとＳ．ｅｑｕｉの双方から保護される。

ＣＩＶ攻撃感染後の臨床スコアを、ＣＩＶ攻撃感染前２日から攻撃感染後１３日までの各処理群に対する平均臨床スコアにより図示する。研究３５日目に全てのイヌをＣＩＶに攻撃感染し、−２日目からＣＩＶ攻撃感染後１３日目まで臨床徴候を毎日モニターした。各処理群に対する平均臨床スコアを攻撃感染後の日数に対し示した。臨床スコアに関しては表４を参照。 攻撃感染後の経鼻ＣＩＶ排出を、攻撃感染後１日目から１０日目までの各日に鼻腔用綿棒で集めた分泌物（鼻腔スワッブ）を採取することによって各群に対し測定した平均ウイルス力価により図示する。群１、３および４のイヌの全てを研究３５日目にＣＩＶに攻撃感染した。仔イヌがＣＩＶに攻撃感染していないことを確認するために、攻撃感染の前日（−１日目）に鼻腔スワッブを採取した。１０日間（攻撃感染後１から１０日目）の各日に鼻腔スワッブを採取することによって攻撃感染したイヌにおいても経鼻ウイルス排出をモニターし、ＭＤＣＫ細胞の単一層上で滴定を実施した。Ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０／ｍＬとして表される、各処理群の平均ウイルス力価を算出し、攻撃感染後の日数に対し示した。 鼻腔スワッブおよび肺洗浄からのＳ．ｅｑｕｉの単離を、ＣＩＶ攻撃感染前日から攻撃感染後１４日目までの各群のイヌのＳ．ｅｑｕｉ陽性の％により図示する。［発明の詳細な説明］

本発明は、例えば他の病原体との同時感染等の危険な要因がないときは、臨床徴候を呈さない二次病原体に起因する疾患からイヌを保護するための方法に関する。同時感染等の場合、たとえどちらの病原体も単独では臨床徴候を呈さないとしても、二ついっしょになると、結果として病原性を高め臨床的に重要な疾患を引き起こす。

イヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）亜型Ｈ３Ｎ８は一定のイヌに急性呼吸器疾患を引き起こすかもしれない。発明者らは、イヌのＣＩＶとＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ． ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ（Ｓ．ｅｑｕｉ）による同時感染後の病原性を検討することによって、Ｓ．ｅｑｕｉがＣＩＶに起因する疾患を悪化させることを確定した。同様に発明者らは、Ｓ．ｅｑｕｉに単独感染したイヌは臨床徴候を呈さないが、ＣＩＶとＳ．ｅｑｕｉの双方に攻撃感染したときは活発な臨床疾患が観察されることを見出した。発明者らは次にＣＩＶワクチンによる免疫化が病原性ＣＩＶとＳ．ｅｑｕｉによる重複攻撃感染からイヌを保護することを見出した。意外なことにはＳ．ｅｑｕｉに起因する呼吸器疾患は、ＣＩＶに対するワクチンを投与することによって予防することができた。

Ｓ．ｅｑｕｉに単独攻撃感染したイヌは、如何なる臨床徴候、細菌排出または肺病変も示さなかった。ＣＩＶに単独攻撃感染したイヌは、いくつかの臨床徴候、ウイルス排出および肺病変の症状を呈した。臨床スコア、ＣＩＶおよび／またはＳ．ｅｑｕｉ排出、および肺スコアは、ＣＩＶまたはＳ．ｅｑｕｉに単独攻撃感染したイヌと比較したとき、ＣＩＶプラスＳ．ｅｑｕｉに攻撃感染したイヌでの方がかなり高かった。肺スコア、臨床スコアおよび細菌排出は、ＣＩＶに単独攻撃感染かまたはＣＩＶプラスＳ．ｅｑｕｉに攻撃感染した非ワクチン接種イヌと比較したとき、ＣＩＶプラスＳ．ｅｑｕｉに攻撃感染したＣＩＶワクチン接種イヌでの方が顕著に低かった。

本明細書で用いられる用語一次病原体とは、ある動物において疾患の臨床徴候を呈するかもしれないが、当該病原体に暴露された動物全てにおいて必ずしも検出可能なほどの発病度を呈さない病原体を意味する。
本明細書で用いられる用語二次病原体とは、動物が他の病原体に暴露されることによって衰弱させられるかまたは別な方法で衰弱した状態にあるのでなければ、病原体に暴露された動物において疾患の臨床徴候を呈しそうもない病原体を意味し、またしばしば日和見病原体とも呼ばれる。

単独では二次病原体であり疾患の臨床徴候を呈しそうもない病原体は、一または複数の他の二次病原体と共存するときに主病原体として働くことができる。
限定ではなく説明の目的で、本明細書で示す実施態様においてＣＩＶは一次病原体と、Ｓ．ｅｑｕｉは二次病原体と呼ぶことができよう。

イヌ気管支炎は多数のウイルス性および細菌性の病原体に起因するイヌの重要な疾患である。ＣＩＶおよびＳ．ｅｑｕｉは、イヌ呼吸器疾患症例、特に飼育場および動物保護施設のイヌから近年しばしば単離された２つの新規病原体である。

発明者らは、イヌにおけるＣＩＶとＳ．ｅｑｕｉによる重複感染の病原性を研究し、重複感染におけるＣＩＶワクチンの有効性を評価した。ＣＩＶに単独感染したイヌと違って、ＣＩＶプラスＳ．ｅｑｕｉに感染したイヌの大多数は長期間持続する臨床的な発熱、およびより重い臨床徴候、特に長期間持続する咳嗽を示した。重複攻撃感染したイヌにおける経鼻Ｓ．ｅｑｕｉ排出は、排出陽性のイヌの数および排出持続期間に関して非常に高い値を示した。さらに重複攻撃感染は、ＣＩＶ単独かまたはＳ．ｅｑｕｉ単独かと比較してかなり高い肺スコアを誘発した。発明者らは、Ｓ．ｅｑｕｉに単独攻撃感染したイヌが臨床的な発熱、呼吸器疾患の臨床徴候または肺病変を示さないことを見出した。さらにＳ．ｅｑｕｉは、Ｓ．ｅｑｕｉに単独攻撃感染したイヌの鼻腔分泌物に検出されなかった。発明者らは、Ｓ．ｅｑｕｉ単独では如何なる疾患も誘導することができないこと、Ｓ．ｅｑｕｉがＣＩＶの存在下で細菌性コロニー形成へと導く日和見感染菌であることを見出した。Ｓ．ｅｑｕｉは、ＣＩＶに起因する発熱、他の臨床徴候および関連する肺症状を悪化させる。発明者らは、ＣＩＶワクチン投与が、ＣＩＶ単独のみならずＣＩＶプラスＳ．ｅｑｕｉによって誘発される臨床徴候、ウイルス／細菌の排出および肺病変を軽減することを発見した。ＣＩＶに対するワクチン接種化は、ＣＩＶおよびＳ．ｅｑｕｉ等の日和見病原体に起因する呼吸器疾患を予防した。

攻撃感染用のＳ．ｅｑｕｉは、以下の実施例で使用する単離株等、感染動物から入手可能であり、またはＡＴＣＣから入手可能な単離株ＡＴＣＣ番号６５８０等、寄託機関から入手可能である。

例えば下記の実施例等における攻撃感染のために使用し得るイヌインフルエンザウイルス、および／または発明に従って投与用のワクチンを調製するためのイヌインフルエンザウイルスの例には、２００６年１０月１８日出願の米国特許出願１１／５８２，６５２号（出願公開ＵＳ ２００７／００９２５３７号）、２００６年１０月６日出願の米国特許出願１１／５４４，８４１号（出願公開ＵＳ ２００７／００８２０１２号）、２００６年１０月１９日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４１６１号、および２００７年１２月１４日出願の米国特許出願１１／９５６，６５８号に記載された任意のＨ３Ｎ８ウイルスが含まれ、それら全ては本明細書で参照され内容全体が援用される。

本発明のＣＩＶワクチンは、非病原性、弱毒化もしくは不活化ワクチンを有するか、または抗原性サブユニットを含む。非病原性および弱毒化ウイルスには、非病原性単離株、継代ウイルス、低温適応ウイルスおよび他の方法によって病原性の低下したもしくは非病原性となったウイルスはもちろん組換えウイルスも含まれることを意図している。ＣＩＶワクチンは、例えばＩｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｃ．／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、Ｅｌｋｈｏｒｎ、ＮＥから入手可能なＣＩＶワクチン、ＮＯＢＩＶＡＣ（登録商標）Ｃａｎｉｎｅ Ｆｌｕ Ｈ３Ｎ８等の市販のワクチンであってもよい。本発明に従って任意の有効なＣＩＶワクチンを使用することができよう。

本発明はさらにインフルエンザウイルス、例えばイヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）および他の疾患、例えば他のイヌ感染症に対する防御免疫を誘発する混合ワクチンを提供する。当該ワクチンは、非病原性、弱毒化もしくは／または不活化ワクチンもしくは／または細菌を有し、および／または抗原性サブユニットを含む。従って本発明は、例えば、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌアデノウイルス２型、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌコロナウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌニューモウイルス、および／またはＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ属血清型菌種（ｓｅｒｏｖａｒ）、例えばＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ ｓｅｒｏｖａｒ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、および／またはＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｐｏｍｏｎａに対する免疫を誘発するための病原体／免疫原等を含む、一または複数の他のイヌ病原体および／または免疫原と組み合わせた、例えば不活化ＣＩＶ Ｈ３Ｎ８等の一または複数のＣＩＶ菌株含む混合ワクチンを提供する。さらに本発明の混合ワクチンに添加可能なイヌの病原体／免疫原には、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ；Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒおよびＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ等のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ属生物体；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ｓｅｎｓｕ ｓｔｒｉｃｔｏ（ｓｓ）、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ｓｓ、Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ、およびＢ．ａｆｚｅｌｉｉを含むＢｏｒｒｅｌｉａ属菌種（ｓｐｐ．）ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属菌種（例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｙｎｏｓ）；狂犬病ウイルス；およびＥｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓが含まれる。特定の実施態様において本発明の混合ワクチンは、組合せ自由でイヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩ）および／またはイヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ２）および／またはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ（ＢＢ）および／またはイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、および／またはイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、および／またはイヌコロナウイルスと共にＣＩＰを含む。一当該実施態様においてワクチンはイヌインフルエンザウイルス、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａおよびイヌパラインフルエンザウイルスを含む。他の当該実施態様においてワクチンは、イヌインフルエンザウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス２型、イヌパルボウイルス、およびイヌパラインフルエンザウイルスを含む。特定の実施態様において本発明の混合ワクチンが一または複数のウイルスおよび／または細菌の株を含むときは、当該株は非病原性、弱毒化、および／または不活化株である。

本発明のワクチンは、非経口投与、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射、皮内注射、経口投与、鼻腔内投与、傷付処理およびそれらの組み合せを含む任意の経路によって投与できよう。本発明の好ましい一実施態様においてワクチンは筋肉内注射によって投与される。

本発明のワクチンは、アジュバントを含むこともまたはアジュバントを含まないことも可能である。本発明のワクチンに使用するアジュバントの例には、油と水の乳剤、および／または水酸化アルミニウムを含有するアジュバントが含まれる。後者の場合、市販の水酸化アルミニウム、例えばアルハイドロゲル（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、Ｆｒｅｄｅｉｋｓｓｕｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）およびリハイドロゲル（Ｒｅｈｅｉｓ Ｉｎｃ．）を使用することができる。油と水の乳剤は典型的には鉱物油または代謝可能な油（例えば、植物油、魚油）を含む。乳化剤として非イオン性の洗浄剤または界面活性剤を使用してもよい。乳化剤の例には、Ｔｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８０、Ａｒｌｅｃｅｌ８０／Ｔｗｅｅｎ８０、およびＭｏｎｔａｎｉｄｅｓ（Ｓｅｐｐｉｃ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）が含まれる。アジュバント乳剤の場合、一般的には容量の５〜２５％が油で容量の７５〜９５％が水性である。いくつかの実施態様において、アジュバント乳剤は容量の２０％が油で８０％が水性である。水酸化アルミニウムの容量は通常、水相の約５％から１５％である。いくつかの実施態様においては、Ｅｍｕｎａｄｅ（登録商標）がアジュバントである。

いくつかの実施態様に関して、ＩＳＣＯＭがアジュバントとして用いられてよい。ＩＳＣＯＭは免疫刺激複合体（Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ）の頭字語であり、その技術はＭｏｒｅｉｎらによって記載された（Ｎａｔｕｒｅ、３０８：４５７−４６０（１９８４））。ＩＳＣＯＭは２方法の中の１つによって簡便に形成できる。いくつかの実施態様において抗原は、ＩＳＣＯＭの形成の際にその構造に物理的に組み込まれる。他の実施態様において、ＩＳＣＯＭマトリックス（例えば、Ｉｓｃｏｎｏｖａから供給されるもの）は抗原を含有しないが、免疫化の前にエンドユーザに選択された抗原と混合される。混合後、抗原はＩＳＣＯＭマトリックスとともに溶液中に存在するが、物理的に構造の中に組み込まれていない。

以下の実施例は本発明を明瞭に理解するために提供される。実施例は説明するものにすぎず、なんら本発明の範囲または根本的な原理を制限するものではないことを了解されたい。特許請求の範囲内での本発明の種々の改変は、実施例および本明細書の記載から本発明が関係する技術分野の当業者にとって明白であろう。

諸言
７から８週令の総数３２匹のイヌを本研究において使用した。イヌ１０匹からなる１群を２の投与量のイヌインフルエンザＨ３Ｎ８不活化ウイルスワクチンに接種し、２１日間隔で投与した。ワクチン接種イヌを、ブースターワクチン接種の２週間後に病原性ＣＩＶおよびＳ．ｅｑｕｉに攻撃感染した。残りのイヌ３群は、ワクチン接種せず単独および重複攻撃感染後の病原性を評価するために使用した。イヌ６匹からなる１群をＣＩＶに単独攻撃感染し、もう一つのイヌ６匹からなる群をＳ．ｅｑｕｉに単独攻撃感染した。イヌ１０匹からなる１群をＣＩＶおよびＳ．ｅｑｕｉの双方に攻撃感染した。

全てのイヌは、その呼吸器疾患の臨床徴候およびウイルスおよび／または細菌排出に関しモニターした。ＣＩＶに対する抗体力価を測定するために、ワクチン接種した群からはワクチン接種前に、全ての群からは攻撃感染投与前および死体解剖時に血清試料を採取した。ＣＩＶ攻撃感染後１４日目（研究４９日目）にイヌを安楽死させ、その病変に関し肺を評価した。死体解剖時にＳ．ｅｑｕｉ単離のために肺洗浄試料を採取した。

群４の７〜８週令のイヌをワクチン接種するためにイヌインフルエンザＨ３Ｎ８不活化ウイルスワクチン（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｃ．、Ｅｌｋｈｏｒｎ、ＮＥ）の市販品を使用した。

群４の全てのイヌは最初のワクチン接種時にＣＩＶ血清陰性であり、群１、２および３の全てのイヌはＣＩＶ攻撃感染時にＣＩＶ血清陰性だった。

イヌを性別および同腹仔によって分類しコンピューター発生乱数を割り当てた。イヌを昇順で乱数によって分類し処理群に割り当てた。

群４のイヌ全１０匹に研究０日目および２１日目に、ＣＩＶワクチン１ｍＬ（製造番号２１９１０４）の皮下注射によってＣＩＶのワクチンを接種した。

臨床評価：臨床評価を実施し研究３３日目と３４日目（ＣＩＶ攻撃感染前の２日間）、およびＣＩＶ攻撃感染日（研究３５日目）に全てのイヌの体温を記録した。臨床所見は臨床評価ガイドに従って実施した。

試料採取：全てのイヌからＣＩＶ攻撃感染投与の前日（研究３４日目）に約５ｍＬの血液試料を採取した。またＣＩＶ排出を検出するために、群１、３および４のイヌの全てから研究３４日目に鼻腔スワッブも採取した。

イヌインフルエンザウイルス：３回の継代で集めたウイルス単離株ＣＩＶ１４−０６Ａ（イヌインフルエンザウイルス、ＣＩＶ１４−０６Ａ（Ｐ３）と呼ぶ）を攻撃感染ウイルスとして使用した。本ウイルスは元来イヌ呼吸器疾患に罹患したイヌから単離された。攻撃感染の日、凍結したウイルス含有液体を使用直前に解凍し、無菌で冷温のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、目的攻撃感染投与量７．５Ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０を含有するイヌ当たり２ｍＬの終容量まで希釈した。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ：細菌単離株は動物保護施設に収容されイヌ呼吸器病症候群により死亡したイヌから獲得した。細菌を単離し、純化しＳ．ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓと同定した。細菌をブレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ）で増殖し１Ｘ１０^９ｃｆｕ／ｍＬとなるまで希釈して攻撃感染物質を調製した。
攻撃感染投与
イヌインフルエンザウイルス：群１、３および４のイヌを３５日目にＣＩＶに攻撃感染した。攻撃感染を加えるために、イヌ４匹をプレキシグラスチャンバー内に収容し、約２５〜３０分間にわたってエアロゾルを発生するために攻撃感染ウイルス８ｍＬ（２ｍＬ／イヌ）を使用した。イヌはエアロゾルに合計４０分間暴露した。

Ｓ．ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ：群２、３および４のイヌを研究３８日目にＳ．ｅｑｕｉに攻撃感染した。ｍＬ当たりＳ．ｅｑｕｉを１ｘ１０^９ｃｆｕ含有する攻撃感染物質半ミリリットル（０．５ｍＬ）をイヌの全ての各鼻孔に鼻カニューレを使用して点滴した。
攻撃感染後のモニタリング
臨床徴候：攻撃感染後の１３日間毎日、各イヌについて直腸温を記録し臨床評価を実施した。
鼻腔スワッブの採取
イヌインフルエンザウイルス：ＣＩＶ排出を評価するために、攻撃感染の日から１０日間毎日、各イヌから鼻腔スワッブを採取した。鼻腔スワッブはウイルス輸送用培地に採取した。

Ｓ．ｅｑｕｉの単離：細菌単離のために、攻撃感染後死体解剖日まで３日に１度、細菌輸送用培地を使用して鼻腔スワッブを採取した。

採血：ＣＩＶに対する抗体力価を評価するために、死体解剖日に血液試料（約５〜１０ｍＬ）を採取した。
死体解剖／処分
群３のイヌ１匹（ＩＤはＣＡＵＥＬＷ）は重篤な呼吸困難のために研究４３日目（すなわちＣＩＶに攻撃感染後８日、Ｓ．ｅｑｕｉに攻撃感染後５日）に死亡した。当該イヌは死亡前の２日間、発熱、抑うつ状態、重篤な咳嗽および呼吸困難を示した。死体解剖により、肺葉と胸壁間の線維素性癒着、肺葉の硬化および微膿瘍で特徴付けられる重症肺炎であることが明らかになった。

群１のイヌ１匹（ＩＤはＣＡＵＥＬＺ）は研究４３および４４日目に発熱、重篤な咳嗽、抑うつ状態および呼吸困難を示した。それ故に研究獣医は４４日目（ＣＩＶ攻撃感染後９日）に当該イヌを安楽死させ死体解剖を実施した。肺病変は肺炎を暗示する硬化によって特徴付けられた。

攻撃感染後死体解剖所見および標本：残りのイヌの全てはＣＩＶ攻撃感染後１４日目に安楽死させた。迅速な肺評価を可能とするために、イヌは死後変化が始まる前、死体解剖の直前に安楽死させた。また細菌の単離のために新鮮な肺組織由来の肺洗浄液も採取した。
臨床評価ガイド
隔離室への入室の際に、臨床評価を実施する研究員は動物の態度を評価するためにざっと見渡して歩き、それから臨床所見を続けた。攻撃感染投与等の他の処置を行う前に、臨床所見は最初に各イヌに対し完了させた。各臨床徴候をスコア化するために以下のガイドラインを使用した。
鼻漏
０＝無
０．５＝漿液性排膿：希薄で清澄な液体が鼻孔から滴る。ここに記録されるためには、液体が鼻から流出していなければならない。
１＝粘液膿性排膿、軽度ないし中度：粘液と混ざった濁った液体が少なくとも鼻から口の中間まで流れる。
２＝粘液膿性排膿、重度：粘液が口を通り過ぎて流れる。
眼漏
０＝無：目頭、目尻中の少量の乾燥固化物質は眼漏とはみなさない。
０．５＝漿液性排膿：清澄な液体が少なくとも眼から少なくとも口の中間まで流れるように排膿される。
１＝粘液膿性排膿、軽度ないし中度：粘液と混ざった濁った液体が少なくとも眼から口の中間まで流れる。
２＝粘液膿性排膿、重度：液体または粘液が鼻の中間まで流れるかまたは眼を縁取り、目頭または目尻で髪をびしょ濡れにする。
咳嗽
０＝無
０．５＝軽度：１回の短い咳だけが観察される。
１．０＝中度：咳が持続し、観察期間中に繰り返し起きる。
２．０＝重度：咳にゼイゼイまたはゲイゲイ言う音が伴う。
くしゃみ
０＝無
２＝有
呼吸困難
０＝無（正常呼吸）
２＝有（努力呼吸）
抑うつ状態
０＝無（正常活動）
２＝有：正常と比較してイヌが活動的または陽気でない。観察の最中に立つのを嫌がり無気力または寝転んでいるならば、仔イヌは記録される。
分析方法
赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）アッセイ：赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）アッセイによってイヌ血清試料中のＣＩＶに対する抗体を測定した。手短に言えば、９６穴Ｕ底マイクロタイタープレートでＰＢＳにより試験用血清の２倍段階希釈を実施した。試験用血清を含有する各ウェルに４ＨＡ単位のＣＩＶ２５−０６Ｂを含有する等容量（２５μＬ）のウイルス懸濁液を添加し、抗原抗体反応を起こすためにプレートを２０〜２５℃で６０±５分間インキュベートした。それから５０μＬの０．５％雄鶏赤血球懸濁液を添加した。プレートを２０〜２５℃で４５〜６０分間インキュベートしＨＡＩ結果を読み取った。ＨＡＩ力価は、赤血球凝集抑制を示す血清の最高希釈度の逆数として記録した。アッセイ全てを繰り返して実施しエンドポイント法によるＨＡＩ力価を測定した。

細胞培養液でのＣＩＶ滴定：攻撃感染物質の力価を確認し、攻撃感染イヌにおけるウイルス排出を測定するために、攻撃感染物質および鼻腔スワッブ中のウイルス力価をＭＤＣＫ細胞における滴定によって測定した。ＭＤＣＫ細胞を９６穴組織培養プレートに２〜３日間播種し、１０倍段階希釈ウイルス懸濁液または鼻腔スワッブから調製した試料と共にインキュベートした。プレートは、温度３６±２およびＣＯ_２４〜６％下でインキュベートした。攻撃感染後７日目にプレートを細胞変性効果（ＣＰＥ）について観察し、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を使用して攻撃感染力の５０％エンドポイント（細胞５０％に対する感染力）を算出した。ウイルス力価はＬｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０／ｍＬとして表した。

Ｓ．ｅｑｕｉの単離：試料上清を血液寒天培地（１０μＬ）に接種し、平板培地を３６±２℃で２４〜４８時間培養した。溶血現象を示したコロニーを、グラム染色、形態、コロニー特性および標準同定試験（例えば、オキシダーゼ、カタラーゼおよびコアグラーゼ試験）によってさらにＳ．ｅｑｕｉと同定した。
データ解析
結果変数：肺病変スコアが主要な変数だった。他の変数には、臨床徴候、ウイルス排出、細菌排出および血清学が含まれた。
統計解析
肺病変スコア：死体解剖の間に採点された各肺葉の硬化％は、肺スコアリングシステムに基づく重み付けしたスコアに変換した。種々の群の関する肺スコアの中央値は、ウィルコクソン順位和検定を使用して比較した。非ワクチン接種群に関する減少したワクチン有効率の推定値および当該推定値に対する９５％の信頼区間についても報告する。

臨床スコア：各イヌに対する総臨床スコアを得るために、発熱、眼漏、鼻漏、くしゃみ、咳嗽、抑うつ状態および呼吸困難に関する攻撃感染後１３日間の臨床スコアを合計した。総スコアはウィルコクソン順位和検定を使用して処理群の間で比較した。

ウイルス排出：各イヌに対するウイルス力価（Ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ）を攻撃感染後１０日間にわたり合計した。平均曲線下面積（ＡＵＣ）およびウイルス排出日数は、ウィルコクソン順位和検定を使用して解析した。

細菌排出：細菌排出の日数は、ウィルコクソン順位和検定を使用して解析し排出陽性の日数を処理群間で比較した。

血清転換：異なる時点における幾何平均抗体力価を報告した。

統計解析は、ＳＡＳバージョン９．１．３（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡ）を使用して実施した。ｐ＜０．０５で統計的有意と判定した。
検査妥当性およびロット判定基準
群４のイヌ以外のイヌの全ては、ＣＩＶ攻撃感染時にＣＩＶ抗体陰性だった。

群２のイヌ以外のイヌの全ては、ＣＩＶ攻撃感染時に経鼻ＣＩＶ排出陰性だった。群２のイヌはＣＩＶ排出の試験をしなかった。

ＣＩＶに攻撃感染した非ワクチン接種イヌの全ては（群１および３）、ＣＩＶ攻撃感染後に高変動度の肺病変を示した。
結果と考察
妥当性：群４のイヌの全ては最初のワクチン接種の前はＣＩＶ血清陰性で、非ワクチン接種イヌの全て（群１、２および３）はＣＩＶ攻撃感染攻撃前、血清陰性のままだった（表２）。またイヌの全ては、ＣＩＶ攻撃感染時にＣＩＶおよび／Ｓｅｑｕｉ排出も陰性だった（表５および６）。

血清転換：ＨＡＩ抗体力価を表にまとめ処理群間で比較した（表２）。ワクチン接種後にワクチン接種イヌの全てがＣＩＶに血清転換した。ＨＡＩ抗体力は１０から１６０の間で変動し、３４日目のＧＭＴ（幾何平均力価）が７３だった。ワクチン接種した大多数（８０％）は、４０またはそれ以上のＨＡＩ力価を発生した。非ワクチン接種群のイヌの全ては、ＣＩＶ攻撃感染時にＣＩＶ血清陰性だった（ＨＡＩ力価＜１０）。攻撃感染後、ワクチン接種イヌの抗体力価は非常に高いレベルに達したが（ＧＭＴ＞６３７８）、このことは病原性ＣＩＶに対する免疫系の抗原刺激におけるワクチンの有効性を証明している。当該イヌの全てのＨＡＩ力価は少なくとも２５６０だった。群１および３のＣＩＶに攻撃感染した非ワクチン接種イヌは、ＣＩＶ攻撃感染後に血清転換し、ＧＭＴがそれぞれ２２６および２７８だった。群２のイヌの全ては死体解剖時にＣＩＶ血清陰性のままだったが、このことは当該イヌがＣＩＶに暴露されなかったことおよびバイオセキュリティー手法が有効だったことを裏付けている。

攻撃感染の確認：攻撃感染投与前後に凍結し−５０℃またはそれ以下に保存した攻撃感染ウイルス試料は、ＭＤＣＫ細胞上で滴定し、投与量がイヌ当たり７．７３Ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０のＣＩＶ１４−０６Ａであることを確認した。さらに、攻撃感染前と攻撃感染後の保存試料の間に実質的な差異がなかった。

血液寒天培地で滴定したＳ．ｅｑｕｉ保存試料は、攻撃感染物質の力価が１Ｘ１０^９ｐｆｕ／ｍＬであることを確認した。攻撃感染投与の過程において細菌は生存可能なままだった。

直腸温および臨床徴候：研究３３日目から４８日目までの毎日、処理群全ての直腸温を記録した（表３）。群１（ＣＩＶ単独）のイヌ６匹中２匹に臨床的な発熱（≧３９．５℃）が１日間だけ生じた。またそのイヌ２匹中１匹に重篤な抑うつ状態が生じ安楽死させた。群２のイヌ６匹中１匹（Ｓ．ｅｑｕｉ単独）に軽度の発熱が１日間だけ生じた。ＣＩＶとＳ．ｅｑｕｉの双方に攻撃感染した群３のイヌ９０％（１０匹中９匹）に発熱が生じ、その大多数（７０％）は少なくとも２日間発熱を呈した。またワクチン接種イヌの５０％（１０匹中５匹、群４）にも重複攻撃感染後に発熱が生じた。しかし初熱は１日間しか続かなかった。

またイヌの全ては、他の臨床徴候、例えば眼漏、鼻漏、くしゃみ、咳嗽、呼吸困難および抑うつ状態等に関しても、研究３３日目から４８日目までの毎日モニターした。ＣＩＶに、およびＣＩＶプラスＳ．ｅｑｕｉに攻撃感染したイヌの全て（群１、３および４）は、攻撃感染後２日目から始まる広範囲な臨床徴候を示した（表４および図１）。咳嗽および呼吸困難が主な臨床徴候だった。群１（６／６）と群３（１０／１０）のイヌの全ては、それぞれ平均２．７日間および４．５日間持続する高変動度の咳嗽を示した。一方では、群４のワクチン接種イヌのわずか６０％（６／１０）だけが平均１．３日間持続する軽度の咳嗽を示した。群１のイヌ１匹（ＩＤはＣＡＵＥＬＺ）は、ＣＩＶ攻撃感染後９日目に抑うつ状態と呼吸困難のために安楽死させた。群３のイヌ１匹（ＩＤはＣＡＵＥＬＷ）は、ＣＩＶ攻撃感染後８日目に死体で発見された。Ｓ．ｅｑｕｉに単独攻撃感染したイヌ６匹のどれも如何なる臨床徴候も示さなかった。

結果は、ＣＩＶが死に至らしめ得る重篤な呼吸器疾患をイヌに引き起こす可能性のあることを示唆する。Ｓ．ｅｑｕｉは二次病原体としてふるまいＣＩＶ誘発性疾患を亢進する。Ｓ．ｅｑｕｉ単独ではそれ自身如何なる臨床疾患も誘発しなかった。

ウイルス排出：ＣＩＶ攻撃感染イヌ（群１、３および４）の全てにおいて、攻撃感染前日それから攻撃感染後１から１０日目までの毎日、経鼻ウイルス排出をモニターした。各群に対する平均ウイルス力価を、Ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０／ｍＬとして表し、攻撃感染後の日数に対して示した（表５および図２）。群１および４のイヌの５０％および群３のイヌの全て（１００％）は、攻撃感染後１日目から鼻汁中にＣＩＶを排出し始めた。攻撃感染後２日目までに、全３群のイヌの全ては経鼻ウイルス排出陽性だった。ウイルス排出はＣＩＶ攻撃感染後４から５日目の間にピークに達しその後６日目に急激に低下した（図２）。非ワクチン接種およびワクチン接種の双方とも、攻撃感染後８日目までに鼻汁中へのＣＩＶ排出を停止した。各イヌのウイルス力価を攻撃感染後１０日間にわたり合計し統計解析を実施した。平均曲線下面積の推定値は群４（８．９Ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ）と比較して群１及び３（それぞれ１７．０Ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０／ｍＬおよび１８．６Ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ）の方が有意に高かった（群１および３に対し、それぞれＰ＝０．００７５およびＰ＜０．０００１）。また群１及び３の平均排出日数（それぞれ５．７日および５．８日）も群４（４日）と比較して有意に高かった（それぞれＰ＝０．０３５６およびＰ＝０．００３３）。本結果により、ＣＩＶワクチンがワクチン接種イヌの経鼻ウイルス排出を有意に減少することが明らかとなった。

細菌排出：群２、３および４のＳ．ｅｑｕｉ攻撃感染イヌは、−４日目（ＣＩＶ攻撃感染前）、およびＳ．ｅｑｕｉ攻撃感染後の０、３、６、９および１１日目にＳ．ｅｑｕｉの経鼻排出に関しモニターした（表６および図３）。さらにＳ．ｅｑｕｉの単離のために死体解剖時に群２、３および４のイヌすべてから肺洗浄試料を採取した。群１のイヌ（未検）を除き全群のイヌの全ては、ＣＩＶまたはＳ．ｅｑｕｉ攻撃感染時にＳ．ｅｑｕｉ排出陰性だった。どのＳ．ｅｑｕｉ単独攻撃感染イヌ（群２）も、Ｓ．ｅｑｕｉ攻撃感染後の任意の時点において経鼻Ｓ．ｅｑｕｉ排出陽性でなかった。しかし群２のイヌ１匹（１７％）の肺洗浄試料からＳ．ｅｑｕｉが単離された。対照的に、ＣＩＶプラスＳ．ｅｑｕｉの双方に攻撃感染した群３のイヌの１００％は、Ｓ．ｅｑｕｉ攻撃感染後３および６日目に鼻汁中でＳ．ｅｑｕｉ陽性であり、その大多数（６７％）は攻撃感染後少なくとも９日間細菌を排出し続けた。また群３のイヌの大多数（６７％）が、肺洗浄液（Ｓ．ｅｑｕｉ攻撃感染後１１日目）でもＳ．ｅｑｕｉ陽性だったが、このことは細菌が下気道においてコロニー形成し増殖したことを示唆する。またＣＩＶプラスＳ．ｅｑｕｉに攻撃感染したＣＩＶワクチン接種イヌの大多数（６０％）も、Ｓ．ｅｑｕｉ攻撃感染後３日目に鼻汁中にＳ．ｅｑｕｉを排出した。６日目以降、Ｓ．ｅｑｕｉを排出するイヌの数は、群３と比較して群４において実質的により少なかった。ワクチン接種イヌのわずか２０％だけがその肺洗浄試料においてＳ．ｅｑｕｉ陽性だった。

肺病変：あらゆるインフルエンザ攻撃感染において、肺硬化／肺炎は主要な病理学的病変である。ＣＩＶにおよびＣＩＶプラスＳ．ｅｑｕｉに攻撃感染した群（群１および３）のイヌの全て（１００％）は高変動度の肺硬化を示したが、一方ではＣＩＶワクチン接種群（群４）のわずかイヌ３匹（３０％）だけが肺硬化になり、その中の２匹は非常に軽度だった（表７）。Ｓ．ｅｑｕｉ攻撃感染群（群２）のわずかイヌ１匹（１７％）だけが肺病変を示し、しかも軽度だった。群１において肺病変は主として肺前葉に観察されたが、一方、群３において病変は全ての肺葉に出現した。肺病変は、出血および赤みを帯びた硬化および肝変化によって特徴付けた。群１の肺スコアは中央値スコア＝１７．２７を有し０．５から３２．９７の間で変動し、群３は、中央値肺スコア＝２３．２９を有し５．５３から３９．７４の間で変動した。群４は、中央値スコア＝０を有し０から２５．５４の間で変動した。ＣＩＶ攻撃感染に関する減少したワクチン有効率の比推定値は、ＣＩ（赤血球の色素指数）が９５％において８８．３％（６０％、１００％）、ＣＩＶプラスＳ．ｅｑｕｉ攻撃感染に関してはＣＩが９５％において８８．０％（５８％、１００％）だった。群４の肺スコアは、群１（Ｐ＝０．００１９）および群３（Ｐ＝０．０００２）と比較して有意に低かった。群３の肺スコアは群１と比較して高かったが、有意差はなかった（Ｐ＝０．５６２２）。データよりＣＩＶワクチンがＣＩＶ誘発性およびＣＩＶプラスＳ．ｅｑｕｉ誘発性の肺病変の予防を助成することが明らかとなった。

本発明についてはその具体的な実施態様に関連して記載したが、さらなる改変が可能であること、および一般的に本発明の原理を包含しながら、もしくは本発明が関係する技術分野内の既知行為または慣行となるような本開示からの逸脱を含みながら、本応用が本発明のいかなる変化、使用または適応を包含することを意図することを了解されたい。本明細書において記載された特許および公開特許の全ては、その内容全体が参照され援用される。

Claims (11)

1. 一次病原体に対する抗原を含むワクチンを提供すること、および免疫学的に有効量の一次病原体に対するワクチンを動物に投与することを含む、二次病原体に起因する疾患から動物を保護するための方法。
2. 一次病原体に対する抗原を含むワクチンを提供すること、および免疫学的に有効量の一次病原体に対するワクチンをイヌに投与することを含む、二次病原体に起因する疾患からイヌを保護するための方法。
3. イヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）に対するワクチンを提供すること、および免疫学的に有効量のＣＩＶワクチンをイヌに投与することを含む、二次病原体に起因する疾患からイヌを保護するための方法。
4. 二次病原体がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ． Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ（Ｓ．ｅｑｕｉ）である請求項３記載の方法。
5. イヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）に対するワクチンを提供すること、および免疫学的に有効量のＣＩＶワクチンをイヌに投与することを含む、イヌ感染性呼吸器疾患（ＣＩＲＤ）からイヌを保護するための方法。
6. ワクチンが１または複数の追加の免疫原を含む混合ワクチンである請求項５記載の方法。
7. １または複数の追加の免疫原が、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌコロナウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌニューモウイルス、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属血清型菌種、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属生物体、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属菌種（ｓｐｐ．）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属菌種、狂犬病ウイルス、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ、およびその任意の組み合せから成る群から選択される請求項６記載の方法。
8. ワクチンが１または複数の追加の免疫原をさらに含む混合ワクチンである請求項４記載の方法。
9. １または複数の追加の免疫原が、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌコロナウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌニューモウイルス、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属血清型菌種、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属生物体、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属菌種（ｓｐｐ．）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属菌種、狂犬病ウイルス、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ、およびその任意の組み合せから成る群から選択される請求項８記載の方法。
10. ＣＩＶワクチンをイヌに投与することを含む、二次病原体に起因する疾患からイヌを保護するためのＣＩＶワクチンの使用。
11. ＣＩＶワクチンをイヌに投与することを含む、Ｓ．ｅｑｕｉ疾患からイヌを保護するためのＣＩＶワクチンの使用。

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