ES2280230T3 - Vacuna multicomponente para la proteccion contra la enfermedad provocada por haemophilus influenzae y moraxella catarrhalis. - Google Patents
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Abstract
Composición inmunógena multivalente para proporcionar protección en un huésped contra la enfermedad provocada tanto por Haemophilus influenzae como por Moraxella catarrhalis, caracterizada por: por lo menos por cuatro antígenos diferentes que comprenden por lo menos un antígeno procedente de Haemophilus influenzae y por lo menos un antígeno procedente de Moraxella catarrhalis, siendo por lo menos tres de dichos antígenos adhesinas y por lo menos uno de dichos antígenos procede de Moraxella catarrhalis.
Description
Vacuna multicomponente para la protección contra
la enfermedad provocada por Haemophilus influenzae y
Moraxella catarrhalis.
La presente invención se refiere al campo de la
vacunología y, en particular, a una vacuna multicomponente que
comprende proteínas recombinantes de Haemophilus influenzae y
Moraxella catarrhalis.
Haemophilus influenzae es la causa de
varias enfermedades humanas graves, tales como la meningitis, la
epiglotitis, la septicemia y la otitis media. Existen seis
serotipos de H. influenzae, denominados a a f, que están
identificados por su polisacárido capsular. H. influenzae de
tipo b (Hib) era la causa principal de la meningitis bacteriana
hasta la introducción de varias vacunas conjugadas de Hib en la
década de los 80 (ref. 1. A lo largo de la solicitud, se citan
varias referencias entre paréntesis para describir con mayor detalle
el estado de la técnica al que se refiere la presente invención.
Toda la información bibliográfica para cada cita se encuentra al
final de la memoria, inmediatamente antes de las reivindicaciones).
Las vacunas basadas en el polisacárido capsular de H.
influenzae de tipo b conjugado con el toxoide diftérico (ref.
2), el toxoide tetánico (ref. 3 y patente US nº
4.496.538) o la proteína de la membrana externa de Neisseria
meningitidis (ref. 4) han sido eficaces para reducir la
meningitis producida por H. influenzae de tipo b. Los demás
serotipos de H. influenzae están asociados a la enfermedad
invasiva con bajas frecuencias, aunque parece existir un aumento en
la frecuencia de la enfermedad causado por estas cepas ya que la
incidencia de la enfermedad por Hib desciende (refs. 5 y 6). H.
influenzae no encapsulada o no tipificable (NTHi) son también
responsables de una amplia gama de enfermedades humanas que
incluyen la otitis media, la epiglotis, la neumonía y la
traqueobronquitis. La frecuencia de la enfermedad producida por
NTHi no se ha visto
\hbox{afectada por la introducción de las
vacunas con Hib (ref. 7).}
La otitis media es la enfermedad más frecuente
de la primera infancia, con 60 a 70% de todos los niños menores de
2 años de edad, que experimentan entre una y tres infecciones de
oído (ref. 8). La otitis crónica media es responsable de
deficiencias auditivas, de habla y cognitivas en los niños. Las
infecciones por H. influenzae totalizan aproximadamente el
30% de los casos de otitis aguda o media y aproximadamente 60% de
otitis crónica media. Las infecciones por M. catarrhalis
totalizan otro 15 a 20% de otitis aguda media. Únicamente en los
Estados Unidos, el tratamiento de la otitis media cuesta entre 1 y 2
billones de dólares al año en antibióticos y procedimientos
quirúrgicos tales como amigdalectomías, adenoidectomías e inserción
de tubos de timpanostomía. Se estima que otros 30 billones de
\textdollar se gastan al año en terapias asociadas tales como
logopedia y clases especiales de educación. Moraxella
(Branhamella) catarrhalis es la tercera causa más
frecuente de otitis media y de sinusitis en los niños, responsables
del 15 al 20% de la enfermedad. Se ha asociado también a la
enfermedad del aparato respiratorio inferior en niños y adultos,
incluyendo la neumonía y la bronquitis crónica y con menos
frecuencia puede producir bacteremia y meningitis (refs. 9, 10 y
11). No hay vacunas disponibles para proteger contra la enfermedad
por M. catarrhalis. Además, muchos de los organismos
causantes de la otitis media se están volviendo resistentes al
tratamiento con antibióticos. Por lo tanto es muy deseable una
vacuna profiláctica eficaz contra la otitis media.
Durante la infección natural, las proteínas de
la membrana externa expuestas en superficie que estimulan una
respuesta al anticuerpo son en potencia importantes dianas para
anticuerpos bactericidas y/o protectores y por consiguiente
potenciales candidatos de vacunas. Barenkamp y Bodor (ref. 12)
demostraron que los sueros de niños convalecientes que padecen
otitis media debida a NTHi, contenían anticuerpos contra proteínas
de alto peso molecular (HMW). Aproximadamente del 70 al 75% de las
cepas de NTHi expresa las proteínas HMW y la mayoría de estas cepas
contienen dos grupos génicos denominados hmw1ABC y
hmw2ABC (refs. 13 y 14). Se ha demostrado que las proteínas
HMWA son adhesinas que median el acoplamiento a las células
epiteliales humanas (ref. 15). La inmunización con una mezcla de
proteínas naturales HMW1A y HMW2A produjo la protección parcial en
el modelo de prueba de prolongación intravesicular en chinchilla de
la otitis media (ref. 16).
La patente US nº 5.603.938 (Barenkamp),
concedida a la St. Louis University y a la Washington University,
describe la clonación, expresión y secuenciado de los genes que
codifican las proteínas HMW1 y HMW2 de la cepa 12 de
Haemophilus no tipificable. Las proteínas HMW son una familia
de proteínas procedente de Haemophilus no tipificable de
peso molecular comprendido entre aproximadamente 120 y 125 kDa que
se encuentran en las cepas no tipificables de Haemophilus.
Las proteínas HMW están ausentes en las cepas encapsuladas de
Haemophilus.
La producción de proteínas HMW naturales de
cepas de H. influenzae es muy baja y un método para producir
proteínas HMW recombinantes (rHMW) protectoras se ha descrito en el
documento WO 00/20609, publicado el 13 de abril de 2000, cedido a
su cesionario. Se ha desarrollado específicamente un modelo de
colonización nasofaríngea de chinchilla para demostrar la eficacia
de la vacuna de las adhesinas (ref. 17) y las proteínas rHMW son
protectoras en este modelo, tal como se describe en el documento WO
00/20609 mencionado anteriormente. Se demuestra que las proteínas
rHMW1A y rHMW2A proporcionan una protección equivalente a cada una
de las demás y la proteína rHMW1A se seleccionó para posteriores
estudios de la vacuna. En esta solicitud, rHMW se refiere a HMW1A
recombinante procedente de la cepa 12 de NTHi, aunque la proteína
HMW1A recombinante correspondiente procedente de otras cepas de
NTHi y la proteína rHMW2A correspondiente procedente de las cepas
NTHi pueden utilizarse. Pueden utilizarse las proteínas naturales
correspondientes.
Una segunda familia de proteínas de adhesión de
peso molecular alto se ha identificado en aproximadamente el 25% de
NTHi y en las cepas de H. influenzae encapsuladas (refs. 18,
19 y 20). La patente US nº 5.646.259 (St. Geme, III et al.),
concedida a la St. Louis University y a la Washington University,
describe la clonación, expresión y las secuencias de los genes que
codifican las que se denominan en la presente memoria proteínas HA1
y HA2, que presentan homología limitada a las proteínas HMW1 y HMW2
de la patente US nº 5.603.938.
El miembro NTHi de esta segunda familia se
denomina adhesina de Haemophilus influenzae o Hia (HA1) y la
proteína homóloga encontrada en cepas encapsuladas se denomina
proteína fibrilar de superficie de Haemophilus influenzae o
Hsf (HA2). El gen hia se clonó originalmente en un banco de
expresión que utiliza sueros de un paciente convaleciente de otitis
media, lo que indica que es un inmunógeno importante durante la
enfermedad. El prototipo de proteínas Hia y Hsf demuestra
aproximadamente 82% de similitud de secuencia, aunque la proteína
Hsf es considerablemente mayor. Las proteínas se componen de
terminales amino y carboxi conservados y varios motivos de
repetición con Hsf que contiene más secuencias repetidas que
Hia.
Las versiones completas y truncadas en el
terminal N de la proteína Hia (rHia) en E. coli protegen
contra la bacteremia causada por organismos de H. influenzae
de tipo a y tipo b, y proporcionan protección parcial contra la
colonización nasofaríngea por H. influenzae no tipificable.
En esta solicitud, rHia se refiere a V38 rHia de la cepa 11 de
NTHi, aunque pueden utilizarse otras proteínas Hia completas y
truncadas en el terminal N recombinantes procedentes de otras cepas
de NTHi. Pueden utilizarse asimismo las correspondientes proteínas
naturales.
Una adhesina de alto peso molecular identificada
en M. catarrhalis, ha sido denominada 200 kDa y se describe
en la patente US nº 5.808.024 (Sasaki et al.), cedida a su
cesionario así como (documento WO 96/34960) publicado el 7 de
noviembre de 1996 cedida a su cesionario. La proteína de 200 kDa se
ha identificado en 96 de cada 109 cepas de M. catarrhalis,
incluyendo 73 de cada 74 cepas procedentes de la otitis media y se
supone que es un factor de virulencia. Existe homología de
secuencia entre la proteína de 200 kDa de M. catarrhalis y
las proteínas Hia y Hsf de H. influenzae. Además, el
anticuerpo antinatural de 200 kDa reconoció la proteína rHia en una
inmunotransferencia, lo que indica el parentesco antigénico.
No existe ningún modelo animal adecuado para la
infección y enfermedad por M. catarrhalis, pero se ha
desarrollado un análisis para el anticuerpo bactericida como
análisis sustituto, tal como se describe en la patente US nº
5.808.024 mencionada anteriormente. Una proteína V56 r200 kDa
truncada en el terminal N se ha expresado en E. coli y el
anticuerpo obtenido contra V56 r200 kDa se ha demostrado que es
bactericida contra las cepas homólogas y heterólogas de M.
catarrhalis, indicando de este modo su utilidad como antígeno
para vacuna. La proteína V56 r200 kDa procedente de la cepa 4223 de
M. catarrhalis se utiliza en esta referencia si bien pueden
utilizarse otras proteínas 200 kDa recombinantes completas y
truncadas en el terminal N procedentes de otras cepas de M.
catarrhalis. Pueden utilizarse también las proteínas naturales
correspondientes.
Cuando están bajo sobrecarga ambiental, tal como
temperatura elevada, los organismos sobreproducen respuesta a la
sobrecarga o proteínas de choque térmico (hsps). Se ha demostrado
que las hsps bacterianas son inmunógenos importantes, que estimulan
tanto a los linfocitos B como a los linfocitos T (ref. 21). Las
proteínas bacterianas del choque térmico HtrA o DegP se expresan en
condiciones de sobrecarga y la proteína HtrA o Hin47 de H.
influenzae se ha demostrado que es un antígeno parcialmente
protector en el modelo de la prueba de provocación intravesicular
de la otitis media (ref. 22). Las proteínas HtrA son serina
proteasas y su actividad proteolítica las hace inestables. Además,
como componente de una vacuna multicomponente; la proteína HtrA
natural degradará los antígenos mezclados. La mutagénesis dirigida
al sitio del gen htrA de H. influenzae (denominado
hin47) y las propiedades de los mutantes se han descrito
completamente en la patente US nº 5.506.139 (Loosmore et
al.), cedida a su cesionario.
La patente US nº 5.506.139 (Loosmore et
al.) describe la preparación de análogos de la proteína Hin47 de
Haemophilus influenzae que presenta una actividad de
proteasa disminuida que es inferior aproximadamente al 10% de la de
la proteína Hin47 natural y que preferentemente presenta
sustancialmente las mismas propiedades inmunológicas que la
proteína Hin47 natural. La patente describe también el aislamiento,
la purificación y la caracterización de moléculas de ácido nucleico
que codifican los análogos de Hin47. La proteína Hin47 natural se
conserva inmunológicamente entre las cepas no tipificables y
encapsuladas de H. influenzae. La secuencia de aminoácidos
de la proteína natural Hin47 y la secuencia nucleotídica del gen
hin47 codificador se describen en el documento WO 94/00149
publicado el 6 de enero de 1994.
Los análogos de Hin47 de la patente US nº
5.506.139 se preparan eliminando o sustituyendo por un aminoácido
diferente por lo menos un aminoácido de la Hin47 natural que
contribuye a la actividad de la proteasa o insertando por lo menos
un aminoácido en la proteína Hin47 natural, tal como se describió
específicamente en la presente memoria. El aminoácido por lo menos
eliminado o sustituido puede seleccionarse de entre los aminoácidos
195 a 201 de Hin47 y específicamente puede ser
Serina-197, que puede eliminarse o sustituirse por
alanina. Además, el aminoácido por lo menos eliminado o sustituido
puede ser His91 y puede ser eliminado o sustituido por alanina,
lisina o arginina. Además, el aminoácido por lo menos eliminado o
sustituido puede ser Asp-121 y puede ser eliminado
o sustituido por alanina.
En la patente US nº 5.869.302, cedida a su
cesionario, se han descrito múltiples mutaciones efectuadas en
diferentes aminoácidos de la proteína Hin47 natural para
proporcionar el análogo de Hin47 no proteolítico.
En la presente invención, la mutación de
histidina 91 a alanina (denominada a veces en la presente memoria
"H91A") se emplea como ilustración de la proteína mutante
Hin47, si bien pueden utilizarse otros mutantes de Hin47 con
actividad de proteasa reducida tal como se describe en la patente y
solicitud mencionadas anteriormente.
El análogo no proteolítico de HtrA, H91A Hin47,
se ha demostrado que es un antígeno protector contra la bacteremia
causada por H. influenzae de tipo b y contra la otitis media
causada por H. influenzae no tipificable (ref. 22). HtrA se
encontró en todas las cepas de H. influenzae examinadas,
incluyendo las cepas encapsuladas. Existían también pruebas de
reactividad cruzada con una proteína específica procedente de M.
catarrhalis en la inmunotransferencia, lo que sugiere la
posibilidad de un análogo de HtrA en este organismo.
El principal objetivo de una vacuna profiláctica
contra la otitis media consiste en impedir la implantación de la
colonización nasofaríngea incluyendo adhesinas como inmunógenos. Las
proteínas HMW y Hia de H. influenzae son adhesinas que se ha
demostrado que evitan la colonización. Sin embargo, ya que puede
existir un pequeño porcentaje de cepas de H. influenzae que
no contienen los genes hmw o hia, el antígeno H91 A
Hin47 se ha añadido para proporcionar protección contra dichas
cepas, aunque puede utilizarse cualquier otro análogo de Hin47 no
proteolítico. La adición de una o más adhesinas de 200 kDa de M.
catarrhalis proporciona protección frente a la colonización de
este organismo. La presente invención proporciona una vacuna
multicomponente para proteger contra la colonización y la
enfermedad causada por organismos H. influenzae y M.
catarrhalis encapsulados o no encapsulados.
Sería deseable proporcionar una combinación de
vacunas eficaz que comprenda los componentes de H. influenzae
y M. catarrhalis que contienen cantidades relativas
seleccionadas de antígenos seleccionados.
La presente invención se refiere a una
composición inmunógena multivalente para proporcionar protección en
un huésped contra la enfermedad provocada por la infección con
Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis, que
se caracteriza por lo menos por cuatro antígenos diferentes, que
comprende por lo menos un antígeno procedente de Haemophilus
influenzae y por lo menos un antígeno procedente de Moraxella
catarrhalis, tres de cuyos antígenos por lo menos son adhesinas
y uno de cuyos antígenos por lo menos procede de Moraxella
catarrhalis.
Uno de los antígenos que es una adhesina puede
ser una proteína de alto peso molecular (HMW) de una cepa no
tipificable de Haemophilus, particularmente una proteína HMW1
o HMW2 de la cepa no tipificable, que puede ser producida de manera
recombinante.
Otro de los antígenos que es una adhesina puede
ser una proteína adhesina (Hia) de Haemophilus influenzae de
una cepa no tipificable de Haemophilus influenzae o de una
proteína fibrilar de superficie (hsf) de Haemophilus
influenzae de una cepa tipificable de Haemophilus
influenzae que puede producirse de manera recombinante.
Un antígeno de Haemophilus influenzae que
no es una adhesina puede ser una proteína no proteolítica de choque
térmico de una cepa de Haemophilus influenzae, que puede ser
un análogo de la proteína Hin47 de Haemophilus influenzae
que presenta una actividad disminuida de proteasa que es inferior a
aproximadamente el 10% de la de la proteína natural Hin47.
Uno de los antígenos que es una adhesina puede
ser una proteína de la membrana externa de Moraxella
catarrhalis que tiene una masa molecular aparente de
aproximadamente 200 kDa, determinada por SDS-PAGE, y
puede producirse de manera recombinante.
Según una forma de realización preferida de la
presente invención, se aporta una composición inmunógena
multivalente para proporcionar protección en un huésped contra la
enfermedad producida tanto por Haemophilus influenzae como
por Moraxella catarrhalis, que comprende: (a) un análogo de
la proteína Hin47 de Haemophilus influenzae con actividad de
proteasa disminuida que es menor que aproximadamente el 10% de la
proteína natural Hin47, (b) una proteína adhesina de Haemophilus
influenzae (Hia) de una cepa no tipificable de Haemophilus
influenzae, (c) una proteína de alto peso molecular (HMW) de
una cepa de Haemophilus influenzae no tipificable, y (d) una
proteína de la membrana externa de Moraxella catarrhalis con
una masa molecular aparente de aproximadamente 200 kDa, determinada
por SDS-PAGE.
En dicha composición las proteínas Hin47, Hia,
HMW y 200 kDa pueden estar presentes en cantidades que no
proporcionen inmunogenicidades individuales de las proteínas, de
modo que no exista interferencia entre los componentes con respecto
a sus inmunogenicidades individuales.
El análogo de la proteína Hin47 puede ser uno en
el que por lo menos un aminoácido de la proteína Hin47 natural que
contribuye a la actividad de la proteasa se ha eliminado o
sustituido por un aminoácido diferente y que sustancialmente tiene
las mismas propiedades inmunógenas que la proteína natural
Hin47.
Por lo menos dicho aminoácido puede
seleccionarse de entre el grupo constituido por los aminoácidos 91,
121 y 195 a 207 de la proteína Hin47 natural. Pueden utilizarse
mutantes específicos incluyendo serina-197
sustituido por alanina, Histidina-91 sustituido por
alanina, lisina o arginina y Asp-121 sustituido por
alanina.
La proteína HMW de la cepa no tipificable de
Haemophilus influenzae puede ser una proteína HMW1 o HMW2 y
puede producirse de manera recombinante. Las proteínas HMW1 y HMW2
proceden de las respectiva cepa de Haemophilus influenzae no
tipificable y poseen los pesos moleculares respectivos indicados en
la Tabla I siguien-
te:
te:
Las proteínas Hia y 200 kDa pueden producirse de
manera recombinante y pueden comprender truncamientos
N-terminales, V38 rHia y V56 r200 kDa
respectivamente.
La composición inmunógena de la presente
invención puede formularse además con un adyuvante. Dicho adyuvante
para su utilización en la presente invención puede incluir (pero no
limitarse a) fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, QS21, Quil
A, derivados y componentes de los mismos, matriz ISCOM, fosfato de
calcio, hidróxido de calcio, hidróxido de cinc, un análogo de
glucolípido, un éster de octadecilo de un aminoácido, un dipéptido
de muramilo, polifosfaceno, ISCOPREP, DC-chol, DDBA
y una lipoproteína y otros adyuvantes. Las combinaciones de
adyuvantes ventajosas se describen en la patente US nº 5.837.250
(documento WO 95/34308, publicado el 21 de noviembre de 1995). El
adyuvante puede comprender preferentemente fosfato de aluminio o
hidróxido de aluminio (conocido comúnmente como alúmina).
Los componentes de la composición pueden estar
presentes en cantidades apropiadas para proporcionar la respuesta
inmunitaria deseada. Los componentes pueden formularse como vacuna
para la administración in vivo al hospedador. La composición
de la vacuna puede comprender:
- (a)
- aproximadamente del 25 a aproximadamente 100 \mug del análogo de la proteína Hin47,
- (b)
- aproximadamente 25 a aproximadamente 100 \mug de la proteína Hia,
- (c)
- aproximadamente 25 a aproximadamente 100 \mug de la proteína HMW, y
- (d)
- aproximadamente 25 a aproximadamente 100 \mug de la proteína de 200 kDa.
Las composiciones inmunógenas pueden formularse
con otros componentes antigénicos para proporcionar una vacuna
multivalente en la que el/los componente(s) antigénicos
adicionales proporcionen protección contra la enfermedad producida
por otro(s) patógeno(s). Dichos antígenos adicionales
deberían ser tales que y estar presentes en cantidades que la
inmunogenicidad de los componentes individuales de la vacuna
resultante no sea proporcionada por otros componentes individuales
de la composición. Dichos antígenos adicionales son preferentemente
antígenos purificados en cantidades definidas para producir un
componente de la vacuna.
Dichos antígenos adicionales pueden ser los
hallados tradicionalmente en las vacunas protectoras multivalentes,
tales como el toxoide diftérico, toxoide tetánico y antígenos de la
tos ferina, incluyendo toxoide de tos ferina, hemoaglutinina
filamentosa, pertactina y/o aglutinógenos.
La vacuna multivalente resultante puede contener
también poliovirus no virulento, tales como poliovirus inactivados,
que pueden ser poliovirus de tipo 1, de tipo 2 y/o de tipo 3. La
vacuna multicomponente puede comprender además un conjugado de un
toxoide tetánico o antidiftérica y un polisacárido capsular de
Haemophilus influenzae, preferentemente
PRP-T.
La invención se extiende a un método de
inmunización de un huésped contra la enfermedad producida por la
infección tanto con Haemophilus influenzae como con
Morexella catarrhalis, que incluye la otitis media, que
comprende administrar al huésped una cantidad inmunoeficaz de la
composición inmunógena proporcionada en la presente memoria.
Las ventajas de la presente incluyen una vacuna
multivalente que puede proporcionar protección contra las
enfermedades por Haemophilus influenzae y Moraxella
catarrhalis no encapsuladas de manera segura y eficaz.
La presente invención se pondrá más claramente
de manifiesto a partir de la siguiente descripción haciendo
referencia a los dibujos, en los que:
La Figura 1, con los paneles A y B, presenta las
respuestas inmunitarias de Hin47 anti-H91A para
vacunas de la combinación H91A Hin47+ rHMW + rHia + r200 kDa en
ratones. En el panel A, los componentes H91A Hin47+ rHMW + rHia
estaban en una concentración de 0,3 \mug cada uno y, en el panel
B, estaban en una concentración de 3,0 \mug cada uno. Se
añadieron cantidades crecientes de r200 kDa a razón de 0, 0,3, 1,0,
3,0 y 10,0 \mug;
la Figura 2, con los paneles A y B, presenta las
respuestas inmunitarias de anti-rHMW para vacunas de
la combinación H91 A Hin47+ rHMW + rHia + r200 kDa en ratones. En
el panel A, los componentes H91 A Hin47+ rHMW + rHia estaban en una
concentración de 0,3 \mug cada uno y, en el panel B, estaban en
una concentración de 3,0 \mug cada uno. Se añadieron cantidades
crecientes de r200 kDa a razón de 0, 0,3, 1,0, 3,0 y 10,0
\mug;
la Figura 3, con los paneles A y B, presenta las
respuestas inmunitarias de anti-rHia para vacunas de
la combinación H91 A Hin47+ rHMW + rHia + r200 kDa en ratones. En
el panel A, los componentes H91 A Hin47+ rHMW + rHia estaban en una
concentración de 0,3 \mug cada uno y, en el panel B, estaban en
una concentración de 3,0 \mug cada uno. Se añadieron cantidades
crecientes de r200 kDa a razón de 0, 0,3, 1,0, 3,0 y 10,0
\mug;
la Figura 4, con los paneles A, B, C y D,
presenta las respuestas inmunitarias de anti-r200
kDa para vacunas de la combinación H91 A Hin47+ rHMW + rHia + r200
kDa en ratones. En el panel A, se añadieron cantidades crecientes
de H91 A Hin47+ rHMW + rHia en 0, 0,3 ó 3,0 \mug de cada uno a 0,3
\mug de r200 kDa. En el panel B, se añadieron cantidades
crecientes de H91 A Hin47+ rHMW + rHia en 0, 0,3 ó 3,0 \mug de
cada uno a 1,0 \mug de r200 kDa. En el panel C, se
añadieron cantidades crecientes de H91 A Hin47+ rHMW + rHia en 0,
0,3 ó 3,0 \mug de cada uno a 3,0 \mug de r200 kDa. En el panel
D, se añadieron cantidades crecientes de H91 A Hin47+ rHMW + rHia
en 0, 0,3 ó 3,0 \mug de cada uno a 10,0 \mug de r200 kDa;
la Figura 5, con los paneles A y B, presenta las
respuestas inmunitarias de Hin47 anti-H91A para
vacunas de la combinación H91 A Hin47+ rHMW + rHia + r200 kDa en
cobayas. En el panel A, los componentes H91 A Hin47+ rHMW + rHia
estaban en una concentración de 25 \mug cada uno y, en el panel B,
estaban en una concentración de 50 \mug cada uno. Se añadieron
cantidades crecientes de r200 kDa a razón de 0, 25, 50 y 100
\mug;
la Figura 6, con los paneles A y B, presenta las
respuestas inmunitarias anti-HMW para vacunas de la
combinación H91 A Hin47+ rHMW + rHia + r200 kDa en cobayas. En el
panel A, los componentes H91 A Hin47+ rHMW + rHia estaban en una
concentración de 25 \mug cada uno y, en el panel B,
estaban en una concentración de 50 \mug cada uno. Se añadieron
cantidades crecientes de r200 kDa a razón de 0, 25, 50 y 100
\mug;
la Figura 7, con los paneles A y B, presenta las
respuestas inmunitarias anti-Hia para vacunas de la
combinación H91 A Hin47+ rHMW + rHia + r200 kDa en cobayas. En el
panel A, los componentes H91 A Hin47+ rHMW + rHia estaban en una
concentración de 25 \mug cada uno y, en el panel B, estaban en una
concentración de 50 \mug cada uno. Se añadieron cantidades
crecientes de r200 kDa a razón de 0, 25, 50 y 100 \mug;
la Figura 8, con los paneles A, B y C, presenta
las respuestas inmunitarias anti-200 kDa para
vacunas de la combinación H91 A Hin47+ rHMW + rHia + r200 kDa en
cobayas. En el panel A, se añadieron cantidades crecientes de H91 A
Hin47+ rHMW + rHia a razón de 0, 25 ó 50 \mug de cada uno a 25
\mug de r200 kDa. En el panel B, se añadieron cantidades
crecientes de H91 A Hin47+ rHMW + rHia a razón de 0, 25 ó 50 \mug
de cada uno a 50 \mug de r200 kDa. En el panel C, se añadieron
cantidades crecientes de H91 A Hin47+ rHMW + rHia a razón de 0, 25
ó 50 \mug de cada uno a 100 \mug de r200 kDa;
la Figura 9 presenta la protección de la vacuna
de la combinación H91A + Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa en el
modelo de chinchilla de colonización nasofaríngea. La protección
proporcionada por la vacuna de cuatro componentes se compara con la
de una vacuna rHMW monocomponente, con una vacuna de dos componentes
rHMW + H91 A Hin47, con una vacuna de tres componentes rHMW + H91 A
Hin47 + rHia y con las referencias de convalecientes;
la Figura 10 ilustra la protección proporcionada
por la vacuna de la combinación H91 A Hin47 + rHMW + rHia + r200
kDa en el modelo de chinchilla de la prueba de provocación
intravesicular. La protección proporcionada por la vacuna de cuatro
componentes se compara con la de una vacuna H91 A Hin47 (H91 A)
monocomponente, con una vacuna de dos componentes rHMW + H91 A
Hin47, con una vacuna de tres componentes rHMW + H91 A Hin47 + rHia
y con las referencias de alúmina;
la Figura 11 es una ilustración esquemática del
esquema de construcción para producir el plásmido
DS-2150-1 que contiene el gen que
codifica el análogo Hin47 de H91;
la Figura 12 es una ilustración esquemática del
esquema de construcción para producir el plásmido
BK-76-1-1 que
contiene el grupo génico hmw1ABC de la cepa 12 de NTHi;
la Figura 13 es una ilustración esquemática del
esquema de construcción para producir el plásmido
BK-96-2-11que
contiene el gen que codifica Hia truncada por V38 con N truncado de
la cepa 11 de NTHi; y
las Figuras 14A y 14B son una ilustración
esquemática de un esquema de construcción para producir el plásmido
pKS348 que contiene el gen que codifica r200 kDa de V56 truncado en
N de la cepa 4223 de M. catarrhalis.
La producción y purificación de antígenos de
H. influenzae recombinantes rHMW, rHia y H91 A Hin47 ha sido
totalmente descrita en el documento WO 00/20609 mencionado
anteriormente y en la patente US nº 5.506.139 mencionada
anteriormente, respectivamente.
La colonización de la nasofaringe en la primera
etapa en el desarrollo de la enfermedad para muchos patógenos
bacterianos o víricos y vacunas que contienen moléculas de adhesina
deberían proteger contra esta primera etapa en la evolución de la
enfermedad. Las proteínas de alto peso molecular (HMW), encontradas
en aproximadamente el 75% de H. influenzae no tipificable,
se ha demostrado que son adhesinas que son protectoras contra la
colonización cuando se administran en una composición de vacuna.
Las proteínas HMW no están presentes en cepas de H.
influenzae encapsulada o en aproximadamente el 25% de cepas de
H. influenzae no tipificables, de este modo no son
suficientes para una vacuna completamente eficaz con protección en
toda la cepa.
Asimismo se ha demostrado que las proteínas
Hia/Hsf son adhesinas y están presentes en todas las cepas de H.
influenzae encapsuladas y en la mayoría de las cepas de H.
influenzae no tipificables que no producen proteínas de HMW. La
proteína rHia es protectora contra la colonización por NTHi y contra
la bacteremia causada por organismos de tipo a y tipo b de H.
influenzae. Existe un pequeño porcentaje
\hbox{de cepas de
NTHi que no producen proteínas HMW ni Hia.}
La proteína HtrA o Hin47 se encuentra en todas
las cepas encapsuladas y no tipificables de H. influenzae.
Hin47 o su mutante proteolítica H91A Hin47, protege contra la
bacteremia causada por H. influenzae de tipo b y la otitis
media causada por H. influenzae no tipificable, pero no evita
la colonización. Hin47 es proteolítica y no puede utilizarse en
formulaciones de proteínas. Una vacuna de combinación que comprende
antígenos rHMW, rHia y H91 A Hin47 puede formularse para proteger
contra la enfermedad por H. influenzae, incluyendo la otitis
media.
La proteína de 200 kDa de M. catarrhalis
está relacionada desde un punto de vista genético y antigénico con
la familia Hia/Hsf de adhesinas. La inmunización con la proteína
r200 kDa produce anticuerpos bactericidas interreactivos. Puede
formularse una vacuna de combinación que comprende los tres
antígenos de H. influenzae y la proteína r200 kDa de M.
catarrhalis para proteger contra la enfermedad por H.
influenzae y M. catarrhalis, incluyendo la otitis
media.
La composición de vacunas multicomponentes es
importante. Los componentes de la vacuna deben ser compatibles y
deben combinarse en proporciones apropiadas para evitar la
interferencia antigénica y optimizar cualquier sinergia posible. Si
se administran con otras vacunas probadas, no deben interferir en la
protección proporcionada por la vacuna contra otra(s)
enfermedad(es).
La preparación inmunógena y las propiedades
protectoras de la vacuna de dos componentes rHMW + H91A Hin47, se
describió en el documento WO 00/35477, publicado el 22 de junio de
2000.
Se compararon varias proporciones de antígeno
con la vacuna de cuatro componentes H91 A Hin47 + rHMW + rHia +
r200 kDa y se comparó la inmunogenicidad en dos especies animales.
En los ratones, la adición del componente r200 kDa a la vacuna de
tres componentes a baja dosis (0,3 \mug de cada uno), potenció la
respuesta primaria de anti-H91 A Hin47, sin embargo
la respuesta de la vacuna a una dosis mayor (3,0 \mug de cada
uno), no fue afectada. En cobayas, la respuesta de
anti-H91 A Hin47 para la vacuna de 3 ó 4 componentes
fue equivalente. En ratones la respuesta anti-rHMW
a la vacuna de tres componentes a baja dosis con o sin añadir
antígeno r200 kDa fue muy escasa. No parecía existir un efecto
sinérgico o de inhibición sobre la respuesta
anti-rHMW en la adición del componente r200 kDa a
la vacuna a alta dosis. No hubo ningún efecto evidente sobre la
respuesta anti-rHia en la adición del componente
r200 kDa a la vacuna de tres componentes a baja o alta dosis. La
respuesta inmunitaria al componente r200 kDa con o sin añadir
vacuna de tres componentes, fue generalmente más escasa que la
observada para otros componentes. A la dosis de 1,0 \mug de r200
kDa, la adición de la vacuna de tres componentes a 3 \mug de cada
uno, disminuyó la respuesta inmunitaria a r200 kDa. Sin embargo, a
dosis más altas, la respuesta anti-r200 kDa no fue
afectada por la presencia de los demás componentes. En los cobayas,
la respuesta inmunitaria a cada antígeno no fue afectada por la
presencia de los otros tres.
La protección proporcionada por la vacuna de
cuatro componentes fue evaluada en el modelo de chinchilla de
colonización nasofaríngea. Los animales fueron bien protegidos
contra la colonización, a niveles equivalentes a una vacuna
monocomponente de rHMW, a una vacuna de dos componentes rHMW + H91 A
Hin47 o a una vacuna de tres componentes rHMW + rHia + H91 A Hin47.
La protección proporcionada por la vacuna de cuatro componentes se
evaluó también en el modelo de la otitis media de prueba de
provocación intravesicular en chinchilla. Los animales fueron
protegidos contra la otitis media, a niveles equivalentes a una
vacuna monocomponente de H91 A Hin47, a una vacuna de dos
componentes H91 A Hin47 + rHMW o a una vacuna de tres componentes
H91 A Hin47 + rHMW + rHia. Estos datos demuestran que la adición de
más antígenos a la vacuna no tenía un efecto perjudicial sobre la
protección proporcionada por un solo componente.
En cuanto a la Fig. 1, se ilustra la respuesta
inmunitaria en ratones, al antígeno H91 A Hin47 de una vacuna de
tres o cuatro componentes en la que los componentes H91 A Hin47 +
rHMW + rHia se fijan a 0,3 ó 3,0 \mug cada uno y se añade r200
kDa a concentraciones de 0, 0,3, 1,0, 3,0 y 10,0 \mug. Se obtienen
anticuerpos de título elevado en los sueros de la extracción final
de todas las combinaciones.
En cuanto a la Fig. 2, se ilustra la respuesta
inmunitaria en ratones, al antígeno rHMW de una vacuna de tres o
cuatro componentes en la que los componentes H91 A Hin47 + rHMW +
rHia se fijan a 0,3 ó 3,0 \mug cada uno y se añade r200 kDa a
concentraciones de 0, 0,3, 1,0, 3,0 y 10,0 \mug. La respuesta
inmunitaria a la vacuna a baja dosis es muy escasa, pero se
obtienen títulos altos en anticuerpos en el suero de extracción
final para las vacunas de tres o cuatro componentes a alta
dosis.
En cuanto a la Fig. 3, se ilustra la respuesta
inmunitaria en ratones, al antígeno rHMW de una vacuna de tres o
cuatro componentes en la que los componentes H91 A Hin47 + rHMW +
rHia se fijan a 0,3 ó 3,0 \mug cada uno y se añade r200 kDa a
concentraciones de 0, 0,3, 1,0, 3,0 y 10,0 \mug. Se obtienen
anticuerpos de título elevado en los sueros de la extracción final
de todas las combinaciones.
En cuanto a la Fig. 4, se ilustra la respuesta
inmunitaria en ratones, al antígeno r200 kDa de una
vacuna de uno o cuatro componentes en la que los componentes H91 A
Hin47 + rHMW + rHia se fijan a 0, 0,3 ó 3,0 \mug cada uno y se
añade r200 kDa a concentraciones de 0,3, 1,0, 3,0 y 10,0 \mug. La
respuesta inmunitaria del componente r200 kDa es muy escasa a las
dosis de 0,3 \mug y de 1,0 \mug. A las dosis mayores de 3 ó 10
\mug de r200 kDa, se obtienen títulos altos en anticuerpo para los
sueros de la extracción final, con independencia de la presencia o
ausencia de los demás componentes.
En cuanto a la Fig. 5, se ilustra la respuesta
inmunitaria en cobayas, al antígeno H91 A Hin47 de una vacuna de
tres o cuatro componentes en la que los componentes H91 A Hin47 +
rHMW + rHia se fijan a 25 ó 50 \mug de cada uno y se añade r200
kDa a concentraciones de 0, 25, 50 ó 100 \mug. Se obtienen
anticuerpos de título elevado en los sueros de la extracción final
de todas las combinaciones.
En cuanto a la Fig. 6, se ilustra la respuesta
inmunitaria en cobayas, al antígeno rHMW de una vacuna de tres o
cuatro componentes en la que los componentes H91 A Hin47 + rHMW +
rHia se fijan a 25 ó 50 \mug de cada uno y se añade r200 kDa a
concentraciones de 0, 25, 50 ó 100 \mug. Se obtienen anticuerpos
de título elevado en los sueros de la extracción final de todas las
combinaciones.
En cuanto a la Fig. 7, se ilustra la respuesta
inmunitaria en cobayas, al antígeno rHia de una vacuna de tres o
cuatro componentes en la que los componentes H91 A Hin47 + rHMW +
rHia se fijan a 25 ó 50 \mug de cada uno y se añade r200 kDa a
concentraciones de 0, 25, 50 ó 100 \mug. Se obtienen anticuerpos
de título elevado en los sueros de la extracción final de todas las
combinaciones.
En cuanto a la Fig. 8, se ilustra la respuesta
inmunitaria en cobayas, al antígeno r200 kDa de una vacuna de uno
o cuatro componentes en la que los componentes H91 A Hin47 + rHMW +
rHia se fijan a 0, 25 ó 50 \mug de cada uno y se añade r200 kDa a
concentraciones de 25, 50 ó 100 \mug. Se obtienen anticuerpos de
título elevado en los sueros de la extracción final de todas las
vacunas.
En cuanto a la Fig. 9, se ilustra la protección
proporcionada por la vacuna de cuatro componentes H91 A Hin47 +
rHMW + rHia + r200 kDa contra la colonización nasofaríngea en un
modelo de chinchilla. La protección es comparable a la
proporcionada por una vacuna monovalente rHMW, una vacuna de dos
componentes H91 A Hin47 + rHMW y una de tres componentes H91 A
Hin47 + rHMW + rHia.
En cuanto a la Fig. 10, se ilustra la protección
proporcionada por la vacuna de cuatro componentes H91 A Hin47 +
rHMW + rHia + r200 kDa contra la colonización nasofaríngea en un
modelo de chinchilla. La protección es comparable a la
proporcionada por una vacuna monovalente rHMW, una vacuna de dos
componentes H91 A Hin47 + rHMW y una de tres componentes H91 A
Hin47 + rHMW + rHia.
La exposición anterior describe de forma general
la presente invención. Puede obtenerse una comprensión más completa
haciendo referencia a los siguientes Ejemplos específicos. Estos
Ejemplos se describen únicamente a título ilustrativo y no
limitativo del alcance de la invención. Los cambios en la forma y la
sustitución de equivalentes se contemplan como circunstancias que
pueden sugerirse o ser convenientes. Aunque en la presente memoria
se han empleado términos específicos, dichos términos se
proporcionan con un sentido descriptivo y no a título
limitativo.
Los métodos de tecnología genética molecular,
bioquímica de proteínas, inmunología y fermentación utilizados,
pero no explícitamente descritos en esta exposición y estos
Ejemplos, se describen ampliamente en la bibliografía científica y
están comprendidos en la capacidad de los expertos en la
materia.
Este Ejemplo describe la preparación del
componente H91 A Hin47 de la vacuna.
Se preparó el mutante de H91 A Hin47 tal como se
describe en la patente US nº 5.506.139 mencionada anteriormente. En
resumen, se sintetizó el oligonucleótido 5' ATCAATAACAGCATTATTGGT 3'
(SEC. ID. nº 1) que cambiaría el resto de histidina en 91 por una
alanina (ref. 17).
El plásmido
JB-1276-1-2 es un
plásmido a base de pUC que contiene el gen T7/hin47 en un
fragmento de EcoR I y se utilizó para clonar el gen
hin47 en M13mp18 para la mutagénesis dirigida al sitio con el
kit de mutagénesis dirigida al sitio in vitro de Amersham.
La preparación del plásmido
JB-1276-1-2 se
describe en la patente US nº 5.506.139. La mutación del codón His91
en Ala91 se confirmó por secuenciado local. El gen hin47
mutante de H91 A se subclonó en pT7-7 para generar
el plásmido DS-1277-19 (Fig.
11).
El plásmido de expresión H91 A Hin47
(DS-1277-19) utiliza selección de
ampicilina. Se clonó el gen hin47 de T7/H91 A en pBR328 de
modo que pudo utilizarse la selección de tetraciclina. El vector
DS-1312-12 era por lo tanto un
plásmido a base de pBR328 que contenía las secuencias del gen
hin47 de T7/H91 A entre las secuencias EcoRI y
ClaI, con genes funcionales con resistencia a la ampicilina y
a la tetraciclina que contienen una repetición de las secuencias
HindIII - BamHI que se encuentran tanto en pBR328 como
en pEVvrfl.
Se construyó un nuevo plásmido basado en
DS-1312-12 que utiliza la selección
de kanamicina. En la Figura 11 se presenta el esquema de
construcción. Se digirió el ADN plásmido de
DS-1312-12 con HindIII
generando dos fragmentos. El fragmento mayor de 5,9 kb
contenía un gen tetR sin activador, el gen ampR y el gen
hin47 de T7/H91 A y se volvió a ligar en el propio vector de
creación DS-2140-3. Se digirió el
plásmido DS-2140-3 con el gen PstI
y el kanR del plásmido pUC-4K
(P-L Biochemicals) se insertó en la secuencia PstI,
generando el plásmido DS-2150-1 que
es kanR y sensible tanto a la ampicilina como a la
tetraciclina.
Se preparó el ADN plásmido de
DS-2150-1 procedente de un cultivo
de 50 ml que utiliza un protocolo basado en el procedimiento de
Holmes y Quigley (ref. 23) y que incluye extracciones con fenol y
cloroformo. Las células BL21(DE3) de E. coli se
hicieron electrocompetentes de la forma siguiente. En resumen, se
inocularon 10 ml de cultivo durante la noche en 500 ml de medio YT
y se cultivaron las células a 37ºC con agitación hasta que
alcanzaron una A_{620}=0,540. El cultivo se enfrió en hielo
durante 30 min., se centrifugó a 5.000 rpm durante 15 min., y el
sedimento celular se volvió a poner en suspensión en 500 ml de agua
esterilizada con hielo frío. La suspensión celular se centrifugó
como anteriormente y el sedimento celular se volvió a poner en
suspensión en 250 ml de agua esterilizada enfriada con hielo. La
suspensión celular se centrifugó de nuevo, y se volvieron a poner
las células en 10 ml de glicerol al 10%. La suspensión en glicerol
se centrifugó y las células se volvieron a poner en suspensión en
1,5 ml de glicerol al 10%, se tomaron alícuotas como muestras de 40
\mul y se almacenaron a -70ºC.
Se descongeló en hielo una alícuota de células
BL21 electrocompetentes (DE3) y se le añadieron aproximadamente 9
ng de ADN de DS-2150-1. Las muestras
se incubaron en hielo durante 3 min., a continuación se
transfirieron a una cubeta con electrodo Gene Pulser de BioRad a
-20ºC y se sometieron a una pulsación eléctrica. Se añadieron 900
\mul de medio SOC y la mezcla se transfirió a un tubo de cultivo
en el que se incubó a 37ºC durante 1 hora antes de ser colocada en
placas en agar-agar YT que contenían 25 \mug/ml de
kanamicina. La placa se incubó durante la noche a 37ºC y se
utilizaron colonias aisladas para estudios de expresión.
Se cultivaron clones individuales en medio NZCYM
a una A_{600\ nm} de aproximadamente 0,3 y se añadió lactosa al
1% para producir la expresión. Se cultivaron las células durante 4
horas, se recogieron a continuación y se analizaron por SDS PAGE.
Se seleccionó el clon
DS-2171-1-1 como
clon representativo que expresa altos niveles de H91 A Hin47.
La E. coli que contenía
DS-2171-1-1 se
cultivó en matraces 2 \times 2 l que contenían 250 ml de ECGM (que
contenía 8 g/l de glucosa, pH 6,5) y se incubó agitando a 37ºC
durante aproximadamente 9 horas a la oscuridad a 250 rpm. Se
inoculó el fluido de cultivo (2 \times 250 ml) en un fermentador
de 10 l y se desarrolló el cultivo a 37ºC. Después de
aproximadamente 10 horas de incubación, se añade lactosa al 1%
(concentración final) para inducción, seguido de una incubación de
4 horas adicionales.
Se recogió el fluido de cultivo en botellas de
transferencia estériles, se concentró y se filtró por diálisis en
flujo cruzado frente a tampón Tris/HCl 50 mM, pH 8,0. Las células en
el concentrado se lisan utilizando un homogeneizador a alta presión
(2 pasadas 15.000 psi) para liberar la proteína H91 A Hin47. El
residuo celular se eliminó por centrifugación a 15.000 rpm durante
1,5 horas. El sobrenadante se clarificó más por centrifugación y se
filtró a través de un filtro sin salida de 0,22 \mum. Los
productos pueden almacenarse congelados a -70ºC hasta el
tratamiento ulterior.
Se añadió cloruro sódico (NaCl) a la muestra
clarificada hasta una concentración final de 100 mM. La muestra se
purificó a continuación en una columna de cromatografía por
intercambio aniónico (TMAE-Fractogel) equilibrada
con Tris 50 mM pH 8,0 que contiene NaCl 100 mM. La proteína H91 A
Hin47 se obtuvo en el ensayo preliminar.
Se cargó la capa acuosa en una columna de
hidroxiapatito cerámico tipo 1 (CHTP-1) equilibrada
con tampón de fosfato sódico 10 mM pH 8,0. La columna se lavó a
continuación con tampón fosfato sódico 150 mM pH 8,0 y la H91 A
Hin47 se eluyó con tampón de fosfato sódico 175 mM, pH 8,0 que
contenía NaCl 1 M.
La proteína purificada H91A Hin47 se concentró
utilizando una membrana para corte a peso molecular 10 kDa seguido
de filtración por diálisis con aproximadamente 10 volúmenes de
solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,5.
La proteína H91 A Hin47 purificada en PBS se
pasó a través de un adsorbedor de membrana Q600 Sartobind. Después
de pasar la solución, se regeneró la membrana utilizando KCl 1,0
M/NaOH 1,0 M seguido de lavado con KCl 1 M equilibrando a
continuación con PBS. El procedimiento se repitió dos veces. La
proteína H91 A Hin47 filtrada por diálisis concentrada se filtró
esterilizada a través de un filtro con membrana de 0,22 \mum. La
proteína H91 A Hin47 esterilizada se enriqueció con fosfato de
aluminio. El concentrado purificado adsorbido se diluyó para
producir la masa adsorbida a 400 \mug/ml.
Este Ejemplo describe la preparación del
componente rHMW de la vacuna.
La producción y purificación de la proteína rHMW
se ha descrito en el documento WO 00/20609, publicado el 13 de
abril de 2000.
En resumen, el plásmido pHMW1-15
(ref. 13) contiene una secuencia XbaI en la secuencia del
activador T7 y una secuencia única BamHI en la secuencia de
codificación de la proteína HMW1A madura de la cepa 12 de
Haemophilus no tipificable. El fragmento
XbaI-BamHI de 1,8 kb del pHMW1-15 se
eliminó y se sustituyó por un fragmento XbaI-BamHI de
114 bp generado a partir de oligonucleótidos. El plásmido
DS-1046-1-1 de 11,3
kb resultante, por lo tanto contiene el activador T7 unido al marco
con el operón hmw1ABC que codifica la proteína madura HMW1A
de 125 kDa (Figura 12).
El plásmido
DS-1046-1-1 contiene
la casete del gen T7hmw1ABC y tiene una única secuencia
BglII fuera de la zona de codificación del gen HMW1A maduro.
El plásmido
DS-2224-1-4 contiene
el gen cer de E. coli situado en un fragmento de
BamHI. Este fragmento se aisló y se ligó en la secuencia
BglII del plásmido
DS-1046-1-1 para
producir el plásmido BK-35-4 (Fig.
12). La casete con resistencia a kanamicina se escindió de pUC 4K
por la restricción SalI y se ligó en el plásmido
BK-35-4 restringido por Sal I
para producir el plásmido
BK-76-1-1 (Fig.
12).
Se preparó el ADN plásmido de
BK-76-1-1 procedente
de un cultivo de 50 ml que utiliza un protocolo basado en el
procedimiento de Holmes y Quigley (ref. 23) y que incluye
extracciones con fenol y cloroformo. El ADN plásmido se introdujo
en células BL21 (DE3) de E. coli por electroporación
utilizando un aparato de BioRad. Se cultivaron las cepas a 37ºC en
medio NZCYM a una densidad óptica de A_{578} = 0,3, a continuación
se estimularon mediante adición de lactosa al 1,0% durante 4 horas.
Las muestras se ajustaron a 0,2 D.O./\mul con lisis por
SDS-PAGE + tampón de carga y la misma cantidad de
muestra de proteína se cargó en geles SDS-PAGE. Se
seleccionó el clon
BK-116-1-1 como clon
representativo que expresaba buenos niveles de rHMW.
La proteína HMW recombinante se expresó como
cuerpos de inclusión en E. coli, y se purificó de la forma
siguiente. Los sedimentos celulares de E. coli de 500 ml de
cultivo se volvieron a poner en suspensión en 50 ml de
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, que contenían NaCl 0,1 M y
se descompusieron por tratamiento con ultrasonidos. El extracto se
centrifugó a 20.000 g durante 30 min. y se descartó el sobrenadante
resultante. El sedimento se continuó extrayendo en 50 ml de
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 que contenía Triton
X-100 al 0,5% y EDTA 10 mM, a continuación se
centrifugó a 20.000 g durante 30 min y se descartó el sobrenadante.
El sedimento se continuó extrayendo en 50 ml de
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 que contenía octilglucósido
al 1%, a continuación se centrifugó a 20.000 g durante 30 min y se
descartó el sobrenadante.
El sedimento resultante, obtenido tras las
extracciones anteriores, contiene los cuerpos de inclusión. El
sedimento se solubilizó en 6 ml de Tris-HCl 50 mM,
pH 8,0, que contenía guanidina 6 M y DTT 5 mM. Se añadieron 12 ml
de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 a esta solución y la
mezcla se centrifugó a 20.000 g durante 30 min. El sobrenadante se
precipitó con polietilenglicol (PEG) 4000 a una concentración final
de 7%. El sedimento resultante se eliminó por centrifugación a
20.000 g durante 30 min y el sobrenadante se precipitó mediante
(NH_{4})_{2}SO_{4} a 50% de saturación. Tras la
adición de (NH_{4})_{2}SO_{4} la solución experimentó
la separación de fases yendo la proteína a la fase superior, la
cual se sometió a continuación a centrifugación a 20.000 g durante
30 min. El sedimento resultante se disolvió en 2 ml de
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, que contenía guanidina HCl
6 M y DTT 5 mM y la solución transparente se purificó en una columna
de filtración en gel Superdex 200 equilibrada en
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, que contenía guanidina HCl 2
M. Se analizaron las fracciones por SDS-PAGE y las
que contenían la rHMW1 purificada se agruparon y se dializaron
durante la noche a 4ºC frente a PBS, a continuación se
centrifugaron a 20.000 g durante 30 min. La proteína permaneció
soluble en estas condiciones y se añadió glicerol a la preparación
rHMW1 a una concentración final del 20% para almacenaje a -20ºC.
La concentración del componente de la vacuna
rHMW se ajustó a 400 \mug ml^{-1} en PBS (pH 7,3) y se
enriqueció con fosfato de aluminio hasta una concentración final de
3 \mug ml^{-1}. Se prepararon diferentes dosis diluyendo la
solución madre con 3 \mug ml^{-1} de fosfato de aluminio en
agua.
Este Ejemplo ilustra la preparación del
componente rHia de la vacuna.
En resumen, el plásmido
DS-1843-2 es un plásmido a base de
pBR328 en el que se ha introducido una secuencia de clonación
múltiple y dos terminadores de transcripción en oligonucleótidos,
entre las secuencias EcoRI y PstI, destruyendo de
este modo los genes con resistencia tanto al cloranfenicol como a la
ampicilina (Fig. 6B). El gen con resistencia a la kanamicina
procedente del pUC-4K se insertó en la secuencia
Sal I, para generar los plásmidos
DS-2147-1 que son resistentes a la
kanamicina y sensibles a la tetraciclina. El plásmido
DS-2224-1-4 es un
plásmido pUC que contiene el gen sintético cer de E. coli
(ref. 15) construido a partir de oligonucleótidos y flanqueado por
secuencias BamHI. El fragmento BamHI de 290 bp del gen
cer se insertó en la secuencia BamHI de
DS-2147-1 creando el plásmido
BK-2-1-2. Este
plásmido basado en pBR contiene por lo tanto una secuencia de
clonación múltiple, el gen con resistencia a kanamicina y el gen
cer. El plásmido
BK-2-1-2 se
linealizó con Bgl II y se desfosforiló. El plásmido
DS-2186-2-1 se
digirió con BglII y BamHI y el fragmento T7 V38
hia de 3,6 kb se insertó en
BK-2-1-2, creando el
plásmido BK-96-2-11
(Fig. 13).
Se preparó el ADN plásmido de
BK-96-2-11
procedente de un cultivo de 50 ml que utiliza un protocolo basado
en el procedimiento de Holmes y Quigley (ref. 23) y que incluye
extracciones con fenol y cloroformo. El ADN plásmido se introdujo
en células BL21 (DE3) de E. coli electrocompetentes por
electroporación utilizando un electroporador de BioRad. Se
cultivaron las cepas a 37ºC en medio NZCYM utilizando la selección
de antibióticos apropiada a una densidad óptica de A_{578} de 0,3
antes de la inducción mediante adición de lactosa al 1,0% durante 4
horas. Las muestras se ajustaron a 0,2 D.O./\mul con lisis por
SDS-PAGE + tampón de carga y la misma cantidad de
muestra de proteína se cargó en geles SDS-PAGE. Se
seleccionó el clon
BK-131-1-1 como clon
representativo que expresaba buenos niveles de V38 rHia (Fig.
13).
La proteína Hia truncada recombinante se expresó
como cuerpos de inclusión en E. coli, y se purificó de la
forma siguiente. Los sedimentos celulares de E. coli de 500
ml de cultivo se volvieron a poner en suspensión en 50 ml de
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, que contenían NaCl 0,1 M y
se descompusieron por tratamiento con ultrasonidos. El extracto se
centrifugó a 20.000 g durante 30 min. y se descartó el sobrenadante
resultante. El sedimento se continuó extrayendo en 50 ml de
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 que contenía Triton
X-100 al 0,5% y EDTA 10 mM, a continuación se
centrifugó a 20.000 g durante 30 min y se descartó el sobrenadante.
El sedimento se continuó extrayendo en 50 ml de
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 que contenía octilglucósido
al 1%, se centrifugó a continuación a 20.000 g durante 30 min y se
descartó el sobrenadante.
El sedimento resultante, obtenido tras las
extracciones anteriores, contiene los cuerpos de inclusión. El
sedimento se disolvió en 6 ml de Tris-HCl 50 mM, pH
8,0, que contenía guanidina 6 M y DTT 5 mM. Se añadieron 12 ml de
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 a esta solución y la mezcla
se centrifugó a 20.000 g durante 30 min. El sobrenadante se
precipitó con polietilenglicol (PEG) 4000 a una concentración final
de 7%. El sedimento resultante se eliminó por centrifugación a
20.000 g durante 30 min y el sobrenadante se precipitó mediante
(NH_{4})_{2}SO_{4} a 50% de saturación. El precipitado
de (NH_{4})_{2}SO_{4} se recogió a continuación a
centrifugación a 20.000 g durante 30 min. El sedimento resultante
se disolvió en 2 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, que
contenía guanidina HCl 6 M y DTT 5 mM y la solución transparente se
purificó en una columna de filtración en gel Superdex 200
equilibrada en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, que contenía
guanidina HCl 2 M. Se analizaron las fracciones por
SDS-PAGE y las que contenían la rHia purificada se
agruparon y se dializaron durante la noche a 4ºC frente a PBS, a
continuación se centrifugaron a 20.000 g durante 30 min. La proteína
permaneció soluble en estas condiciones y se añadió glicerol a la
preparación rHia a una concentración final del 20% para almacenaje a
-20ºC.
La concentración del componente rHia de la
vacuna se ajustó a 400 \mug ml^{-1} en PBS (pH 7,3) y se
enriqueció con fosfato de aluminio hasta una concentración final de
3 mg ml^{-1}. Se prepararon diferentes dosis diluyendo la
solución madre con 3 mg ml^{-1} de fosfato de aluminio en
H_{2}O.
Este Ejemplo ilustra la preparación del
componente r200 kDa de la vacuna.
La patente US nº 5.808.024, cedida a su
cesionario y el documento WO 96/34960 describen el aislamiento de
un banco genómico de M. catarrhalis en el fago lambda, un
clon 8II del fago lambda que expresa la proteína de aproximadamente
200 kDa. Se extrajo ADN y se preparó una serie de vectores de
plásmido a partir de fragmentos de ADN. Se construyó el plásmido
pKS348 como se muestra esquemáticamente en las Figuras 14 y 14B. El
plásmido pKS47, que contiene un fragmento KpnI/XhoI
de 1,1 kb, se digirió con XhoI y KpnI y se separó por
electroforesis en gel de agarosa. Se aisló el fragmento de 1,1 kb
del gel y se insertó en el plásmido pKS5 que contiene un fragmento
XhoI/SalI de 4,9 kb, que había sido digerido
anteriormente con las mismas dos enzimas y se purificó para formar
pKS80. Un fragmento PstI de aproximadamente 5,8 kb de pKS80
se insertó en el vector pT7-7 (ref. 24) que había
sido digerido con PstI y se desfosforiló. La orientación de
la inserción se determinó mediante análisis con enzima de
restricción y se seleccionó el pKS122 para la construcción ulterior
(véase la Figura 14A).
Una zona 5' de aproximadamente 500 bp del gen de
200 kDa se amplió por PCR a partir de la cepa 4223 de M.
catarrhalis del ADN cromosómico utilizando los cebadores 5471.KS
(CGCTCGCTGTCCATATGATCGGTGCAACGCTCA - SEC. ID. nº 2) y 4257.KS
(GACCCTGTGCATATGACATGGCT - SEC. ID. nº 3). El producto de PCR se
digirió con NdeI purificado e insertado en NdeI
digerido y pKS122 desfosforilado para proporcionar pKS348 (véase la
Figura 14B). El plásmido pKS348 fue confirmado por análisis con
enzima de restricción y secuenciando la pieza de ADN ampliada por
PCR y sus zonas de unión. Dicho plásmido contiene ácido nucleico
que codifica una proteína truncada en N de aproximadamente 200 kDa
en la que el codón que codifica el aminoácido V56 está sustituido
por un codón de iniciación que codifica el aminoácido M56 (proteína
M56 r200 kDa).
\newpage
Una colonia aislada de E. coli, BL21
(DE3)/pLysS, (KS358) que transportó el pKS348, se puso en suspensión
en 5 ml de caldo de cultivo BHI que contenía Amp (100 \muM) y
0,4% de glucosa y se cultivó durante la noche a 37ºC. Se añadieron
2,5 ml de cultivo de la noche a 250 ml de LB caldo de cultivo
(Luria-Bertani) que contiene Amp (100 \muM) y Cm
(50 \muM) y se cultivó en agitación a 37ºC a A_{600}=0,26 a
0,44. Se provocó la expresión génica de los cultivos por adición de
IPTG (concentración final: 4 mM). Las bacterias se cultivaron y se
recogieron a diferentes puntos de tiempo por centrifugación. La
expresión del gen de la proteína de 200 kDa en el cultivo se
confirmó por análisis de SDS-PAGE utilizando tinción
de azul Coomassie y por análisis de transferencia Western
utilizando suero de proteína anti-200 kDa de cobaya,
tal como se describe en la patente US nº 5.808.024 y en el
documento
WO 96/34960.
WO 96/34960.
Cuando se transformó BL21 (DE3)/pLysS de E.
coli con pKS348, los transformantes se desarrollaron bien
incluso en placas de agar-agar LB y en caldo de
cultivo LB que contenía antibióticos a 37ºC. Después de la inducción
con IPTG, estos clones produjeron una gran cantidad de proteína
r200 kDa truncada en el terminal N. La proteína r200 kDa truncada
en el terminal N se purificó en el cultivo de E. coli, tal
como se muestra en la Figura
13.
13.
Se obtuvieron sedimentos celulares de E.
coli de cultivos preparados por centrifugación y se volvieron a
poner en suspensión en 50 ml de Tris-HCl 50 mM, pH
8,0, que contenía NaCl 0,1 M y se descompusieron mediante
tratamiento con ultrasonidos. El producto tratado con ultrasonidos
se centrifugó a 20.000 \times g durante 30 min. y se descartó el
sobrenadante resultante. El sedimento se extrajo en 50 ml de
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 que contenía Triton
X-100 al 0,5% y EDTA 10 mM, a continuación se
centrifugó a 20.000 \times g durante 30 min. y se descartó el
sobrenadante. Se extrajo más el sedimento en 50 ml de
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, que contenía glucósido de
octilo al 1%, a continuación se centrifugó a 20.000 \times g
durante 30 min. y se descartó el sobrenadante.
El sedimento resultante contenía los cuerpos de
inclusión. El sedimento se solubilizó en 6 ml de
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, que contenía guanidina 6 M
y DTT 5 mM. Se añadieron 12 ml de Tris-HCl 50 mM, pH
8,0 a esta solución y la mezcla se centrifugó a 20.000 g durante 30
min. y se descartó el sobrenadante. El sobrenadante se precipitó
añadiendo polietilenglicol (PEG) 4000 a una concentración final de
5% y se incubó a 4ºC durante 30 min. El sedimento resultante se
eliminó por centrifugación a 20.000 x g durante 30 min. El
sobrenadante se precipitó a continuación mediante
(NH_{4})_{2}SO_{4} a 60% de saturación a 4ºC durante la noche. Después de la adición de (NH_{4})_{2}SO_{4}, la solución experimentó la separación de fases yendo la proteína a la fase superior (considerada por la turbidez de la capa). Se recogió la fase superior, a continuación se sometió a centrifugación a 20.000 x g durante 30 min. El sedimento resultante se recogió y se disolvió en 2 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, que contenía guanidina HCl 6 M y DTT 5 mM. La solución transparente se purificó en una columna de filtración en gel Superdex 200 equilibrada en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, que contenía guanidina HCl 2 M. Se analizaron las fracciones por SDS-PAGE y las que contenían la r200 kDa purificada se agruparon. La fracción agrupada se concentró 5 a 10 veces utilizando una centriprep 30 y a continuación se dializaron durante la noche a 4ºC frente a PBS, y se centrifugaron a 20.000 x g durante 30 min para
clarificar.
(NH_{4})_{2}SO_{4} a 60% de saturación a 4ºC durante la noche. Después de la adición de (NH_{4})_{2}SO_{4}, la solución experimentó la separación de fases yendo la proteína a la fase superior (considerada por la turbidez de la capa). Se recogió la fase superior, a continuación se sometió a centrifugación a 20.000 x g durante 30 min. El sedimento resultante se recogió y se disolvió en 2 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, que contenía guanidina HCl 6 M y DTT 5 mM. La solución transparente se purificó en una columna de filtración en gel Superdex 200 equilibrada en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, que contenía guanidina HCl 2 M. Se analizaron las fracciones por SDS-PAGE y las que contenían la r200 kDa purificada se agruparon. La fracción agrupada se concentró 5 a 10 veces utilizando una centriprep 30 y a continuación se dializaron durante la noche a 4ºC frente a PBS, y se centrifugaron a 20.000 x g durante 30 min para
clarificar.
La proteína permaneció soluble en estas
condiciones y se añadió glicerol a la preparación M56 r200 kDa a una
concentración final del 20% para almacenaje a -20ºC. El rendimiento
medio de la proteína purificada M56 r200 kDa es aproximadamente de
10 mg l^{-1} de cultivo.
La concentración del componente r200 kDa de la
vacuna se ajustó a 400 \mug ml^{-1} en PBS (pH 7,3) y se
enriqueció con fosfato de aluminio hasta una concentración final de
3 mg ml^{-1}. Se prepararon diferentes dosis diluyendo la
solución madre con 3 mg ml^{-1} de fosfato de aluminio en
H_{2}O.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Este Ejemplo describe la combinación de H91 A
Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa como una vacuna de cuatro
componentes.
En resumen, se prepararon vacunas que
comprendían la combinación de rHia con una vacuna de dos componentes
H91 A Hin47 y rHMW, preparada tal como se describe en el documento
WO 00/35477 publicado el 22 de junio de 2000. Se combinaron los
componentes el día 0, se mezclaron durante la noche a 4ºC y se
tomaron alícuotas el día 1. Las vacunas combinadas se almacenaron a
4ºC durante todo el periodo de inmunización.
Se prepararon vacunas que comprendían las
siguientes combinaciones de r200 kDa con la vacuna de tres
componentes como en la Tabla II:
| Notas: | 3 componentes se refiere a H91 A Hin47 + rHMW + rHia |
| m indica que la vacuna se utilizó para inmunizar ratones. | |
| gp indica que la vacuna se utilizó para inmunizar cobayas. |
Los componentes de la vacuna en la Tabla II se
combinaron el día 0, se mezclaron durante la noche a 4ºC y se
tomaron alícuotas el día 1. Todas las vacunas se almacenaron a 4ºC
durante todo el periodo de inmunización.
Este Ejemplo describe el análisis de la
inmunogenicidad de las vacunas multicomponentes en animales.
La inmunogenicidad de una vacuna de tres
componentes compuesta por H91A Hin47 + rHMW + rHia se ha descrito
en la solicitud de patente US nº 09/261.182 pendiente de trámite
mencionada anteriormente.
Grupos de cinco ratones BALB/c (Charles River,
Quebec) se inmunizaron por vía subcutánea (s.c.) los días 1, 29 y
43 con una de las vacunas para ratones descrita en el Ejemplo 5. Se
extrajeron muestras de sangre los días 0, 14, 28, 42 y 56.
Grupos de cinco cobayas Hartley no consanguíneos
(Charles River, Quebec) se inmunizaron por vía intramuscular (i.m.)
los días 1, 29 y 43 con una de las vacunas para cobayas descritas en
el Ejemplo 5. Se extrajeron muestras de sangre los días 0, 14, 28,
42 y 56.
Se determinaron los títulos de los anticuerpos
anti-H91 A Hin47, anti-rHMW,
anti-rHia y anti-r200 kDa IgG por
ensayos de inmunosorbente ligado a la enzima específica para el
antígeno (ELISA). Pocillos de microvaloración (NuncMAXISORB, Nunc,
Dinamarca) se recubrieron con 100 \mul de solución de proteína
(0,2 \mug ml^{-1}). Los anticuerpos secundarios utilizados eran
fragmentos F(ab')_{2} purificados por afinidad de IgG
antirratón de cabra (específico para Fc) o anticuerpos IgG
anti-cobaya (específico para Fc) conjugados con
peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Labs,
Mississauga, Ontario). Se desarrollaron las reacciones utilizando
tetrametilbencidina (TMB/H_{2}O_{2}, ADI, Mississauga, Ontario)
y se midieron las absorbancias a 450 nm (utilizando 540 nm como
longitud de onda de referencia) en un lector de microplacas MCC de
Flor Multiskan (ICN Biomedicals, Mississauga, Ontario). El título
reactivo de un antisuero se definió como el recíproco de la
dilución que muestra constantemente un aumento al doble de la
absorbancia sobre el obtenido con la muestra de suero extraída
previamente.
Los resultados de los estudios de
inmunogenicidad se ilustran en las Figuras 1 a 8. Como se muestra en
la Figura 1, paneles A y B, el suero de la extracción final
obtenido de ratones inmunizados con 0,3 \mug o 3,0 \mug de cada
H91 A Hin47 + rHMW + rHia con 0, 0,3, 1,0, 3,0 ó 10,0 \mug de r200
kDa añadido, todos tenían títulos altos de anticuerpo para el
componente H91 A Hin47. Con la dosis baja la vacuna de tres
componentes, puede existir un efecto sinérgico en la respuesta
primaria anti-H91 A Hin47 con r200 kDa añadido.
Como se muestra en la Figura 2, paneles A y B,
el suero de extracción final obtenido de ratones inmunizados con 3
\mug de cada H91 A Hin47 + rHMW + rHia con 0, 0,3, 1,0, 3,0 ó 10,0
\mug de r200 kDa añadido, todos tenían anticuerpos con valor alto
para el componente rHMW. La vacuna a baja dosis fue poco inmunógena.
No hubo mejora o efecto de inhibición aparentes en la respuesta a
anti-rHMW con la adición del componente r200
kDa.
Como se muestra en la Figura 3, paneles A y B,
el suero de extracción final obtenido de ratones inmunizados con 3
\mug de cada H91 A Hin47 + rHMW + rHia con 0, 0,3, 1,0, 3,0 ó 10,0
\mug de r200 kDa añadido, todos tenían anticuerpos con valor alto
contra el componente rHia. No hubo mejora o efecto de inhibición
aparentes en la respuesta a anti-rHia con la
adición del componente r200 kDa.
Como se muestra en la Figura 4, paneles A a D,
el suero de extracción final obtenido de ratones inmunizados con 10
\mug de r200 kDa añadido a 0, 0,3, ó 3,0 \mug de cada H91 A
Hin47 + rHMW + rHia, todos tenían anticuerpos con título alto
contra el componente r200 kDa. No hubo mejora o efecto de inhibición
aparentes en la respuesta a anti-r200 kDa con la
adición de los demás componentes de la vacuna. Sin embargo, a dosis
menores de r200 kDa, la vacuna fue poco inmunógena y a la dosis de
1,0 \mug, existe un efecto inhibidor de los componentes añadidos
a la respuesta a anti-r200 kDa.
Los datos en ratones demuestran que la
naturaleza preferida de la composición de una vacuna multicomponente
impidiendo la supresión a las respuestas a antígenos
individuales.
La inmunogenicidad en cobayas se ilustra en las
Figuras 5 a 8. Como se muestra en la Figura 5, paneles A y B, el
suero de extracción final obtenido de cobayas inmunizados con 25
\mug o 50 \mug de cada H91 A Hin47 + rHMW + rHia con 0, 25, 50
ó 100 \mug de r200 kDa añadido, tenían en su totalidad anticuerpos
con título alto contra el componente H91 A Hin47. No hubo mejora o
efecto de inhibición aparentes en la respuesta a
anti-H91 A Hin47 con la adición del antígeno r200
kDa.
Como se muestra en la Figura 6, paneles A y B,
el suero de extracción final obtenido de cobayas inmunizados con 25
\mug o 50 \mug de cada H91 A Hin47 + rHMW + rHia con 0, 25, 50 ó
100 \mug de r200 kDa añadido, tenían en su totalidad anticuerpos
con título alto contra el componente rHMW. No hubo mejora o efecto
de inhibición aparentes en la respuesta a anti-rHMW
con la adición del antígeno r200 kDa.
Como se muestra en la Figura 7, paneles A y B,
el suero de extracción final obtenido de cobayas inmunizados con 25
\mug o 50 \mug de cada H91 A Hin47 + rHMW + rHia con 0, 25, 50 ó
100 \mug de r200 kDa añadido, tenían en su totalidad anticuerpos
con título alto contra el componente rHia. No hubo mejora o efecto
de inhibición aparentes en la respuesta a anti-rHia
con la adición del antígeno r200 kDa.
Como se muestra en la Figura 8, paneles A, B y C
el suero de extracción final obtenido de cobayas inmunizados con
25, 50 ó 100 \mug de r200 kDa con 0, 25 ó 50 \mug añadido de
cada H91 A Hin47 + rHMW + rHia, tenían en su totalidad anticuerpos
con título alto contra el componente r200 kDa. No hubo efecto
estadísticamente significativo sobre los títulos del anticuerpo
anti-r200 kDa para alguna de las extracciones
intermedias, al aumentar las cantidades de los demás componentes
añadidos. Sin embargo, no hubo ningún efecto significativo sobre
las extracciones finales.
Este Ejemplo describe la capacidad protectora de
una vacuna multicomponente en los modelos animales de la
enfermedad.
En chinchillas jóvenes, se ha demostrado que la
colonización nasofaríngea con H. influenzae no tipificable
conduce a la otitis media (ref. 17). rHMW es parcialmente protectora
en un modelo de prueba de provocación de colonización nasofaríngea,
tal como se describe en la solicitud de patente US 09/167.568
mencionada anteriormente. En este modelo, se inmunizan i.m. los
animales los días 0, 14 y 28 con 25, 50 ó 100 \mug de rHMW
adsorbida en alúmina, y se someten a prueba de provocación el día
44 con 10^{8} cfu de bacterias vivas administradas por vía
intranasal (50 \mul por nariz). El lavado nasofaríngeo se realiza
4 días después de la prueba de provocación utilizando 1 ml de
solución salina como lavado. Se colocan en placas 25 \mul de
lavado en agar-agar con chocolate en presencia de
estreptomicina y se incuban las placas a 37ºC durante 24 h. (La cepa
de la prueba de provocación se hizo resistente a la estreptomicina
por pasadas en serie, para facilitar la cuantificación de las
bacterias recuperadas en presencia de la flora natural que es
destruida por la estreptomicina). Se utilizan como referencias
animales convalecientes o los pseudoinmunizados con sólo alúminas.
Para el estudio de la vacuna multicomponente, se mezclaron 50
\mug de cada H91 A Hin47, rHMW, rHia y r200 kDa tal como se
describe en el Ejemplo 5 y se inmunizaron las chinchillas tal como
se describió anteriormente. Los resultados del estudio de
protección se presentan en la Figura 9 que indica que existe todavía
excelente protección proporcionada en el modelo de la prueba de
provocación de colonización nasofaríngea por la combinación de rHMW
+ rHia + H91 A Hin47 + r200 kDa.
H91 A Hin47 es parcialmente protectora en el
modelo de chinchilla de la otitis media, tal como se describió en
la patente US nº 5.506.139 mencionada anteriormente. En este modelo,
chinchillas de 1 a 2 años (Moulton Chinchilla Ranch, Rochester,
Minnesota) se inmunizan i.m. los días 0, 14 y 28 con 30 \mug de
H91 A Hin47 adsorbida en alúmina, y se sometieron a la prueba de
provocación el día 44 con 50 a 350 cfu de organismos vivos
administrados en el espacio del oído medio por la vesícula
epitimpánica (ref. 14). Los animales se controlan por timpanometría
y se recoge fluido del oído medio 4 días después de la prueba de
provocación, se mezcla con 200 \mul de medio BHI y las diluciones
se colocan en placas de agar-agar con chocolate que
se incuban durante 24 h a 37ºC. Se utilizan como referencias
animales convalecientes o los pseudoinmunizados con alúmina solo.
Para el estudio de la vacuna multicomponente, se combinaron 50
\mug de cada H91 A Hin47, rHMW, rHia y r200 kDa tal como se
describe en el Ejemplo 5 y se inmunizaron las chinchillas tal como
se describió anteriormente. Los resultados del estudio de
protección se presentan en la Figura 10 que indica que existe
todavía protección parcial proporcionada en el modelo de la prueba
de provocación intravesicular por la combinación de rHMW + rHia +
H91 A Hin47 + r200 kDa.
Este Ejemplo ilustra las propiedades
bactericidas de la composición.
No existe ningún modelo animal aplicable para la
infección por Moraxella catarrhalis pero se ha desarrollado
un ensayo bactericida de anticuerpos como un ensayo sustituto. En
resumen, se cultivó la cepa 4223 de M. catarrhalis durante
la noche en caldo de cultivo de infusión térmica de cerebro (BHI)
(Difco Laboratories, Detroit, MI) a 37ºC. El cultivo de la noche se
subcultivó en 10 ml de caldo de cultivo BHI y se desarrolló a
A_{528}=0,5.
Se diluyeron las bacterias (10^{-3} ó
10^{-4}) en solución salina tamponada Veronal (VBS, pH 7,6) que
contenía NaCl 140 mM, NaHCO_{3} 93 mM, barbiturato sódico 2 mM,
ácido barbitúrico 4 mM, MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 0,5 mM,
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O 0,4 mM y albúmina de suero bovino al
0,1%. Se calentaron suero anti-r200 kD de cobaya y
suero de referencia preinmunitario a 56ºC durante 30 min. para
inactivar el complemento endógeno. El suero y el antisuero se
diluyeron en VBS y se colocaron en hielo.
Se añadieron 25 \mul de suero preinmune
diluido o antisuero de ensayo a los pocillos de una placa de
microvaloración Nuncion de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca).
Se añadieron 25 \mul de células bacterianas diluidas a cada uno
de los pocillos. Se diluyó 1:10 en VBS un complemento para cobayas
(BioWhittaker, Walkerville, MD), y se añadieron porciones de 25
\mul a cada pocillo. Se incubaron las placas durante 60 min.,
agitando suavemente a 70 rpm en una plataforma rotatoria. Se
colocaron en placas de agar-agar Mueller Hinton
(Becton-Dickinson, Cockeysville, MD) 50 \mul de
cada mezcla de reacción. Las placas se incubaron a 37ºC durante 24
horas y a continuación se dejaron a temperatura ambiente durante 24
horas más. Se hizo el recuento del número de colonias por placa y
se estimaron los valores promediados de las colonias por placa en
pares por duplicado.
Cuando se comparan las placas de suero preinmune
con las placas de referencia de PBS (sin suero), el suero preinmune
no presentaba ningún efecto bactericida sobre la cepa homóloga 4223.
Por consiguiente, se supone que el número de colonias por placa en
las placas de suero preinmune representaba el 100% de viabilidad
para cada cepa y se calculó el porcentaje de destrucción
bactericida de la manera siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
100% -
\frac{[número \ promedio \ de \ colonias \ por \ placa \ en \
grupo \ de \ antisuero \ anti \ r200 \ kD \ x \
100%]}{número \ promedio \ de \ colonias \ por \ placa \ en \
grupo \ de \ suero \
preinmune}
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando este análisis, se compararon la
actividad relativa del anticuerpo bactericida de los antisueros
anti-r200 kDa y anti-4 componentes
(H91 A Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa) y se descubrió que eran
equivalentes. Estos datos, publicados en las Tablas III y IV a
continuación, indican que no existe ningún efecto desfavorable
sobre la actividad bactericida del anticuerpo
anti-r200 kDa cuando están presentes anticuerpos
contra antígenos
adicionales.
adicionales.
En el sumario de esta exposición, la presente
invención proporciona una vacuna multivalente contra la enfermedad
producida tanto por Haemophilus influenzae como por
Moraxella catarrhalis, incluyendo la otitis media, que
presenta un amplio espectro de eficacia y que comprende tres
antígenos diferentes de Haemophilus influenzae, dos de cuyos
antígenos diferentes son una adhesina y un antígeno de Moraxella
catarrhalis, que está relacionado antigénicamente con uno de
los antígenos de Haemophilus influenzae. Es posible
introducir modificaciones dentro del alcance de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
| LM613, 11.12.98 | |
| Referido a log_{10} = -4 dilución de 4223 | |
| El recuento medio de colonias de la extracción previa fue 482 |
| LM615, 16.12.98 | |
| El recuento promedio de colonias extraídas previamente a dilución log_{10}-4 de 4223 fue 720 | |
| El recuento promedio de colonias extraídas previamente a dilución log_{10}-3 fue 58 |
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Claims (19)
1. Composición inmunógena multivalente para
proporcionar protección en un huésped contra la enfermedad
provocada tanto por Haemophilus influenzae como por
Moraxella catarrhalis, caracterizada por:
por lo menos por cuatro antígenos diferentes que
comprenden por lo menos un antígeno procedente de Haemo-
philus influenzae y por lo menos un antígeno procedente de
Moraxella catarrhalis, siendo por lo menos tres de dichos
antígenos adhesinas y por lo menos uno de dichos antígenos procede
de Moraxella catarrhalis.
2. Composición inmunógena según la
reivindicación 1, en la que uno de dichos antígenos que es una
adhesina es una proteína de alto peso molecular (HMW) de una cepa
no tipificable de Haemophilus influenzae, preferentemente
una proteína HMW1 o HMW2 de la cepa no tipificable de Haemophilus
influenzae, preferentemente producida de manera
recombinante.
3. Composición inmunógena según la
reivindicación 2, en la que dichas proteínas HMW1 y HMW2 derivan de
la cepa respectiva de Haemophilus influenzae no tipificable y
poseen los pesos moleculares respectivos indicados en la Tabla
siguiente:
4. Composición inmunógena según la
reivindicación 1 ó 2, en la que otro de los antígenos que es una
adhesina es una proteína adhesina de Haemophilus influenzae
(Hia) de una cepa no tipificable de Haemophilus influenzae o
de una proteína fibrilar de superficie de Haemophilus
influenzae (Hsf) de una cepa tipificable de Haemophilus
influenzae, producida preferentemente de manera
recombinante.
5. Composición inmunógena según la
reivindicación 4, en la que dicha proteína Hia producida de manera
recombinante es una V38 rHia con truncamiento en el terminal N.
6. Composición inmunógena según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en la que un antígeno de Haemophilus
influenzae que no es una adhesina es una proteína no
proteolítica de choque térmico de una cepa de Haemophilus
influenzae, preferentemente un análogo de la proteína Hin47 de
Haemophilus influenzae que presenta una actividad disminuida
de proteasa que es inferior al 10% de la que presenta la proteína
natural Hin47.
7. Composición inmunógena según la
reivindicación 6, en la que dicho análogo de la proteína Hin47 es
uno en el que por lo menos un aminoácido de la proteína Hin47
natural que contribuye a la actividad de la proteasa se ha
eliminado o sustituido por un aminoácido diferente y que presenta
sustancialmente las mismas propiedades inmunógenas que la proteína
natural Hin47.
8. Composición inmunógena según la
reivindicación 7, en la que dicho por lo menos un aminoácido se
selecciona de entre el grupo constituido por los aminoácidos 91,
121 y 195 a 207 de la proteína Hin47 natural, preferentemente la
serina-197 se sustituye por alanina, la
histidina-91 se sustituye por alanina, lisina o
arginina y Asp-121 se sustituye por alanina.
9. Composición inmunógena según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, en la que uno de dichos antígenos que
es una adhesina es una proteína de la membrana externa de
Moraxella catarrhalis que presenta una masa molecular
aparente de 200 kDa, como se ha determinado por
SDS-PAGE, producida preferentemente de manera
recombinante.
10. Composición inmunógena según la
reivindicación 9, en la que la proteína de 200 kDa producida de
manera recombinante es una V56 r200 kDa con truncamiento en el
terminal N.
11. Composición inmunógena según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, que comprende:
- (a)
- un análogo de la proteína Hin47 de Haemophilus influenzae con actividad de proteasa disminuida que es inferior al 10% que la de la proteína Hin47 natural,
- (b)
- una proteína adhesina de Haemophilus influenzae (Hia) de una cepa no tipificable de Haemophilus influenzae,
- (c)
- una proteína de alto peso molecular (HMW) de una cepa de Haemophilus influenzae no tipificable, y
- (d)
- una proteína de la membrana externa de Moraxella catarrhalis con una masa molecular aparente de 200 kDa, como se ha determinado por SDS-PAGE.
12. Composición inmunógena según la
reivindicación 11, en la que dichas proteínas Hin47, Hia, HMW y 200
kDa están presentes en cantidades que no proporcionan las
inmunogenicidades individuales de las proteínas.
13. Composición inmunógena según la
reivindicación 11 ó 12, que comprende:
- (a)
- 25 a 100 \mug del análogo de la proteína Hin47, y
- (b)
- 25 a 100 \mug de la proteína Hia,
- (c)
- 25 a 100 \mug de la proteína HMW, y
- (d)
- 25 a 100 \mug de la proteína de 200 kDa.
14. Composición inmunógena según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 13, que comprende además un adyuvante,
preferentemente hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio.
15. Composición inmunógena según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 14, que comprende además por lo menos un
componente antigénico adicional para proporcionar protección contra
la infección provocada por otro patógeno, preferentemente
seleccionado de entre el grupo constituido por toxoide diftérico,
toxoide tetánico y antígenos de tos ferina, poliovirus no virulento
y PRP-T, seleccionándose más preferentemente dichos
antígenos de tos ferina de entre el grupo constituido por toxoide
de tos ferina, hemaglutinina filamentosa, pertactina y
aglutinógenos.
16. Composición inmunógena multivalente que
comprende por lo menos cuatro antígenos diferentes, que comprende
por lo menos un antígeno procedente de Haemophilus influenzae
y por lo menos un antígeno procedente de Moraxella
catarrhalis, siendo por lo menos tres de dichos antígenos
adhesinas y por lo menos una de las adhesinas procede de
Moraxella catarrhalis para su utilización en proporcionar
protección en un huésped contra la enfermedad provocada por
Haemophilus influenzae como por Moraxella
catarrhalis.
17. Composición inmunógena según la
reivindicación 16, en la que dichos por lo menos cuatro antígenos
diferentes son como se definen en cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 15.
18. Utilización de por lo menos cuatro
antígenos diferentes, que comprende por lo menos un antígeno
procedente de Haemophilus influenzae y por lo menos un
antígeno procedente de Moraxella catarrhalis, siendo por lo
menos tres de dichos antígenos una adhesina y por lo menos una de
dichas adhesinas procede de Moraxella catarrhalis en la
preparación de una composición inmunógena multivalente destinada a
proporcionar protección en un huésped contra la enfermedad
provocada tanto por Haemophilus influenzae como por
Moraxella catarrhalis.
19. Utilización según la reivindicación 18, en
la que dichos por lo menos cuatro antígenos diferentes son como se
define en las reivindicaciones 2 a 15.
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