ES2277893T3 - Acidos nucleicos y proteinas del gen mhp3 de mycoplasma hyopneumoniae y usos de los mismos. - Google Patents

Acidos nucleicos y proteinas del gen mhp3 de mycoplasma hyopneumoniae y usos de los mismos. Download PDF

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Abstract

Una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº 4, en la que dicha proteína no tiene una cisteína acilada por ácidos grasos seguido de la secuencia de aminoácidos Trp Asp Lys Glu, y no tiene una homoserina lactona C-terminal.

Description

Ácidos nucleicos y proteínas del gen mhp3 de Mycoplasma hyopneumoniae, y usos de los mismos.
El gen mh3 codifica una proteína de Mycoplasma hyopneumoniae. La presente se refiere a nucleótidos y proteínas de mh3. La presente invención se refiere además a antígenos de apoproteína novedosos codificados por mh3 para uso en vacunas para prevenir y tratar enfermedades provocadas por infección con Mycoplasma hyopneumoniae, y procedimientos para la producción recombinante de tales antígenos.
Antecedentes de la invención
Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) es un patógeno bacteriano que provoca neumonía micoplasmal enzoótica de cerdos. La neumonía micoplasmal enzoótica es una enfermedad crónica que da como resultado una conversión de alimento escasa, crecimiento atrofiado y predisposición a infecciones pulmonares secundarias. Mycoplasma hyopneumoniae se transmite fácilmente a través de las secreciones del tracto respiratorio y mediante transmisión de cerdo a lechón, y se extiende en gran medida en las granjas de cerdos. Aproximadamente 99% de las piaras de cerdos de los Estados Unidos están infectadas, costando a la industria de cerdos aproximadamente 300 millones de dólares anualmente de acuerdo a una estimación de 1991.
No existe ningún ensayo sencillo para la detección de M. hyopneumoniae, ni son medidas eficaces contra la infección. El ensayo para la detección de M. hyopneumoniae se ha complicado por la reactividad cruzada de anticuerpos dirigidos contra M. hyopneumoniae a otras especies de micoplasmas porcinos. El campo de la vacuna para la mayor parte ha estado dependiendo de las preparaciones de membranas con adyuvante o células enteras de M. hyopneumoniae que no han inducido respuestas inmunes significativas. De manera adicional, la clonación y expresión de genes de M. hyopneumoniae ha fracasado para producir proteínas que son de manera suficiente protectoras para uso en
vacunas.
Debido a la carencia de vacunas adecuadas, la neumonía micoplasmal enzoótica ha estado en gran medida contenida mediante la detección y aislamiento de animales infectados. El tratamiento de animales infectados por M. hyopneumoniae con antibióticos se ha encontrado con un éxito limitado en la reducción del curso de la infección.
De este modo, existe una gran necesidad de encontrar medios de prevención de la extensión de esta enfermedad, o bien mediante la prevención de la infección o cura. Una solución para la prevención es la inmunización. La capacidad de producir grandes cantidades de proteínas o péptidos de M. hyopneumoniae antigénicos in vitro para uso en formulaciones de vacuna avanzarían por lo tanto en gran medida el desarrollo de vacunas preventivas.
La solicitud de patente internacional WO 96/28472 identifica seis especies de antígenos de proteína de M. hyopneumoniae a pesos moleculares de 46 - 48, 52 - 54, 60 - 64, 72 - 75, 90 - 94 y 110 - 114 kilodaltons, y describe secuencias de proteínas parciales de los antígenos de 52 - 54, 60 - 64 y 72 - 75 kilodaltons y el nucleótido de longitud completa y secuencias de aminoácidos del antígeno de 46 - 48 kilodaltons. El antígeno de 46 - 48 kilodaltons, al que se denominará de aquí en adelante como P46, corresponde al antígeno de 44 kilodaltons de la patente de Estados Unidos Nº 5.252.328 de Faulds y un antígeno de 48 kilodaltons descrito en Lee (Lee y col., 1996, J. Chromatogr. 737: 273 - 279), como se determina en la base de las descripciones de Fauldsy Lee de secuencias de péptidos parciales. El gen que codifica P46, es decir p46, también fue clonado por Futo y col., (1995; J. Bacterial 177: 1915 - 1917(. Más tarde, el mismo grupo mostró que el producto génico expresado in vitro era útil en la diagnosis de respuestas de anticuerpos responsables de infecciones por M. hyopneumoniae sin reactividad cruzada a otras especies de Micoplasma (Futo y col., 1995, J. Clin. Microbiol. 33: 680 - 683). Las secuencias y uso diagnósticos del gen p46 descrito por Futo y col., se describen además en la solicitud de patente europea Nº 0 475 185 A1.
La secuencia de péptidos parcial del antígeno 60 - 64 kilodaltons del antígeno de 60 - 64 kilodaltons del documento WO 96/28472 tiene una homología significativa con una proteína llamada P102 (véase más adelante). Además, el antígeno tiene una homología significativa de un antígeno de 64 kilodaltons descrito por Faulds (patente de Estados Unidos Nº 5.252.328).
El antígeno de 72 - 75 kilodaltons del documento 96/28472 corresponde a una proteína de 65 kilodaltons descrita por Wise y Kim (1987, J. Bacterial., 169: 5546 - 5555 y la patente de Estados Unidos Nº 5.788.962) y se denominará de aquí en adelante como P65.
El antígeno de 52 - 54 kilodaltons, al que se mencionará de aquí en adelante como Mhp3, puede corresponder a la proteína de membrana integral de 50 kilodalton descrita por Wise y Kim (1987, J. Bacterial., 169: 5546 - 5555) y/o la especie de proteína de 52 kilodaltons descrita en Faulds (patente de Estados Unidos Nº 5.252.328). El antígeno de 52 - 54 kilodaltons se denomina de aquí en adelante MHP3. El documento 96/28472 describe las secuencias del extremo amino de la proteína madura y de un fragmento interno de bromuro de cianógeno.
El antígeno de 90 - 94 kilodaltons del documento WO 95/28472 puede corresponder a la adhesina p97 como se describe por Hsu y col., que se describe más adelante.
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El documento WO 96/28472 describe además los resultados de ensayos de vacunas que usan el antígeno de 60 - 64 kilodaltons, P46 o una combinación de P65 y Mhp3. Las vacunaciones inducían una protección significativa de la infección por M. hyopneumoniae.
Existen múltiples reseñas con respecto a proteínas de membrana externa de M. hyopneumoniae en la bibliografía científica y de patentes. Por ejemplo, Wise y Kim (1987, J. Bacterial., 169: 5546 - 5555) reseñan que existen cuatro especies de proteínas de membrana integral en M. hyopneumoniae, denominadas p70, p65 (P65, anteriormente), p50 y p44, y que las tres últimas están modificadas por uniones lipídicas covalentes e inducen una fuerte respuesta inmune humoral. Los efectos protectores de la respuesta inmune no se investigaron. El gen que codifica la proteína P65 se clonó, y sus secuencias y sus usos, por ejemplo en vacunas y diagnósticos se describen en la patente de Estados Unidos Nº 5.788.962.
La solicitud de patente internacional WO 91/15593 describe cinco proteínas de M. hyopneumoniae de pesos moleculares aparentes de 105, 90, 85, 70 y 43 kilodaltons. Se proporcionó una secuencia de longitud completa del gen que codifica la proteína de 85 kilodaltons (proteína C), como eran las secuencias de nucleótidos parciales que codifican las otras cuatro proteínas. Ensayos de vacuna que usan la proteína C proporcionó a los animales de ensayo una protección "significativa" contra M. hyopneumoniae.
La patente de Estados Unidos Nº 5.252.328 de Faulds describe secuencias de amino terminal de proteínas M. hyopneumoniae inmunorreactivas, los pesos moleculares de los que son 36, 41, 44, 48, 64, 68, 74,5, 79, 88,5, 96 y 121 kilodaltons. Otras proteínas identificadas basándose en las movilidades electroforéticas pero para las que no se describieron secuencias de proteínas tenían pesos moleculares aparentes de 22,5, 34 y 52 kilodaltons. Mientras que la patente de Estados Unidos Nº 5.252.328 proponía el uso de estas proteínas en las formulaciones de vacunas, no se reseñaron resultados de ensayos de vacunas.
La solicitud de patente internacional WO 95/09870 describe procedimientos bioquímicos para la purificación de adhesinas de M. hyopneumoniae, las proteínas de membranas integrales de micoplasmas responsables de la adhesión a los cilios del epitelio respiratorio superior de los huéspedes. El documento WO 95/09870 también propone ensayos y usos para estas proteínas, por ejemplo en vacunas y diagnósticos. Sin embargo, no se reseñó clonación de genes de adhesinas hasta que un gen denominado p97 se clonó y su producto, de aquí en adelante "P97", mostró que juega un papel en la capacidad del organismo para unirse a células ciliadas dentro del tracto respiratorio de cerdos infectados por M. hyopneumoniae (Hsu y col., 1997, J. bacterial. 179: 1317 - 1323). Un artículo de investigación de King y col., (1997, Vaccine 15: 25 - 35) describía Mhp1, una adhesina de 124 kilodaltons que es una variante de cepa de P97. Sin embargo, intentos a cerdos vacunados contra M. hyopneumoniae que usan una proteína de fusión GST - Mhp1 no dio como resultado una protección estadísticamente significativa contra neumonía micoplasmal enzoótica. Una variante de 94 kilodaltons de P97 se identificó por Wilson y col., (1998, Microbiology 144: 1931 - 1943). De manera adicional, el gen p97 se mostró que es parte de un operón que también codifica una segunda proteína, denominada P102, de un peso molecular predicho de aproximadamente 102 kilodaltons (Hsu y col., Gene 214: 13 - 23). Minino y Hsu sugieren el uso de P102 en vacunas en la solicitud de patente internacional WO 99/26664 pero no reseñan ensayos de vacunas.
Sumario de la invención
La presente invención abarca nucleótidos y proteínas del gen mhp3 de M. hyopneumoniae. La presente invención también abarca antígenos de apoproteína novedosos por el gen mhp3 para uso en vacunas para prevenir y tratar enfermedades provocadas por infección con M. hyopneumoniae. También se proporcionan procedimientos para la producción recombinante de apo-Mhp3.
La invención proporciona una formulación de vacuna que comprende un polipéptido antigénico o inmunogénico que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ. ID. Nº 4, en la que dicho polipéptido no tiene una cisteína acilada por ácido graso por la secuencia de aminoácidos Trp Asp Lys Glu, y no tienen una homoserina lactona C-terminal, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. en una realización preferida, el polipéptido antigénico o inmunogénico se expresa como una proteína de fusión de tioredoxina, preferiblemente mediante clonación en el vector de expresión pBAD/Tio-TOPO, y producida por una cepa de E. coli. En una realización altamente preferida, la vacuna además comprende al menos un polipéptido seleccionado entre el grupo constituido por M. hyopneumoniae. P46, P65, P97 y P102 y fragmentos, variantes y derivados de los mismos.
La invención proporciona un uso en la fabricación de de una formulación de vacunas para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un animal provocada por la infección con M. hyopneumoniae de un polipéptido antigénico o inmunogénico que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEQ ID Nº 4. En una realización preferida, el animal es un cerdo.
La invención además proporciona kits para la detección de M. hyopneumoniae. En una realización, el kit proporciona reactivos para la detección de anticuerpos circulantes contra la proteína Mhp3 de M. hyopneumoniae.
Esta invención proporciona una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID. Nº 4, en la que dicha proteína no tiene una cisteína acilada por ácido graso seguida por la secuencia de aminoácidos Trp Asp Lys Glu, y no tienen una homoserina lcatoca C-terminal. En otra realización, la proteína es una proteína de fusión. En una realización adicional, la proteína de fusión es una proteína de fusión de tioredoxina.
Esta invención proporciona cualquiera de las proteínas anteriores, que es una proteína aislada. esta invención también proporciona una composición que comprende cualquiera de las proteínas anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptables. En una realización, la composición comprende además un adyuvante. En otra realización, la composición comprende además al menos un polipéptido seleccionado entre el grupo constituido por P46, P65, P97 y P102 de M. hyopneumoniae.
Esta invención proporciona una proteína inmunogénica que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID Nº 4, en la que la proteína inmunogénica no tiene una cisteína acilada por ácido graso seguida de las secuencias de aminoácidos Trp Asp Lys Glu, y no tiene una homoserina lactona C-terminal.
Esta invención proporciona un uso en la fabricación de una formulación de vacunas para tratar o prevenir una secuencia de enfermedad que comprende la SEQ ID Nº 4, en la que dicha proteína no tiene una cisteína acilada por ácido graso seguida de las secuencias de aminoácidos Trp Asp Lys Glu.
En una realización de cualquiera de los uso anteriores, dicho animal es un cerdo.
Esta invención proporciona un ADN que codifica en el código genético universal una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 4, o su complemento.
En otras realizaciones el ADN anterior está unido operativamente a un promotor heterólogo. En esta invención, el ADN unido operativamente a un promotor heterólogo es ADN aislado. En todavía otras realizaciones, cualquiera de los ADN anteriores comprende además un origen de replicación activa en una célula procariótica. En otras realizaciones, cualquiera de los ADN anteriores comprende un origen de replicación activa en una célula eucariótica.
Esta invención proporciona una célula huésped que comprende cualquiera de los ADN anteriores unidos operativamente a un promotor heterólogo en una realización, la célula huésped es E. coli BL21 y dicho ADN es el vector de de expresión pBAD/Tio-TOPO.
Esta invención proporciona un procedimiento para la producción de apo-Mhp3, comprendiendo dicho procedimiento (i) hacer crecer las células anteriores en condiciones en las que apo-Mhp3 se expresa, y (ii) recuperar dicha proteína. En una realización, dicha proteína se recupera en una forma soluble. En otra realización, dicha proteína se recupera en una forma insoluble.
Esta invención proporciona un uso en la fabricación de una formulación de vacuna para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un animal provocada por la infección con Mycoplasma hyopneumoniae de cualquiera de los ADN anteriores. En una realización dicho animal es un cerdo.
Esta invención proporciona un kit que comprende en al menos un contenedor una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº 4 como se ha definido anteriormente y una exposición indicando que el kit es útil para la diagnosis de infección por M. hyopneumoniae. En una realización, el kit comprende además un anticuerpo secundario anti-cerdo, y en una realización adicional el anticuerpo secundario se conjuga a una enzima que cataliza una reacción colorimétrica. En todavía otra realización, la enzima se selecciona entre el grupo constituido por fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano picante, e incluso en otra realización adicional, el kit comprende además reactivos para un ensayo colorimétrico.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 es un alineamiento de secuencia Clustal W (1.7) entre M. hyopneumoniae (SEQ ID Nº 2) y Ag234-5 (SEQ ID Nº 41), originalmente pensado para originarse a partir de M. arginini pero posteriormente mostrado para derivarse a partir de M. hyorhinis. La identidad de aminoácidos se muestra mediante asteriscos (*), se indican las sustituciones altamente conservadoras mediante dos puntos (:), y las sustituciones conservadoras se indican mediante puntos (.). En conjunto, las dos proteínas comparten 36,2% de identidad de aminoácidos.
La Fig. 2 es una transferencia de Western que demuestra la reactividad de anticuerpos a partir de un cerdo expuesto experimentalmente con M. hyopneumoniae contra extractos de proteína de M. hyopneumoniae, M. hyorhinis, o M. mycoides, o contra Mhp3 recombinante purificado.
Abreviaturas y definiciones
La abreviatura M, cuando precede al nombre de una especie, se refiere al género Micoplasma.
El término "mhp3 recombinante" se refiere a un ácido nucleico que codifica el antígeno Mhp3 en el código genético universal. "mhp3 de M. hyopneumoniae" se refiere a un ácido nucleico que codifica el antígeno de Mhp3 en el código genético de M. hyopneumoniae. En M. hyopneumoniae, el codón TGA indica un resto de triptófano en lugar de un codón de parada de la transcripción. De este modo, el gen de mhp3 recombinante se diferencia de mhp3 de M. hyopneumoniae que tiene los codones TGG en lugar de los codones TGA.
El término "Mhp3" se refiere a una proteína codificada por un gen mhp3.
El término "apoproteína" indica una proteína que carece de un resto lipídico, por ejemplo mediante sumersión o mutación del aminoácido que funcionaría como un aceptor de dicho resto lipídico.
El término "ORF" indica "marco de abierto lectura", es decir, la región codificadora de un gen.
El "Porcentaje de identidad de secuencia" para ácidos nucleicos y polipéptidos se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación, en la que el alineamiento óptimo proporciona la coincidencia de orden más alto y puede introducir adiciones o supresiones a la secuencia de ensayo o referencia. El porcentaje de identidad se determina calculando el porcentaje de aminoácidos que son idénticos en la secuencia de ensayo o referencia, o más preferiblemente mediante un algoritmo de ordenador que incluye pero no se limita a TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, GAP, BESTFIT, y CLUSTALW (Altschul y col., 1990, J. Mol. Biol. 215 (3): 403 - 10; Pearson and Lipman, 1988, Proc. natl. Acad. Sci. USA 85 (8): 244 - 8; Thomson, y col., 1994, Nucleic Acids Res. 22 (22): 4673 - 80; Devereaux y col., 1984, Nuc. Acids. Res. 12: 387 - 395); Higgins, y col., 1996., Methods Enzymol 266: 383 - 402). Preferiblemente, el conjunto del servidor NCBI Blast (http:/www.ncbi.nim.nih.gov) y los parámetros por defecto se usan para determinar el porcentaje de identidad de secuencias.
El término heterólogo, cuando se usa en esta memoria descriptiva para describir un promotor, indica que el promotor no es original del marco abierto de lectura cuya expresión controla.
El término "proteína aislada" indica una composición de proteínas en las que la proteína aislada comprende al menos 50% en peso. Más preferiblemente, la composición comprende aproximadamente 95%, y los más preferiblemente 99% en peso de la proteína aislada.
El término "recuperado en una forma soluble" indica que una proteína o polipéptido se recupera a partir del citoplasma de la célula que expresa dicha proteína o polipéptido.
El término "recuperado en una forma insoluble" indica que una proteína o polipéptido se recupera a partir de cuerpos de inclusión presentes en la célula que expresa dicha proteína o polipéptido.
El término "funcionalmente equivalente", como se utiliza en esta memoria descriptiva, se refiere a una proteína capaz de ser reconocida por un anticuerpo específico a Mhp3, que es una proteína capaz de inducir una respuesta inmunológica sustancialmente similar a la proteína Mhp3 endógena. De este modo, un anticuerpo inducido contra una proteína funcionalmente equivalente también reconocerá Mhp3.
El término "inmunogenicidad" indica se refiere a la capacidad de una proteína o polipéptido para inducir una respuesta inmune dirigida específicamente contra la proteína o polipéptido.
El término "antigenicidad" indica se refiere a la capacidad de una proteína o polipéptido para estar unida inmunoespecíficamente mediante un anticuerpo a la proteína o polipéptido.
El término "protección" o "que protege", como se usa en esta memoria descriptiva con respecto a una vacuna, significa que la vacuna previene o reduce los síntomas de la enfermedad provocados por el organismo al que el(los) antígeno(s) usado(s) en la vacuna se deriva.
El término "anticuerpo", como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse a un antígeno. Los anticuerpos pueden ser una mezcla policlonal o monoclonal. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o a partir de fuentes recombinantes y pueden ser partes inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos pueden existir en una diversidad de formas que incluyen, por ejemplo, Fv, Fab', (F(ab')_{2}, así como en cadenas individuales. También se pueden usar anticuerpos de una sola cadena, en los que los genes para una cadena pesada y una cadena ligera se combinan en una sola cadena de codificación.
El término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de nucleótido mhp3 o polipéptido Mhp3 suficiente para inducir una respuesta inmune en el sujeto al que se administra. La respuesta inmune puede comprender, sin limitación, la inducción de inmunidad celular y/o humoral.
El término "tratamiento o prevención de infección por M. hyopneumoniae" significa que inhibe la replicación de bacterias M. hyopneumoniae, para inhibir la transmisión de M. hyopneumoniae, o para prevenir M. hyopneumoniae que se establezca por sí mismo en su huésped, y para aliviar los síntomas de la enfermedad provocada por infección por M. hyopneumoniae. El tratamiento se considera terapéutico si existe una reducción en la carga bacteriana, disminución en las infecciones pulmonares y/o incremento en la ingesta de alimentos y/o crecimiento.
El término vehículo "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un medio vehículo que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo, es químicamente inerte y no es tóxico para el sujeto al que se administra.
El término "agente terapéutico" se refiere a cualquier molécula, compuesto o tratamiento, preferiblemente un antibacteriano, que ayuda en el tratamiento de una infección bacteriana o las enfermedades provocadas por ellos.
Descripción detallada de la invención
Como se describe en esta memoria descriptiva, el inventor ha descubierto y caracterizado un gen de M. hyopneumoniae que codifica Mhp3, que se cree que está unido a la membrana plasmática de M. hyopneumoniae en virtud de una cadena lipídica unida covalentemente a la proteína. La invención proporciona medios recombinantes de expresión de las proteínas Mhp3 que carecen de una secuencia señal y la señal necesaria para la modificación lipídica, de esta manera permitiendo una expresión eficaz y con alto rendimiento de Mhp3 para uso en vacunas contra y tratamientos para enfermedades provocadas por infección con M. hyopneumoniae.
De este modo la presente invención abarca las proteínas codificadas por y secuencias de nucleótidos de mhp3 de M. hyopneumoniae. La invención además abarca ácidos nucleicos que codifican tales proteínas en el código genético universal que son adecuados para la expresión de tales proteínas en huéspedes eubacterianos y eucarióticos, tales como E. coli y baculovirus, respectivamente.
La invención además abarca proteínas que tienen una secuencia que comprende la SEQ ID Nº 4 y ácidos nucleicos que codifican tales proteínas en el código genético universal.
La invención además abarca usos de las proteínas y/o anticuerpos de la invención en la fabricación de una formulación de vacuna para el tratamiento de enfermedades provocadas por M. hyopneumoniae.
La invención además abarca formulaciones de vacuna que comprenden proteínas Mhp3. En ciertas realizaciones, las formulaciones de vacuna comprenden proteínas aisladas seleccionadas entre el grupo constituido por P46, P65, P97 y P102 y los fragmentos, variantes y derivados de los mismos.
Para claridad de la descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas características, realizaciones o aplicaciones de la invención.
Secuencias de nucleótidos de mhp3
La presente invención abarca secuencias de nucleótidos del gen Mhp3 e incluye secuencias de nucleótidos que codifican variantes de especies en otras especies de M. hyopneumoniae. Una realización preferida de la invención abarca las secuencias de nucleótidos que codifican una forma truncada amino de la proteína Mhp3 que no está modificada por la adición covalente de cadenas de ácidos grasos y por lo tanto no localizada en la membrana. En un modo de la realización preferida de la invención, la supresión en 5' de mhp3 correspondiente al terminal amino de Mhp3 abarca las secuencias de nucleótidos que codifican los aminoácidos 2 - 29 de Mhp3. En otros modos de la realización, la supresión en 5' de mhp3 corresponde a los aminoácidos 30, 31 ó 33 - 44.
La invención además proporciona un ADN que codifica en el código genético universal que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº 4, o su componente. La invención además proporciona un ADN que tiene la secuencia de la SEQ ID Nº 3.
Proteínas y polipéptidos codificados por mhp3
La presente invención proporciona proteínas Mhp3 recombinantes. En una realización, la proteína tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº 4 y no está unida covalentemente a un resto de ácido graso. En una realización adicional, la proteína es una proteína aislada. La presente invención también proporciona composiciones que comprenden tales proteínas Mhp3. En ciertas realizaciones, las composiciones comprenden una proteína Mhp3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, o una proteína Mhp3 y un adyuvante. En otra realización específica, la composición comprende al menos otra proteína de M. hyopneumoniae tal como, pero no limitado a, P46, P65, P97 o P102. En otras realizaciones, la composición comprende una proteína Mhp3 y al menos otro polipéptido inmunogénico o antigénico que no es un polipéptido de M. hyopneumoniae y es preferiblemente un polipéptido viral, bacteriano o parásito. Tal composición es beneficioso como una vacuna de combinación.
Además, las proteínas Mhp3 de la presente invención para uso en preparaciones de vacuna son sustancialmente puras u homogéneas. Los procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la técnica se pueden usar para determinar la pureza u homogeneidad de proteínas, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra, seguido de la visualización de una sola banda de polipéptido en un gel de tinción. Se puede determinar una resolución más alta para determinar usando HPLC u otros procedimientos similares bien conocidos en la técnica.
La presente invención abarca polipéptidos que están purificados típicamente a partir de células huésped que expresan secuencias de nucleótidos recombinantes que codifican estas proteínas. Tal purificación de proteínas se puede llevar a cabo mediante una diversidad de procedimientos bien conocidos en la técnica. en una realización, la proteína Mhp3 de la presente invención se expresa como una proteína de fusión, por ejemplo sin tioredoxina. La proteína de fusión resultante recombinante se puede purificar mediante cromatografía de afinidad. En un modo de la realización, la proteína Mhp3 se escinde fuera del resto heterólogo dando como resultado una muestra de proteína Mhp3 sustancialmente pura. se pueden usar otros procedimientos, por ejemplo, las técnicas descritas en "Methods in Enzymology", 1980, Academia Press, Inc., San Diego, "Protein Purification: Principles and practice", 1982, Springer-Verlag, Nueva York.
Sistemas de expresión
La presente invención abarca sistemas de expresión, tanto vectores de expresión eucarióticos como procarióticos, que se pueden usar para expresar tanto las formas truncadas como de longitud completa de la proteína mhp3.
En una realización preferida de la invención, el ácido nucleico tiene la secuencia de la SEQ ID Nº 3 y codifica una proteína de la SEQ ID Nº 4, que incluye residuos 30 - 444 de la SEQ ID Nº 2, Los codones TGA de M. hyopneumoniae se han cambiado a codones de TGG.
Una diversidad de sistemas de vectores de expresión se pueden utilizar para expresar las secuencias de proteínas antigénicas de la invención. Tales sistemas de huésped - expresión representan vehículos mediante los que las secuencias de codificación se pueden producir y posteriormente purificar, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias de codificación de nucleótidos apropiadas, mostrar los productos del gen mhp3 de la invención in situ. Éstos incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformados con vectores de expresión de ADN de bacteriófagos recombinantes, ADN de plásmidos o ADN de cósmidos que contienen secuencias codificadoras de mhp3 (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformados con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen las secuencias codificadoras del producto del gen mhp3; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias codificadoras de mhp3; sistemas de células de plantas infectadas con vectores de expresión recombinantes (por ejemplo, virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco; TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias codificadoras de mhp3; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que albergan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o a partir de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de 7,5 k del virus de vaccinia).
En una realización preferida, el sistema de expresión es un sistema bacteriano. Se puede seleccionar de manera ventajosa un número de vectores de expresión dependiendo del uso propuesto para el producto de mhp3 que se está expresando. Por ejemplo, cuando una gran cantidad de tal proteína se ha de producir, para la generación de composiciones farmacéuticas de Mhp3 o para inducir anticuerpos para Mhp3, por ejemplo, pueden ser deseables vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Preferiblemente, los vectores contienen promotores que dirigen la expresión génica inducible. Los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther y col., 1983, EMBO J2: 1971), en el que las secuencias codificadoras de mhp3 pueden estar ligadas individualmente dentro del vector en el marco con la región que codifica lac Z de manera que se produce una proteína de fusión; los vectores pIN (Inouye & Intuye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101 - 3109; van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503 - 5509); vectores pET (Studier y Moffat, 1986, J. Mol. Biol. 189; 113; Rosenberg y col., 1987, Gene 56: 125 - 135; los vectores están disponibles de Novagen, Madison, Wisconsin), en los que la secuencia codificadora de mhp3 se puede condensar en fase a una secuencia que codifica múltiples (por ejemplo seis) restos de histidina; los vectores pBAD (Guzman y col., 1995, J. Bact. 1774: 4121 - 4130), que usan Mhp3 se pueden expresar bajo el control de una proteína inducible por arabinosa. Los vectores pGEX (Promega Corporation) también se pueden usar para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutation G-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante la adsorción a perlas de glutation - azarosa seguido de la elución en presencia de glutation libre. Los vectores pGEX se diseñan para que incluyan sitios de escisión de trombina o factor Xa proteasa de manera que el producto génico diana clonado se pueda liberar del resto GST. Las secuencias mhp3 se pueden clonar en un vector de expresión \lambda y expresarse en cepas bacterianas \lambda. En un modo preferido de la realización, la cepa bacteriana es LW14, que contiene un represor \lambda sensible a la temperatura, de manera que la expresión de la proteína a partir de un vector A se comprime a 30ºC pero es activo a 42ºC. En una realización altamente preferida, el vector Mhp3 se expresa como una proteína de fusión de tioredoxina, que promueve la solubilidad de las proteínas que normalmente son insoluble. una proteína de fusión tioredoxina - Mhp3 se expresa preferiblemente ligando una secuencia codificadora de Mhp3 en el vector de pBAD pBAD/Tio - TOPO (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California). En un modo altamente preferido de la realización, la proteína de fusión tioredoxina - Mhp3 se expresa en la cepa de E. coli BL21. Se pueden usar otros vectores y son conocidos por los expertos en la técnica.
Anticuerpos mhp3
De acuerdo con la invención las proteínas codificadas por mhp3 y sus derivados y análogos se pueden usar como inmunógenos para generar anticuerpos que se unen de manera inmunoespecífica tal como un inmunógeno.
Se pueden usar diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales a Mhp3. Para la producción de anticuerpos, se pueden inmunizar diversos animales huésped mediante la inyección con la proteína nativa Mhp3, o una versión sintética, o los derivados de la misma, incluyendo, pero no limitados a conejos, ratones, ratas, etc. Se pueden usar diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunogénica, dependiendo de las especies huéspedes (véase, por ejemplo, las usadas para la preparación de vacunas).
Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos a la secuencia de proteínas codificadas por mhp3 o análogos de las mismas, se puede usar cualquier técnica que proporciona la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein, (Kohler y Milstein 1975, Nature 256: 495 - 497), así como la técnica de trioma, la técnica de híbrido de células B humanas (Kozbor y col., 1983, Immunology Today 4: 72), y la técnica de EBV - hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p. 77 - 96). En una realización adicional de la invención, se pueden producir en animales sin gérmenes utilizando tecnología reciente (véase, por ejemplo, el documento PCT/US90/02545). De acuerdo con lo anterior, se pueden usar anticuerpos humanos y se pueden obtener mediante el uso de hibridomas humanos (Cole y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80: 2026 - 2030) o mediante la transformación de células B humanas con virus EBV in vitro (Cole y col., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 - 96). De hecho, de acuerdo con la invención, se pueden usar técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison y col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81: 6851 - 6855; Neuberger y col., 1984, Nature 312: 604 - 608; Takeda y col., 1985, Nature 314: 452 - 454) mediante ayuste de los genes a partir de una molécula de anticuerpo de ratón específico para la proteína codificada por mhp3 junto con los genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada; tales anticuerpos están dentro del alcance de la invención.
De acuerdo con la invención, se pueden adaptar las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (patente de Estados Unidos Nº 4.946.778) para producir anticuerpos de una sola cadena específicos del producto génico de mhp3. Una realización adicional de la invención utiliza las técnicas descritas para la construcción de genotecas de expresión de Fab (Huse y col., 1989, Science 246: 1275 - 1281) que permite una identificación rápida y fácil de fragmentos de Fab monoclonales con la especificidad deseada para las proteínas codificadas por mhp3, derivados o análogos.
Se pueden generar fragmentos de anticuerpos que contienen el idiotipo de la molécula mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen pero no se limitan a, el fragmento F(ab')_{2} que se puede producir mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo, los fragmentos Fab' que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro del fragmento F(ab')_{2}, los fragmentos Fab que se pueden generar tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor, y fragmentos Fv.
En la producción de anticuerpos, se puede llevar a cabo la selección del anticuerpo deseado mediante técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas o ELISA). Por ejemplo, los anticuerpos seleccionados que reconocen un dominio específico de la proteína especificada por mhp3, se puede ensayar hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento que contiene tal dominio. Para la selección de un anticuerpo que se une específicamente a un primer homólogo de Mhp3 pero que no se une específicamente a un homólogo de Mhp3 diferente, se puede seleccionar en base de la unión positiva al primer homólogo de Mhp3 y una carencia de unión al segundo homólogo de Mhp3.
También se proporcionan anticuerpos específicos a un dominio de una proteína codificada por mhp3. También se proporcionan anticuerpos específicos a un epítope de una proteína codificada por mhp3.
Se pueden usar los anticuerpos específicos anteriores en los procedimientos conocidos en la técnica con relación a la localización y actividad de las secuencias de proteínas codificadas por mhp3 de la invención, por ejemplo, midiendo los niveles de los mismos en muestras fisiológicas apropiadas, en procedimientos de diagnóstico, inmunoterapia, etc.
Kits de mhp3
La invención además proporciona kits para la detección de M. hyopneumoniae. En una realización, el kit proporciona reactivos para la detección de anticuerpos circulantes contra la proteína Mhp3 de M. hyopneumoniae. En ciertas realizaciones, los kits comprenden una instrucción que indica que el kit es útil para la diagnosis de infección por M. hyopneumoniae. Mínimamente, el kit comprende en al menos un recipiente una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº 4. En un modo de la realización el kit además comprende un anticuerpo secundario anti - cerdo. En un modo preferido de la realización; el anticuerpo secundario se conjuga con una enzima que cataliza una reacción colorimétrica, tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante. En una realización adicional, el kit además comprende reactivos para un ensayo colorimétrico.
Formulaciones de vacuna y procedimientos de administración
Ya que el antígeno de la proteína Mhp3 de la presente invención se puede producir en grandes cantidades, el antígeno así producido y purificado tiene uso en preparaciones de vacuna. La proteína Mhp3 también tiene utilidad en inmunoensayos, por ejemplo, para detectar o medir en una muestra de fluido corporal de un animal de ensayo vacunado o potencialmente infectado la presencia de anticuerpos para el antígeno, y así controlar la respuesta inmune y/o para diagnosticar la infección del animal.
La preparación de vacunas que contiene un polipéptido inmunogénico como el ingrediente activo es conocida por los expertos en la técnica.
Determinación de eficacia de vacunas
La inmunogenicidad de del antígeno de Mhp3 se puede determinar controlando la respuesta inmune en animales de ensayo después de la inmunización con el antígeno Mhp3, solo o en combinación con al menos otro polipéptido, o mediante el uso de cualquier inmunoensayo conocido en la técnica. En una realización preferida, dicho otro polipéptido se selecciona entre el grupo constituido por las proteínas P46, P65, P97 y P102 de M. hyopneumoniae. La generación de una respuesta humoral (anticuerpo) y/o inmunidad mediada por células se puede tomar como una indicación de una respuesta inmune.
Los procedimientos de introducción de la vacuna pueden incluirlas vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal o cualquier otra vía de inmunización. La respuesta inmune de los sujetos de ensayo se pueden analizar mediante diversas soluciones tal como la reactividad del suero inmune resultante al antígeno de Mhp3, como se ensaya mediante técnicas conocidas, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente (ELISA), inmunotransferencias, radioinmunoprecipitaciones, etc., o en el caso en el que el antígeno de Mhp3 muestre antigenicidad o inmunogenicidad, mediante la protección del huésped inmunizado a partir de infección por M. hyopneumoniae y/o atenuación de los síntomas debidos a la infección por M. hyopneumoniae en el huésped inmunizado.
Formulaciones de vacuna
Las vacunas de la invención comprenden Mhp3 recombinante y/o fragmentos, variantes y derivados de la misma. En ciertas realizaciones las vacunas de la invención comprenden Mhp3 y al menos otro polipéptido de M. hyopneumoniae antigénico. Los polipéptidos antigénicos adecuados para uso en combinación con Mhp3 incluyen pero no se limitan a las proteínas P46, P65, P97 y P102 y/o fragmentos, variantes y derivados de dicho polipéptido. Los polipéptidos no Mhp3 de las vacunas tales como las proteínas P46, P65, P97 y P102 y sus fragmentos, variantes, y derivados, se pueden purificar a partir de cultivos de M. hyopneumoniae o expresarse de manera recombinante.
Las preparaciones adecuadas de tales vacunas además incluyen inyectables, o bien como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquidas antes de inyección. La preparación también se puede emulsionar. Los ingredientes inmunogénicos activos a menudo se mezclan con adyuvantes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo.
Los ejemplos de adyuvantes eficaces incluyen, pero no se limitan a: hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N- acetil-no muramil-L-alanil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina.
La eficacia de un adyuvante se puede determinar midiendo la inducción de los anticuerpos dirigidos contra un polipéptido inmunogénico en las vacunas que también están comprendidas por los diversos adyuvantes.
Los polipéptidos se pueden formular en la vacuna como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del péptido) y que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, maleico, y similares. Las sales formadas con grupos carboxilo libres también se pueden derivar a partir de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férrico, y tales bases orgánicas como isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y similares.
Se pueden usar muchos procedimientos para introducir las formulaciones de vacuna de la invención, éstas incluyen pero no se limitan a las vías oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, intranasal, y mediante escarificación (raspado a través de las capas superiores de la piel, por ejemplo, usando una aguja bifurcada).
El sujeto al que se administra la vacuna es preferiblemente un animal, lo más preferiblemente un cerdo.
Las formulaciones de vacuna de la invención comprenden una cantidad inmunizadora eficaz de la proteína Mhp3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las preparaciones de vacuna comprenden una cantidad inmunizadora de uno o más antígenos y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica e incluyen pero no se limitan a solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, tampón acuoso isotónico estéril, y los combinantes de los mismos. Un ejemplo de tal vehículo aceptable es un medio de cultivo equilibrado fisiológicamente que contiene uno o más agentes estabilizantes tales como proteínas estabilizadas, hidrolizadas, lactosa, etc. El vehículo es preferiblemente estéril. La formulación se debe acomodar al modo de administración.
En una realización específica, un polipéptido de Mhp3 liofilizado de la invención se proporciona en un primer recipiente; un segundo recipiente comprende diluyente que consta de una solución acuosa de glicerina al 50%, fenol al 0,25%, y un antiséptico (por ejemplo, verde brillante al 0,005%).
Se puede llevar a cabo el uso de antígenos purificados como preparaciones de vacuna mediante procedimientos convencionales. Por ejemplo la(s) proteína(s) purificada(s) se deben ajustar hasta una concentración apropiada, formularse con cualquier adyuvante de vacuna adecuada y envasarse para uso. Los adyuvantes adecuados pueden incluir, pero no se limitan a: geles minerales, por ejemplo, hidróxido de aluminio; sustancias tensioactivas tales como lisolecitina; glicósidos, por ejemplo, derivados de saponina tales como Quil A; polioles plurónicos; polianiones; polímeros de bloque no iónicos, por ejemplo, Pluronic F-127 (B. A. S. F., Estados Unidos); péptidos; aceites minerales, por ejemplo Montanide ISA-50 (Seppic; Paris, Francia), emulsiones oleosas, por ejemplo, una emulsión de aceite mineral tal como BayolF/Arlacel A y agua, o una emulsión de aceite vegetal, agua y un emulsionante tal como lecitina; alumbre, y MDP. El inmunógeno también se puede incorporar en lisosomas, o conjugarse a polisacáridos y/u otros polímeros para uso en una formulación de vacuna. En los casos en los que el antígeno recombinante es un hapteno, es decir, una molécula que es antigénica porque puede reaccionar de manera selectiva con anticuerpos afines, pero no inmunogénicos ya que no pueden inducir una respuesta inmune, el hapteno se puede unir de manera covalente a un vehículo o molécula inmunogénica; por ejemplo, una proteína grande tal como albúmina de suero conferirá inmunogenicidad al hapteno acoplado a él. El vehículo de hapteno se puede formular para uso como una vacuna.
Las dosis eficaces (cantidades inmunizadoras) de las vacunas de la invención también se pueden extrapolar a partir de curvas dosis - respuesta derivadas de sistemas de ensayo de modelos.
La invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes que comprende uno o más de los ingredientes de las formulaciones de vacuna de la invención.
La presente invención proporciona así un procedimiento de inmunización de un animal, o tratamiento o prevención de diversas enfermedades o trastornos en un animal, que comprende la administración al animal de una dosis inmunizadora eficaz de una vacuna de la presente invención.
Uso de anticuerpos generados por las vacunas de la invención
Los anticuerpos generados contra el antígeno mediante inmunización con las proteínas Mhp3 de la presente invención también tienen usos potenciales en inmunoensayos de diagnóstico, inmunoterapia pasivas, y generación de anticuerpos antiidioptípicos.
Los anticuerpos generados se pueden aislar mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica (por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad, centrifugación, precipitación, etc.) y usados en inmunoensayos de diagnóstico. Los anticuerpos también se pueden usar para controlar el tratamiento y/o progresión de la enfermedad. Se puede usar cualquier sistema de inmunoensayo conocido en la técnica, tal como los enumerados anteriormente para este propósito incluyendo pero sin limitación a sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando las técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayos inmunoabsorbentes unidos a enzimas), inmunoensayos "sándwich", reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión de gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos complemento - fijación, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de la proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, por nombrar unos pocos.
Las formulaciones de vacunas de la presente invención también se pueden usar para producir anticuerpos para uso en inmunoterapia pasiva, en las que la protección a corto plazo de un huésped se lleva a cabo mediante la administración de de anticuerpo preformado dirigido contra un organismo heterólogo.
Los procedimientos de inmunización, la cantidad de inmunógeno a usar y el programa de inmunización serán determinados por un médico experto en la técnica y se administrarán mediante referencia a la respuesta inmune y títulos de anticuerpo del sujeto.
Envasado
Las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. El envase puede, por ejemplo, comprender una lámina delgada de metal o plástico tal como un envase blíster. El envase o dispositivo dispensador se puede acompañar de instrucciones para la administración. También se pueden preparar composiciones que comprenden un compuesto de la invención formulada en un vehículo farmacéutico compatible, colocado en un recipiente adecuado, y marcado para el tratamiento de una afección indicada.
Ejemplos Aislamiento de ADN cromosómico de M. hyopneumoniae
Se aisló ADN genómico de ADN de M. hyopneumoniae mediante el procedimiento de Dybvig y Alderete (Plasmid, 20: 33 - 41; 1988), en el que se cosecharon las células mediante centrifugación (10 min a 6000 g a 4ºC), suspendidas en solución salina tamponada com fosfato, y se lisaron mediante la adición de 0,1 volúmenes de dodecil sulfato sódico al 10%. Se extrajo el lisado con una mezcla de fenol, cloroformo, y alcohol isoamílico (25:24:1) saturado con Tris - HCl. Se extrajo la fase acuosa con cloroformo, y ácidos nucleicos precipitados mediante la adición de 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M y 2 volúmenes de etanol enfriado con hielo. Después de la incubación a -20ºC durante 1 hora, se recuperaron los ácidos nucleicos mediante centrifugación durante 10 minutos en una microcentrífuga. Los ácidos nucleicos se volvieron a suspender en agua que contenía 20 \mug de ARNasa A/ml, y se almacenaron als muestras a -20ºC.
Clonación molecular de mhp3 de M. hyopneumoniae
Se diseñaron y se sintetizaron cebadores de oligonucleótidos degenerados KWK40, KWK41, KWK42, KWK43, KWK42RC, y KWK43RC (SEQ ID Números 10 - 15) (Genosys Biotechnologies, Inc.; The Woodlands, TX) basándose en las secuencias de aminoácidos parciales identificaads anteriormente (SEQ ID Números 7 - 9) de Mhp3 (solicitud de panete internacional WO 96/28472). Se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con diversas combinaciones de estos cebadores en un volumen de reacción de 50 \mul que contiene tampón 1 x PCR (Perkin Elmer; Foster City, CA), MgCl_{2} 2,0 mM, 1 \muM de cada cebador, 400 \muM de cada desoxi-NTP, y 2,5 U AmpliTaq Gold (Perkin Elmer). Las condiciones para la amplificación consistían en la desnaturalización a 94ºC durante 2 minutos, seguido de 25 ciclos de desnaturalización (94ºC, 1 min), hibridación (56ºC, 1 min), y polimerización (72ºC, 1 min). Usando cebadores KWK41 (SEQ ID Nº 11) y KWK42RC (SEQ ID Nº 14), se amplificó un fragmento de aproximadamente 250 pares de bases de longitud usando 410 ng del ADN cromosómico de la cepa 232 de M. hyopneumoniae (subcultivo n = 5). El fragmento se subclonó en el sitio de clonación TA de pCR2.1-TOPO (Invitrogen; Carisbad, CA); el producto ligado se transformó en células TOP 10 de E. coli (Invitrogen). Se confirmó la clonación mediante secuenciación de la terminación de cadena de didesoxinucleótido (Advanced Genetic Análisis Center, St. Paul, MN) y digestión por endonuclesa de restricción seguido de electroforesis en gel de agarosa.
La PCR inversa, un procedimiento usado para amplificar las secuencias que flanquean una región núcleo de ADN (Ochman, H., Medhora, M. M., Garza, D., y Harti, D. L. 1990. En "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications." Academic Press, San Diego, CA) se usó para clonar los extremos 5' y 3' restantes del gen que codifica Mhp3. Se generaron conjuntos de fragmentos de ADN cromosómico de la cepa 232 de M. hyopneumoniae (subcultivo = 5) mediante la digestión individual de ADN no cortado con las siguientes endonucleasas de restricción: AluI, BamHI, EcoRV, EcoRI, HaeIII, HinddI, HindI, NdeI, PvuII, Sau3AI, SpeI, SspI, XabaI. Después de la digestión, los fragmentos se hicieron circulares mediante ligamiento y se sometieron a PCR usando cebadores de oligonucleótidos RAC3 (SEQ ID Nº 16) y RAC4 (SEQ ID Nº 17), que se diseñaron basándose en la secuencia a partir del fragmento de 250 pares de bases descrito anteriormente. La amplificación con estos cebadores se llevó a cabo como sigue; desnaturalización a 94ºC durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalización (94ºC, 1 min), hibridación (55ºC, 1 min), y polimerización (72ºC, 2 min). El conjunto de ADN cromosómico digerido por SspI produjo un fragmento de aproximadamente 600 pares de bases que se subclonó en pCR2.1 TOPO. El análisis de secuencia del fragmento clonado identificó el extremo 5' del gen. Se diseñaron los oligonucleótidos RAC7 (SEQ ID Nº 18) y RAC8 (SEQ ID Nº 19) basándose en esta secuencia con el fin de obtener la secuencia adicional correspondiente al extremo 3' de mhp3. Las condiciones de amplificación con estos cebadores consistían en la desnaturalización a 94ºC durante 9 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización (94ºC, 30 segundos), hibridación (50ºC, 30 segundos), y polimerización (72ºC, 1 min). Cuando se usó el conjunto de ADN digerido por SpeI como molde, se amplificaron productos múltiples (250 pares de bases a > 1 kb); la mezcla de los fragmentos se clonó en pCR2.1 - TOPO. El análisis de secuencia del fragmento mayor clonado (-1,2 kb) proporcionó datos de secuencias en 3' adicionales. A partir de estos datos, se diseñaron y se sintetizaron los oligonucleótidos RAC12 (SEQ ID Nº 20) y RAC15 (SEQ ID Nº 23) a usar para la amplificación mediante PCR usando el conjunto de ADN digerido por HindI como molde. Los parámetros consistían de desnaturalización (94ºC, 30 segundos), hibridación (55ºC, 30 segundos), y polimerización (72ºC, 2 min), más una etapa de polimerización final a 72ºC durante 7 minutos. Se amplificó un fragmento de aproximadamente 600 pares de bases de longitud, se clonó en pCR2.1 - TOPO, y se secuenció. Los datos obtenidos proporcionaron la secuencia en 3' adicional dentro del gen que codifica Mhp3. La amplificación por PCR adicional con RAC12 (SEQ ID Nº 20) y RAC15 (SEQ ID Nº 23) se llevó a cabo usando el conjunto de ADN digerido por HindI como molde. Las condiciones para amplificación fueron desnaturalización a 94ºC durante 9 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización (94ºC, 1 min), hibridación (55ºC, 1 min), y polimerización (72ºC, 3 min), más una etapa de polimerización final (72ºC, 7 min). Se amplificó un fragmento de 700 pares de bases y se clonó en pCR2.1 - TOPO. La secuenciación del fragmento clonado generó los datos de secuencia en 3', incluyendo aquellos que codificaron el extremo carboxilo del polipéptido.
Los resultados de la secuenciación preliminar descrita anteriormente se usaron para diseñar los cebadores de oligonucleótidos para la amplificación específica del gen mhp3 directamente a partir del ADN cromosómico de la cepa 232 de M. hyopneumoniae de subcultivo bajo (n = 4). Estos productos se secuenciaron directamente en un intento por evitar la introducción de artefactos de secuencia debido a posibles mutaciones que pueden surgir durante la amplificación durante la amplificación por PCR y etapas posteriores de clonación.
Los oligonucleótidos sintéticos que flanquean el gen mhp3 se usaron para amplificar específicamente el marco abierto de lectura (ORF) del ADN cromosómico. La amplificación mediante PCR se llevó a cabo por triplicado y contenía 1 \muM de cada cebador Mhp3 - U1 (SEQ ID Nº 31) y Mhp3 - D (SEQ ID Nº 33), 360 ng de ADN cromosómico purificado, 1 x de tampón PC2 (Ab Peptides, Inc; St. Louis, MO), 200 \muM de cada dNTP, 7,5 U Klen Tap1 (Ab peptides, Inc) y 0,15 U de polimerasa termoestable de Pfu clonada (Stratagene; La Jolla, CA) en un volumen de 50 \mul de volumen final de muestra. Las condiciones para amplificación consistían en la desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos, seguido de 25 ciclos de desnaturalización (94ºC, 30 segundos), hibridación (55ºC, 30 segundos), y polimerización (72ºC, 3 min 45 segundos), más una extensión final a 72ºC durante 7 minutos. Después de la amplificación, la muestra por triplicado se reunió y el producto específico se purificó mediante extracción con cromatografía de giro (kit de purificación de PCR QIAquick ™, Qiagen; Santa Clarita, CA). La mezcla reunida se sometió después a análisis de secuencia directa usando las reacciones de terminación DyeDeoxi en un secuenciador de ADN automático ABI (Lara Technologies Inc, Houston, TX).
Se usaron cebadores de oligonucleótidos sintéticos (SEQ ID Números 16 - 28, 31, y 33) para secuenciar tanto hebras de ADN de los productos amplificados a partir de M. hyopneumoniae. La secuencia de nucleótidos del gen mhp3 y la proteína Mhp3 deducida codificada con esta región se presenta en la SEQ ID Nº 1 y la SEQ ID Nº 2, respectivamente.
El ORF de mhp3 se extiende desde los nucleótidos 97 - 1452 de la SEQ ID Nº 1, y codifica una proteína de 451 aminoácidos (SEQ ID Nº 2) que tiene un peso molecular teórico de 49.775 daltons. El polipéptido codificado contendrían 8 restos de triptófano, 7 de los cuales están codificados por el codón TGA (UGAen ARNm), que se sabe que especifica la adición de este aminoácido en muchas especies de micoplasma (Dybvig, K., 1990. Ann. Rev. Microbiol. 44: 88 - 104; Yamao, F., Muto, A., Kawauchi, Y., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82: 2306 - 2309). El extremo amino de la proteína codificada parece que tiene propiedades características de una secuencia de señal procariótica (von Heijne, G., 1985. J. Mol. Biol. 184: 99 - 105; Nielsen, H., Engelbrecht, J., Brunak, S., y von Heijne, G., 1997. Protein Engineering, 10: 1 - 6), aunque el sitio preciso de escisión no se conoce actualmente. El residuo de cisteína en la posición 29 de la proteína codificada (SEQ ID Nº 2) se cree que se modifica después del procesamiento mediante la adición de un ácido graso unido a sulfidrilo para preparar una lipoproteína Mhp3 (Razin, S., Yogev, D., y Naot, Y. 1998). Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 1094 - 1156).
Cuando el ORF de mhp3 se comparó frente a las bases de datos de nucleótido y proteína existentes usando los programas basic Local Alignement Search Tool (BLAST) (Allschul, S. F., Gish, W., Miller, W., E. W., Lipman, D. J., 1990. J. Mol. Biol. 215: 403 - 410), la entrada con la que comparte la mayor homología era la proteína Ag 234 - 5 de M. arginini (Nº de acceso del Gen Bank D16674). Cuando estos dos polipéptidos se alinearon usando CLUSTAL W (Thompson, J. D., Hihhings, D. G., y Gibson, T. G., 1994. Nucl. Acids Res., 22: 4673 - 4680), existe un 36,2% de identidad de aminoácidos entre las proteínas Mhp3 y Ag 234 - 5 (Fig. 1). Aunque el gen que codifica Ag 234 - 5 se identificó originalmente como presentes en M. arginini (Ushio, S., Iwaki, K., taniani, M, Ohta, T., Fukuda, S., Sugimura, K, y Kurimoto, M., 1995. Microbiol. Immunol. 39: 395 - 400), una evidencia reciente ha revelado que este gen se deriva realmente de M. hyorhinis (Dórese, M., Wise, K. S., 1998. Abstract E20, 12ª Organización Internacional de la Conferencia de Micoplasmología, Sydney, AU). En aquellos estudios, se concluyó que Ag 234-5 no se conservó entre otros micoplasmas, incluyendo M. hyopneumoniae, como se determina mediante PCR, hibridación por transferencia de Southern, y análisis de transferencia de Western.
Usando el programa STEMLOOP del grupo de Ordenadores de Genética de la Universidad de Wisconsin (Devereux, J., Haeberli, P., y Smithies, O., 1984. Nuc. Acids Res. 12: 387 - 395), se identificó una secuencia cadena abajo del ORF de mhp3, específicamente los nucleótidos 1519 - 1550 de la SEQ ID Nº 1, que podría potencialmente formar una estructura de bucle de tronco. El tronco se podría formar mediante 14 repeticiones invertidas de base separadas por un bucle de 4 bases. La existencia real y función potencial de esta estructura se desconoce actualmente.
Un ORF adicional también está codificado por el fragmento de ADN representado en la SEQ ID Nº 5. Este ORF está presente en la hebra opuesta del gen mhp3 y se extiende desde el nucleótido 602 al nucleótido 1 de la SEQ ID Nº 1. Este ORF predicho codifica una proteína de al menos 200 aminoácidos, designado "ORF1" y presentado como la SEQ ID Nº 6, que tiene un peso molecular teórico de 22.528 daltons. El hecho que el ORF continúa a través del extremo del fragmento de ADN (SEQ ID Nº 1) y permanece abierto sugiere que la masa actual de del polipéptido codificado es probablemente mayor que 22.528 daltons. Aunque Mhp3 y "ORF" están codificados en hebras opuestas, al tercera base de cada codón (la posición "Oscilante") es común entre ellos. Así, la base oscilante en cualquier codón de aminoácido particular en "ORF" está compartida por la hebra opuesta que codifica un aminoácido particular en el gen Mhp3. Esta disposición única de secuencias de codificación compartidas para las dos proteínas minimizarían, en teoría, el impacto de la deriva genética en las posiciones oscilantes de codón para Mhp3 y "ORF1" y maximizarían la conservación de ambas proteínas codificadas.
Preparación de plásmido y materiales de depósito
El fragmento del gen mhp3 se preparó para depositar en la Colección Americaan de Cultivos Tipo (ATCC). La mezcla reunida que se produce por reacciones de PCR por triplicado que emplean cebadores específicos en 5' y 3' Mhp3-U1 (SEQ ID Nº 31) y Mhp3-D (SEQ ID Nº 33) como se ha descrito anteriormente se aisló mediante extracción con cromatografía de giro (QIAquick™) y se insertó en el sitio de clonación de pCR2.1 - TOPO. Las reacciones de extensión de secuencias individuales que utilizan cebadores de secuenciación específicos de vectores confirmó los puntos finales del fragmento de 1.692 pares de bases, y reveló que el gen que codifica Mhp3 estaba en la orientación opuesta con relación al promotor de lactosa. esta construcción de plásmido se denominó pER427 y se introdujo en células TOP10 de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA). La cepa resultante se denominó Pz427.
Mutagénesis dirigida al sitio del gen de mhp3
La preparación de ADN que codifica Mhp3 para la expresión en E. coli requirió la modificación del gen de mhp3 de M. hyopneumoniae mediante la eliminación de la secuencia que codifica la guía supuesta y el sitio de unión de ácidos grasos, cisteína 29, y la conversión de los 6 codones TGA a codones TGG. Los cebadores de oligonucleótidos usados para la amplificación del gen que carece de la secuencia que codifica el péptido señal se denominaron RAC 23 (SEQ ID Nº 29) y RAC 24 (SEQ ID Nº 30). Las condiciones para la amplificación de ese fragmento a partir del ADN cromosómico de la cepa 232 de M. hyopneumoniae (subcultivo N = 5) se desnaturalizó a 94ºC durante 9 minutos, seguido de 25 ciclos de desnaturalización (94ºC, 1 min), hibridación (50ºC, 1 min), y polimerización (72ºC, 2 min), más una etapa final de polimerización (72ºC, 7 min). El fragmento amplificado se clonó en pCR2.1-TOPO; la confirmación de la clonación fue mediante secuenciación y digestión por endonucleasa de restricción seguido de electroforesis en gel. La secuencia en el extremo 5' del fragmento clonado codifica el resto de metionina de iniciación, después un resto de triptófano, que es el aminoácido después del resto de cisteína en la posición 29 del polipéptido codificado (véase la SEQ ID Nº 2). En el extremo 3', se introdujeron cambios de bases en la secuencia de nucleótidos de tipo salvaje (SEQ ID Nº 1) que creó un sitio de restricción para propósitos de clonación. Esto dio como resultado 2 aminoácidoa carboxi - terminal del polipéptido de tipo salvaje, Lys - Asn (SEQ ID Nº 2) que se reemplazan por la secuencia Asn - Leu (véanse los restos 422 - 423 en la SEQ ID Nº 4).Estaba presente un nucleótido adicional T en el cebador RAC 24 (SEQ ID Nº 30) comparado con el gen de tipo salvaje, pero no estaba presente en el producto PCR. Los oligonucleótidos RAC 23 (SEQ ID Nº 29) y RAC 24 (SEQ ID Nº 30) contenían sitios de restricción sintéticos NdeI y XabaI, respectivamente, cerca de los extremos 5' para facilitar la clonación del gen en diversos plásmidos. También se añadieron nucleótidos adicionales (6 para RAC 23 (SEQ ID Nº 29) y7 para RAC 24 (SEQ ID Nº 30)) en el extremo 5' de cada cebador para facilitar el corte mediante las enzimas de restricción respectivas.
Una vez que se elimina la secuencia que codifica el péptido señal, seis codones TGA internos permanecían en el gen. Para posibilitar la expresión del polipéptido de longitud completa en E. coli, éstos de convirtieron a codones TGG mediante mutagénesis in vitro dirigida al sitio. El plásmido pCR2.1 - TOPO se transformó en la cepa CJ236 de E. coli (dut^{-}ung^{-}). La adición del fago R108 auxiliar a las células que contienen el plásmido ayudó a la producción de partículas de fago que tienen ADN de una cadena (ss) que contiene uracilo. Estas partículas se aislaron, y ADN ss se purificó mediante extracción y precipitación. La mutagénesis se llevó a cabo usando este ADN como molde, los oligonucleótidos Mhp3-2M, Mhp3-3M, Mhp3-4M, Mhp3-5M, Mhp3-6M, Mhp3-7M SEQ ID Números 35 - 40), y reactivos del sistema MutaGene (Laboratorios BioRad; Hercules, CA). El ADN ss, oligonucleótidos y tampón de hibridación se mezclaron y se calentaron hasta 70ºC, después se dejó que se enfriaran hasta 30ºC durante un período de 1 hora. La síntesis de la hebra complementaria se realizó añadiendo la ADN ligasa de T4, ADN polimerasa de T7, y tampón de síntesis. La mezcal se incubó en hielo durante 5 minutos, después a temperatura ambiente durante 5 minutos, seguido de a 37ºC durante 30 minutos. Las moléculas de ADN de doble cadena resultante se transformaron en células DH5\alpha Ultra Como (Gibco BRL; Gaithersburg, MD). Los clones se propagaron y se seleccionaron para las mutaciones deseadas mediante secuenciación. Todas las mutaciones (TGA > TGG) se confirmaron de esta manera. Además, una transición A Z G se produjo sin querer correspondiente al nucleótido 388 del gen de tipo salvaje (SEQ ID Nº 1) en virtud de la secuencia de oligonucleótido Mhp3-2M (SEQ ID Nº 35). Esto dio como resultado una alteración del resto codificado a partir de serina (AGT) en el resto de aminoácidos 98 de la Mhp3 de tipo salvaje (SEQ ID Nº 2) a glicina (GGT) en el resto de aminoácido 70 de recombinante Mhp3 (SEQ ID Nº 4).
El gen mhp3 recombinante (con o sin ka transición sin querer A > G descrita anteriormente) que se produce por los cambios anteriores se muestra en la SEQ ID Nº 3, y el marco abierto de lectura codificado por el gen mhp3 recombinante (con glicina en el resto de aminoácido 70) se muestra en la SEQ ID Nº 4.
Clonación del gen mhp3 recombinante en el vector de expresión y cepa huésped de expresión
Para el propósito de la expresión de proteína recombinante, el gen mhp3 mutado que carece de la secuencia que codifica el péptido señal (SEQ ID Nº 3)se clonó en el plásmido de expresión pBAD/Tio - TOPO (Invitrogen); esta construcción se transformó directamente en E. coli BL21 huésped de expresión. Se identificó un clon que contenía el plásmido apropiado.
Expresión de la proteína Mhp3 recombinante
Reserva operativa congelada del transformante E. coli BL21 que expresa la fusión tioredoxina - Mhp3 se descongeló y se sembró a una dilución 1:5000 en medio RWLDM/D vi definido, que contiene lo siguiente: K_{2}HPO_{4} (6 g/l), KH_{2}PO_{4} (3 g/l), (NH_{4})_{2}SO_{4} (5 g/l), NaCl (2 g/l), 0,2 ml de CaCl_{2} (15 g/l), 0,4 ml de FeCl_{3}. 6 H_{2}O (5 g/l), 0,4 ml de MeSO_{4}. 7 H_{2}O (480 g/l), ZnCl_{2} (6,5 g/l), MnSO_{4}. H_{2}O (12 g/l), Na_{2}MoO_{4}. 2 H_{2}O (5 g/l), CuSO_{4} (1,5 g/l), CoCl_{2}. 6 H_{2}O (2 g/l), H_{3}BO_{3} (0,5 g/l), y HCl al 37% (5 ml/l). También se añadió carbenicilina a una concentración de 125 \mug/ml. El cultivo se hizo crecer en condiciones de alimento - lote (dextrosa al 50%) en un fermentador BioFlow 3000 de volumen de trabajo de 5 litros (New Brunswick Scientific; Edison, NJ) a 37ºC hasta que la A_{625} era de 10 - 20.
Células húmedas del transformante E. coli BI21 que expresa tioredoxina - Mhp3 a partir de 5 l de fermentación se recogieron mediante centrifugación y se volvieron a suspender en solución salina tamponada con fosfato. Las células se lisaron mecánicamente. Después de la centrifugación, se desechó el sedimento. El sobrenadante se pasó sobre una columna de intercambio iónico, y se eluyó usando un gradiente de NaCl. Las fracciones que contenían la proteína de fusión se reunieron, se dializaron para retirar el NaCl, y se esterilizaron por filtración usando un filtro de 0,2 \mum. Esta preparación se usó para los ensayos de vacunación.
Caracterización inmunológica de Mhp3 recombinante
La concentración de proteína de tioredoxina - Mhp3 recombinante preparada como se ha descrito anteriormente se determinó usando un kit de ensayo de proteína BCA (Pierce). En resumen, cada muestra se diluyó 1/10, 1/20, 1/40, y 1/80 en agua estéril desionizada, destilada (ddH_{2}O). Se diluyó BSA (patrón de proteína) hasta concentraciones que varían entre 200 y 800 \mug/ml. Un volumen de 20 l de muestra o patrón se añadió a pocillos por triplicado en una placa de microvaloración de 96 pocillos, y 200 \mul de reactivo B diluido 1/50 en Reactivo A se añadió a cada pocillo. La placa se incubó a 37ºC durante 30 minutos. La absorbancia de la muestra se determinó a 560 nm. La concentración de proteína para cada muestra se calculó mediante extrapolación usando la curva patrón de BSA.
Se volvieron a suspender alícuotas de Mhp3 recombinante (carga de proteína era variable) y lisados de células enteras de M. hyopneumoniae, Micoplasma hiorhinis, y Micoplasma mycoides subespecie mycoides hasta un volumen final de 10 \mul, y se añadieron 10 \mul de 2 x de tampón de muestra de reducción (Owl Scientific). Las muestras se calentaron durante 10 minutos a 100ºC, y el volumen entero se cargó en pocillos separados de un gel de Tris - glicina al 10%, de 10 pocillos, 1,5 mm de espesor (Novex). También se incluyeron marcadores de peso molecular de amplio intervalo, no teñidos (Novex).
Las proteínas separadas mediante SDS - PAGE se transfirieron a membrana de PVDF (Owl Scientific) a una corriente constante de 100 mA durante 1 hora. La transferencia se incubó en tampón de bloqueo que constaba de leche en polvo desnatada al 5% y Tween 20 al 5% en TBS (TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Se retiró el tampón de bloqueo, y la membrana se lavó 1 vez durante 5 minutos con TBST. El anticuerpo primario se obtuvo a partir de un cerdo después de la exposición experimental con la cepa 232 de M. hyopneumoniae. Se añadió suero diluido a la membrana, seguido de 1 hora de incubación a temperatura ambiente. Se diluyó anticuerpo de la proteína G conjugada mediante fosfatasa alcalina (Pierce), se añadió a la membrana lavada, y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La membrana se lavó con TBST, y el sustrato BCIP/NBT (Kikegaard y Laboratorios Perry) se añadió a la membrana y se incubó hasta que se desarrolló una reacción de color. La membrana se enjuagó después con agua para detener la reacción, y se secó a temperatura ambiente.
Se identificó suero del cerdo expuesto experimentalmente con M. hyopneumoniae no reconocían la Mhp3 expresada de manera recombinante (FIG. 2), como una banda de 60 kDa. Esto sugiere que la proteína recombinante expresó epítopes que se reconocieron mediante anticuerpos generados en respuesta a la exposición del cerdo a organismos de M. hyopneumoniae de células enteras.
Estudio animal para ensayar la eficacia de Mhp3 recombinante como un candidato a vacuna
Se obtienen cerdos sanos cruzados (aproximadamente de 12 a 16 días de edad) sin un historial de vacunación previa contra M. hyopneumoniae o enfermedad provocada por M. hyopneumoniae. Los animales se asignan al azar por camadas en grupos. Los cerdos se dejan aclimatar durante un mínimo de cinco días antes del inicio del estudio.
Los animales se vacunan con 1 ml de la vacuna experimental apropiada mediante la vía intramuscular (IM; músculo del cuello izquierdo) el día "0" cuando los cerdos tienen 19 a 23 días de edad. A aproximadamente dos a tres semanas después de la primera vacunación los cerdos reciben una segunda dosis de 1 ml (IM; músculo del cuello derecho) de la vacuna experimental apropiada. Todos los cerdos se observaron estrechamente (durante hasta 1 hora o como se garantiza) para cualesquiera signos después de la vacuna tales como vómitos, depresión, diarrea, ataxia - falta de coordinación, aumento de la respiración, o temblores.
A aproximadamente dos a cuatro semanas después de la segunda vacunación, los cerdos se exponen intranasalmente con 1 ml/fosa nasal de un homogenato de pulmón virulento de la cepa 232 de M. hyopneumoniae, que contiene aproximadamente 5,0 x 10^{8} de unidades de cambio de color/ml (CCU/ml).
A todos los animales expuestos se les hace la necropsia a aproximadamente 4 semanas después de la exposición. Se extraen los pulmones y se evalúan de manera grosera para determinar las lesiones características atribuibles a una infección por M. hyopneumoniae. Las puntuaciones de las lesiones pulmonares individuales se determinarán mediante análisis de imagen. Una muestra sesgada de tejido de pulmón se puede obtener de cada animal expuesto para aislamiento bacteriano (CCU/g de tejido), histopatología, e IFA.
Depósito de microorganismos
Se depositó la siguiente cepa de microorganismo con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801, University Blvd., Manassas, VA el 9 de septiembre de 1999 y se ha asignado el número de acceso indicado más abajo. El depositante fue Pfizer Inc. cuya dirección registrada es 235 East 42^{nd} Street, Nueva York, Nueva York 10017, Estados Unidos.
Microorganismo Número de acceso
Pz427 PTA-634
La presente invención no está limitada en alcance por las realizaciones específicas descritas en esta memoria descriptiva. De hecho, serán evidentes para los expertos en la técnica diversas modificaciones de la invención además de las descritas en esta memoria descriptiva a partir de la descripción anterior y dibujos acompañantes. Tales modificaciones se pretende que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
<110> Pfizer Products Inc
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<120> ÁCIDOS NUCLEICOS Y PROTEÍNAS DEL GEN mhp3 DE MYCOPLASMA PNEUMONIAE Y USOS DE LOS MISMOS
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<130> PC 10555
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<140>
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<141>
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<150>
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<151>
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<160> 41
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 1692
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<212> ADN
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<213> Micoplasma hyopneumoniae 
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<400> 1
1 
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<210> 2
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<211> 451
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<212> PRT
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<213> Micoplasma hyopneumoniae 
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<400> 2
2
3 
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<210> 3
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<211> 1269
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: mhp3 manipulada para la expresión in vitro 
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<400> 3
4 
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<210> 4
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<211> 423
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: mhp3 manipulada para la expresión in vitro 
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<400> 4
5
6 
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<210> 5
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<211> 602
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<212> ADN
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<213> Micoplasma hyopneumoniae 
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<400> 5
7 
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<210> 6
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<211> 200
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<212> PRT
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<213> Micoplasma hyopneumoniae 
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Micoplasma hyopneumoniae 
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<400> 7
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\sa{Ala Gly Xaa Trp Ala Lya Glu Thr Thr Lys Glu Glu Lys Ser}
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<210> 8
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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<400> 8
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\sa{Ala Trp Val Thr Ala Asp Gly Thr Val Asn}
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\sa{Ala Ile Val Thr Ala Asp Gly Thr Val Asn Asp Ans Lys Pro Asn Gln}
\sac{Trp Val Arg Lys Tyr}
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<210> 10
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<213> Secuencia artificial
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tgytgrgcna argaracnac naargargar 
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<211> 30
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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tgttgagcwa aagaaacwac waaagaagaa 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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tgrgtnacng cngayggnac ngtnaay 
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tgagtwacwg cwgatggwac wgtwaat 
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rttnacngtn ccrtcngcng tnacyc 
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tttgagacat cagtgatttg c 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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gaacgaaaat ccgaaattat gg 
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ctactactg aagaatctca cc 
\hfill
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gtgatgccgt tcacaagatg 
\hfill
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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cactaagaac gctgaaaacg g 
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<211> 21
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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gattacaact gtaaaatcga g 
\hfill
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ggcttcttca gttttatagg 
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gaaatgcctg ataaacaacc 
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cttcagaaat ggcttcagtt gc 
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22 
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gctagataac cagcgataaa atcag 
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tgcataatcc tgatttatc 
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tgaaagtcat cgtaattaaa ac 
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22 
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aatcggcata tgtgggataa agaaacaact aaag 
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ggagtaatct agattattaa tatcggtaat taag 
\hfill
34 
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gtttttgaat ataatagaaa atg 
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tttattaaaa aataattgaa agtcatcg 
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28 
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ctattttgta attggcataa aaactgcc 
\hfill
28 
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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gataaaatgg aataaatttc ttgg 
\hfill
24 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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caggttggga ggcaattcaa c 
\hfill
21 
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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caaaaatgtt tgggtacttt ctgg 
\hfill
24 
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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cacaagatgg ttaaaaatcc c 
\hfill
21 
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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ggaattgact ggactgatac tg 
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22 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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<211> 457
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<212> PRT
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<213> Micoplasma hyorhinis 
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9
10 
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LISTADO DE SECUENCIAS 
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<110> Pfizer Products Inc
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<120> ÁCIDOS NUCLEICOS Y PROTEÍNAS DEL GEN mhp3 DE MYCOPLASMA PNEUMONIAE Y USOS DE LOS MISMOS
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<130> PC 10555
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<140>
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<213> Micoplasma hyopneumoniae 
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<213> Secuencia artificial
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<211> 423
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: mhp3 manipulada para la expresión in vitro 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido
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aatcggcata tgtgggataa agaaacaact aaag 
\hfill
34 
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<210> 30
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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ggagtaatct agattattaa tatcggtaat taag 
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34 
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<210> 31
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<211> 23
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<212> ADN
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gtttttgaat ataatagaaa atg 
\hfill
23 
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<210> 32
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tttattaaaa aataattgaa agtcatcg 
\hfill
28 
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<210> 33
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ctattttgta attggcataa aaactgcc 
\hfill
28 
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<210> 34
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gataaaatgg aataaatttc ttgg 
\hfill
24 
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<210> 35
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\hskip-.1em\dddseqskip
caggttggga ggcaattcaa c 
\hfill
21 
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<210> 36
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<212> ADN
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caaaaatgtt tgggtacttt ctgg 
\hfill
24 
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<210> 37
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<212> ADN
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<400> 37
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cacaagatgg ttaaaaatcc c 
\hfill
21 
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<210> 38
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<212> ADN
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ggaattgact ggactgatac tg 
\hfill
22 
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<210> 39
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<211> 22
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gccggatggc ttgcaggata tg 
\hfill
22 
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taaagcttgg aatctaaaaa attc 
\hfill
24 
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<211> 457
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<212> PRT
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<213> Micoplasma hyorhinis 
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19
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Claims (26)

1. Una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº 4, en la que dicha proteína no tiene una cisteína acilada por ácidos grasos seguido de la secuencia de aminoácidos Trp Asp Lys Glu, y no tiene una homoserina lactona C-terminal.
2. La proteína de la reivindicación 1 que es una proteína aislada.
3. La proteína de la reivindicación 1 que es una proteína de fusión.
4. La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína de fusión es una proteína de fusión de tioredoxina.
5. Una composición que comprende la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
6. La composición de la reivindicación 5, que comprende además un adyuvante.
7. La composición de la reivindicación 5 ó 6, que comprende además al menos un polipéptido seleccionado entre el grupo constituido por P46, P65, P97 y P102 de Mycoplasma hyopneumoniae.
8. Una proteína inmunogénica que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID Nº 4, en la que la proteína inmunogénica no tiene una cisteína acilada por ácido graso seguido de la secuencia de aminoácidos Trp Asp Lys Glu, y no tiene una homoserina lactona C-terminal.
9. Uso de una proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en la fabricación de una formulación de vacuna para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un animal provocada por infección con Mycoplasma hyopneumoniae.
10. El uso de la reivindicación 9, en el que dicho animal es un cerdo.
11. Un ADN que codifica en el código genético universal una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº 4 ó su componente.
12. El ADN de la reivindicación 11 unido de manera operativa a un promotor heterólogo.
13. El ADN de la reivindicación 12 que comprende además un origen de replicación en una célula procariótica.
14. El ADN de la reivindicación 12 que comprende además un origen de replicación en una célula eucariótica.
15. Una célula huésped que comprende el ADN aislado de la reivindicación 12.
16. La célula huésped de la reivindicación 15, en la que dicha célula es E. coli BL21 y dicho ADN es el vector de expresión pBAD/Tio-TOPO.
17. Un procedimiento para la producción de la proteína según la reivindicación 1, comprendiendo dicho procedimiento (i) hacer crecer las células de la reivindicación 15 y 16 en condiciones en las que dicha proteína se expresa, y (ii) recuperar dicha proteína.
18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicha proteína se recupera en una forma soluble.
19. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicha proteína se recupera en una forma insoluble.
20. Uso del ADN de la reivindicación 11 en la fabricación de una formulación de vacuna para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un animal provocada por infección con Mycoplasma hyopneumoniae.
21. El uso de la reivindicación 20 en el que dicho animal es un cerdo.
22. Un kit adecuado para la diagnosis de infección por M. hyopneumoniae que comprende en al menos un recipiente una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una proteína como se ha definido en la reivindicación 1.
23. El kit de la reivindicación 22, que comprende además un anticuerpo secundario anti-cerdo.
24. El kit de la reivindicación 23, en el que el anticuerpo secundario se conjuga a una enzima que cataliza una reacción colorimétrica.
\newpage
25. El kit de la reivindicación 24, en el que la enzima se selecciona entre el grupo constituido por fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano picante.
26. El kit de la reivindicación 24, que comprende además reactivos para un ensayo colorimétrico.
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