CN101309701A - 治疗犬流感的疫苗和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提供用于犬流感病毒相关疾病的新型疫苗和疗法。本发明公开了流感病毒抗原和将这些抗原呈递给犬类尤其是狗的方法。其涉及减毒和杀死的病毒。本发明涉及实验产生的犬和马流感病毒。本发明还包括甲型流感，其包括H3、N8、H3N8、H7N7和包含来自犬和马流感病毒的至少一个基因组区段的病毒。本发明还涉及这些病毒在治疗性组合物中的用途，所述治疗性组合物用于保护犬类特别是狗免患流感病毒引起的疾病。

Description

治疗犬流感的疫苗和方法
发明领域
本发明涉及提供用于犬流感病毒相关疾病的新型疫苗和疗法。本发明公开了流感病毒抗原和将这些抗原呈递给犬类尤其是狗的方法。其涉及减毒和杀死的病毒。本发明涉及实验产生的犬和马流感疫苗和病毒。本发明还包括甲型流感，H3、N8、H3N8、H7N7病毒，其包含来自犬和马流感病毒的至少一个基因组区段。本发明还涉及这些病毒在治疗性组合物中的用途，所述治疗性组合物用于保护犬类特别是狗免患流感病毒引起的疾病。
发明背景
从大约1956年开始，马流感病毒就已经被认为是马的主要呼吸道病原体。由马流感病毒引起的疾病症状可以很严重，并且经常随后是继发性细菌感染。已经认识了两种马流感病毒亚型：即亚型-1，其原型为A/Equine/Prague/1/56(H7N7)，和亚型-2，其原型为A/Equine/Miami/1/63(H3N8)。目前，主要的病毒亚型是亚型-2，即H3N8毒株。现在认为此毒株可感染犬类，并且可以具有相当的毒力，在某些案例中报道的犬类致死率高达36％。可能是完整的或部分的马流感病毒种间转移至狗中而导致产生了与急性呼吸道疾病相关的新型犬特异性流感病毒。参见Transmission of Equine Influenza to Dogs(P.C.Crawford等人，Science 310，482-485(2005))。明显且确定无疑地需要有效的疫苗以治疗和预防这种新型犬流感。
附图简述
图1显示了用马抗原疫苗免疫接种的狗的几何平均注射位点反应。图2显示了在用马流感病毒疫苗免疫接种并用犬流感病毒攻击的动物中的肺实变平均百分比。
发明概述
本发明提供了马和犬流感抗原，疫苗，和使用这些疫苗来治疗犬类尤其是狗的由犬流感引起的感染、疾病和症状的方法。本发明进一步提供了用于保护动物以抵抗由流感病毒引起的疾病的治疗性组合物。本文描述了制备所述疫苗的方法和治疗动物的方法。本发明的抗原可以是来自任何鸟类和哺乳动物的任何经鉴定的流感病毒毒株，包括但不限于具有H3N8抗原亚型或更通常称为H3N8毒株的流感。流感可以具有任何哺乳动物来源，包括但不限于猪、鸟、马或犬来源。优选的是马和犬流感病毒以及相关抗原。公开了具有标示为H3或N8的蛋白质的毒株。具有H3N8的毒株是优选的。还公开了具有标示为H7N7的蛋白质的毒株。
本文描述了抗原浓度和疫苗生产。描述了细胞培养基和病毒生长。对于减弱的、杀死的和灭活的病毒的疫苗制备以及疫苗佐剂、制剂、形式、和载体、剂量、施用途径及测定法也都进行了描述。
发明详述
定义和缩写
下面的定义应用于本公开内容，未被定义的词语具有本领域技术人员通常使用的含义。
当与可测量的数字变量一起使用时，“大约”是指该变量的所示值，以及在所示值的实验误差内(例如，在平均值的95％置信区间内)或在所示值的10％内(任选其中更大的一个)的变量的所有值。
“活性免疫”包括狗中的体液免疫和/或细胞介导的免疫。
“抗体”是指由于对抗原的免疫应答而可以与特定抗原结合的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是由具有“恒定”和“可变”区的“轻”和“重”多肽链组成的血清蛋白质，并根据恒定区的组成被分成几类(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。对于给定抗原“特异”的抗体表明，该抗体的可变区专一地识别和结合特定抗原。抗体可以是多克隆的混合物或是单克隆的。抗体可以是来自天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白，或者可是是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体可以以多种形式存在，包括，例如Fv、Fab’、F(ab’)2以及单链。
“抗原”或“免疫原”是指包括一个或多个表位(线性的、构象的或两者)的分子，该分子一旦暴露于受试者就会诱导对于该抗原特异的免疫应答。表位是抗原上的特异位点，其与T-细胞受体或特异性抗体结合，并通常包含大约3个氨基酸残基至大约20个氨基酸残基。术语抗原涉及亚单位抗原--从在天然状态下所述抗原与之相连的完整生物体中分开和分离的抗原--以及杀死的、减毒的或灭活的细菌、病毒、真菌、寄生虫或其它微生物。术语抗原也涉及抗体，例如抗独特型抗体或其片段，以及能够模拟抗原或抗原决定簇(表位)的合成肽模拟表位。术语抗原也涉及在体内表达抗原和抗原决定簇的寡核苷酸或多核苷酸，例如在DNA免疫应用中。
“抗原性”是指蛋白质或多肽被针对该蛋白质或多肽而产生的抗体免疫特异性地结合的能力。
“犬”包括通常被称为狗的动物，但还包括犬科中的其他成员。
“细胞免疫应答”--参见免疫应答。
如本文使用的“伴侣动物”是指被当作宠物的任何圈养的非人动物。这些动物可包括但不限于狗、猫、马、绵羊、兔、猴和啮齿类动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠和雪貂)。
“马”包括通常被称为马的动物，但还包括马科中的其他成员。
“赋形剂”是指疫苗中不是抗原的任何组分。
“第一疫苗”、“第二疫苗”、“第三疫苗”等是指可分开施用的疫苗，其可以是相同的或不同的，并且其通常可以以任何顺序施用。这样，第三疫苗可以在第二疫苗之前或之后施用至受试者。
当在本文中使用时，“异源的”表示来自不同的病毒物种或毒株。
当在本文中使用时，“同源性”、“同源的”等表示多核苷酸或多肽序列之间共享的同一性的程度。
当关于病毒物种进行使用时，“同源的”表示相同的病毒物种或毒株。
当在本文中使用时，“寄主细胞”表示含有质粒、病毒或其他载体的细菌或真核生物细胞，包括哺乳动物、鸟类或昆虫。
“体液免疫应答”--参见免疫应答。
“杂交瘤”--参见单克隆抗体。
在受试者中的“免疫应答”是指对于抗原的体液免疫应答、细胞免疫应答或者体液和细胞免疫应答的形成。“体液免疫应答”是指通过抗体介导的免疫应答。“细胞免疫应答”是指通过T-淋巴细胞或其他白细胞或者两者介导的免疫应答，并且包括由活化的T-细胞、白细胞或两者所产生的细胞因子、趋化因子和类似分子的产生。可使用标准的免疫测定法和中和测定法来测定免疫应答，这些测定法在本领域中是已知的。
“免疫原性”是指蛋白质或多肽引发免疫应答的能力，所述免疫应答特异性地针对引起经鉴定的疾病的细菌或病毒。
抗原的“免疫学保护量”或者“产生免疫应答的有效量”是对于在受者体内诱导免疫原性应答来说有效的量，所述免疫原性应答足以预防或改善疾病的征兆或症状，包括不利的健康影响或其并发症。可以诱导体液免疫或细胞调节的免疫或两者。动物对疫苗组合物的免疫原性应答可以如此进行评估，例如通过测量抗体滴度、淋巴细胞增值测定法来间接进行评估，或者通过监视在用野生型毒株攻击后的征兆或症状来直接进行评估。疫苗所赋予的保护性免疫可通过测量例如临床征兆的降低来进行评估，所述临床征兆例如为受试者的死亡率、发病率、温度读数以及总体身体状况和总体健康和能力。免疫应答可包括但不限于细胞和/和体液免疫的诱导。治疗有效的疫苗的量可依赖所使用的特定病毒或被免疫的动物的状况而变化，并且可以由兽医医生来确定。
“鼻内”施用是指通过或经由鼻子将诸如疫苗的物质导入受试者体内，并且包括主要通过鼻腔粘膜来转运所述物质。
当在本文中使用时，“分离的”表示单独地或者在异源寄主细胞、或染色体、或载体(例如质粒、噬菌体等)内从其天然发生的环境中移出。“分离的细菌”、“分离的厌氧细菌”、“分离的细菌菌株”、“分离的病毒”、“分离的病毒毒株”等是指其中细菌或病毒基本上不含其他微生物的组合物，例如在培养中，例如当从其天然发生的环境中分离。当用于描述任何特别限定的物质(例如多核苷酸或多肽)时，“分离的”是指从最初细胞环境中分离的物质，在所述最初细胞环境中通常发现该物质(例如多肽或核酸)。因此，如本文使用的，仅作为例子，用本发明的多核苷酸构建的重组细胞系使用了“分离的”核酸。备选地，如果特定的蛋白质或特异的免疫原性片段作为疫苗而被要求保护或使用，那么其可被视为分离的，因为与其在自然中存在的情况相比，其已被鉴定、分离并纯化至一定程度。如果该蛋白质或其特异的免疫原性片段在产生抗原的重组细菌或真核生物表达载体中产生，那么其被视为以分离的蛋白质或核酸存在。例如，用多核苷酸构建的重组细胞系使用“分离的”核酸。
“可代谢佐剂”是由能够被靶物种代谢的组分组成的佐剂，例如基于植物油的佐剂。可代谢佐剂可以是可代谢的油。可代谢的油是通常出现在植物和动物中并且经常主要由三酰基甘油混合物组成的脂肪和油，所述三酰基甘油也被称为甘油三酯和中性脂肪。这些非极性、水溶性物质是甘油的脂肪酸三酯。三酰基甘油根据其3个脂肪酸残基的特性和位置而不同。与“不可代谢佐剂”相比较。
“不可代谢佐剂”是由不能被动物受试者的机体所代谢的组分组成的佐剂，所述动物受试者被施用以乳剂。适于在本发明的乳剂中使用的不可代谢的油包括烷烃、烯烃、炔烃，和它们相应的酸和醇，其醚和酯，以及其混合物。优选地，油的个别化合物是轻质烃化合物，即此类组分具有6-30个碳原子。油可以合成地制备或从石油产品中纯化。用于在本发明乳剂中使用的优选的不可代谢油包括例如矿物油、石蜡油和环烷。术语“矿物油”是指一种不可代谢的佐剂油，其是通过蒸馏技术从石油中得到的液态烃。该术语与“液化石蜡”、“液体石蜡”和“石蜡油”同义。该术语也意图包括“轻质矿物油”，即类似地通过蒸馏石油得到的、但具有比石蜡油稍微更低的比重的油。参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton，Pa.：Mack Publishing Company，1990，在第788页和1323页)。矿物油可以从多个商业来源获得，例如J.T.Baker(Phillipsburg，PA)、USB Corporation(Cleveland，OH)。优选的矿物油是以
Figure A20068003710600091
的名称商购可得的轻质矿物油。
“单克隆抗体”是指由单系杂交瘤细胞产生的抗体，所有所述抗体针对特定抗原上的一个表位。用于制备单克隆抗体的抗原可以以病原体的分离蛋白质或整个病原体来提供。“杂交瘤”是由杂交细胞所构成的无性繁殖细胞系，所述杂交细胞通过融合骨髓瘤细胞和特异的抗体产生细胞而形成。通常，单克隆抗体是鼠源的；然而，单克隆抗体也指针对抗原的特定表位而制备的抗体的克隆群体，所述抗原通过噬菌体展示技术或等同于噬菌体展示的方法或非鼠源的杂交细胞来产生。
事件后的“N天”或“M-天”分别是指该事件后的第N或第M天的任何时间。例如，在施用第一疫苗后14天使用第二疫苗免疫接种受试者表示第二疫苗是在第一次免疫后的第14天的任何时间施用的。
“ORF”表示“开放阅读框”，即基因的编码区。
“口服”或“经口”施用是指通过或经由口将诸如疫苗的物质导入受试者体内，并且包括吞咽或通过口腔粘膜的转运(例如舌下或颊吸收)或两者。气管内也是口腔或经口施用。
“口鼻”施用是指通过或经由鼻和口将诸如疫苗的物质导入受试者体内，如通过例如在鼻内放置一个和多个小液滴而发生的。口鼻施用包括与口服和鼻内施用相关的转运过程。
“肠胃外施用”是指通过或经由不包括消化道的途径将诸如疫苗的物质导入受试者体内。肠胃外施用包括皮下施用、肌内施用、经皮肤施用、皮内施用、腹膜内施用、眼内施用和静脉内施用。为本公开内容的目的，肠胃外施用不包括主要涉及通过口、鼻、气管和肺中的粘膜组织转运物质的施用途径。
“药学上可接受的”是指具有如下性质的物质：其在可靠医学判断的范围内，适用于与受试者的组织接触而无不适当的毒性、刺激、过敏反应等，与合理的收益-风险比相称，并且对于其所希望的用途来说是有效的。
“药学上可接受的载体”是指不干扰活性成分的生物活性的效力，并且对被施用的受试者没有毒性的载体介质。
“多克隆抗体”是指针对特定的病原体或抗原而制备的抗体的混合群体。一般而言，该群体包括多种抗体组，每组针对所述病原体或抗原的某一特定表位。为制备多克隆抗体，通过接种或感染将整个病原体或分离的抗原导入寄主中从而诱导寄主产生针对该病原体或抗原的抗体。
“预防感染”表示防止或抑制引起所鉴定的疾病的细菌或病毒的复制，抑制细菌或病毒的传播，或者防止细菌或病毒在其寄主内立足，或者缓解由感染引起的疾病的症状。如果细菌或病毒载量降低，则认为该处理是治疗性的。
如本文中关于疫苗而使用的，“保护作用”、“保护”等表示，所述疫苗预防或降低了由生物体引起的疾病的症状，疫苗中所用的抗原来源于所述生物体。术语“保护作用”和“保护”等也表示，所述疫苗可以用于“治疗”已在受试者中存在的疾病或者该疾病的一个或多个症状。
“呼吸道”施用是指通过或经由吸入雾化(喷雾化)的物质来将诸如疫苗的物质导入受试者体内。在呼吸道施用中，主要的转运机制包括通过气管、支气管和肺中的粘膜吸收喷雾化的物质，并因此与鼻内或经口施用不同。
当用于描述本发明的抗体时，“对...特异的”表示，本发明的抗体的可变区专一地识别和结合特定的H3N8毒株(即，能够通过在结合亲和力方面可测量的差异而将特定的H3N8蛋白与其他已知蛋白质相区分，尽管在H3N8s蛋白和这样的多肽之间存在局部的序列同一性、同源性和相似性)。应当认识到，特异的抗体也可以通过与抗体可变区外(特别是在分子的恒定区中)的序列的相互作用而与其他蛋白质(或者在ELISA技术中的其他抗体)相互作用。用于测定本发明抗体的结合特异性的筛选测定法是本领域中熟知的和常规实施的。关于此种测定法的全面讨论，参见Harlow等人(编辑)，Antibodies：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory；Cold SpringHarbor，NY(1988)，第6章。可以使用本领域中熟知的和常规实施的任何方法来产生本发明的抗体。
“亚单位疫苗”是指包含一种或多种抗原但不包含所有抗原的疫苗类型，所述抗原来源于或同源于来自目的病原体的抗原，所述目的病原体例如为病毒、细菌、寄生虫或真菌。这样的组合物基本上没有完整的病原体细胞或病原颗粒，或这些细胞或颗粒的裂解物。因此，亚单位疫苗可以从至少部分纯化或基本上纯化的、来自病原体或其类似物的免疫原性多肽来制备。获得亚单位疫苗中的一种或多种抗原的方法包括标准纯化技术、重组生产或化学合成。因此，“亚单位疫苗”是指由完整的病毒、细菌或其他免疫原的指定的一种或多种抗原性组分组成的疫苗。
“特异的免疫原性片段”表示被抗体识别的序列的一部分，所述抗体对该序列是特异的。
“受试者”是指任何具有免疫系统的动物，其包括哺乳动物，例如狗。
“TCID50”是指“组织培养感染量”，并被定义为对于感染50％的给定批次的经接种细胞培养物所需的病毒稀释度。可使用多种方法来计算TCID50，包括在本说明书中使用的Spearman-Karber方法。对于Spearman-Karber方法的描述，参见B.W.Mahy & H.O.Kangro，Virology Methods Manual 25-46(1996)。
“治疗性试剂”是指辅助治疗病毒感染或由此引起的疾病或病状的任何分子、化合物、病毒或疗法，优选地减毒的或杀死的病毒，或者亚单位或化合物。
在本公开内容的情况下，“治疗有效量”是指可在接受抗原或疫苗的受试者(例如狗)中诱导免疫应答的抗原或疫苗的量，所述免疫应答足以预防或改善疾病的征兆或症状，包括由病原体感染引起的不利的健康影响或其并发症，所述病原体例如为病毒(例如H3N8)、细菌、寄生虫或真菌。可以诱导体液免疫或细胞介导的免疫或体液和细胞介导的免疫两者。动物对疫苗的免疫原性应答可以如此进行评估，例如通过测量抗体滴度、淋巴细胞增值测定法来间接进行评估，或者通过监视在用野生型毒株攻击后的征兆或症状来直接进行评估。疫苗所赋予的保护性免疫可通过测量例如临床征兆的降低来进行评估，所述临床征兆例如为受试者的死亡率、发病率、温度读数以及总体身体状况和总体健康和能力。治疗有效的疫苗的量可依赖所使用的特定病毒或受试者的状况而变化，并且可由本领域技术人员来确定。
“传染的”表示能够从第一只动物(狗)传递到第二只动物(狗)的病毒，其中第二只狗显示出对所传染的病毒的血清转化。
“治疗”是指逆转、减轻、抑制该术语所应用的病症、病状或疾病的进程，或预防所述病症、病状或疾病，或者指预防此类病症、病状或疾病的一种或多种症状。
“疗法”是指上述定义的“治疗”的实施过程。
“疫苗”是指选自病毒(经修饰的活的、减毒的或杀死的)、或亚单位疫苗或上述内容的任何组合的免疫原性组合物。将疫苗施用至受试者导致产生免疫应答。可通过任何已知的施用途径(包括肠胃外、经口等)将疫苗直接引入受试者中。
第一部分.抗原和病毒毒株，它们的疫苗的生产、制造、配制和施用
本发明一个方面提供使用下述抗原以激发免疫原性应答的疫苗。
本发明的有用的抗原。本发明的抗原可以是来源于任何鸟类和哺乳动物的任何经鉴定的流感病毒毒株，包括但不限于具有H3亚型血凝素和N8亚型神经氨酸酶的流感病毒，或者具有H3N8亚型或更常见地称为H3N8病毒的流感病毒。所述流感可以具有任何哺乳动物或鸟类来源，包括但不限于猪、马或犬来源。优选的是马和犬流感抗原。具有标示为H3或N8的亚型糖蛋白的毒株，更优选地具有H3和N8两者的毒株。
如在Transmission of Equine Influenza to Dogs(P.C.Crawford等人，Science 310，482-485(2005))中描述的毒株和变体和突变体及其变体也是优选的。病毒HA是流感病毒的寄主物种特异性的重要决定因素。
本发明的流感抗原可从家养的和野生的狗、马、猪和禽类中分离。选择用于样品收集的动物应表现出急性和/或亚急性临床症状，包括温和至严重的呼吸道症状和发热。动物还表现出厌食和嗜睡的征象。病毒分离的方法是本领域技术人员熟知的，包括：用来自临床样本的鼻或咽粘膜样品接种哺乳动物和鸟类细胞培养物、含胚胎的蛋，通过擦拭鼻腔通道或咽喉或通过收集组织例如脾、肺、扁桃腺以及肝和肺的灌洗液来进行收集。可在细胞培养物中观察病毒的致细胞病变效应，和可以就其凝集人、公鸡(rooster)、火鸡或豚鼠红细胞的能力来测试尿囊液或细胞裂解物，这种能力是推测的关于流感病毒存在的证据。
病毒毒株和可能的抗原的命名法。甲型流感病毒毒株根据在病毒颗粒表面上的其糖蛋白的抗原特征而被再分成亚型。这些病毒糖蛋白是血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。通常先命名HA亚型，再命名NA亚型，因而H3N8是指具有血凝素亚型3和神经氨酸酶亚型8的病毒。该亚型基于HA和NA的血清学分析。使用在本文中公开的程序，可制备任何这些亚型的疫苗。现在有16种经鉴定的HA亚型和9种经鉴定的NA亚型。野生环境中可能有更多还没有被记述的亚型。特别地，经鉴定的亚型包括H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16以及N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。亚型的所有这些组合和其任何组合以及使用上文描述的程序或实质上相似的程序在将来将被鉴定出的任何未来亚型和未来亚型的组合作为本发明的有用抗原在本文中被描述并要求保护。公开了亚型的所有其他HA和NA组合。这包括但不限于优选的H3N8和H7N7亚型。
流感病毒血凝素(HA)是病毒颗粒表面糖蛋白，其将病毒与寄主细胞上的HA受体相结合，并将病毒包膜与胞吞小泡的膜相融合以起始感染过程。其也是保护性抗体的刺激和形成中最重要的病毒颗粒组分。HA的氨基酸序列以及因此其N-糖基化位点的位置由病毒基因组所决定。
流感病毒的分节段的负链RNA基因组由依赖RNA的RNA聚合酶进行复制，所述依赖RNA的RNA聚合酶缺少有效的校正功能，从而导致高比率的转录错误，这可以造成表面糖蛋白HA和NA的氨基酸置换。此种高突变频率的结果之一是，病毒群体包括在HA的N-联聚糖的数量和位置方面与大多数病毒不同的突变体。这些寡聚糖的结构可通过其在HA上的位置和通过生物合成的和修剪性的酶的排列来确定，所述酶由在其中生长病毒的寄主细胞提供。因此，病毒基因组的可塑性和寄主特异的糖基化机制可以一起产生在结构和功能上比通过以上任一过程单独地所能够形成的更加异质的病毒群体。该多样性被认为是这些病毒在各种生物小生境中存活的原因，也是它们具有克服中和抗体和抗病毒试剂的抑制作用的能力的原因。已经鉴定出在各种毒株的病毒基因组中的突变，并且在此还要求保护这些突变的毒株。例如，这些突变体中的一些描述于Transmission of Equine Influenza to Dogs(P.C.Crawford等人，Science 310，482-485(2005))中，该文献引入本文作为参考。
本发明还公开了从所收集的并被鉴定为马流感毒株A/Equine/2/Miami/1/63的特定毒株制得的疫苗。该毒株以保藏号ATCC VR 317保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)，10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209。该毒株最初分离自1963年迈阿密的一匹病马的鼻洗出物。该病毒在鸡胚胎中传代5次。该病毒被进一步分类为H3N8。
源自马的北美H3N8流感病毒的另一个实例是A/Equine/Kentucky/1998。源自马的H3N8的其他实例是A/Equine/Kentucky/15/2002、A/Equine/Ohio/1/2003、A/Equine/Kentucky/1/1994、A/Equine/Massachusetts/213/2003、A/Equine/Wisconsin/2003和A/Equine/NewYork/1999。其他实例是源自欧洲H3N8流感病毒的A/Equine/Newmarket/A2/1993。
本发明还公开了从所收集的并被鉴定为犬流感毒株A/canine/Iowa/13628/2005和毒株A/canine/Iowa/9A1/B5/08/D12的特定毒株制得的疫苗。后一种毒株，即毒株A/canine/Iowa/9A1/B5/08/D12作为UC 25508，于2006年6月29日保藏在美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，ATCC登录号是PTA-7694。该病毒被进一步分类为H3N8。
除了上述毒株，我们还公开了以下述方式获得的毒株。鉴定一只或一组表现出呼吸道疾病的临床征兆的狗，从这些狗中获得口腔或鼻腔分泌物的样品或者源自呼吸道组织或内部器官组织的样品，分析这些样品，并鉴定H3N8流感病毒的存在。使用在本文中描述的程序，分离、纯化、培养、生长、产生、浓缩该病毒抗原并鉴定为Pfizer犬流感病毒。适应并在含胚胎的蛋或犬细胞或两者中传代，鉴定为主种子(Master Seed)，犬流感H3N8病毒。优选的是犬来源的H3N8流感病毒。也可使用马或猪来源的H3N8，以及H3或N8亚型的流感病毒。我们公开了以下述方式获得的毒株。使用马流感H3N8感染一只或一组狗。从表现出呼吸道疾病的临床或亚临床征兆的狗中，获得狗的口腔或鼻腔分泌物的样品或者源自呼吸道组织或肺灌洗液或内部器官组织的样品，分析这些样品，并鉴定H3N8流感病毒的存在。使用在本文中描述的程序，分离、纯化、培养、生长、产生、浓缩该病毒抗原并鉴定为犬流感病毒。适应并在含胚胎的蛋或犬细胞或两者中传代，鉴定为主种子，犬流感H3N8病毒。优选的是犬来源的H3N8流感病毒。也可使用马或猪来源的H3N8，以及H3或N8亚型的流感病毒。以与在本文中详细描述的马或犬来源的病毒一样的方式处理猪来源的H3N8病毒。
第2部分.关于生产、制造、配制和施用从第1部分的抗原产生的疫苗的详细描述
第2部分a)讨论。第1部分的病毒抗原可制成有用的包含该病毒抗原的物质组合物并配制成有用的制剂或疫苗制剂，所述病毒抗原被修饰以降低其毒力。下列描述提供了生产、制造、配制和施用疫苗的细节，所述疫苗可用于预防或治疗狗的与流感病毒感染相关的临床征兆，或预防由犬或马流感病毒引起的狗的疾病。待治疗的犬流感感染可以由马流感病毒引起，或者其可以是源自马流感病毒的新的经修饰的犬流感。在本文中描述的疗法可辅助防止在犬疾病中犬或马流感病毒的泄出(shedding)。
本文描述了用于使用疫苗来治疗和免疫动物的方法和材料，特别是针对马和犬流感病毒来治疗和免疫狗。该方法包括对狗施用治疗有效量的第一、第二和或第三疫苗，所述疫苗能够诱导免疫应答，并且特别是在狗中诱导抗H3N8流感病毒的免疫应答。本发明的疫苗通常旨在预防性治疗，其针对由马或犬流感病毒的毒性毒株引起的疾病来免疫狗。
在本文中，我们公开了提供主动和或被动免疫的疫苗。当作为针对马或犬流感病毒的治疗性处理而给予时，完整疫苗或其蛋白质的特异的免疫原性片段都预期是有效的。因此，通过本发明提供的免疫可以是主动或被动免疫，并且该疫苗的预期用途可以是预防性的或治疗性的。在优选的实施方式中，该疫苗进一步包括用于针对任何形式的犬或马流感病毒来免疫狗的疫苗。
第2部分b)疫苗生产和抗原浓缩。在本节中所描述的疫苗可通过在细胞中生长所选的病毒来生产。病毒的生产优选地在马和犬类哺乳动物细胞培养物中进行。在蛋中进行病毒(抗原)生长和生产也是优选的。狗肾细胞系是优选的。也可以在任何可用的培养基和许可的细胞系中完成病毒的繁殖，所述细胞系可以来自鸟类和哺乳动物细胞系，所述哺乳动物细胞系来自猫、马、牛和猪细胞系。该疫苗通常在灭活前包含103-109的TCID50的病毒水平。备选地，病毒制剂中的抗原含量可通过血细胞凝集抑制(HI)试验、单辐射扩散或血细胞凝集测定法来进行分析，并且通过使用该测定法，优先采用具有10-10,000HA单位/ml，更通常地100-2000HA单位/ml，并且常常地100-1000HA单位/ml(作为每剂量中的施用量)的滴度的疫苗。
病毒生长：细胞系和含胚胎的蛋。用于流感病毒繁殖的优选细胞系是犬肾细胞(DK)。可以使用的其他细胞系包括原代和永生化马肾细胞(EK)、马真皮细胞(ED)、猪睾丸细胞(ST)、猪肾细胞(PK)、牛肾细胞(BK)、猫肾细胞(FK)、Vero细胞以及原代和永生化鸡胚胎成纤维细胞(CEF)。用于生长流感病毒的优选细胞培养系统是传统的粘附单层培养。备选地，也可使用悬浮和微载体细胞培养系统。优选的微载体是Cytodex 3微载体珠(Amersham Biosciences Ltd.)。微载体的其他实例包括由玻璃、聚硅氧烷和葡聚糖、DEAE、胶原、葡聚糖或明胶组成的珠。
用于培养细胞系和繁殖流感病毒的优选容器是滚瓶，优选的滚瓶表面积是1760cm2，但可在490-4250cm2的范围内变化。备选地，其他可用的细胞培养形式包括烧瓶(150cm2-420cm2)、堆叠的模块(stacked modules)(21,000cm2-340,000cm2)和搅拌罐(1.0L-900L)。优选的感染复数(MOI)是0.001-0.1，但可在0.0001-2.0的范围内变化。用于从细胞培养物中收获病毒的优选窗口期是感染后第2天至第5天，但可在感染后第1天至第7天的范围内变化。
也可通过接种含胚胎的蛋来完成病毒的繁殖。通常使用0-12日龄的含胚胎的蛋用于病毒繁殖。优选地，将7-8日龄的含胚胎的蛋用于病毒生长。将病毒接种到蛋的羊膜腔中。病毒在羊膜的细胞内复制，并且大量的病毒释放回羊水中。在接种后2-3天，可以收获羊水中的病毒。
细胞培养基：用于繁殖流感病毒的优选细胞培养基制剂包括但不限于以下培养基：Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco′smodified eagle media，DMEM)、基础的改良的Eagle培养基(basalmodified eagle media)、Optimem和Leibovitz-15(L-15)培养基。通常，细胞培养基补充有0.1-10个单位的胰蛋白酶。备选地，也可在细胞培养中使用2-100个单位的植物来源的胰蛋白酶等价物(例如Accutase)，以用于病毒的有效繁殖。可在存在或不存在动物来源的组分的情况下使用细胞培养基。补充动物来源组分的一个实例是终浓度为0.5-10％的经伽马射线照射的血清。
第2部分c)疫苗制备，灭活的或杀死的、亚单位和减毒的、修饰的-活的
灭活的或杀死的。在本发明的一个实施方案中，疫苗包括灭活的或杀死的H3N8流感病毒疫苗，其包含选自任何马或犬感染性流感毒株的H3N8马或犬毒株。参见Transmission of Equine Influenza to Dogs(P.C.Crawford等人，Science 310，482-485(2005))。疫苗也可包括源自猪的流感H3N8或者H3或N8亚型的任何流感。通过本领域熟知的方法制作灭活疫苗。例如，一旦病毒繁殖到高滴度，对本领域技术人员显而易见的是可通过本领域熟知的方法获得病毒抗原物质。例如，可以通过稀释、浓缩和提取来获得病毒抗原物质。所有这些方法都已用于获得合适的病毒抗原物质以生产疫苗。可通过使用福尔马林(例如0.1-10％)、β-丙内酯(BPL)(例如0.01-10％)或双吖丙啶(binary ethyleneimine，BEI)(例如1-10mM)处理或者使用本领域技术人员已知的其他方法来灭活病毒，其中双吖丙啶是优选的。提出了常用的条件和试剂，但其他试剂和浓度对本领域技术人员是显而易见的。
除了上文详述的杀死的病毒的生产外，多种减毒方法也是可以的并且是本领域中已知和经描述的并可用于本发明。导致产生修饰的活疫苗的减毒也是可以的。一些此类技术在此处和下文中描述。在更优选的减毒形式中包括在细胞培养中连续传代、在动物中连续传代、用于产生遗传修饰的多种方法以及紫外和化学诱变。
亚单位疫苗。另外，可通过重组表达技术来产生马和犬流感亚单位疫苗，其中包括但不限于异源原核表达(例如大肠杆菌、假单胞菌、沙门氏菌等)和异源真核表达(例如酵母[毕赤酵母，耶氏酵母(Yarrowia)]、昆虫细胞[杆状病毒]等)和病毒载体(例如犬腺病毒、人腺病毒、痘病毒、犬疱疹病毒)。
减毒的和修饰的-活的。从在细胞系和蛋中培养的流感病毒中制备减毒病毒犬疫苗，所述流感病毒优选地是源自流感的H3N8，其通过系列传代而被减毒，包括在亚最佳温度下系列传代至不再能够引起疾病，但仍能够引发保护性免疫应答的状态。
可通过在细胞培养物中系列传代野生型流感病毒毒株来实现流感病毒的减毒。病毒毒株可以在各种细胞系统中传代直到其失去产生疾病的能力而完全保留其免疫原性特征。一旦接种到寄主内，该病毒能够繁殖到一定的程度。也可以通过如下方式来获得合适的减毒病毒毒株：进行系列传代以获得过减毒的毒株。“过减毒”表示，用于减毒的传代数目显著高于通常对于去除病原性所需的数目。在这些许多次传代后，这些减毒的病毒保留了其抗原性，例如保留了其血凝素和神经氨酸酶抗原，从而其免疫原性能力没有被破坏。当施用时，这样的毒株几乎不产生症状和副反应，因此是安全、有效的疫苗。
可通过流感病毒毒株的冷适应来实现流感病毒的减毒。冷适应的流感病毒毒株可通过包括以下步骤的方法来产生：传代野生型流感病毒，随后选择在降低的温度下生长的病毒。例如通过下述方式可以产生冷适应的流感病毒：在逐渐更低的温度下，于含胚胎的鸡蛋中顺次传代野生型流感病毒，从而选择在降低的温度下稳定复制的在所述病毒混合物中的某些成员。冷适应的流感病毒毒株表现出温度敏感表型。温度敏感的冷适应的流感病毒在降低的温度下复制，但在特定的较高生长温度下不再在组织培养细胞中复制或形成噬斑，在所述温度下野生型病毒将复制和形成噬斑。温度敏感型病毒将会生长的温度在本文中是指对于该温度敏感型病毒而言的“许可”温度，并且温度敏感型病毒将不会生长但相应的野生型病毒将会生长的更高温度在本文中是指对于该温度敏感型病毒而言的“非许可”温度。例如，特定温度敏感型冷适应的流感病毒在30℃或低于30℃的温度下，在含胚胎的鸡蛋中复制，并且在大约34℃的许可温度下在组织培养细胞中形成噬斑，但在大约37℃的非许可温度下在组织培养细胞中不形成噬斑。某些冷适应的流感病毒可具有显性干扰表型。即，当与另一种流感病毒共感染细胞时，它们控制感染，从而损害该其他病毒的生长。也可通过重组方法来产生冷适应的流感病毒。在此方法中，鉴定出与经鉴定的冷适应、减毒、温度敏感性或显性干扰表型相关的一种或多种特异突变，并使用反向遗传学方法将其导回野生型流感病毒毒株中。反向遗传学需要使用从被流感病毒感染的细胞中分离的RNA聚合酶复合物以转录包含突变的人工流感病毒基因组区段，用辅助病毒将该合成的RNA区段合并入病毒颗粒中，随后选择包含所需变化的病毒。
第2部分d)疫苗佐剂、制剂、形式和载体。在本文中呈现的疫苗的组分优选地包括一种或多种佐剂。佐剂包括但不限于RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)铝盐，包括明矾(0.5-20％，更优选的是低于10％，更优选的是2和5％)，磷酸铝(0.5-20％，更优选的是低于10％，更优选的是2和5％)，氢氧化铝(0.5-20％的铝胶或吸附氢氧化铝凝胶(Rehydragel)，更优选的是低于10％，更优选的是2和5％)，胆固醇，水包油乳剂，油包水乳剂例如弗氏完全和不完全佐剂，嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)，SAF-M(Chiron，Emeryville CA)，
Figure A20068003710600201
佐剂，皂苷和皂苷类例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge MA)，GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)(优选的皂苷浓度为10-100微克，优选大约50微克)或者其他皂苷级分，单磷酰脂质A，阿夫立定脂质-胺(Avridinelipid-amine)佐剂，来自大肠杆菌的热不稳定肠毒素(重组或其他)，霍乱毒素，或胞壁酰二肽，此外还有许多其他佐剂。免疫原性组合物可进一步包含一种或多种其他免疫调节剂，例如白细胞介素、干扰素或其他细胞因子。免疫原性组合物还可包含庆大霉素和硫柳汞。
疫苗的组分可包括药学上可接受的赋形剂，包括载体、溶剂和稀释剂、等渗剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、免疫调节剂(例如白细胞介素、干扰素或其他细胞因子)、血管收缩剂、抗细菌剂、抗真菌剂等等。典型的载体、溶剂和稀释剂包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。代表性的等渗剂包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、乳糖等。可用的稳定剂包括明胶、清蛋白等。
依赖于施用途径、贮存要求等，以多种形式提供H3N8流感病毒疫苗。例如，可以将疫苗制备成适用于注射器、点滴器、喷雾器等的含水溶液和分散液，或者可以制备成冻干粉末，所述冻干粉末在使用前在盐水、HEPES缓冲液或第二犬疫苗的含水免疫原性级分等等中重构。
根据待使用的施用方式在药学上可接受的载体中配制用于本发明的任一实施方案的疫苗。本领域技术人员可以容易地配制疫苗，所述疫苗包含活的或杀死的马或犬流感或者其免疫原性片段、编码马或犬流感的重组病毒或细菌载体、其特异免疫原性片段、或者编码马或犬流感或其特异免疫原性片段的DNA分子。
在肌内注射为优选的情况下，等渗制剂是优选的。一般来说，用于等渗性的添加剂包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在特别的情况下，等渗溶液例如磷酸盐缓冲盐水是优选的。制剂可进一步提供稳定剂例如明胶和清蛋白。在一些实施方案中，向制剂中添加血管收缩剂。根据本发明的药学制剂以无菌且无热源的形式提供。然而，本领域技术人员熟知，用于包含本发明疫苗的优选制剂的药学上可接受载体是在由美国农业部或其他国家(例如加拿大或墨西哥或欧洲任何国家)的相当的政府机构所颁布的规定中批准用于任何犬疫苗、多肽(抗原)亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗和DNA疫苗的那些药学载体。因此，用于本发明疫苗的商业生产的药学上可接受载体是已经和将要被美国和其他国家适当的政府机构批准的载体。疫苗可进一步与药学上可接受的佐剂相混合。在本发明疫苗的某些制剂中，疫苗与其他犬疫苗相组合以产生多价疫苗产品，所述多价疫苗产品可以保护犬类免患由其他犬病原体引起的广泛多种的疾病。
疫苗组合物任选地可包含疫苗相容性的药学上可接受(即，无菌的且无毒的)液体、半固体或固体稀释剂，其作为药学媒介物、赋形剂或介质。稀释剂可包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖，及其他。稳定剂包括清蛋白及其他。可在疫苗组合物中使用任何本领域已知的佐剂，包括可代谢的和不可代谢的佐剂，基于油的佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)，基于分枝菌酸酯(mycolate)的佐剂(例如海藻糖二分枝菌酸酯)，细菌脂多糖(LPS)，肽聚糖(即胞壁质、黏肽或者糖蛋白例如N-Opaca、胞壁酰二肽[MDP]或MDP类似物)，蛋白聚糖(例如从肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中提取的)，链球菌制剂(例如OK432)，BiostimTM(例如01K2)，EP 109 942、EP180 564和EP 231 039的“Iscoms”，氢氧化铝，皂苷，DEAE-葡聚糖，中性油(例如miglyol)，植物油(例如花生油)，脂质体，和
Figure A20068003710600221
多元醇。
本发明的免疫原性组合物可根据施用途径制成各种形式。例如，免疫原性组合物可制成适于注射使用的无菌水溶液或分散液形式，或使用冻干技术制成冻干形式。冻干的免疫原性组合物通常维持在4℃，并可以在有或无佐剂的情况下在稳定化溶液(例如盐水或/和HEPES)中重构。
另外，本发明的免疫原性和疫苗组合物可包含一种或多种药学上可接受的载体。如本文使用的，“药学上可接受的载体”包括任何和全部溶剂、分散介质、涂覆剂、佐剂、稳定化试剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延缓剂等。载体必须在与本发明的组分相兼容并对待免疫的受试者无害的意义上是“可接受的”。通常，载体是无菌的和无热源的。
第2部分e)疫苗剂量和测定法。H3N8流感病毒疫苗的剂量大小通常依赖于施用途径而在大约2.0-0.1ml的体积范围内变化。灭活疫苗通常在灭活前包含103-109 TCID50的病毒水平。备选地，病毒制剂中的抗原含量优选具有10-10,000HA单位/ml的滴度的疫苗，其可以具有100-2000HA单位/ml，更优选100-1000HA单位/ml作为每剂的施用量。对于含有修饰的活病毒或减毒病毒的疫苗，治疗有效剂量一般在大约105 TCID50-大约108 TCID50的范围内变化，包括端值。对于包含亚单位抗原(例如流感H3或N8蛋白)的疫苗，治疗有效剂量一般在大约10μg-大约100μg的范围内变化，包括端值。尽管技术人员可以容易地确定在本发明文情况下可用的佐剂和添加剂的量和浓度，但是本发明设想了包含大约50μg-大约2000μg佐剂的组合物，优选大约500μg/2ml剂量的疫苗组合物。
测定法。可通过病毒分离或通过病毒抗原、病毒RNA或特异抗体检测方法来检测流感病毒。用于检测病毒或病毒组分的方法包括肺组织、鼻上皮细胞或细支气管灌洗液的免疫荧光，组织样品的免疫组织化学，酶联免疫吸附分析(ELISA)，聚合酶链式反应(PCR)，细胞培养和免疫过氧化物酶，荧光抗体染色以确定病毒类型和亚型，以及快速酶-免疫分析膜测试。通常就流感病毒来进行评估的组织包括肺、肺灌洗液、扁桃体、气管、脾以及血清。特异地靶向各种病毒表位(即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表位)的单克隆抗体也是可用的。用于流感诊断的最常见血清学测定法是血凝素抑制(HI)测定法。其优点之一是，它可以区分不同的亚型和一个亚型内的抗原变体。可使用源自马、犬、猪和鸟的血清来进行HI测定法。用于测量抗体的更精确的方法是通过单辐射溶血(single radial hemolysis，SRH)技术。SRH比HI测定法更灵敏，并具有更高的精确度。带面积增加50％代表了抗体的产生并且是最近被感染的证据。
第2部分f)施用的时机和途径。狗的接种优选地在6周龄，更优选8周龄或更老的狗上进行。狗优选地接受2个剂量，每个剂量通常分别相隔3-4周施用，优选地相隔3周，通过皮下注射(SC)，这些依赖于狗的状态及其环境。这将会得到完整的、广泛的免疫原性应答。在本发明的另一个实施方案中，狗经历一系列共3次免疫接种以产生完整的、广泛的免疫应答。推荐每年使用单剂量进行再免疫接种。如果需要，狗任选地在第3和或第6个月进行加强免疫。优选的途径是皮下注射(使用大约1mL)，但是肌内注射(IM)(使用大约1mL)或者皮内(ID)注射(使用0.1-0.3mL)、口服、口鼻或鼻途径(使用0.2-0.5mL)也是优选的。其他时间、注射位点、使用的量和施用类型对本领域技术人员是显而易见的。
本发明疫苗的任一实施方案的施用途径包括但不限于皮内、肌内、眼内、腹膜内、静脉内，口服、口鼻和皮下，以及吸入、栓剂和经皮。优选的施用途径包括皮内、肌内、腹膜内、口鼻和皮下注射。疫苗可以通过任何手段施用，包括但不限于注射器、喷雾器、弥雾机(misters)、无针注射装置或微粒轰击基因枪(生物射弹轰击)。第3部分.所选疫苗的生产、制造、配制和施用的具体描述
在本文中，我们提供了关于用于治疗犬流感的杀死或灭活的单价疫苗的更详细具体描述。
第3部分a)杀死的和或灭活的病毒单价犬流感疫苗
使用在上述第1部分中描述的任何抗原，包括优选的源自犬或马流感的流感来源的H3N8抗原，包括灭活的和有佐剂的(adjuvanted)H3N8流感病毒培养物。
杀死的或灭活的病毒二价犬流感疫苗
使用在上述第1部分中描述的任何抗原，优选地源自犬和马流感的流感来源的H3N8抗原，灭活的和有佐剂的H3N8流感病毒培养物。然而，所述犬抗原源自一种犬流感病毒而所述马抗原源自一种马流感病毒。犬抗原也可由2种犬流感病毒或2种马流感病毒组成。
杀死的或灭活的病毒三价犬流感疫苗
使用在上述第1部分中描述的任何抗原，但更优选地源自犬或马流感的流感来源的H3N8抗原，灭活的和有佐剂的H3N8流感病毒培养物。描述了下列三价疫苗：a)犬抗原源自一种犬流感病毒而马抗原源自2种马流感病毒，b)犬抗原源自2种犬流感病毒而马抗原源自一种马流感病毒，c)犬抗原源自3种犬流感病毒和或马抗原源自3种马流感病毒。描述了以上内容的任何组合以制作三价疫苗。
第3部分b)杀死的或灭活的疫苗的生产和抗原浓度
在该部分中描述的疫苗可通过在细胞中生长所选的病毒来生产。病毒的生产优选地在马或犬哺乳动物细胞培养物中进行，在蛋中的病毒(抗原)的生长或产生也是优选的。狗肾细胞系是更优选的。病毒繁殖也可在任何可用的培养基中完成，包括可以来自猫、马、牛、鸟或猪细胞系的许可细胞系。疫苗应当在灭活前包含105-108 TCID50的病毒水平。备选地，可通过血细胞凝集抑制(HI)试验或血细胞凝集测定法来分析病毒制剂。使用这种测定法，优选滴度为10-10,000HA单位/ml，更通常地100-2000HA单位/ml，更常常地100-1000HA单位/ml的疫苗作为施用量。
杀死的或灭活的病毒生长：细胞系和含胚胎的蛋。用于生长流感病毒的优选的细胞培养系统是传统的粘附单层培养。备选地，也可使用悬浮和微载体细胞培养系统。优选的微载体是Cytodex 3微载体珠(Amersham Biosciences Ltd.)。用于培养细胞系和繁殖流感病毒的优选容器是滚瓶形式，优选的滚瓶表面积是1760cm2，但可在850-4250cm2的范围内变化。优选的感染复数(MOI)是0.001-0.1，但可在0.0001-2.0的范围内变化。优选地从细胞培养物中收获病毒是在感染后第2天至第5天，但可在感染后第1天至第7天的范围内变化。
细胞培养基：用于繁殖流感病毒生长的优选细胞培养基制剂包括但不限于以下培养基：Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、基础的改良的Eagle培养基、Optimem和Leibovitz-15(L-15)培养基。通常，细胞培养基补充有0.1-10个单位的胰蛋白酶。
第3部分c)杀死的和灭活的灭活。产生后，可使用本领域常用的任何方法来杀死或灭活病毒。更优选的方法是使用BEI来灭活病毒液体，如在下文中描述的。使用福尔马林和BPL来灭活含病毒的液体也是可用的。
第3部分d)杀死的或灭活的疫苗佐剂、制剂、形式和载体。第1部分的抗原以及特别是灭活的或杀死的病毒可以以各种方式进行配制以产生可用的疫苗。优选的制剂是将杀死的疫苗与佐剂相组合。许多佐剂可与本发明的疫苗一起使用，应注意到其中有几种是优选的。佐剂的量通常包括在1mL剂量中大约25μg-大约1000μg，包括端值。对犬流感疫苗特别有用的佐剂如下，其也可以联合使用，优选的组合是：铝盐，包括明矾(0.5-20％，更优选的是低于10％，更优选的是2和5％)、磷酸铝(0.5-20％，更优选的是低于10％，更优选的是2和5％)、氢氧化铝(0.5-20％的铝胶或吸附氢氧化铝凝胶(Rehydragel)，更优选的是低于10％，更优选的是2和5％)，
Figure A20068003710600261
佐剂，皂苷类(优选的是1-100ug范围内的Quil A或QS-21或QA-21，CambridgeBiotech Inc.，Cambridge MA)，GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)，其中优选的皂苷浓度为10-100微克并且优选的是大约50微克，胆固醇，或其他合成的聚合物，DEAE葡聚糖，角鲨烯等。
优选的佐剂和组合物是：2、3、4或5％的明矾，明矾与QuilA、胆固醇的任意组合，使用任何已知的市售疫苗佐剂和制剂。特别优选的是单独的2-5％明矾，单独的Quil A，和被称为“QAC”的Quil A和胆固醇。QAC可单独使用或与另外的Quil A和胆固醇联合使用。也可以使用其他已知的佐剂。可以调整疫苗的其他组分以修饰疫苗的物理和化学性质。例如，佐剂的量通常为在1mL剂量中大约25μg-大约1000μg，包括端值。相似地，本文所描述的疫苗可以与抗生素相组合，所述抗生素的量通常为在1mL剂量中大约1μg-大约60μg，包括端值。可以有其他成分。
第3部分e)杀死的或灭活的疫苗剂量和测定法。H3N8流感病毒疫苗的剂量大小通常依赖于施用途径而在大约2.0-0.1ml的体积范围内变化。对于含有修饰的活病毒或减毒病毒的疫苗，治疗有效剂量一般在大约105 TCID50-大约108 TCID50的范围内变化，包括端值。对于包含亚单位抗原(例如流感H3或N8蛋白)的疫苗，治疗有效剂量一般在大约10μg-大约100μg的范围内变化，包括端值。对于包含灭活流感病毒的疫苗，该疫苗应当在灭活前包含103-109 TCID50的病毒水平。疫苗优选地具有100-1000HA单位/ml，作为所施用的量/剂。最优选的是大约640HA/剂。
第3部分f)杀死的或灭活的，施用的时机和途径。参见第2部分f的免疫接种的时机。优选的途径是皮下注射(SC)(使用大约1mL)，但是肌内(IM)(大约1mL)或皮内(使用1.0-0.2mL)以及口鼻和鼻(使用0.2-0.5mL)也是优选的。
第4部分.疫苗的组合
本发明的抗原和疫苗可以与其他产品或疫苗相组合。例如，它们可以以液体或干燥级分与Pfizer’s Canine系列产品(包括许多产品)和或Pfizer’s Canine Vanguard
Figure A20068003710600272
系列产品(也包括许多产品，包括Vanguard Plus CCV/
Figure A20068003710600273
)和其他组合相组合，以提供针对主要幼犬疾病的完全保护。马或犬流感病毒抗原可在任何各种组合物中与下述犬抗原相组合：犬副流感病毒(CPIV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒-1(CAV-1)、犬腺病毒-2(CAV-2)、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、流感伤寒钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)、出血黄疸钩端螺旋体(Leptospira icterohaemorrhagiae)、波摩那钩端螺旋体(Leptospira pomona)、布拉迪斯拉发钩端螺旋体(Leptospirabratislava)、犬呼吸道冠状病毒(CRCV)、肠道犬冠状病毒(CCV)、牛冠状病毒(BCV)和支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)抗原。
另外，本发明的马或犬流感病毒抗原和疫苗可与支气管炎博德特氏菌(p68或
Figure A20068003710600274
或Canvac
Figure A20068003710600275
)和/或犬副流感病毒(CPIV)和/或犬呼吸道冠状病毒(CRCV)和/或牛冠状病毒(BCV)疫苗相组合，从而提供预搭载(pre-boaridng)疫苗以针对犬窝咳嗽(kennel cough)的常见病因进行保护。组合疫苗的起始剂量可为相隔3周的2次1mL剂量，在随后的搭载(boardings)前可给予单次1mL加强免疫。
第5部分.疫苗的具体实例
特别提供以下疫苗。
实例1-3生长的哺乳动物细胞
在a)2或5％明矾或者b)QAC中的细胞来源的Pfizer马H3N8(A/Equine/2/Miami/1/1963)。
实例4-6生长的哺乳动物细胞
在a)2或5％明矾或者b)QAC中的细胞来源的Pfizer临床分离物犬H3N8A/Canine/Iowa/9A1/B5/D8/D12。
实例7-9生长的禽蛋
在a)2或5％明矾或者b)QAC中的蛋来源的Pfizer马H3N8。
实例10-11生长的禽蛋
在a)2或5％明矾或者b)QAC中的蛋来源的Pfizer临床分离物犬H3N8。
第6部分.疫苗测试程序的具体实例
本发明的疫苗可以使用下述方法来评估和验证。
对6周龄或更大的目的育种研究用狗施用此处描述的疫苗。以每组5-20只将狗分配到疫苗组中。疫苗通过皮下或肌内途径，以相隔3周的2次1mL剂量或2次0.5mL剂量进行施用。对照狗给予安慰剂疫苗。在第一次和第二次免疫接种的当日，然后在第二次免疫接种后以及在攻击后每周2次，从每只狗中收集血清样品。通过HI(血细胞凝集抑制)或SRH(单辐射溶血)就对于疫苗抗原的血清转化来测试来自经免疫接种的狗的血清。在第二次免疫接种后的第14天或第28天，通过鼻内或口服途径(其可包括气管内)采取气雾剂或小液滴的形式，用H3N8对狗进行攻击。攻击后，通过监视临床征兆例如呼吸道症状、发热、厌食、嗜睡来观察狗的疾病临床征兆。通过在攻击后每隔一天擦拭经免疫接种的狗和未经免疫接种的对照并进行10-14天来收集鼻腔分泌物以测量攻击病毒的泄出。通过细胞组织培养(优选地狗肾)来证实泄出病毒的存在。在攻击后，从一亚组的狗中收集组织样品，包括气管、扁桃体、肺。如上所述或通过免疫组织化学分析来证实狗组织样品中病毒的存在。通过比较攻击病毒的泄出和组织样品中病毒，用有效疫苗免疫接种的狗与未经免疫接种的对照狗相比具有更低的病毒载量或更低的病毒量。与未经免疫接种的对照相比，有效的疫苗在经免疫接种的动物中会导致产生更低的病毒载量或更低的病毒量，并且经免疫接种的动物会显示出与流感感染相关的临床征兆的降低。
具体的实例
在狗中犬流感疫苗的攻击和功效研究评估。关于在犬类中提供抗流感病毒的交叉保护来评估马流感疫苗，杀死的病毒。
为评估马流感病毒的血清保护；包含A/Equine/2/Miami/1/63和A/Equine/Ohio/1/2003的疫苗，将7-10周龄的狗分配到9个治疗组之一中(表2)。在研究的第0天和第21天，通过皮下途径用1.0mL剂量免疫接种狗。在研究的第0天(第一次免疫接种)、第21天(第二次免疫接种)和第35天(第二次免疫接种后14天)从所有参与研究的狗中收集血液以得到血清。分析所有血清样品的对于Miami63、Ohio03和CIV的HAI。血清学应答数据呈现在表3中。在研究的第35天，在下列IVP组中证明了与未经免疫接种的动物相比较的血清学滴度的统计学显著差异：T02、T03、T04、T06、T07、T08和T09(表3)。另外地，在研究的第21天，在下列IVP组中观察到统计学显著差异：T06、T07、T08和T09(表3)。
初步安全性
除了测量血清学应答外，在本研究中还评估了初步疫苗安全性。总的来说，在任何进行评估的IVPs中没有观察到临床上重要的疫苗相关反应。在研究过程中没有观察到疫苗相关的系统反应。另外地，在任何治疗组中在第一次免疫接种后没有观察到注射位点肿胀。在第21天(第二次免疫接种前)，在来自5个治疗组的34只动物中，通过触诊注射位点检测到小的肿胀。在这些组中，4个组(T02、T03、T06和T07)用2％明矾作为佐剂，而第5个治疗组(T09)用Quil-A/胆固醇/加其他佐剂作为佐剂。在治疗期间，第21天肿胀的几何平均体积的大小范围是0.07-0.24cm3。
在第二次免疫接种后，在研究的第22-24天，在87只动物中的58只之中观察到注射位点肿胀。这些肿胀在免疫接种后24小时(第22天)到达峰值，并在研究的第24天尺寸减少直至消退。没有注射位点肿胀在触摸时疼痛或发热，而发现有5个肿胀在触摸时坚硬。
关于在犬类中提供抗流感病毒的交叉保护通过攻击来评估马流感疫苗，杀死的病毒
9个治疗组中的6个用CIV进行攻击：T01、T02、T03、T06、T07和T09。在研究第0天，即攻击当日，在用大约1∶8/50ml的HA进行第二次免疫接种后6周，动物显示出大约6.9logs/mL的CIV。在与猪流感病毒呼吸道疾病模型相似的模型中，通过气管内途径攻击狗。在所有动物中每日观察与呼吸道疾病相关的临床征兆：流鼻涕、流眼泪、打喷嚏、恶心、厌食、抑郁和咳嗽。另外地，每日收集鼓室温度和用于病毒分离的鼻/咽拭子。
每日报道并跟踪临床观察，直到大约50％的经攻击的动物表现出呼吸道疾病的临床征兆。攻击后5天，59只经攻击的动物中的31只表现出一种或多种以下临床征兆：流鼻涕、流眼泪和/和咳嗽。因此，在研究的第5天，对所有动物实施安乐死并进行尸体解剖。记录肺实变得分并收集样品用于病毒分离。
肺实变百分比得分表明，使用这种攻击可以实现呼吸道疾病的成功证实。所有动物中的实变百分比范围是从9只动物中的60％，至8只动物中的10-35％实变，26只动物表现出＜10％实变，和16只动物表现出无实变(图2)。治疗组中，具有肺实变的动物的数目呈现在表5中。尽管在治疗组和阴性对照之间观察到数字上的差异，但没有检测到在肺实变、肺和扁桃体组织中病毒分离方面的统计学显著差异(表6)。从肺灌洗液样品中，在阴性对照与T02、T07和T09之间检测到在病毒分离结果方面的统计学显著差异(P＜＝0.05)(表7)。
表2.用于犬血清转化研究的治疗组
  组   IVP
  T01   盐水-阴性对照
  T02   Miami 63-320HAI剂量-2％明矾
  T03   Miami 63-640HAI剂量-2％明矾
  T04   Miami 63-320HAI剂量-Quil-A/胆固醇
  T05   Miami 63-640HAI剂量-Quil-A/胆固醇
  T06   Ohio 03-320HAI剂量-2％明矾
  T07   Ohio 03-640HAI剂量-2％明矾
  T08   Ohio 03-640HAI剂量-Quil-A/胆固醇
  T09   Ohio 03-640HAI剂量-Quil-A/胆固醇/加其他佐剂
表3.在用马流感抗原疫苗(36252)免疫接种的狗中的血清学滴度数据总结
表4.在每一个研究日治疗组的阳性注射位点反应的频率分布
Figure A20068003710600321
表5.具有正肺实变得分的动物的数目/治疗组
  IVP   T01   T02   T03   T06   T07   T09
  阳性数目   8   5   9   7   5   9
  阴性数目   2   4   1   3   5   1
Figure A20068003710600322
表7.从治疗组的肺灌洗液样品中的病毒分离
Figure A20068003710600331
*表示在T01和治疗组之间具有统计学显著差异(p≤0.05)
具体描述的结论
应当认识到，在本说明书和所附的权利要求书中使用的单数表达(例如“a”、“an”和“the”)是指一个物体或多个物体，除非上下文另有清晰说明。因此，例如，当提及包含“化合物”的组合物时，可包括单种化合物或者2种或更多种化合物。
应当理解，上述描述意在举例说明而非限制性的。通过阅读上述描述，许多实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，本发明的范围应当根据所附权利要求书来确定，包括这些权利要求所授予的等价形式的全部范围。所有的文章和参考文献(包括专利、专利申请和出版物)的公开内容以其整体并为所有目的引入本文。
根据本公开内容，可以制备和实施本文所公开的和要求保护的所有组合物和/或方法，而不需要过度的实验。尽管本发明的组合物和方法以优选实施方案的形式进行了描述，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，变化形式可应用于所述组合物和/或方法，以及应用在本文描述的方法的步骤或步骤的顺序中，而不背离本发明的构思、精神和范围。更特别地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可替代本文所描述的试剂并达到相同或相似的结果。对于本领域技术人员来说显而易见的所有这样的类似替代和修饰被认为在所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和构思之中。

Claims (18)

1.针对流感病毒来免疫狗的方法，该方法包括对狗施用治疗有效量的包含至少一种减毒或杀死的流感病毒的疫苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒选自H3、N8和或H3N8亚型，及其任何组合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述病毒是流感H3N8亚型。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述病毒来自犬或马来源。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述病毒能够或不能够被传染至狗。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述病毒能够被传染至狗。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述病毒不能够被传染至狗。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述病毒的量是10-10000HA单位。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述病毒的量是100-1000HA单位。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述病毒来自马来源。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述病毒是马流感病毒。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述病毒来自抗原马流感毒株A/Equine/2/Miami/1/63。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述病毒选自：
a)马流感毒株A/Equine/2/Miami/1/63，和或
b)马流感毒株A/Equine 2/Miami/1/63，传代和保藏的种子毒株Master Seed Virus，Lot 3 17-9，标记为Equine Flu A2，3 17-9MSV，1 1-2 1-86。
14.根据权利要求5所述的方法，其中所述病毒来自犬来源。
15.根据权利要求1-14所述的方法，其中所述病毒被杀死。
16.根据权利要求1-14所述的方法，其中所述疫苗进一步包含佐剂，其中所述佐剂可选自：a)可代谢的佐剂，b)不可代谢的佐剂，c)2％明矾，d)5％明矾，e)Quil A，和f)胆固醇或其任何组合。
17.生产疫苗的方法，其中所述疫苗包括权利要求1-14中任一项所述的疫苗组合物。
18.权利要求1-14中的疫苗在制备用于针对流感病毒来免疫狗的药物中的用途，所述药物包含治疗有效量的含有至少一种减毒或杀死的流感病毒的疫苗。
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