MXPA01003382A - Acidos nucleicos y proteinas del gen mhp3 de mycoplasma hyopneumoniae y sus usos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a los acidos nucleicos y proteinas del mhp3, codificados por este; la presente invencion se refiere ademas a nuevos antigenos de apoproteinas codificadas por mhp3 para uso en vacunas para prevenir y tratar enfermedades causadas por la infeccion con Mycoplasma hyopneumoniae; la presente invencion se refiere ademas a metodos para la produccion recombinante de dichos antigenos.

Description

ACIDOS NUCLEICOS Y PROTEINAS DEL GEN mho3 DE MYCWLASMA HYOPNEUMONIAE Y SUS USOS CAMPO DE LA INVENCION El gen mhp3 codifica a una proteína de Mycoplasma hyopneumoniae. La presente invención se refiere a los nucleótidos y proteínas del mhp3. La presente invención se refiere además a nuevos antígenos de apoproteínas codificadas por el mhp3 para uso en vacunas para prevenir y tratar enfermedades causadas por la infección con Mycoplasma hyopneumoniae, y a métodos para la producción recombinante de dichos antígenos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION EL Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) es un patógeno bacteriano que causa la neumonía micoplásmica enzoótica del cerdo. La neumonía micoplásmica enzoótica es una enfermedad crónica que produce una pobre conversión de los alimentos, falta de crecimiento y predisposición a infecciones pulmonares secundarias. El M. hyopneumoniae se transmite fácilmente por las secreciones del tracto respiratorio y por transmisión de la cerda a los lechones, y es altamente prevalente en las granjas de cerdos. Aproximadamente el 99% de las manadas de cerdos de Estados Unidos están infectadas, lo que cuesta anualmente a la industria porcina aproximadamente 300 millones de dólares según un estimado de 1991. No hay ensayos sencillos para la detección de M: hyopneumoniae, ni hay medidas efectivas frente a la infección. Los ensayos para la detección de M. hyopneumoniae han sido dificultados por la reactividad cruzada de los anticuerpos dirigidos frente a M. hyopneumoniae hacia otras especies de mycoplasma porcino. El campo de las vacunas ha sido dependiente en su mayor parte de las preparaciones con adyuvante de la membrana o de la célula completa de M. hyopneumoniae, las cuales no han producido respuestas inmunes significativas. Adicionalmente, la clonación y la expresión recombinante de los genes de M. hyopneumoniae han fallado en la producción de proteínas que sean suficientemente protectoras para uso comercial en vacunas. Debido a la falta de vacunas adecuadas, la neumonía micoplásmica enzoótica ha sido reprimida, en gran medida, por la detección precoz y el aislamiento de los animales infectados. Se ha efectuado el tratamiento con antibióticos de los animales infectados con M. hyopneumoniae, con éxito limitado, para cortar el curso de la infección. Por ello, existe una gran necesidad de encontrar medios para prevenir la diseminación de esta enfermedad, ya sea por la prevención o por la cura de la infección. Un método de prevención es la inmunización. La posibilidad de producir in vitro grandes cantidades de proteínas o péptidos ¾ antigénicos d M. hyopneumoniae para uso en formulaciones de vacunas sería, por tanto, un gran avance para el desarrollo de vacunas preventivas. La publicación de la patente internacional WO 96/28472 identifica seis especies de antígenos proteínicos de M. hyopneumoniae de pesos moleculares de 46-48, 52-54, 60-64, 72-75, 90-94 y 110-114 kilodalton, y describe las secuencias proteínicas parciales de los antígenos de 52-54, 60- 64 y 72-75 kilodalton y las secuencias de longitud total de los nucleótidos y aminoácidos del antígeno de 46-48 kilodalton. El antígeno de 46-48 kilodalton, al que de aquí en adelante, se hará referencia como P46, corresponde al antígeno de 44 kilodalton de la patente de Estados Unidos No. 5,252,328 para Faulds y a un antígeno de 48 kilodalton descrito por Lee (Lee et al., 1996, J. Chromatogr. A. 737: 273-279), como se determina a partir de las descripciones de Faulds y Lee de las secuencias parciales de los péptidos. El gen que codifica al P46, esto es el gen p46, también fue clonado por Futo et al. (1995; J. Bacteriol. 177: 1915-1917). Más tarde, el mimo grupo demostró que el producto génico expresado in vitro era útil para diagnosticar las respuestas de anticuerpos a las infecciones con M. hyopneumoniae sin reactividad cruzada con otras especies de Mycoplasma (Futo et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33: 680-683). Las secuencias y usos de diagnóstico del gen p46 descritos por Futo et al. están descritos además en la publicación de la patente europea No. 0 475 185 A1. La secuencia parcial de los péptidos del antígeno de 60-64 kilodalton del documento WO 96/28472 tiene una significativa homología con una proteína llamada P102 (véase más adelante). Además, el antígeno tiene una significativa homología con un antígeno de 64 kilodalton descrito por Faulds (patente de Estados Unidos No. 5,252,328). El antígeno de 72-75 kilodalton del documento WO 96/28472 corresponde a una proteína de 65 kilodalton descrita por Wise y Kim (1987, J.

Bacteriol., 169: 5546-5555 y la patente de Estados Unidos No. 5,788,962) y de aquí en adelante se hará referencia al mismo como P65. El antígeno de 52-54 kilodalton, al que, de aquí en adelante, se hará referencia como Mhp3, puede corresponder a la proteína de 50 kilodalton de la membrana integral descrita por Wise y Kim (1987, J. Bacteriol., 169: 5546-5555) y/o a la especie de proteína de 52 kilodalton descrita por Faulds (patente de Estados Unidos No. 5,252,328). El antígeno de 52-54 kilodalton se denomina de aquí en adelante MHP3. El documento WO 96/28472 describe las secuencias del amino terminal de la proteína madura y de un fragmento interno de bromuro de cianógeno. El antígeno de 90-94 kilodalton del documento WO 96/28472 pueden corresponder a la adhesina p97 como ha sido indicado por Hsu ef al., lo que se describe más adelante. El documento WO 96/28472 describe además los resultados de los ensayos de vacunas que utilizan el antígeno de 60-64 kilodalton, el P46 o una combinación de P65 y hp3. Las vacunaciones proporcionaron una protección significativa frente a la inyección con M. hyopneumoniae. Hay múltiples informes, en la literatura científica y de patentes, en relación con las proteínas de la membrana exterior de M. hyopneumoniae. Por ejemplo, Wise y Kim (1987, J. Bacteriol., 169: 5546-5555) publicaron que hay cuatro especies de proteínas en la membrana integral de M. hyopneumoniae, denominadas p70, p65 (P65,citada antes), p50 y p44, y que las tres últimas están modificadas por uniones lipídicas covalentes e inducen una fuerte respuesta inmune humoral. Los efectos protectores de la respuesta inmune no fueron investigados. El gen que codifica a la proteína P65 fue clonado, y sus secuencias y los usos de éstas, por ejemplo en vacunas y métodos de diagnóstico, están descritos en la patente de Estados Unidos No. 5,788,962. La publicación de la patente internacional WO 91/15593 describe cinco proteínas de M. hyopneumoniae de pesos moleculares aparentes de 105, 90, 85, 70 y 43 kilodalton. Se proporciona una secuencia de longitud total del gen que codifica a la proteína de 85 kilodalton (proteína C), así como las secuencias parciales de los nucleótidos que codifican a las otras cuatro proteínas. Los ensayos de vacunas que usan la proteína C produjeron en los animales de ensayo una protección 'significativa' frente a M. hyopneumoniae. La patente de Estados Unidos No. 5,252,328 para Faulds, describe las secuencias con amino terminal de las proteínas inmunorreactivas de M. hyopneumoniae, cuyos pesos moleculares son 36, 41 , 44, 48, 64, 68, 74.5, 79, 88.5, 96 y 121 kilodalton. Otras proteínas identificadas a partir de sus movilidades electroforéticas pero de las cuales no se describieron las secuencias proteínicas, tenían pesos moleculares aparentes de 22.5, 34 y 52 kilodalton. Aunque la patente de Estados Unidos No. 5,252,328 propuso el uso de estas proteínas en formulaciones de vacunas, no se publicó ningún resultado de ensayos realizados con vacunas. La publicación de la patente internacional WO 95/09870 describe métodos bioquímicos para la purificación de adhesinas de M. hyopneumoniae, las proteínas micoplásmicas de la membrana integral responsables de la adhesión a los cilios del epitelio respiratorio superior del hospedante. El documento WO 95/09870 propone también ensayos y usos para estas proteínas, por ejemplo en vacunas y métodos de diagnóstico. Sin embargo, no se publicó ninguna clonación de los genes de adhesina hasta que se clonó un gen denominado p97 y se demostró que su producto, de aquí en adelante "P97", desempeña un papel en la capacidad del organismo para unirse a las células ciliadas dentro del tracto respiratorio del cerdo infectado con M. hyopneumoniae. (Hsu et al., 1997, J. Bacteriol. 179: 1317-1323). Un informe de investigación de King et al. (1997; Vaccine 15: 25-35) describe la Mhp1 , una adhesina de 124 kilodalton que es una cepa variante del P97. Sin embargo, los intentos de vacunar a cerdos frente a M. hyopneumoniae usando una proteína de fusión GST-Mhp1 no dieron como resultado una protección estadísticamente significativa frente a la neumonía micoplásmica enzoótica. Una variante del P97 de 94 kilodalton fue identificada por Wilton et al. (1988, Microbiology 144: 1931-1943). Adicionalmente, se demostró que el gen p97 forma parte de un operan que codifica también a una segunda proteína, denominada P102, de un peso molecular anticipado de aproximadamente 102 jk»lodalton (Hsu et al., 1998, Gene 214: 13-23). Minion y Hsu sugieren, en la publicación de la patente internacional WO 99/26664, el uso de la P102 en vacunas pero no informan de ensayos realizados con vacunas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención incluye los nucleótidos y proteínas del gen mhp3 de M. hyopneumoniae. La presente invención incluye también nuevos antígenos de apo-proteínas codificadas por el gen mhp3 para uso en vacunas, para prevenir y tratar enfermedades causadas por la invención con M. hyopneumoniae. También se proporcionan métodos para la producción recombinante de apo-Mhp3. La invención proporciona una formulación de una vacuna que contiene un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2, o algún fragmento de la misma que consta de al menos 10, o al menos 20, o al menos 30, o al menos 40, o al menos 50 o al menos 100 aminoácidos contiguos, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, la vacuna contiene adicionalmente al menos otro polipéptido inmunogénico o antigénico, y este otro polipéptido puede ser de origen vital, bacteriano o parasitario. En una modalidad preferida, la vacuna contiene adicionalmente al menos un polipéptido del grupo constituido por las proteínas P46, P65, P97 y P102 de M. hyopneumoniae y fragmentos, variantes y derivados de las mismas La invención proporciona una formulación de una vacuna que contiene un polipéptido antigénico o inmunogénico que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a la SEQ ÍD NO: 4, o algún derivado, variante o fragmento de la misma, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad preferida, el polipéptido antigénico o inmunogénico se expresa como una proteína de fusión con la tiorredoxina, preferiblemente por clonación en el vector de expresión pBAD/Thio-TOPO, y se produce por una cepa de £. coli BL21. En una modalidad altamente preferida, la vacuna contiene adicionalmente al menos un polipéptido seleccionado del grupo constituido por las proteínas P46, P65, P97 y P102 de M. hyopneumoniae y fragmentos, variantes y derivados de las mismas. La invención proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno de un animal causados por la infección con M. hyopneumoniae, que comprende administración al sujeto una formulación de una vacuna que contiene un polipéptido antigénico o inmunogénico que comprende una secuencia de aminoácido correspondiente a la SEQ ID NO: 2, o algún apo-derivado, variante o fragmento de la misma, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad suficiente para producir un aumento de las respuestas celulares o humorales específicas frene a M. hyopneumoniae. En una modalidad preferida, la secuencia de aminoácidos es como se indica en la SEQ ID NO: 4. En otra modalidad preferida, el animal es un cerdo.

La invención proporciona además kits para la detección de M. hyopneumoniae. En una modalidad, el kit proporciona reactivos para la detección de anticuerpos circulantes frente a la proteína Mhp3 de M. hyopneumoniae. En otra modalidad, el kit proporciona reactivos para la detección de los ácidos nucleicos de M. hyopneumoniae, o por métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o por métodos de hibridización. Esta invención provee una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 30 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:4, en donde dicha proteína no tiene una cisteína acilada con un ácido graso seguida por la secuencia de aminoácidos Trp Asp Lys Glu, y no tiene una homoserina-lactona C-terminal. En una modalidad, la proteína tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 50 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:4. En otra modalidad, la proteína es una proteína de fusión. En una modalidad adicional, la proteína de fusión es una proteína de fusión de tiorredoxina. Esta invención también provee una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos los aminoácidos 1 -30 de SEQ ID NO:4. En una modalidad, la proteína tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:4. Esta invención provee cualquiera de las proteínas anteriores, que es una proteína aislada. Esta invención también provee una composición que comprende cualquiera de las proteínas anteriores y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la composición comprende además un adyuvante. En otra modalidad, la composición comprende también por lo menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de Mycoplasma hyopneumoniae P46, P65, P97 y P102. Esta invención provee una proteína inmunogénica que tiene una secuencia de aminoácidos como se ilustra en SEQ ID NO:2, o un fragmento, variante o derivado de la misma, en donde la proteína inmunogénica no tivne una cisteína adiada con un ácido graso seguida por la secuencia de aminoácidos Trp Asp Lys Glu, y no tiene una homoserina-lactona C-terminal. Esta invención provee una proteína inmunogénica que tiene una secuencia de aminoácidos como se ilustra en SEQ ID NO:4, o un fragmento, variante o derivado de la misma, en donde la proteína inmunogénica no tiene una cisteína adiada con un ácido graso seguida por la secuencia de aminoácidos Trp Asp Lys Glu, y no tiene una homoserina-lactona C-terminal. Esta invención provee un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un animal ocasionada por infección con Mycoplasma hyopneumoniae que consiste en administrar al animal una formulación de vacuna que comprende (i) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene por lo menos 30 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:4, en donde dicha proteína no tiene una cisteína adiada con un ácido graso seguida por la secuencia de aminoácidos Trp Asp Lys Glu, y (ii) un excipiente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad suficiente para producir un incremento en las respuestas celulares o humorales específicas frente a Mycoplasma hyopneumoniae. En una modalidad, dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 50 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:4. Esta invención provee un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un animal ocasionada por infección con Mycoplasma hyopneumoniae que consiste en administrar al animal una formulación de vacuna que comprende (i) una proteína antigénica o inmunogénica que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos los aminoácidos 1-30 de SEQ ID NO:4 y (ii) un excipiente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad suficiente para producir un incremento en las respuestas celulares o humorales específicas frente a Mycoplasma hyopneumoniae. En una modalidad, dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:4. En una modalidad de cualquiera de los métodos anteriores, dicho animal es un cerdo. Esta invención provee un ADN aislado o purificado que codifica en el código genético del micoplasma una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 30 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:2, o su complemento. En una modalidad, la proteína tiene una secuencia que comprende por lo menos 50 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:2. En otra modalidad, el ADN tiene una secuencia que comprende por lo menos 90 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:1. Esta invención provee un ADN que codifica en el código genético universal una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que i comprende por lo menos 30 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:4, o su complemento. En una modalidad, la proteína tiene una secuencia que comprende por lo menos 50 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:4. En otra modalidad, el ADN tiene una secuencia que comprende por lo menos 90 * 5 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:3.

En otras modalidades, el ADN anterior es operativamente ligado a un promotor heterólogo. En esta invención, el ADN operativamente ligado a un promotor heterólogo es ADN aislado. En otras modalidades, cualesquiera de los ADN anteriores comprende además un origen de replicación activa en 10 una célula procariótica. En otras modalidades, cualquiera de los ADN anteriores comprende además un origen de replicación activa en una célula eucariótica.

Esta invención provee una célula hospedante que comprende cualquiera de los ADN anteriores operativamente ligados a un promotor í 15 heterólogo. En una modalidad, la célula hospedante es E. Coli BL21 y dicho ADN es un vector de expresión pBAD/Thio-TOPO. Esta invención provee un método para la producción de apo- Mhp3 o un fragmento del mismo, dicho método comprendiendo (i) cultivar las células anteriores en condiciones en las que se expresa apo-Mhp3, y (ii) 20 recuperar dicha proteína. En una modalidad, dicha proteína es recuperada en una forma soluble. En otra modalidad, dicha proteína es recuperada en una forma insoluble. Esta invención provee un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un animal ocasionada por infección con Mycoplasma hyopneumoniae que consiste en administrar al animal una formulación de vacuna que comprende (i) cualquiera de los ADN anteriores, y (ii) un excipiente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad suficiente para producir un incremento en las respuestas celulares o humorales específicas frente a Mycoplasma hyopneumoniae. En una modalidad, dicho animal es un cerdo. Esta invención provee un ADN aislado que comprende un fragmento de 15-40 nucleótidos, dicho fragmento híbrida en condiciones restrictivas para la PCR con un ADN que codifica en el código genético del micoplasma, a una proteína que tiene una secuencia de por lo menos 5 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:2, o su complemento. En una modalidad, la hibridación es específica para M. hyopneumoniae. Esta invención provee un ADN aislado que comprende un fragmento de por lo menos 90 nucleótidos, dicho fragmento híbrida en condiciones de alta restricción para la hibridación en filtro con un ADN que codifica en el código genético del micoplasma una proteína que tiene una secuencia de por lo menos 30 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:2, o su complemento. Esta invención provee un kit que comprende en por lo menos un recipiente, un primer ADN aislado que comprende un fragmento de por lo menos 15 nucleótidos, dicho fragmento híbrida en condiciones restrictivas para PCR con un ADN que codifica en el código genético del micoplasma una proteína que tiene una secuencia de por lo menos 5 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:2, y un segundo ADN aislado que comprende un fragmento de por lo menos 15 nucleótidos, dicho fragmento híbrida en condiciones restrictivas para PCR con un ADN complementario a un ADN que codifica en el código genético micoplásmico una proteína que tiene una secuencia de por lo menos 5 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:2 en donde dicho kit incluye una leyenda que indica que el kit es útil para diagnóstico de infección por . hyopneumoniae. En una modalidad, la hibridación es específica para M. hyopneumoniae. En otra modalidad, el kit comprende en por lo menos un recipiente cualquiera de los ADN asilados anteriores, en donde la hibridación es específica para M. hyopneumoniae y en donde dicho kit comprende una leyenda que indica que el kit es útil para diagnóstico de infección por M. hyopneumoniae. Esta invención provee un kit que comprende en por lo menos un recipiente una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 30 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:4 y una leyenda que indica que el kit es útil para el diagnóstico de infección por M. hyopneumoniae. En una modalidad, el equipo además comprende un anticuerpo secundario anti-cerdo, y en una modalidad adicional el anticuerpo secundario se conjuga con una enzima que cataliza una reacción colorimétrica. En una modalidad adicional, la enzima se selecciona del grupo que consiste de fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano picante, y en otra modalidad más, el kit comprende reactivos para una prueba colorimétrica.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 es un alineamiento por Clustal W (1.7) de las secuencias entre la Mhp3, del M. hyopneumoniae (SEQ ID NO:2) y la Ag234-5 (SEQ ID NO:41 ), que primero se creyó que se originaba del M.argininí pero posteriormente se vió que se derivaba del M. hyorhinis. La identidad de los aminácidos está señalada por asteriscos (*), las sustituciones altamente conservadoras están indicadas por dos puntos (:), y las sustituciones conservadoras están indicadas por puntos (.). Globalmente, las dos proteínas comparten la identidad del 36.2% de aminoácidos. La figura 2 es un Western blot que demuestra la reactividad de los anticuerpos procedentes de un cerdo enfrentado experimentalmente con M. hyopneumoniae frente a extractos de proteína de M. hyopneumoniae, M. hyorhinis, o M. mycoides, o frente a la proteína Mhp3 recombinante purificada.

Abreviaturas v definiciones La abreviatura M., cuando precede al nombre de una especie, se refiere al género Mycoplasma. El término "mhp3 recombinante" se refiere a un ácido nucleico que codifica al antígeno Mhp3 en el código genético universal. El término umhp3 de M. hyopneumoniae" se refiere a un ácido nucleico que codifica al antígeno Mhp3 en el código genético del M. hyopneumoniae. En M. hyopneumoniae, el codón TGA indica un resto triptofano en lugar de un codón de terminación en la traducción. Por ello, el gen mhp3 recombinante se diferencia del mhp3 de M. hyopneumoniae por tener codones TGG en lugar de codones TGA. El término "Mhp3" se refiere a una proteína codificada por un gen mhp3. El término apoproteína indica una proteína que carece de un resto lipídico, por ejemplo por deleción o mutación del aminoácido que debería funcionar como un aceptor de dicho resto lipídico. El término "ORF" indica "marco de lectura abierto", esto es, la región codificadora de un gen. El "porcentaje de identidad de la secuencia" para lo ácidos nucleicos y polipéptidos se determina comparando dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación, donde el alineamiento óptimo proporciona la semejanza del mayor orden y se pueden introducir adiciones o deleciones a la secuencia de ensayo o a la secuencia de referencia. El porcentaje de identidad se determina calculando el porcentaje de aminoácidos que son idénticos en la secuencia de ensayo y en la secuencia de referencia en una posición dada. El alineamiento óptimo de la secuencia y el porcentaje de identidad se pueden determinar manualmente, o más preferiblemente por medio de un algoritmo de ordenador que incluye, pero sin limitarse a ellos, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, GAP, BESTFIT, y CLUSTALW (Altschul et al., 1990, J. Mot. Biol. 215(3): 403-10; Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85(8): 2444-8; Thompson, er a/., 1994. Nucleic Acids Res. 22(22): 4573-80; Devereux ef al., 1984, Nuc. Acids. Res. 12: 387-395); Higgins, et al., 1996, Methods Ezymol 266: 383-402). Preferiblemente, se usa el NCBI Blast Server (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), ajustado a los parámetros preferidos, para determinar el porcentaje de identidad de la secuencia. El término heterólogo, cuando se usa aquí para describir a un promotor, indica que el promotor no es nativo para el marco de lectura abierto cuya expresión controla. El término "proteína aislada" indica una composición de proteínas en la que la proteína aislada comprende al menos el 50% en peso.

Más preferiblemente, la composición contiene aproximadamente el 95%, y más preferiblemente el 99% en peso de la proteína aislada. El término "recuperado en una forma soluble" indica que una proteína o polipéptido se recupera del citoplasma de la célula que expresa dicha proteína o polipéptido. El término "recuperado en una forma insoluble" indica que una proteína o polipéptido se recupera de los cuerpos de inclusión presentes en la célula que expresa dicha proteína o polipéptido. El término "funcionalmente equivalente" como se utiliza aquí, se refiere a una proteína capaz de ser reconocida por un anticuerpo específico para la Mhp3, que es una proteína capaz de producir una respuesta inmunológica sustancialmente similar a la de la proteína Mhp3 endógena. De ^ esta manera, un anticxierpo producido frente a una proteína funcionalmente equivalente reconocerá también a la Mhp3. El término "¡nmunogenicidad" se refiere a la capacidad de una proteína o polipéptido para producir una respuesta inmune dirigida específicamente frente a la proteína o polipéptido. El término "antigenicidad" se refiere a la capacidad de una proteína o polipéptido para se unida ¡nmunoespecíficamente con un anticuerpo frente a la proteína o polipéptido. El término "protección" o "proteger", como se usa aquí con respecto a una vacuna, significa que la vacuna previene o reduce los síntomas de la enfermedad causada por el organismo del cual se derivan el antígeno o antígenos usados en la vacuna. El término "anticuerpo", como se usa aquí, se refiere a una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse a un antígeno. Los anticuerpos pueden ser una mezcla policlonal o monoclonal. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser porciones inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos pueden existir en una variedad de formas que incluyen, por ejemplo, Fv, Fab', F(ab')2, así como en cadenas sencillas. Se pueden usar también los anticuerpos de cadenas sencillas, en ios que los genes para una cadena pesada y una cadena ligera, se combinan en una secuencia codificadora sencilla. El término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad del ¾¾nucleótido mhp3 o del polipéptido Mhp3 suficiente para producir una respuesta inmune en el sujeto al que se administra. La respuesta inmune puede comprender, sin limitación, la inducción de inmunidad celular y/o humoral. El término "tratar o prevenir la infección de M. hyopneumoniae" significa inhibir la replicación de las bacterias de M. hyopneumoniae, inhibir la transmisión de M. hyopneumoniae, o evitar que el propio M. hyopneumoniae se establezca en su hospedante, y aliviar los síntomas de la enfermedad causada por la infección por M. hyopneumoniae. El tratamiento se considera terapéutico si hay una reducción de la carga bacteriana, una disminución de las infecciones pulmonares y/o un incremento de la absorción de alimentos y/o del crecimiento. El término "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un medio excipiente que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del ingrediente activo, es químicamente inerte y no es tóxico para el sujeto al que se administra. El término "agente terapéutico" se refiere a alguna molécula, compuesto o tratamiento, preferiblemente un antibacteriano, que ayuda en el tratamiento de una infección bacteriana o de las enfermedades causadas por ella.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Como se describe aquí, en esta invención se ha descubierto y caracterizado un gen de M. hyopneumoniae que codifica a la Mhp3, el cual se cree que está unido a la membrana plasmática de M. hyopneumoniae en virtud de una cadena lipídica unida covalentemente a la proteína. La invención proporciona medios recombinantes para expresar las proteínas hp3 que carecen de una secuencia señal y de la necesaria señal para la modificación lipídica, permitiendo de esta manera la expresión eficiente y con alto rendimiento de Mhp3 para uso en vacunas frente a enfermedades causadas por infección con M. hyopneumoniae y para uso en tratamiento de dichas enfermedades. La presente invención incluye así las proteínas codificadas por el mhp3 de M. hyopneumoniae y las secuencias de nucleótidos del mismo. La invención incluye además ácidos nucleicos que codifican a tales proteínas en el código genético universal que son adecuados para la expresión de tales proteínas en hospedantes eubacterianos y eucarióticos, tales como E. coli y baculovirus, respectivamente. La invención incluye también las proteínas que tienen una secuencia que comprende al menos 10, o al menos 20, o al menos 30, o al menos 40, o al menos 50 o al menos 100 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 4 y los ácidos nucleicos que codifican a tales proteínas en e! código genético universal. '-. " . ¦ - ¦ ..-:· ¦ >'¦ ¦ '- ¦¾'*; - jé f La invención incluye además métodos para el tratamiento de enfermedades causadas por M. hyopneumoniae usando las proteínas y/o anticuerpos de la invención. La invención incluye además formulaciones de vacunas que comprenden proteínas Mhp3. En ciertas modalidades, las formulaciones de vacunas comprenden proteínas aisladas seleccionadas del grupo constituido por P46, P65, P97 y P 102 y fragmentos, variantes y derivados de las mismas. Para claridad de la descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas características, modalidades o aplicaciones de la invención.

Secuencias de nucleótidos del mho3 La presente invención incluye las secuencias de nucleótidos del gen mhp3 e incluye aquellas secuencias de nucleótidos que codifican a especies variantes de Mhp3 que se pueden encontrar en otras especies de M. hyopneumoniae. Una modalidad preferida de la invención incluye las secuencias de nucleótidos que codifican a una forma amino-truncada de la proteína Mhp3 que no está modificada por la adición covalente de cadenas de ácidos grasos y que por tanto no está localizada en la membrana. En un modo de la modalidad preferida de la invención, la deleción en 5' del mhp3 correspondiente al amino terminal de hp3 incluye las secuencias de nucleótidos que codifican a los aminoácidos 2-29 de Mhp3. En otros modos de .¿i la modalidad, la deleción en 5' del mhp3 corresponde a los primeros 30, 31-32 ó 33-40 aminoácidos. La invención proporciona un ADN aislado o purificado que codifica en el código genético del micoplasma a una proteína que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 10, o al menos 20, o al menos 30, o al menos 40, o al menos 50 o al menos 100 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2, o su complemento. La invención proporciona también un ADN que tiene una secuencia que comprende al menos 90 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 , o su complemento. La invención proporciona también un ADN que codifica en el código genético universal a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 10, o al menos 20, o al menos 30, o al menos 40, o al menos 50 o al menos 100 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 4, o su complemento. La invención proporciona también un ADN que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3. La invención proporciona también un ADN aislado que comprende un fragmento de 15-40 nucleótidos, cuyo fragmento se híbrida en condiciones restrictivas para la PCR (como se describe más adelante) con un ADN que codifica en el código genético del micoplasma a una proteína que tiene una secuencia de al menos 5 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2, o su complemento. En una modalidad preferida, la hibridación es específica para M. hyopneumoniae. Como se usa aquí, el término "hibridación específica para M. hyopneumoniae " indica hibridación selectiva con el genoma de M. hyopneumoniae pero no con los genomas de especies rrocoptásmicas relacionadas, tales como M. hyorhinis, M. flocculare, M. mycoides, etc. La invención proporciona también un ADN aislado que comprende un fragmento de al menos 90 nucleótidos, cuyo fragmento se híbrida en condiciones de alta restricción para la hibridación en filtro (como se describe más adelante) con un ADN que codifica en el código genético del micoplasma a una proteína que tiene una secuencia de al menos 30 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2, o su complemento. En una modalidad específica, se proporciona un ácido nucleico que es hibridable con una ácido nucleico del mhp3 (por ejemplo, que tiene una secuencia como se indica en las SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5), o con su complemento, o con un ácido nucleico que codifica a un derivado o análogo del mhp3, o con su complemento, en condiciones de baja restricción. A modo de ejemplo y no de limitación, los procedimientos que usan condiciones de baja restricción para las regiones de hibridación de más de 90 nucleótidos son como sigue (véase también Shilo and Weinberg, 1981 , Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78, 6789-6792). Los filtros que contienen el ADN se tratan previamente durante 6 h y 40°C en una solución que contiene formamida 35%, 5X SSC, Tris-HCI 50 mM (pH 7.5), EDTA 5 mM, PVP 0.1%, Ficoll 0.1 %, BSA 1 %, y 500 a^??? de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Las hibridaciones se llevan a cabo en la misma solución con la siguientes modificaciones: PVP 0.02%, Ficoll 0.02%, BSA 0.2%, 100 µa ?? de ADN de esperma de salmón, sulfato de dextrano 10% (p/vol), y se usa una sonda marcada con de 5-20 x 106 cpm. Se incuban los filtros en mezcla de hibridación durante 18-20 h a 40°C, y después se lavan durante 1.5 h a 55°C en una solución que contiene 2X SSC, Tris-HCI 25 mM (pH 7.4), EDTA 5 mM, y SDS 0.1%. La solución de lavado se reemplaza con solución fresca y se incuba durante 1.5 h adicional a 60°C. Los filtros se secan y se exponen a una autorradiografía. Si fuera necesario, se lavan los filtros durante una tercera vez a 65-68°C y se re-exponen a la radiografía. Otras condiciones de baja restricción que se pueden usar son bien conocidas en la técnica (por ejemplo, las que se emplean para hibridaciones de especies cruzadas). En otra modalidad específica, se proporciona un ácido nucleico que es hibridable con un ácido nucleico del mhp3, o con su complemento, en condiciones de alta restricción. A modo de ejemplo y no de limitación, los procedimiento que usan tales condiciones de alta restricción para las regiones de hibridación de más de 90 nucleótidos son como sigue. La prehibridación en los filtros que contienen el ADN se realiza durante de 8 h a toda la noche a 65°C en una solución tampón compuesta de 6X SSC, Tris-HCI 50 mM (pH 7.5), EDTA 1 mM, PVP 0.02%, Ficoll 0.02%, BSA 0.02%, y 500 µ? p?? de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridan durante 48 h a 65°C en una mezcla de prehibridación que contiene 100 µg/m^ de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y una sonda marcada con ^P de 5-20 x 106 cpm. El lavado de los filtros se hace a 37°C durante 1 h en una solución que contiene 2X SSC, PVP 0.01 %, Ficoll 0.01 %, y BSA 0.01%. Esto va seguido por un lavado en 0.1 X SSC a 50°C durante 45 min antes de la i autorradiografía. Otras condiciones de alta restricción que se pueden usar dependen de la naturaleza del ácido nucleico (por ejemplo, longitud, contenido en GC, etc.) y de los fines de la hibridación (detección, amplificación, etc.) y son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la hibridación restrictiva de un oligonucleótido de aproximadamente 15-40 bases con una secuencia complementaria en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se hace en las siguientes condiciones: una concentración de sal de KCI 50 mM, una concentración de solución tampón de Tris-HCI 10 mM, una concentración de Mg2+ 1.5 mM, un pH 7-7.5 y una temperatura de endurecimiento de 55-60X. En otra modalidad específica, se proporciona un ácido nucleico que es hibridable con un ácido nucleico del mhp3, o con su complemento, en condiciones de moderada restricción. La selección de las condiciones apropiadas para tales restricciones es bien conocida en la técnica (véase por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; véase también, Ausubel et al., eds., en las series de manuales de técnicas de laboratorio, Current Protocole in Molecular Biology, ©1987-1997, Current Protocole, ©1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.). Se proporcionan adicionalmente ácidos nucleicos que codifican a derivados y análogos de las proteínas codificadas por mhp3, y ácidos nucleicos antisentido del mhp3. Como es evidente, del modo en que se usa aquí, "un ácido nucleico que codifica a un fragmento o porción de una proteína % «codificada por mhp3", se debe interpretar como referencia a un ácido nucleico que codifica solamente al citado fragmento o porción de la proteína codificada por mhp3 y no a las otras porciones contiguas de la proteína de la codificada por mhp3 como una secuencia continua. En una modalidad específica preferida, después de la hibridación, las condiciones de lavado son como sigue. Cada membrana se lava dos veces durante 30 minutos cada vez, cada una a 45°C en fosfato de sodio 44 mM, pH 7.2, SDS 5%, EDTA 1 mM, albúmina de suero bovino 0.5%, seguido por cuatro lavados durante 30 minutos cada uno en fosfato de sodio, pH 7.2, SDS 1%, EDTA 1 mM, y después cada membrana se trata de forma diferente como se describe a continuación para condiciones de hibridación de baja, media o alta restricción. Para la hibridación con baja restricción, las membranas no se lavan adicionalmente. Para la hibridación con restricción media, las membranas se someten adicionalmente a cuatro lavados, cada uno de ellos durante 30 minutos en fosfato de sodio 44 mM, pH 7.2 SDS 1 %, EDTA 1 mM a 55°C. Para la hibridación con restricción alta, siguiendo a los lavados de las condiciones de baja restricción, las membranas se someten adicionalmente a cuatro lavados, cada uno de ellos durante 30 minutos en fosfato de sodio 40 mM, pH 7.2, SDS 1 %, EDTA 1 mM a 55°C, seguido por cuatro lavados, cada uno de ellos durante 30 minutos en fosfato de sodio, pH 72, SDS 1 %, EDTA 1 mM A 65°C.

Proteínas v polipéptidos codificados por mhp3 La presente invención proporciona proteínas Mhp3 recombinantes. En una modalidad, la proteína tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 10, o al menos 20, o al menos 30, o al menos 40, o al menos 50 o al menos 100 aminoácidos contiguos de la SEQ 10 NO: 4 y que no está ligada covalentemente a un resto de ácido graso. En una modalidad adicional, la proteína es una proteína aislada. La presente invención proporciona también composiciones que comprenden tales proteínas Mhp3. En ciertas modalidades específicas, las composiciones comprenden una proteína Mhp3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable, o una proteína Mhp3 y un adyuvante. En otra modalidad específica, la composición comprende al menos otra proteína de M. hyopneumoniae tal como las P46, P65, P97 o P102, pero sin limitarse a ellas. En otras modalidades, la composición comprende una proteína Mhp3 y al menos otro polipéptido inmunogénico o antigénico que no es un polipéptido de M. hyopneumoniae y que es preferiblemente un polipéptido viral, bacteriano o parasitario. Tal composición es beneficiosa como una vacuna de combinación. Además, las proteínas Mhp3 de la presente invención para uso en preparaciones de vacunas son sustancialmente puras u homogéneas. Para determinar la pureza u homogeneidad de las proteínas, se pueden usar métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como electroforesis de una muestra en gel de poliacrilamida, seguida por la visualízación de una banda sencilla de polipéptido sobre un gel de tinción. Se puede deterinar con más alta resolución usando HPLC u otros métodos similares bien conocidos en la técnica. La presente invención incluye polipéptidos que se purifican típicamente a partir de las células del hospedante que expresan las secuencias de los nucleótidos recombinantes que codifican a estas proteínas. Tal purificación de proteínas se puede realizar por una serie de métodos bien conocidos en la técnica. En una modalidad, la proteína Mhp3 de la presente invención se expresa como una proteína de fusión, por ejemplo con tiorredoxina. La proteína recombinante de fusión resultante se puede purificar por cromatografía de afinidad. En un modo de la modalidad, la proteína hp3 se separa por escisión del resto heterólogo dando como resultado una muestra de proteína Mhp3 sustancialmente pura. Se pueden usar otros métodos, véanse por ejemplo, las técnicas descritas en "Methods In Enzymology", 1990, Academic Press, Inc., San Diego, "Protein Purification: Principies and practice", 1982, Springer-Verlag, New York.

Sistemas de expresión La presente invención incluye sistemas de expresión, tanto vectores de expresión eucarióticos como procarioticos, que se pueden usar para expresar ambas formas de la proteína del mhp3, la truncada y la de longitud completa. En una modalidad preferida de la invención, el ácido nucleico tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3 y codifica a una proteína de la SEQ ID fsfO: 4, que incluye los restos 30-444 de la SEQ ID NO: 2. Los codones TGA de M. hyopneumoniae han sido cambiados a codones TGG. Se pueden utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión en el hospedante para expresar las secuencias de la proteína antigénica de la invención. Tales sistemas de expresión en el hospedante representan vehículos por los cuales se pueden producir y después purificar las secuencias codificadoras de interés, pero representan también células que cuando se transforman o transfectan con las apropiadas secuencias codificadoras de nucleótidos, pueden presentar in situ los productos del gen mhp3 de la invención. Estas células incluyen, pero sin limitarse a ellos, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformados con los vectores de expresión recombinantes de ADN del bacteriófago, de ADN del plásmido o de ADN del cósmido que contienen las secuencias codificadoras del mhp3; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con los vectores de expresión recombinantes de levaduras que contienen las secuencias codificadoras del producto génico mhp3; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión recombinantes de virus (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias codificadoras de mhp3; sistemas de células de plantas infectadas con vectores de expresión recombinantes de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión recombinantes de plásmidos (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen las secuencias codificadoras de mhp3; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, COS, CHO, SHK, 293, 3T3) que alojan construcciones recombinantes de expresión que contienen promotores derivados del genoma de las células de mamíferos (por ejemplo, el promotor metalotioneína) o de los virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío del adenovirus; el promotor de vaccinia virus de 7.5 K). En una modalidad preferida, el sistema de expresión es un sistema bacteriano. Se puede seleccionar ventajosamente una serie de vectores de expresión dependiendo del uso previsto para el producto de mhp3 que se va a expresar. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de una proteína destinada a la generación de composiciones farmacéuticas de Mhp3 o producir anticuerpos frente a hp3, pueden ser deseables, por ejemplo, vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Preferiblemente, los vectores contienen promotores que dirigen la expresión génica inducible. Los vectores adecuados incluyen, pero sin limitarse a ellos, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791 ), en el que las secuencias codificadoras de mhp3 pueden estar ligadas individualmente dentro del vector en el marco con la región codificadora lac Z de forma que se produce una proteína de fusión; los vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol, Chem. 264: 5503-5509); los vectores pET (Studier and Moffatt, 1986, J. Mol. Biol. 189: 113; Rosenberg et aí., 1987, Gene 56: 125-135; los vectores están disponibles de Novagen, Madison, Visconsin), en los cuales la secuencia codificadora de mhp3 puede estar fusionada en el marco con una secuencia que codifica a restos múltiples (por ejemplo, seis) de histidina; los vectores pBAD (Guzman et al., 1995, J. Bact. 177:" 4121 -4130), usando los cuales se puede expresar la Mhp3 bajo el control de una proteína inducible por arabinosa. Los vectores pGEX (Promega Corporation) se pueden usar también para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión-S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas por adsorción en perlas de glutatión-agarosa seguida por elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión por la trombina-proteasa o factor Xa-proteasa de forma que el deseado producto génico clonado se pueda liberar del resto GST. Las secuencias de mhp3 se pueden clonar en un vector de expresión ? y se pueden expresar en cepas bacterianas ?". En un modo preferido de la modalidad, la cepa bacteriana es LW14, que contiene un represor ? sensible a la temperatura, de tal forma que la expresión de la proteína desde un vector ? se reprime a 30°C pero se activa a 42°C. En una modalidad altamente preferida, la Mhp3 en el vector se expresa como una proteína de fusión con tiorredoxina, que favorece la solubilidad de las proteínas que son normalmente insolubles. Una proteína de fusión tiorredoxina-Mhp3 se expresa preferiblemente ligando una secuencia codificadora de hp3 con el vector de pBAD pBAD Thio-TOPO (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California). En un modo de la modalidad altamente preferida, la proteína de fusión tiorredoxina-Mhp3 se expresa en la cepa de E. - .- cti BL2 . Se pueden usar otros vectores que son conocidos por tos expertos en la técnica.

Anticuerpos frente a Mhp3 De acuerdo con la invención la proteína codificada por mhp3 y sus derivados y análogos se pueden usar como inmunógenos para generar anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente con tal inmunógeno. Se pueden usar diferentes procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales frente a Mhp3. Para la producción de anticuerpos, se pueden inmunizar diferentes animales hospedantes por inyección con la proteína nativa Mhp3, o con una versión sintética, o con un derivado de la misma, incluyendo pero sin limitarse a ellos, conejos, ratones, ratas, etc. Se pueden usar diferentes adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedante (véanse por ejemplo, los usados en la preparación de vacunas). Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos a una secuencia de la proteína codificada por mhp3 o a un análogo de la misma, se puede usar cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos por líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica del hibridoma desarrolla originalmente por Kohler y Milstein, (Kohler and Milstein 1975, Nature 256: 495-497), así como la técnica del trioma, la técnica del hibridoma humano de células B (Kozbor er a/., 1983, Immunology Today 4: 72), y la técnica del hibridoma con EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). En una modalidad adicional de la invención, se pueden producir anticuerpos monoclonales en animales libres de gérmenes utilizando tecnología reciente (véase, por ejemplo, el documento PCT/US90/02545). De acuerdo con la invención, se pueden usar anticuerpos humanos que se pueden obtener usando hibridomas humanos (Colé et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 80: 2026-2030) o transformando las células B humanas con el virus EBV in vitró (Colé et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96). De hecho, según la invención, se pueden usar las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452-454) enlazando los genes procedentes de una molécula de anticuerpo de ratón específico para la proteína codificada por mhp3 junto con los genes de una molécula de anticuerpo humano de apropiada actividad biológica; tales anticuerpos están dentro del alcance de esta invención. De acuerdo con la invención, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (patente de Estados Unidos No. 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos para el producto del gen mhp3. Una modalidad adicional de a invención utiliza las técnicas descritas para la construcción de genotecas de expresión de Fab' (Huse ef a/., 1989, Science 246: 1275-1281) para permitir una identificación rápida y fácil de los fragmentos Fab monoclonates con la deseada especificidad para las proteínas, derivados, o análogos codificados por mhp3. Los fragmentos de anticuerpos que contienen el idiotipo de la 5 molécula se pueden generar por técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen pero no están limitados a ellos, el fragmento F(ab')2 que se puede producir por digestión de la molécula del anticuerpo con pepsina, los fragmentos Fab' que se pueden generar reduciendo los puentes de disulfuro del fragmento F(ab')2, los fragmentos Fab que se pueden generar tratando la 10 molécula del anticuerpo con papaína y un gen reductor, y los fragmentos Fv. En la producción de anticuerpos, el cribado para encontrar el anticuerpo deseado se pueden realizar por métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA). Por ejemplo, para seleccionar los anticuerpos que reconocen un dominio 15 específico de una proteína codificada por mhp3, se pueden ensayar los hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento de Mhp3 que contiene dicho domino. Para la selección de un anticuerpo que se une específicamente a un primer homólogo de Mhp3 pero que no se une específicamente a un homólogo diferente de Mhp3, se puede seleccionar en 20 función de una unión positiva con el primer homólogo de Mhp3 y una falta de unión con el segundo homólogo de Mhp3. Se proporcionan también anticuerpos específicos para un dominio de la proteína codificada por mhp3. Se proporcionan también :¦ ;*> jS*-¾¿í ¡S ... .,, , ¦, . i ».,:,; » - ;. ... f.íj . ; , . » f li .JÍr.. g anticuerpos específicos para un epítope de la proteína codificada por mhp3. Los anticuerpos mencionados se pueden usar en métodos conocidos en la técnica en relación con la localización y actividad de las secuencias de la proteína codificada por mhp3 de la invención, por ejemplo, midiendo sus niveles en muestras fisiológicas apropiadas, en métodos de diagnóstico, inmunoterapia, etc.

Kits de mhp3 La invención proporciona adicionalmente kits par la detección de M. hyopneumoniae. En una modalidad, el kit proporciona reactivos para la detección de anticuerpos circulantes frente a la proteína Mhp3 de . hyopneumoniae. En ciertas modalidades, los kits comprenden una nota indicando que el kit es útil para el diagnóstico de la infección por M hyopneumoniae. Como mínimo, el kit contiene, en al menos un recipiente, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 30 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 4. En un modo de la modalidad, el kit contiene además un anticuerpo secundario anti-cerdo. En un modo preferido de la modalidad, el anticuerpo secundario se conjuga con una enzima que cataliza una reacción colorimétrica, tal como una fosfatasa alcalina o una peroxidasa del rábano picante. En un modo adicional de la modalidad, el kit contiene también reactivos para un ensayo colorimétrico. En otra modalidad, el kit proporciona reactivos para la detección de los ácidos nucleicos de M hyopneumoniae. En un modo de la modalidad, el kit proporciona reactivos para la detección por PCR de los ácidos nucleicos de M. hyopneumoniae y contiene, en al menos un recipiente, un primer ADN aislado que comprende un fragmento de al menos 15 nucleótidos, cuyo fragmento se híbrida bajo condiciones restrictivas con un ADN que codifica en el código genético del micoplasma a una proteína que tiene una secuencia de al menos 5 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2, y un segundo ADN aislado que comprende un fragmento de al menos 15 nucleótidos, cuyo fragmento se híbrida bajo condiciones restrictivas con un ADN complementario de un ADN que codifica en el código genético del micoplasma a una proteína que tiene una secuencia de al menos 5 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2. En otro modo de la modalidad, el kit proporciona reactivos para métodos basados en la hibridación para la detección del genoma de M. hyopneumoniae y contiene, en al menos un recipiente, un ADN aislado que comprende un fragmento de al menos 15 nucleótidos, cuyo fragmento se híbrida bajo condiciones restrictivas con un ADN que codifica en el código genético del micoplasma a una proteína que tiene una secuencia de al menos 5 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2, o con el complemento de dicho ADN, y donde la hibridación es específica para M. hyopneumoniae. Como se usa aquí, el término "hibridación específica para M. hyopneumoniae" indica hibridación selectiva con el genoma de M. hyopneumoniae pero no con los genomas de especies relacionadas de micoplasmas, tales como M. hyorhinis, M. flocculare, M. mycoides, etc.

,» Formulaciones de vacunas y métodos de administración Como el antígeno de la proteína Mhp3 de la presente invención se puede producir en grandes cantidades, el antígeno así producido y purificado tiene uso en las preparaciones de vacunas. La proteína Mhp3 también tiene utilidad en los inmunoensayos, por ejemplo, para detectar o medir, en una muestra de fluido corporal procedente de un animal de ensayo vacunado o potencialmente infectado, la presencia de anticuerpos frente al antígeno, y de este modo hacer seguimiento de la respuesta inmune y/o diagnosticar la infección del animal. La preparación de las vacunas que contienen un polipéptido inmunogénico como el ingrediente activo es conocida por los expertos en la técnica.

Determinación de la eficacia de la vacuna La inmunopotencia del antígeno hp3 se puede determinar por seguimiento de la respuesta inmune en animales de ensayo después de inmunización con el antígeno Mhp3, solo o en combinación con al menos otro polipéptido, o por el uso de algún inmunoensayo conocido en la técnica. En una modalidad preferida, el otro polipéptido mencionado se selecciona del grupo constituido por las proteínas P46, P65, P97 y P102 de M. hyopneumoniae. La generación de una respuesta humoral (anticuerpo) y/o de inmunidad mediada por las células se puede tomar como una indicación de una respuesta inmune.

Los métodos de administración de la vacuna pueden incluir las vías oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal o cualquier otra vía estándar de inmunización. La respuesta inmune de los sujetos de ensayo se puede analizar por diferentes métodos tales como: la reactividad del suero inmune resultante al antígeno Mhp3, como se ensaya por técnicas conocidas, por ejemplo, el ensayo de ínmunoabsorbente (ELISA), inmunoblots, radioinmunoprecipitaciones, etc., o en el caso en que el antígeno Mhp3 presenta antigenicidad o inmunogenicidad, por la protección del hospedante inmunizado frente a la infección por M. hyopneumoniae y/o la atenuación de los síntomas debidos a la infección por M. hyopneumoniae en el hospedante inmunizado.

Formulaciones de vacunas Las vacunas de la invención comprenden Mhp3 recombinante y/o sus fragmentos, variantes y derivados. En ciertas modalidades, las vacunas de la invención comprenden Mhp3 y al menos otro polipéptido antigénico de M. hyopneumoniae. Los polipéptidos antigénicos adecuados para uso en combinación con Mhp3 incluyen las proteínas P46, P65, P97 y P102, pero no están limitados a ellas, y/o fragmentos, variantes y derivados de dichos polipéptidos. Los polipéptidos no-Mhp3 de las vacunas, tales como las proteínas P46, P65, P97 y P102 y sus fragmentos, variantes y derivados, se pueden purificar a partir de los cultivos de M. hyopneumoniae o se pueden expresar recombinantemente.

Las preparaciones adecuadas de tales vacunas incluyen además los inyectables, ya sea como soluciones líquidas o como suspensiones; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en un líquido antes de la inyección. La preparación también puede estar emulsionada. Los ingredientes activos inmunogénicos se mezclan a menudo con adyuvantes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Ejemplos de adyuvantes efectivos incluyen, pero no están limitados a: hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamína (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina. La eficacia de un adyuvante se puede determinar midiendo la inducción de anticuerpos dirigidos frente a un polipéptido inmunogénico que contiene un epítope del polipéptido Mhp3, y los anticuerpos que resultan de la administración de este polipéptido en vacunas que constan también de los diferentes adyuvantes. Los polipéptidos se pueden formular en la vacuna como formas neutras o sales. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del péptido) y que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, maleico, y similares. Las sales formadas con grupos carboxilo libres se pueden derivar también de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o hidróxido férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etílamino-etanol, histidina, procaína y similares. Se pueden usar muchos métodos para administrar las formulaciones de vacuna de la invención, estos incluyen, las vías oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, intranasal y la vía de escarificación (raspando las capas superiores de la piel, por ejemplo usando una aguja bifurcada), pero no están limitadoa a ellas. El sujeto al que se administra la vacuna es preferiblemente un animal, más preferiblemente un cerdo. Las formulaciones de vacunas de la invención comprenden una cantidad efectiva inmunizante de la proteína Mhp3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las preparaciones de vacunas comprenden una cantidad efectiva inmunizante de uno o más antígenos y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica e incluyen pero sin limitarse a ellos, solución salina, solución salina tampón, dextrosa, agua, glicerol, solución tampón acuosa isotónica estéril, y combinaciones de las mismas. Un ejemplo de dicho excipiente aceptable es un medio de cultivo fisiológicamente equilibrado que contiene uno o más agentes estabilizantes tales como proteínas estabilizadas, hidrolizadas, lactosa, etc. El excipiente es preferiblemente estéril. La formulación debe ser adecuada para el modo de administración.

En una modalidad específica, se proporciona en un primer recipiente un polipéptido Mhp3 liofilizado de la invención; y un segundo recipiente comprende el diluyente que consta de una solución acuosa de glicerina al 50%, fenol al 0.25% y un antiséptico (por ejemplo, verde brillante 0.005%). El uso de antígenos purificados como preparaciones de vacunas se puede llevar a cabo por métodos estándar. Por ejemplo, la proteína o proteínas purificadas se deben ajustar a una concentración apropiada, formular con algún adyuvante de vacunas adecuado y empaquetar para su uso. Los adyuvantes adecuados pueden incluir, paro no están limitados a: geles minerales, por ejemplo, hidróxido de aluminio; sustancias tensioactivas tales como lisolecitina; glicósidos, por ejemplo, derivados de saponinas tales como Quill A; polioles plurónicos, polianiones, polímeros de bloque no iónicos, por ejemplo, Pluronic F- 27 (B. A. S. F., USA); péptidos; aceites minerales, por ejemplo, Montanide ISA-50 (Seppic, Paris, Francia), emulsiones oleosas, por ejemplo, una emulsión de aceite mineral tal como BayolF/Arlacel A y agua, o una emulsión de aceite vegetal, agua y un emulsionante tal como lecitina; alúmina, y MDP. El inmunógeno se puede incorporar también a liposomas, o conjugar con polisacáridos y/o con otros polímeros para uso en una formulación de una vacuna. En los casos en que el antígeno recombinante es un hapteno, es decir, una molécula que es antigénica porque puede reaccionar selectivamente con anticuerpos afines, pero que no es inmunogénica porque no puede producir una respuesta inmune, el hapteno se puede unir covalentemente a un excipiente o molécula inmunogénica; por ejemplo, una proteína grande tal como albúmina sérica conferirá inmunogenicidad al hepteno acoplado a ella. El hapteno-excipiente se puede * formular para uso como una vacuna. Las dosis efectivas (cantidades inmunizantes) de las vacunas de la invención se puede extrapolar también de las curvas dosis-respuesta derivadas de los sistemas de ensayo modelos. La invención proporciona también un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes que contienen uno o más de los ingredientes de las formulaciones de vacunas de la invención. La presente invención proporciona así un método para inmunizar a un animal, o para tratar o prevenir diferentes enfermedades o trastornos en un animal, que comprende administrar al animal una dosis efectiva inmunizante de una vacuna de la presente invención.

Uso de los anticuerpos generados por las vacunas de la invención Los anticuerpos generados frente al antígeno por inmunización con las proteínas Mhp3 de la presente invención también tienen usos potenciales en inmunoensayos de diagnóstico, inmunoterapia pasiva, y generación de anticuerpos antiidiotípicos. Se pueden aislar los anticuerpos generados por métodos estándar conocidos en la técnica (por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad, centrifugación, precipitación, etc.) y se pue#é§|§ ar en inmunoensayos de diagnóstico. Los anticuerpos se pueden usar también para hacer seguimiento del tratamiento y/o progresión de la enfermedad. Se puede usar para esos fines, cualquier sistema de inmunoensayo conocido en la técnica, tales como los listados anteriormente, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, los sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos "sandwich", reacciones de precipitina, reacciones de precipitina con difusión en gel; ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación al complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, por citar algunos. Las formulaciones de vacunas de la presente invención se pueden usar también para producir anticuerpos para uso en inmunoterapia pasiva, en la cual la protección a corto plazo de un hospedante se consigue por la administración de anticuerpos pre-formados dirigidos frente a un organismo heterólogo. En los procedimientos de inmunización, la cantidad de inmunógeno a ser usada y la pauta de inmunización será determinada por un médico experto en la técnica y se administrará en relación con la respuesta inmune y los títulos de anticuerpos del sujeto.

Empaquetado Se pueden presentar las composiciones, si se desea, en un paquete o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contiene el ingrediente activo. El paquete puede comprender por ejemplo, una lámina metálica o plástica, tal como una plaqueta de blister. El paquete o dispositivo dispensador puede ir acompañado por instrucciones para la administración. Se pueden preparar también composiciones que comprenden un compuesto de la invención formulado en un excipiente farmacéutico compatible, se pueden colocar en un recipiente adecuado, y etiquetar para el tratamiento de una condición indicada.

EJEMPLOS Aislamiento del ADN cromosómico de M. hyopneumoniae El ADN genómico de M. hyopneumoniae se aisló por el método del Dybvig y Alderete (Plasmid, 20: 33-41 ; 1988), en la cual las células se recogieron por centrifugación (10 min. A 6000 g a 4°C), se suspendieron en solución tampón salina de fosfato, y se lisaron por adición de 0.1 volúmenes de dodecilsulfato de sodio al 10%. Se extrajo el lisado con una mezcla de fenol, cloroformo, y alcohol isoamílico (25:24:1 ) saturada con Tris-HCI. La fase acuosa se extrajo con cloroformo, y se precipitaron los ácidos nucleicos por la adición de 0.1 volúmenes de acetato de sodio 3 M y 2 volúmenes de etanol enfriado con hielo. Después de incubación a -20°C durante 1 h, se recogieron los ácidos nucleicos por centrifugación durante 10 min en una microcentrífuga. Se resuspendieron los ácidos nucleicos en agua que contiene 20 g de RNa-se A m), y se almacenaron las muestras a -20°C.

Clonación molecular del mho3 de M. hvopneumoniae Se diseñaron y sintetizaron (Genosys Biotechnologies, Inc.; The Woodlands, TZ) los cebadores de oligonucléotidos degenerados KWK40, KWK41 , KWK42, K K43, K K42RC, y KWK43RC (SEQ ID NOs: 10-15), a partir de las secuencias parciales de aminoácidos previamente identificadas (SEQ ID NOs: 7-9) de la Mhp3 (Publicación de la patente internacional WO 96/28472). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se llevó a cabo con diferentes combinaciones de estos cebadores en un volumen de reacción de 50 µ? que contiene 1x de solución tampón para PCR (Perkin Elmer; Foster City, CA), MgC½ 2.0 mM, cada cebador a concentración 1 µ?, cada desoxi-NTP a concentración 400 µ?, y 2.5 U de AmpliTaq Gold (Perkin Elmer). Las condiciones para la amplificación consistieron en la desnaturalización a 94°C durante 2 min, seguida por 25 ciclos de desnaturalización (94°C, 1 min), endurecimiento (56°C, 1 min), y polimerización (72°C, 1 min). Usando los cebadores KWK41 (SEQ ID NO: 11 ) y KWK42RC (SEQ ID NO: 14), se amplificó un fragmento de aproximadamente 250 bp de longitud usando 410 ng del ADN cromosómico de la cepa 232 de M.hyopneumoniae (pase n=5). El fragmento se subclonó en el sitio de clonación TA de pCR2.1-TOPO (Invitrogen; Carlsbad, CA); el producto ligado se transformó dentro de las células TOP10 de E.coli (Invitrogen). Se confirmó la clonación por la secuenciación de la terminación de la cadena de didesoxtnucteótido (Advanced Genetic Analysis Center, St. Paul, MN) y por la digestión con endonudeasa de restricción seguida por la electroforesis en gel de agarosa. La PCR inversa, un método usado para amplificar las secuencias que flanquean a una región del núcleo de ADN (Ochman, H., Medhora, M.M., Garza, D, and Hartl, D.L. 1990, en "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications". Academic Press, San Diego, CA), se utilizó para clonar los extremos restantes 5' y 3' del gen que codifica a Mhp3. Los conjuntos de los fragmentos de ADN cromosomico de la cepa 232 de M. hyopneumoniae (pase n=5), se generaron por la digestión por separado del ADN sin cortar con las siguientes endonucleasas de restricción: Alu\, BamHI, EcoRV, EcoRI, Haeíll, Hind\\\, Nde\, Pvull, Sa 3AI, Spel, Ssp\, Xbal. Después de la digestión, los fragmentos se circularizaron por ligación y se sometieron a la PCR usando los cebadores de oligonucleótidos RAC3 (SEQ ID NO: 16) y RAC4 (SEQ ID NO: 17), que se diseñaron a partir de la secuencia del fragmento de 250 bp descrito antes. La amplificación con estos cebadores se realizó como sigue: desnaturalización a 94°C durante 2 min, seguida por 40 ciclos de desnaturalización (94°C, 1 min), endurecimiento (55°C, 1 min), y polimerización (72°C, 2 min). El conjunto del ADN cromosómico digerido con Ssp\, dio un fragmento de aproximadamente 600 bp que se subclonó en pCR2.1TOPO. El análisis de la secuencia del fragmento clonado identificó el extremo 5' del gen. Los oligonucleótidos RAC7 (SEQ ID NO: 18) y RAC8 (SEQ ID NO: 19) se diseñaron a partir de esta secuencia para obtener una secuencia adicional que corresponde al extemo 3' del mhp3. Las condiciones para la amplificación con estos cebadores consistieron en la desnaturalización a 94°C durante 9 min, seguida por 40 ciclos de desnaturalización (94°C, 30 sec), endurecimiento (50°C, 30 sec), y polimerización (72°C, 1 min). Cuando el conjunto del ADN digerido con Spel, se usó como molde, se amplificaron múltiples productos (de 250 bp a > 1 kb); y la mezcla de fragmentos, se clonó en pCR2.1-TOPO. El análisis de la secuencia del fragmento más grande clonado (~ 1.2 kb) proporcionó datos adicionales de la secuencia 3'. De estos datos, se diseñaron y sintetizaron los oligonucleótidos RAC12 (SEQ ID NO: 20) y RAC 5 (SEQ ID NO: 23) para ser usados para amplificación por PCR empleando el conjunto del ADN digerido con Hind\\\, como molde. Los parámetros consistieron en la desnaturalización a 94°C durante 9 min, seguida por 40 ciclos de desnaturalización (94°C, 30 sec), endurecimiento (55°C, 30 sec), y polimerización (72°C, 2 min), más una etapa final de polimerización a 72°C durante 7 min. Se amplificó un fragmento de aproximadamente 600 bp de longitud, se clonó en pCR2.1 -TOPO, y se determinó su secuencia. Los datos obtenidos proporcionaron una secuencia adicional 3', dentro del gen que codifica a Mhp3. Se llevó a cabo una amplificación adicional por PCR con RAC12 (SEQ ID NO: 20) y RAC15 (SEQ ID NO: 23) usando el conjunto del ADN digerido con W/ncll, como molde. Las condiciones para la amplificación consistieron en la desnaturalización a 94°C durante 9 min, seguida por 35 ciclos de desnaturalización (94*Cf *Tflm), . endurecimiento (55°C, 1 min), y polimerización (72°C, 3 min), más una etapa final de polimerización (72°C, 7 min). Un fragmento de aproximadamente 700 bp se amplificó y se clonó en pCR2.1-TOPO. La secuenciación del fragmento clonado generó nuevos datos de la secuencia 3', incluyendo que dicha secuencia codifica al carboxilo terminal del polipétido. Los resultados de la secuenciación preliminar descrita antes se usaron para diseñar cebadores de oligonucleótidos para la amplificación específica del gen mhp3 directamente desde el ADN cromosómico de la cepa 232 de M. hyopneumoniae con pocos pases (n=4). Estos productos se secuenciaron directamente en un intento de evitar la introducción de artefactos de la secuencia debido a las posibles mutaciones que pueden surgir durante la amplificación por PCR y posteriores etapas de clonación. Los oligonucleótidos sintéticos que flanquean al gen mhp3 se usaron para amplificar específicamente el marco de lectura abierto (ORF) del ADN cromosómico. Las amplificaciones por PCR se realizaron por triplicado y contenían una concentración 1 µ de cada uno de los cebadores Mhp3-U1 (SEQ ID NO: 31 ) y Mhp3-D (SEQ ID NO: 33), 360 ng de ADN cromosómico purificado, 1x de la solución tampón PC2 (Ab Peptides, Inc; St. Louis, MO), cada dNTP en concentración 200 µ?, 7.5 U de Klen Taq1 (Ab Peptides, Inc) y 0. 5 U de Pfu clonado (Stratagene; La Jolla, CA) polimerasa-termoestable, en un volumen final de muestra de 50 µ?. Las condiciones para la amplificación consistieron en la desnaturalización a 94°C durante 5 min, seguida por 25 ciclos de desnaturalización (94°C, 30 sec), endurecimiento (55°C, 30 sec), y polimerización (72°C; 3 min, 45 sec), más una extensión final a 72°C durante 7 min. Después de la amplificación, se reunió la muestra triplicada y se purificó el producto específico por extracción con cromatografía de espín (kit 5 de purificación por PCR QIA-quick™, Qiagen; Santa Clarita, CA). La mezcla reunida se sometió entonces a un análisis directo de secuencia usando las reacciones de terminación DyeDeoxy sobre un secuenciador de ADN automático ABI (Lark Technologies Inc., Houston, TX). Los cebadores de oligonucleótidos sintéticos (SEQ ID NOs: 16- 10 28, 31 , y 33) se usaron para la secuenciación de ambas hebras del ADN de los productos amplificados de la cepa 232 de M. hyopneumoniae. La secuencia de nucleótidos del gen mhp3 y de la proteína deducida Mhp3 * codificada dentro de esta región se presentan en la SEQ ID NO: 1 y en la SEQ ; ID NO: 2, respectivamente. 15 El ORF del mhp3 se extiende desde los nucleótidos 97-1452 de la SEQ ID NO: 1 , y codifica a una proteína de 451 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) que tiene un peso molecular teórico de 49.775 dalton. El polipéptido codificado debe contener 8 residuos de triptófano, 7 de los cuales están codificados por el codón TGA (UGA en el mARN), que como es sabido 20 especifica la adición de este aminoácido en muchos mycoplasma spp. (Dybvig, K., 1990. Ann. Rev. Microbiol. 44: 81-104; Yamao, F., uta, A., Kawauchi, Y., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82: 2306-2309). El amino terminal de la proteína codificada parece que tiene propiedades caracterísiticas de una secuencia señal procariótica (von Heijne, <3?*tS85. J| Mol. Biol. 184: 99-105; Nielsen, H., Engelbrecht, J., Brunak, S., y von Heijne, G., 1997. Protein Engineering, 10: 1-6), aunque el sitio preciso de escisión no es conocido actualmente. El residuo de cisteína en la posición 29 de la proteína codificada (SEQ ID NO: 2) se cree que se modifica a lo largo del proceso por la adición de un ácido graso ligado a un sulfhidrilo para formar una lipoproteína Mhp3 (Razin, S., Yogev, D., and Naot, Y. 1998. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 1094-1 156). Cuando el ORF del mhp3 se comparó frente a las bases de datos existentes de nucleótidos y proteínas usando los programas Basic Local Alignment Search Tool (SLAST) (Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., Lipman, D.J., 1990. J. Mol. Biol. 215: 403-410), la entrada con la que comparte la mayor homología fue la proteína Ag 234-5 de M. arginini (GenBank Accession No. D16674). Cuando estos dos polipéptidos se alinearon usando CLUSTAL W (Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson, T.J., 1994. Nucí. Acids Res., 22: 4673-4680), la identidad de aminoácidos fue del 36.2% entre las proteínas Mhp3 y Ag 234-5 (Fig. 1 ) Aunque el gen que codifica a la Ag 234-5 se identificó originalmente como presente en M. arginini (Ushio, S., Iwaki, K., Taniai, M, Ohta, T., Fukuda, S., Sugimura, K, and Kurimoto, M., 1995. Microbiol. Immunol. 39: 395-400), ha surgido una evidencia reciente de que este gen se deriva realmente de M. hyorhinis (Droesse, M., Wise, K.S., 1998. Abstract E20, 12th International Organisation of Micoplasmology Conference, Sydney, AU). En tales estudios, se llegó a la conclusión de que la Ag 234-5 no se conservó entre otros mycoplasmas, incluyendo el M. hyopneumoniae, como se determina por PCR, hibridación por Southern blot, y análisis por Western blot. Usando el programa STEMLOOP del University of Wisconsin Genetics Computer Group (Devereux, J., Haeberli, P., and Smtthies, O., 1984. Nuc. Acids Res. 12: 387-395), se identificó una secuencia hacia abajo del ORF de mhp3, específicamente los nucleótidos 1519-1550 de la SEQ ID NO: 1 , que podrían formar potencialmente una estructura stemloop. El vástago puede estar formado por repeticiones invertidas de 14 bases separadas por un bucle de 4 bases. La existencia real y la función potencial de esta estructura es desconocida actualmente. También está codificado por el fragmento del ADN representado en la SEQ ID NO: 5, un ORF adicional. Este ORF está presente sobre la hebra opuesta del gen mhp3 y se extiende desde el nucleotido 602 hasta el nucleotido 1 de la SEQ ID NO: 1. Este ORF anticipado codifica a una proteína de al menos 200 aminoácidos, denominada "ORF1" y presentada como la SEQ ID NO: 6, que tiene un peso molecular teórico de 22.528 dalton. El hecho de que el ORF continúe a través del extremo del fragmento de ADN (SEQ ID NO: 1 ) y permanezca abierto, sugiere que la masa real del polipéptido codificado es algo mayor de 22.528 dalton. Aunque la Mhp3 y "ORF1" están codificadas en hebras opuestas, la tercera base de cada codón (la posición "de tambaleo" es común entre ellas. Así, la base de tambaleo en cualquier codón particular de aminoácidos en "ORF1" es compartida por la hebra opuesta que codifica a un aminoácido particular en el gen de Mhp3. Esta ordenación única de las secuencias codificadoras compartidas para las dos proteínas, en teoría, debe minimizar el impacto de la tendencia en las posiciones de tambaleo del codón para Mhp3 y "ORF1" y maximizar la conservación de ambas proteínas codificadas.

Preparación de plásmidos v materiales para depósito El fragmento del gen mhp3 se preparó para depósito ante la American Type Culture Collection (ATCC). La mezcla reunida resultante de las reacciones por PCR triplicadas que emplean los cebadores específicos en 5' y 3' Mhp3-U1 (SEQ ID NO: 31) y Mhp3 (SEQ ID NO: 33) como se ha descrito antes, se aisló por extracción con cromatografía de espín (QIAquick™) y se insertó en el sitio de clonación TA de pCR2.1-TOPO. Las reacciones de extensión de la secuencia simple utilizando cebadores de secuenciación específicos del vector confirmaron los puntos extremos del fragmento amplificado con 1.692 pares de bases, y revelaron que el gen que codifica a Mhp3 estaba en orientación opuesta en relación al promotor de la lactosa. Esta construcción de plásmido se denominó pER427 y se introdujo en las células TOP10 de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA). La cepa resultante se denominó Pz427.

Mutaqénesis del gen mho3 dirigida al sitio La preparación del ADN que codifica a Mhp3 para la expresión en E. coli requirió la modificación del gen mhp3 de M. hyopneumoniae por la separación de la secuencia que codifica al presunto líder y al sitio dl¾fón al ácido graso, cisteína 29, y por la conversión de 6 codones TGA a codones TGG. Los cebadores de oligonucleótidos usados para la amplificación del gen que carece de la secuencia codificadora del péptido señal se designaron RAC23 (SEQ ID NO: 29) y RAC24 (SEQ ID NO: 30). Las condiciones para la amplificación de tal fragmento del ADN cromosómico de la cepa 232 de M. hyopneumoniae (pase n=5), fueron la desnaturalización a 94°C durante 9 min, seguida por 25 ciclos de desnaturalización (94°C, 1 min), endurecimiento (50°C, 1 min), y polimerización (72°C, 2 min), más una etapa final de polimerización (72°C, 7 min). El fragmento amplificado se clonó en pCR2.1-TOPO; la confirmación de la clonación se hizo por secuenciación y digestión con endonucleasa de restricción seguida por electroforesis sobre gel. La secuencia en el extremo 5' del fragmento clonado codifica al residuo inicial de metionina, después a un residuo de triptófano, que es el aminoácido que sigue al residuo de cisteína en la posición 29 del polipéptido codificado (véase la SEQ ID NO: 2). En el extremo 3', se introdujeron cambios de base en la secuencia de nucleótidos de tipo nativo (SEQ ID NO: 1 ) que creó un sitio de restricción para propósitos de clonación. Esto dio por resultado que los 2 aminoácidos con carboxi-terminal del polipéptido tipo nativo, Lys-Asn (SEQ ID NO: 2), fueran reemplazados por la secuencia Asn-Leu (SEQ ID NO: 4). Un nucleótido T adicional estuvo presente en el cebador de RAC 24 (SEQ ÍD NO: 30) comparado con el gen tipo nativo, pero no estuvo presente en el producto de PCR. Los oligonucleótidos RAC 23 (SEQ ID NO: 29) y RAC 24 (SEQ ID NO: 30) contenían los sitios sintéticos de restricción, ?/del y *bal, respectivamente, próximos a sus extremos 5' para facilitar la clonación del gen en diferentes plásmidos. Se añadieron también nucleótidos adicionales {6 para RAC 23 (SEQ ID NO: 29); 7 para RAC 24 (SEQ ID NO: 30)) en el extremo 5' de cada cebador para facilitar el corte por las respectivas enzimas de restricción. Una vez que se separó la secuencia que codifica al péptido señal, permanecieron en el gen seis codones TGA internos. Para facilitar la expresión del polipéptido de longitud total en E. coli, éstos se convirtieron en codones TGG por mutagénesis dirigida a los oligonucleótidos in vitro. El plásmido pCR2.1-TOPO:m/?p3 se transformó dentro de E. coli, cepa CJ236 {dufung1). La adición del fago ayudador R408 a las células que contienen el plásmido llevó a la producción de partículas de fago que tienen ADN de una sola hebra (ss) que contiene uracilo. Se aislaron estas partículas, y el ssADN se purificó por extracción y precipitación. Se llevó a cabo la mutagénesis usando este ADN como molde, los oligonucleótidos Mhp3-2M, Mhp3-3M, Mhp3-4M, Mhp3-5M, Mhp3-6M, Mhp3-7M (SEQ ID NOs: 35-40), y los reactivos del MutaGeneSystem (BioRad Laboratories; Hercules, CA). El ssADN, los oligonucleótidos y el tampón de endurecimiento se mezclaron y se calentaron a 70°C, se dejó después enfriar hasta 30°C a lo largo de un periodo de 1 h. Se realizó la síntesis de la hélice complementaria añadiendo T4-ADN-ligasa, T7-ADN-polimerasa, y tampón de síntesis. Se incubó la mezcla sobre hielo durante 5 min, después a temperatura ambiente durante 5 ¾ fi%mín, seguido por 37X durante 30 min. Las moléculas resultantes dui | l de doble hélice se transformaron dentro de células DH5a UltraComp (Gibco SRL; Gaithersburg, MD). Se propagaron los clones y se cribaron por secuenciación para ver las mutaciones deseadas. Todas las mutaciones (TGA>TGG) se confirmaron de esta manera. Además ocurrió inadvertidamente una transición A>G en el nucleótido 388 del gen tipo nativo (SEQ ID NO: 1) en virtud de la secuencia de oligonucleótido Mhp3-2M (SEQ ID NO: 35). Esto dio como resultado la alteración del residuo codificado de serina (AGT) en el residuo 98 de los aminoácidos de la Mhp3 tipo nativo (SEQ ID NO: 2) a glicina (GGT) en el residuo 70 de los aminoácidos de la Mhp3 recombinante (SEQ ID NO: 4). El gen mhp3 recombinante (con o sin la transición inadvertida A>G descrita antes) que resultó de los cambios anteriores se representa en la SEQ ID NO: 3, y el marco de lectura abierto codificado por dicho gen mhp3 recombinante (con glicina en el residuo 70 de los aminoácidos) se representa en la SEQ ID NO: 4.

Clonación del gen mhp3 recombinante en el vector de expresión y en la cepa hospedante de expresión Con fines de la expresión recombinante de la proteína, el gen mhp3 mutado que carece de la secuencia que codifica al péptido señal (SEQ ID NO: 3) se clonó en el plásmido de expresión pBAD/Thio-TOPO (Invitrogen); esta construcción se transformó directamente dentro del hospedante de expresión E.coli BL21. Se identificó un clon que contenía el plásmido apropiado.

Expresión de la proteína recombinantes Mhp3 La solución de trabajo de reserva congelada del transformante E. coli BL21 que expresa la fusión tiorredoxina- hp3, se descongeló y se sembró a una dilución de 1 :5000 en un medio definitivo RWLDM/D vi, que contiene lo siguiente: K2HP04 (6 g/l), KH2P04 (3 g/l), (NH4)2S04 (5 g/l), NaCI (2 g/l), 0.2 mi de CaCI2 (15 g/l), 0.4 mi de FeCI3.6H20 (5 g/l), 0.4 mi de MgS04.7H20 (480 g/l), ZnCI2 (6.5 g/l), MnS0 .H20 (12 g/l), I^MoO^H O (5 g/l), CuS04 (1.5 g/l), CoCI2.6H20 (2 g/l), H3BO3 (0.5 g/l), y HCI al 37% (5 mi). Se añadió también carbenicilina a una concentración de 125 pglm . El cultivo se dejó crecer en condiciones de realimentación (dextrosa al 50%) en un fermentador BioFlow 3000 de 5 litros de volumen de trabajo (New Brunswick Scientific; Edison, NJ) a 37°C hasta que la ?ß25 fue de 10-20. Las células húmedas del transformante E.coli BL21 que expresan la tiorredoxina-Mhp3 recombinante a partir de la fermentación de 5 litros, se recogieron por centrifugación y se re-suspendieron en solución salina tamponada de fosfato. Las células se lisaron mecánicamente. Después de la centrifugación, se despreció el sedimento. El sobrenadante se pasó sobre una columna de cambio iónico, y se eluyó usando un gradiente de NaCI. Se reunieron las fracciones que contienen la proteína de fusión, se dializaron para separar el NaCI, y se esterilizaron por filtración usando un filtro de 0.2 µ??. Esta preparación se usó para los ensayos de vacunación.

Caracterización inmunológica de la Mhp3 recombinante La concentración de proteínas de la tiorredoxina-Mhp3 recombinante preparada como se ha descrito antes, se determinó usando un kit de BCA Protein Assay (Pierce). Brevemente, se diluyó cada muestra 1/10, 1/20, 1/40, y 1/80 en agua desionizada o destilada (ddH20) estéril. Se diluyó la BSA (proteína estándar) hasta concentraciones que varían de 200 a 800 µ?/???. Se añadió un volumen de 20 µ? de muestra o estándar a los pocilios por triplicado en una placa de microtitulación de 96 pocilios, y se añadieron a cada pocilio 200 µ? de reactivo B diluido 1/50 en reactivo A. La placa se incubó a 37°C durante 30 min. La absorbancia de la muestra se determinó a 560 nm. La concentración de proteínas para cada muestra se calculó por extrapolación usando la curva estándar de BSA. Se resuspendieron alícuotas de la Mhp3 recombinante (la carga de proteína fue variable) y de los lisados de células bacterianas totales de M. hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, y Mycoplasma mycoides subespecie mycoides hasta un volumen final de 10 µ?, y se añadieron 10 µ? de solución tampón para reducir dos veces la muestra (Owl Scientific). Se calentaron las muestras durante 10 min a 100°C, y el volumen total se cargó en pocilios separados de un total de 10 pocilios, con un gel de Tris-glicina al 10% (Novex) y 1.5 mm de espesor. Se incluyeron también marcadores de peso molecular de amplio intervalo, sin teñir (Novex). Las proteínas separadas por SDS-PAGE se transfirieron a una membrana de PVDF (Owl Scientific) en una corriente constante de 100 mA durante 1 h. Se incubó el blot en solución tampón de bloqueo constituida por leche en polvo con 5% de grasa y Tween 20 al 0.5% en TBS (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave. Se separó la solución tampón de bloqueo, y se lavó la membrana una vez durante 5 min con TBST. El anticuerpo primario se obtuvo de un cerdo tras el enfrentamiento experimental con la cepa 232 de M. hyopneumoniae. Se añadió suero diluido a la membrana, seguido por 1 h de incubación a temperatura ambiente. Se diluyó el anticuerpo de la proteína G conjugado con fosfatasa alcalina (Pierce), se añadió a la membrana lavada, y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Se lavó la membrana con TBST, y se añadió a la membrana el substrato BCIP/NBT (Kirkegaard and Perry Laboratories) y se incubó hasta que se desarrolló un color de reacción adecuado. Se enjuagó después la membrana con agua para detener la reacción, y se secó a temperatura ambiente. El suero del cerdo enfrentado experimentalmente con M. hyopneumoniae reconoció a la proteína Mhp3 purificada expresada recombinantemente (Fig. 2), y se identificó como una banda de 60 kDa. Esto sugiere que la proteína recombinante expresó epítopes que fueron reconocidos por los anticuerpos generados en respuesta a la exposición del cerdo a los organismos de células totales de M. hyopneumoniae.

Estudio en animales para ensayar la eficacia recombinante como un candidato para vacunas Se obtuvieron cerdos sanos cruzados (de aproximadamente 12 a 16 días de edad) sin historia de vacunación previa frente a M. hyopneumoniae ni de enfermedad causada por M. hyopneumoniae. Los animales se asignaron al azar por carnadas en grupos. Se dejó que los cerdos se aclimataran durante un mínimo de cinco días antes de la iniciación del estudio. Los animales se vacunaron 1 mi de la vacuna experimental apropiada por vía intramuscular (IM; músculo izquierdo del cuello) en el día "0" cuando los cerdos tenían aproximadamente 19 a 23 días de edad. Aproximadamente dos a tres semanas después de la primera vacunación, los cerdos recibieron una segunda dosis de 1 mi: (IM; músculo derecho del cuello) de la vacuna experimental apropiada. Todos los cerdos fueron observados cuidadosamente (durante 1 horas o como fue justificado) en cuanto a algún signo post-vacunal tal como vómitos, depresión, diarrea, ataxiaincoordinación, aumento de la respiración, o temores. Aproximadamente dos a cuatro semanas después de la segunda vacunación los cerdos se enfrentaron intranasalmente con 1 mi en cada ventanilla nasal de un cultivo de un homogenado de pulmón vivo virulento de la cepa 232 de M. hyopneumoniae que contiene aproximadamente 5.0 X 108 unidades cambiantes de color/ml (CCU/ml). Todos los animales enfrentados fueron sometidos a necropsia aproximadamente 4 semanas después del enfrentamiento. Se separaron los pulmones y se evaluaron superficialmente en cuanto a lesiones características atribuibles a infección por M. hyopneumoniae. Se determinaron las cuentas de las lesiones pulmonares individuales por medio de análisis de imagen. Se puede obtener una muestra sesgada de tejido pulmonar de cada animal enfrentado, para aislamiento bacteriano (CCU/g de tejido), histopatología, e IFA.

Depósito de microorganismos La siguiente cepa de microorganismo se depositó ante la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA el 9 de septiembre de 1999 y se le ha asignado el número de acceso que se indica a continuación. Microorganismo Número de acceso Pz427 PTA-634 La presente invención no está limitada en su alcance a las modalidades específicas descritas aquí. Ciertamente, para los expertos en la técnica pueden ser evidentes diferentes modificaciones de la invención en adición a las descritas aquí, a partir de la descripción anterior y de los dibujos que la acompañan. Se pretende que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Se han citado aquí anteriormente diferentes referencias, incluyendo solicitudes de patentes, patentes, y publicaciones, y las descripciones de las mismas se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> King eí a/. < 120> ÁCIDOS NUCLEICOS Y PROTEÍNAS DEL GEN hp3 DE MYCOPLASMA PNEUMONIAE Y SUS USOS <130^ PC10555 <140> A ser asignado <14 i> 1999-09-29 < 160> 41 <170> Patentln er. 2.0 <210> 1 <211> 1692 <212> DNA <213> Mycoplasma byopneumonlae 400> 1 gtttctgaat «caatagaaa atgtaaaaca aaaattaatt tattaaaaaa taactgaaag 60 ccaccgtaat taaaacaatt aattaggaga acaactacga aaaaaaagat aaaatgaaac 120 aaatttcttg gcetaggctt «gtttttecg cttteagca* tcgcgacaat ctctgcegga 1BO r.gttgggata aagaaacaac taaagaagaa aaatcagccg ataatcaaaa caagcaaatc 240 actgatgtct csaaaaettc aggactagtc aacgaacgaa aacccgaaa catggccgca 300 aaagcr ;acg caaacaaaca ecttgggcca aatatggeaa ttgtaacegc tggtggaac 3e0 gtaaatgata attcatttaa ccaatcaag cgagaggeaa ttcaaeaac tggcgctctt «20 «ccggaggtg «e-ttaette agtagatage ceaactgctg aacttgcagg aaaacatagc ·?' tcacttgcca «taceaacaa aaatgtttga gtaetttetg gttttcaaca cggtgacgcg 540, ctcacaagat gateaaaaat ccctgaaaat aagcaattae ttactgaaáa aaaeattatc ß?? atactcggaa tfcgactgaac tgatactgaa aatgtaattc caacagg cg atatattaac 660 ttaaectana aaactgaaga agccggatga ettgeaggat atgcgaatgc tccctt etg 720 gcaaaaaaa'c tcccaagtga tccaactaaa agatcagcaa ttgttaecgg tggt ggatt 760 tcgeeagetg eaaetgatlt tatcgctggt tacccagccg gaaecaaagc ttgaaatcta 8<0 aaaaatcetg ataaaaaaac aaagacaaca actgataaaa tcgagatata tcttgggttt 900 gato'ctcaag aeacctcaac aaaagaaaga cctgaaeaaa ttgcttcaaa agataaacct ?«0 tc*áe«etac tagctgtcgc tggaccaett actgaaattt tctcggatat attcgcaaac 1020 caaaatgatc gttatctcat tggtgttgac accgaceaat cacttg tta tacaaaa ct 10IP aaaaataaat tttteaectc aattttgaaa aatttaggtt actccgtttt cagcgttctt 1140 agtgatttat acaccaaaaa atcaaattca agaaatttag ccggctttga atttggtaa* 1200 aaaagtgcaa ccgcttatct tggaattaaa gacaggtttg tcgatattgc tgatacttct 1260 ttagaaggc¾ atgataaaaa aetcgcaact gaagccattt ctgaagetaa aaaagaattt 1320 gaagaaaaaa ctaagacaat tcctgecgaa gaagctcgt» aaactttaga aattccggaa 13»0 atgcctgata aacaacctga taagcaacag gaaagettag acaaactaat taccgacatt 1440 aataaaaatt a-iytaagaaa aaataacaat tcctaacat tatafcetttt tttagegatt 1500 aattttcttc taatttagtt taatttaata taaaattata ttaaat aaa aaaataaaaa 15*0 atceggacta ttfcttgttce ggatttttta tttttgtgtt, actatttaat ataatgafcaa 1620 atcaggatta tgcaattgaa tttattcaag tctcgaaaaa atttggcagt ttttatgcca 16·0 attacaaaat ag 1692 «210 2 <211 > 451 <212> PRT <213> Mycoplasma yopieumonlse <400> 2 Met Lys Lye Lye lie Lye Tr¾¡Aen Lye Phe Leu Gly Leu Gly Leu V 1 1 5 10 15 Phe Pro Leu Ser Ala lie Ala Thr lie Ser Ala Gly Cys Trp Aep Lye 20 25 30 Glu Thr Thr Lys Glu Glu Lye Ser Ala Asp Asn Gln Asn Lys Gln II 35 40 45 Thr Asp Val Ser Lys lie Ser Gly Leu Val Asn Glu Arg Lye Ser Glu SO 55 «0 lie Met Ala Ala Lys Ala Asp Ala Asn Lye Hls Phe Gly Leu Aun M t 65 70 75 60 Ala lie Val Thr Ala >3ly Oly Thr Val Aon Aep Aen Ser Phe A»u Olu 8«; 90 S5 Ser Ser Trp Glu Ala lie Gln Gln Leu Gly Ala Leu Thr Gly Gly Glu 100 105 1X0 lie Thr Ser Val Asp Ser Ser Thr Ala Olu Leu Glu Gly Lys Tyr Ser 115 120 12S Ser Leu Ala Aan Thr Asn Lye Aen Val Trp Val Leu Ser Gly Phe Gln 130 135 140 His Gly Asp Ala Phe Thr Arg Trp Leu Lys lie Pro «lu Asn Lye Gln 145 1S0 155 160 Leu Phe Thr Glu Lys Asn lie lie lie Leu Gly lie A*p Trp Thr Ae 165 170 175 Thr Clu Asn Val lie Pro Thr Gly Arg Tyr lie A*n Leu Thr Tyr Ly 180 185 "¿SO Thr Glu Glu Ala Gly Trp Leu Ala Gly Tyr Ala Asn Ad Ser Phe Leu 195 200 2C5 Ala Lys lya Phe Pro Ser Asp Pro Thr Lys Arg Ser Ala lie Val lie 210 215 220 Gly Gly Gly lie Ser Pro Ala Val Thr Asp Phe lie Ala Gly Tyr Leu 225 230 235 240 Ala Gly lie Lye Ala Trp Aen Leu Lys Asn Jer Aep Lys Lys Thr Lye 245 2S0 255 lie Thr Thr Asp Lys lie Olu lie Aen Leu Gly Phe. Val Gln Aep 260 265 270 Thr Ser Thr T..ys Glu Arg Leu Glu Gln lie Ala Ser Lye Aep Lys Pro 275 260 285 Ser Thr Leu Leu Ala Val Ala Gly Pro Leu Thr Glu lie Phe Ser Ae 290 295 300 lie lie Ala Asn Gln Asn Asp Arg Tyr Leu lie Gly Val Aap Thr A»p 30S 310 315 320 Gln Ser Leu Val Tyr Thr Lye Thr Lya Aen Lye Phe Phe Thr Ser lie 325 330 33S Leu Lys Asn Leu Gly Tyr Ser Val Phe Ser Val Leu Ser Aap Leu Tyr 340 345 3SO Thr Lye Lys Ser Asn Ser Arg Asn Leu Ala Gly Phe Glu Phe Gly Lye 355 360 365 Lye Ser Ala Thr Val Tyr Leu Gly lie Lye Asp Arg Phe Val Asp lie 370 375 380 Ala Asp Thr Ser Leu Glu Gly Asn Aep Lye Lye Leu Ala Thr Glu Ala 365 390 395 400 lie Ser Glu Ala Lya Lye Glu Phe Glu Glu Lye Thr Lys Thr lie Pro 405 410 415 Ala Glu Glu Val Arg Lye Thr Leu Glu lie Pro Glu Met Pro Asp Lye 420 425 430 Gln Pro Asp Lye Gln Gln Glu Ser Leu Asp Lys Leu lie Thr Aep lie 435 440 445 Asn Lys Asn 450 <210> 3 <211> 1263 <212> DMA <213 Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: mhp3 manipulado para expresión in vitro <400> 3 atgtgggata aagaaacaac caaagaagaa aaatcagccg ataateaaaa taagcaaatc SO actgatgtct caaaaatttc aggactagtt aatgaacgaa aatccgaaat tatggcegea 120 aaagctgatg caaacaaaca ttttgggcta aatatggcaa ttgtaaccgc tggtggaacg 180 gtaaatgata attcattta* ccaatcargt tgggagscaa ttcaacaact tggcgctctt 240 actggaggtg agattacttc agtagatagt tcaactgctg aacttgaagg aaaatatagc 300 tcacttgcta ataccaacaa aaatgtttgg gtactttctg gttttcaaca cggtgatgcg 360 ttcacaagat ggttaaaaat ccctgaaaat aagcaattat ttaetgaaaa *aatattatc 420 atactcggaa ttgactggac tgatactgaa aatgtaattc caacaggtcg atatactaac 480 ttaacctata aaactgaaga agecggatgg cttgcaggat atgcgaatgc ttcctttttg 540 gcaaaaiaat tcccaagtga tccaactaaa agatcagcaa ttgttatcgg tggtgggatt 60C trgccagctg taactgattt tatcgctggt tatctagccg gaattaaagc ttggaatcta 66 aaaaattctg ataaaaaaac aeagataaca actgataaaa tcgagataaa tcttgggttt 720 gatgttcaag atacttcaac aaaagaaaga cttgaacaaa ttgcttcaaa agataaacct 780 ccaaeaetat tagctgtcge tggaccactt actgaaattt tctcggatat aategcaaac 840 caaaatgatc gttatctcat tggtgttgac accgaccaat cacttgttta tacaaaaact 900 aaaaataaat ttttcacctc aattttgaaa aatttaggtt actccgtttt cagcgttctt 960 agtgatctat ataccaaaaa atcaaattca agaaatttag c ggctttga atttggtaaa 1020 aasagtgcaa ccgtttatct cggaactaaa gacaggtttg tcgatatcgc Cgatactcct 1060 Ctagaaggca atgataaaaa actcgcaact gaagccactt ccgaagctaa aaaagaactt 1140 gaagaaaaa ctaagacaat tcctgccgaa gaagttcgta aaaetttaga aatteeggaa 1200 atgcctgata aacaacctga taagcaacag gaaagcctag acaaacttaa ttaccgatat 1260 taa 1263 <210> 4 <211> 423 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial mhp manipulado para expresión in vitrb <400> 4 Met Trp Asp Lys Glu Thr Thr Lys Glu Glu Lys Ser Ala Asp Asn Gln 1 5 10 15 Asn Lys Gln lie Tiir Asp Val Ser Lys lie Ser Gly Leu Val Asn Glu 20 25 30 Arg Lys Ser Glu lie Met Ala Ala Lys Ala Asp Ala Asn Lys His Phe 35 40 45 Gly Leu Asn Met Ala lie Val Thr Ala Gly Gly Thr Val Asn Aap Asa 50 55 60 Ser Phe Aen Gln Ser Gly Trp Glu Ala lie Gln Gln Leu Gly Ala Le-Ji 65 70 75 SO Thr Gly Gly Glu lie Thr Ser Val Asp Ser Ser Thr Ala Glu Leu Glu 85 90 95 Gly Lys Tyr Ser Ser Leu Ala Asn Thr Asn Lys Asn Val Trp Val Leu 100 105 110 Ser Gly Phe Gln His Gly Asp Ala Phe Thr Arg Trp Leu Lys lie Pro 115 120 125 Glu Asn Lys Gln Leu Phe Thr Glu Lys Asn lie lia lie Leu Gly lie 130 135 140 Asp Trp Thr Asp Thr Glu Aan Val lie Pro Thr Gly Arg Tyr lie Asn 145 150 155 160 Leu Thr Tyr Lys Thr Glu Glu Ala Gly Trp Leu Ala Gly Tyr Ala Asn 155 170 175 Ala Ser Phe Leu Ala Lys Lys Phe Pro Ser Asp Pro Thr Lys Arg Ser 180 1S5 190 Ala lie Val lie Gly Gly Gly lie Ser Pro Ala Val Thr Asp Phe lie 195 200 205 Ala Gly Tyr Leu Ala Gly lie Lys Ala Trp Asn Leu Lys Asn Ser Asp 2.10 215 220 Lys Lys Thr Lys lie Thr Thr Asp Lys lie Glu lie Asn Leu Gly phe 225 230 235 240 Asp Val Gln Asp Thr Ser Thr Lys Glu Arg Leu Glu Gln lie Ala Ser 245 250 255 Lys Asp Lys Pro Ser Thr Leu Leu Ala Val Ala Gly Pro Leu Thr Glu 2S0 265 270 lie Phe Ser Asp lie lie Ala Asn Gln Asn Asp Arg Tyr Leu lie Gly 275 280 28S Val Asp Thr Asp Gln Ser Leu Val Tyr Thr Lys Thr Lya Asn Lys Phe 290 295 300 Phe Thr Ser lie Leu Lys Asn Leu Gly Tyr Ser Val Phe Ser Val Leu 305 310 315 320 Ser Asp Leu Tyr Thr Lys Lys Ser Asn Ser Arg Asn Leu Ala Gly Phe 325 330 335 Glu Phe Gly Lys Lys Ser Ala Thr Val Tyr Leu Gly lie Lys Asp Arg 340 345 350 Phe Val Asp lie Ala Asp Thr Ser Leu Glu Gly Asn Asp Lys Lys Leu 355 360 365 Ala Thr Glu Ala lie Ser Glu Ala Lys Lys Glu Phe Glu Glu Lya Thr 370 375 330 Lys Thr lie Pro Ala Glu Glu Val Arg Lys Thr Leu Glu lie Pro Glu 385 390 395 400 Met Pro Asp Lys Gln Pro Asp Lys Gln Gln Glu Ser Leu Asp Lys Leu 405 410 415 II® Thr Asp lie Asn Asn Leu 420 Asn His Leu Val Asn Ala Ser Pro Cye Trp Lye Pro Glu Ser Thr Oln 20 25 30 Thr Phe Leu Leu Val Leu Ala Ser Glu Leu Tyr Phe Pro Ser Ser S r 35 40 45 Ala Val Glu Leu Ser Thr Glu Val lie Ser Pro Pro Val Arg Ala Pro 50 55 60 Ser Cys Trp lie Ala Ser Gln Leu Asp Trp Leu Asn Glu Leu Ser Phe 65 70 7S 80 Thr Val Pro Pro Ala Val Thr Xle Ala lie Phe Ser Pro Ly« Cye Leu 85 90 95 Phe Ala Ser Ala Phe Ala Ala lie lie Ser Asp Phe Arg Ser Leu Thr 100 105 110 Ser Pro Glu lie Phe Glu Thr Ser Val lie Cys Leu Phe Trp Leu Ser 115 120 125 Ala Asp Phe Ser Ser Leu Val Val Ser Leu Ser Gln His Pro Ala Glu 130 135 140 lie Val Ala lie Ala Olu Ser Gly Lys Thr Lys Pro Ly« Pro Arg Aan 145 150 155 160 Leu Phe His Phe lie Phe Phe Phe lie Val Val Leu Leu lie ?ßa Cya 165 170 175 Phe Asn Tyr Asp Asp Phe Gln Leu Phe Phe Asn Lys Leu lie Ph lie 180 185 190 Leu His Phe Leu Leu Tyr Ser Lys 19S 200 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Mycoplasma hyopneumonlae <22Q> ' <221 > SITIO <222> (3) <223> Xaa=aminoácido desconocido <400> 7 Ala Gly Xaa Trp Ala Lys Glu Thr Thr Lys Glu Glu Lys Ser 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Mycoptasma yopneumonlae <220> <223> Descripción de la secuencia artificia!: Oligonudeótido <400> 8 Ala Trp Val Thr Ala Asp Gly Thr Val Asn 1 5 10 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Mycoplasma hyopneumonlae <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonudeótido <40O> 9 Ala lie Val Thr Ala Asp Gly Thr Val Asn Asp Asn Lye Pro Asn Gln 1 5 10 15 .

Trp Val Arg Lys Tyr 20 <210> 10 <211> 30 <212> D A <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonudeótido <220> <221> base modificada <222> (9) <223> n=a, c, g, o t <220> <221> base modificada <222> (13) <223> n=a, c, g, o t <220> <221> base modificada <222> (21) <223> n=a, c, g, o t c400> 10 tgytgrgcna argaracnac naargargar <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripdón de la secuenda artifidal: Oligonudeótido <400> 11 tgttgagcwa aagaaacwac waaagaagaa 30 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Secuenda artifidal <220> <223> Descripción de la secuenda artifldai: Oligonudeótido <220> <221> base modificada <222> (6) <223> n=a, c. g, 01 <220> <221> base modificada <222> (9) <223> n=a. C 9, o t <22C> <221> base modificada <222> (11) <223> n=a, C g, 01 <220> <221> base modificada <222> (18) <223> n=a. c, g, o t <220> <221> base modificada <222> (21) <223> n=a, c, g, o t <220> 221 > base modificada <222> (24) <223> n=a, c, g, o t <400> 12 tgrgcnacng cngayggnac ngtnaay <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oiigonucleótido <400> 13 tgagtwacwg cwgatggwac wgtwaat <210> 14 <211> 26 <212> D A <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificia!: Oiigonucleótido <220> <221> base modificada <222> (4) <223> n=a, c, g, o t <220> <221> base modificada <222> (7) <223> n=fi, c, g, o t <220> <221> base modificada <222> (10) <223> n=a, c, g, o t <220> <221> base modificada <222> (16) <223> n=a, c, g. o t <220> <221> base modificada <222> (19) <223> n=a, c, g, ü i <220> <221> base modificada <222> (22) <223> n=a, c. g. o t <400> 14 rttnacngtn ccrtcngcng tnacyc <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonudeótido <400> 15 attsacsgca ccaccsgcsg tsactc <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificia!: Oligonudeótido <400> 16 · tttgagacat cagtgactcg c <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Secuenda artificial <220> <223> Descripdón de la secuenda artificia!: Oligonudeótido <400> 17 gaacqaaaat ccgaaatcat gg <2',Q> 18 <211 > 22 <212> DNA <213> Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificia]: Oligonucieótido <400> 18 ctatctactg aagaatccca ce <210> 19 <21 1> 20 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucieótido <400> 19 gtgatgccgc tcacaagatg <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descrípdón de la secuencia artificial: Oligonucieótido <4C0> 20 cactaagaac gctgaaaacg g <210> 21 <21 > 21 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucieótido <400> 21 gsttacaact gtaaaatcga g <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción ae la secuencia artificial: Oligonucieótido <400> 22 ggctcctcca gttttatagg <210> 23 <2Í1> 18 <212> DNA <213> Secuencia artificial <22Q> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido <4 00 > 23 aaactcgcaa ctgssgce <210> 24 <211> 20 <"2 !2> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido < 400 > 24 gaaatgcctg ataaacaacc <210> 25 <211> 22 <21.2> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial; Oligonucleótido <400> 25 cttcagaaat ggcttcagtt ge 22 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido <400> 26 gctagataac cagc ataaa atcag <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Secuencia artificial 220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido <400 > 27 tgcataaccc tgaettate 19 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Secuencia artificial <22Q> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonudeótido <400> 28 tgaaagtcat cgtaattaaa ac <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Secuenda artifidai <220> <223> Descripción de la secuenda artifidai: Oligonudeótido <400> 29 aateggcaca tgtgggataa agaaacaact aaag <210> 30 <211> 34 <212> DNA <213> Secuenda artifídat <220> <223> Descripción de la secuenda artifidai: Oligonudeótido <400> 30 ggagcaatct agattattaa tatcggtaat taag <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Secuenda artifidai <220> <223> Descripdón de la secuenda artifidai: Oligonudeótido <400> 31 gtttttgaat ataatagaaa atg <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Secuencia artifidai <2 0> «=223> Descripción de la secuencia artifidai: Oligonudeótido <400> 32 tttattaaaa aataattgaa agccatcg <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Secuencia artifidal <220> <223> Descripción de la secuencia artifidal: Oligonudeótido <400> 33 ctattttgta attggcataa aaactgcc <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia artifidal <220> <223> Descripdón de la secuenda artifidal: Oligonudeótido <400> 34 gataaaatgg aataaatttc ttgg <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Secuencia artifidal <220> <223> Descripción de la secuenda artifidal: Oligonudeótido <400> 35 caggttggga ggcaatt aa c <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Secuenda artifidal <220> <223> Descripdón de la secuencia artifidal: Oligonudeótido <400> 36 caaaaacgtc Cgggtacttt ctgg <210> 37 <211 > 21 <212> DNA <213> Secuenda artifidal <220> <223> Descripción de la secuenda artifidal: Oligonudeótido <400> 37 cacaagatgg ttaaaaatcc c <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido Tyr Lys Asn Phe Leu Asn Gly Asn Lys Asn Val Trp lie Leu Thr Gly 115 120 125 Phe Gln Gln Gly Gln Glu Phe Pro Lys Phe Leu Lys Gln Thr Asp Ser 130 135 140 Asn Gly Lys Lys Tyr Ser Asp Leu Leu Ala Glu Lys Lys Val lie lie 145 150 155 160 Val Ala Val Asp Trp Asp Leu Ser Lys Glu Asp Lys Asp Leu II Lys 165 170 175 Ala Gly His Phe lie Ser Leu Leu Tyr Lys Thr Glu Glu Ala Gly Phe 180 185 190 Val Tyr Lys Gly lie Ser Asp Asp Phe Val Gly Val Ser Asn Ser Thr 370 375 380 Val Ala Asp Ala Asp Lys Val Lys Ala Gln Glu Phe Leu Asn Glu Ala 385 390 395 400 Thr Ala Asp Phe Lys Lys Gln lie Gln Ala Asn Pro Thr Asn Tyr Lys 405 410 415 Ser Val Leu Gly lie Pro Thr Met Leu lie Asn Asp Asn Asp Ala Lys 420 425 430 Asp Asn Glu Lys Ala Ser Leu Phe His Phe Asp Asn Trp Gln Thr Tyr 435 440 445 Trp Ala Phe His Ser Arg Phe lie Asn 450 455

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 5 1- Una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprenden al menos 30 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 4, donde dicha proteína no tiene una cisteína acilada con un ácido graso seguida por la secuencia de aminoácidos Trp Asp Lys Glu, y no tiene una homoserina- lactona C-terminal. 10 2.- La proteína de la reivindicación 1 , que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 50 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 4. » 3.- La proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que w comprende al menos los aminoácidos 1-30 de la SEQ ID NO: 4. 15 4.- La proteína de la reivindicación 3, que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 4. 5. - La proteína de las reivindicaciones 1 , 2, 3, ó 4, que es una proteína aislada. 6. - La proteína de la reivindicación 1 , que es una proteína de 20 fusión. 7 - La proteína de la reivindicación 6, en la que la proteína de fusión es una proteína de fusión con tiorredoxina. 8.- Una composición que comprende la proteína de las reivindicaciones 1 , 2, 3 ó 4, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 9. - La composición de la reivindicación 8, que comprende además un adyuvante. 10. - La composición de la reivindicación 8, que comprende además al menos un polipéptido seleccionado del grupo constituido por P46, P65, P97 y P102 de Mycoplasma hyopneumoniae. 11. - Una proteína inmunogénica que tiene una secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, o uno de sus fragmentos, variantes o derivados, donde la proteína inmunogénica no tiene una cisteína acilada con un ácido graso seguida por la secuencia de aminoácidos Trp Asp Lys Glu, y no tiene una homoserina-lactona C-terminal. 12. - La proteína inmunogénica que tiene una secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO: 4, o uno de sus fragmentos, variantes o derivados, donde la proteína inmunogénica no tiene una cisteína acilada con un ácido graso seguida por la secuencia de aminoácidos Trp Asp Lys Glu, y no tiene una homoserina-lactona C-terminal. 13. - El uso de (i) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 30 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 4, donde dicha proteína no tiene una cisteína acilada con un ácido graso seguida por la secuencia de aminoácidos Trp Asp Lys Glu, y (¡i) un excipiente farmacéuticamente aceptable para la fabricación de una vacuna para tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un animal causado por la infección con Mycoplasma hyopneumoniae, donde dicha vacuna produce un aumento de las respuestas celulares o humorales específicas frente a Mycoplasma hyopneumoniae. 14. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 13, donde dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 50 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 4. 15. - El uso de (i) una proteína antigénica o inmunogénica que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos los aminoácidos 1-30 de la SEQ ID NO: 4, y (ii) un excipiente farmacéuticamente aceptable para la fabricación de una vacuna para tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un animal causado por la infección con Mycoplasma hyopneumoniae en donde dicha vacuna produce un aumento de las respuestas celulares o humorales específicas frente a M. hyopneumoniae. 16. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 15, donde dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 4. 17. - El uso como el que se reclama en las reivindicaciones 13, 4, 15 ó 16, donde dicho animal es un cerdo. 18. - Un ADN aislado o purificado que codifica, en el código genético del micoplasma, a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 30 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2, o su complemento. 19. - El ADN de la reivindicación 18, donde la proteína tiene una secuencia que comprende al menos 50 aminoácidos contiguos de la SEQ ID fcwi< ii- >iaiiiitti -t -ii¾ *?¾* Ai* NO; 2. 20.- El ADN de la reivindicación 18, donde el ADN tiene una secuencia que comprende al menos 90 aminoácidos contiguos de la SEQ ID '* NO: 1. * 5 21.- Un ADN que codifica, en el código genético universal, a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 30 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 4, o su complemento. 22. - El ADN de la reivindicación 21 , donde la proteína tiene una secuencia que comprende al menos 50 aminoácidos contiguos de la SEQ ID 10 NO: 4. 23. - El ADN de la reivindicación 21 , donde el ADN tiene una secuencia de al menos 90 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 3. , 24.- El ADN de la reivindicación 22, operativamente ligado a un F promotor heterólogo. 15 25.- El ADN de la reivindicación 24, que comprende además un origen de replicación activa en una célula procariótica. 26. - El ADN de la reivindicación 24, que comprende además un origen de replicación activa en una célula eucariótica. 27. - Una célula hospedante que comprende el ADN aislado de la 20 reivindicación 24. 28. - La célula hospedante de la reivindicación 27, donde dicha célula es E. coíi BL21 y dicho ADN es el vector de expresión pBAD/Thio- TOPO. 29. - Un método para la producción de apo-Mhp3 o de uno de sus fragmentos comprendiendo dicho método (i) cultivar las células de la reivindicación 27 en condiciones en las que se expresa la apo-Mhp3, y .(ii) recuperar dicha proteína. 30. - El método de la reivindicación 29, donde dicha proteína se recupera en una forma soluble. 31- El método de la reivindicación 29, donde dicha proteína se recupera en una forma insoluble. 32. - El uso de (i) el ADN de la reivindicación 20, y (ii) un excipiente farmacéuticamente aceptable para la fabricación de una vacuna para tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un animal causado por la infección con Mycoplasma hyopneumoniae en donde dicha vacuna produce un aumento de las respuestas celulares o humorales específicas frente a Mycoplasma hyopneumoniae. 33. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 32, donde dicho animal es un cerdo. 34. - Un ADN aislado que comprende un fragmento de 15-40 nucleótidos, cuyo fragmento se híbrida, en condiciones restrictivas para la PCR, con un ADN que codifica, en el código genético del micoplasma, a una proteína que tiene una secuencia de al menos 5 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2, o su complemento. 35. - El ADN aislado de la reivindicación 34, donde la hibridación es específica para M. hyopneumoniae. 36. - El ADN aislado que comprende un fragmento de al menos 90 nucleotidos cuyo fragmento se híbrida, en condiciones de alta restricción para la hibridación en filtro, con un ADN que codifica en el código genético del micoplasma a una proteína que tiene una secuencia de al menos 30 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2, o su complemento. 37. - Un kit que contiene, en al menos un recipiente, un primer ADN aislado que comprende un fragmento de al menos 15 nucleotidos, cuyo fragmento se híbrida bajo condiciones restrictivas para PCR, con un ADN que codifica en el código genético del micoplasma a una proteína que tiene una secuencia de al menos 5 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2, y un segundo ADN aislado que comprende un fragmento de al menos 15 nucleotidos, cuyo fragmento se híbrida, bajo condiciones restrictivas para PCR, con un ADN complementario de un ADN que codifica en el código genético del micoplasma a una proteína que tiene una secuencia de al menos 5 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2, y donde dicho kit contiene una nota indicando que el kit es útil para el diagnóstico de la infección por M. hyopneumoniae. 38. - El kit de la reivindicación 37, donde la hibridación es específica para M. hyopneumoniae. 39.- El kit que contiene, en al menos un recipiente, el ADN aislado de la reivindicación 34, donde la hibridación es específica para M. hyopneumoniae, y donde dicho kit contiene una nota indicando que el kit es útil para el diagnóstico de la infección por M. hyopneumoniae. 40. - El kit que contiene, en al menos un recipiente, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 30 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 4, y una nota indicando que el kit es útil para el diagnóstico de la infección por M. hyopneumoniae. 41. - El kit de la reivindicación 40, que comprende además un anticuerpo secundario anti-cerdo. 42. - El kit de la reivindicación 41 , en el que el anticuerpo secundario se conjuga con una enzima que cataliza una reacción colorimétrica. 43. - El kit de la reivindicación 42, en el que la enzima se selecciona del grupo constituido por fosfatasa alcalina y peroxidasa del rábano picante. 44. - El kit de la reivindicación 42, que contiene además reactivos para un ensayo colorimétrico. -iiirfrr