CN102250802A - 红球菌及用于腈水解合成苯乙酮酸的方法 - Google Patents

红球菌及用于腈水解合成苯乙酮酸的方法 Download PDF

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本发明公开了红球菌及用于腈水解合成苯乙酮酸的方法，属于微生物技术领域。红球菌Rhodococcussp.CCZU10-1，保藏号为CGMCCNo.4911。以苯甲酰甲腈为起始原料，以通过在发酵培养基中进行扩增培养得到的红球菌Rhodococcussp.CCZU10-1细胞为生物催化剂在一定条件下进行苯甲酰甲腈的水解，得到产物苯乙酮酸。本方法具有工艺路线简单、反应条件温和及无污染等特点。

Description

红球菌及用于腈水解合成苯乙酮酸的方法
技术领域
本发明公开了土壤中分离的腈水解酶产生菌Rhodococcus sp. CCZU10-1及其用于催化甲酰甲腈水解制备苯乙酮酸的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
苯乙酮酸是一种重要的有机合成中间体，广泛地用于农药和医药等合成。随着其市场的不断扩展，对苯乙酮酸的需求不断增加，应用范围也逐渐拓宽。目前，国内外已报道了很多苯乙酮酸的生产方法，其中化学合成法主要是：(1)苯甲酰腈水解法，(2)扁桃酸氧化法，(3)傅克酰化法和(4)苯乙烯氧化法。上述各种化学方法已取得了较好的效果，但同时也有一些不足之处，例如，产物中都含有杂质，并且化学合成法通常存在产品收率低、成本高和环境污染严重等缺点，与之相比，由于利用生物法实现苯乙酮酸的合成具有反应条件温和，产品收率高等优点，符合绿色化学的发展要求，而越来越受到国内外学者的青睐。生物法中涉及腈水解的酶系主要有腈水解酶、腈水合酶和酰胺酶；腈水解酶能将腈水解生成相应的羧酸和氨，具有选择性好、反应条件温和及产品纯度高等优点，明显优于化学法水解。然而，少有报道利用苯甲酰甲腈水解酶催化合成苯乙酮酸，筛选新的苯甲酰甲腈水解酶菌株成为当务之急。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种红球菌的培养及用于腈水解制备苯乙酮酸的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明所述的红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，该菌株已于2011年5月25日保藏在位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 4911。
上述红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，CGMCC No. 4911，用于催化苯甲酰甲腈生产苯乙酮酸的方法，按照下述步骤进行：
一、菌株的培养：
（1）种子液的摇瓶培养：将所说的红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，CGMCC No. 4911，采用本领域常规的方法，在种子液培养基中进行扩增培养在20~40 ℃下100~160 rpm的摇床上培养12~36 h，离心、洗涤得到静息细胞；
（2）发酵罐扩大培养：在5 L发酵罐中加入适量占发酵罐体积50-70%的发酵培养基，接种量占发酵培养基体积的1~10%, 接种至5 L发酵罐中，通气量1:0.1~1:1 (v/v/m)，搅拌转速200~450 rpm，温度20~40 °C，时间15~72 h，离心、洗涤得到静息细胞；
二、静息细胞催化苯甲酰甲腈水解生产苯乙酮酸：
将收获的静息细胞，以1~100 g湿重/L悬浮于pH为6.0~8.0的体积比为98%:2%-90%:10%的磷酸钾缓冲溶液-有机溶剂两相体系中，加入苯甲酰甲腈，使其浓度为10~1000 mM，在20~40 °C和100~160 rpm的恒温摇床上振荡反应2~120 h后，离心除去细胞，利用2 M NaOH溶液调pH至8.5，利用等体积的乙酸乙酯萃取3次，保留水相，然后利用6 M HCl的溶液调pH至1.0，利用等体积的乙醚萃取3次，收集有机相，经无水Na2SO4干燥过夜后减压蒸去溶剂，即得粗产品，然后过硅胶柱纯化，洗脱液为体积比为25:5:1的苯/乙酸乙酯/甲酸溶液，收集的苯乙酮酸溶液通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到黄色苯乙酮酸粉末。
其中所述的步骤二也可以采用下述技术方案：海藻酸钙固定化细胞催化苯甲酰甲腈水解生产苯乙酮酸：
将收获的静息细胞采用海藻酸钙进行固定化，将海藻酸钙固定化细胞，以1~200 g湿重/L悬浮于pH为7.0~9.0的体积比为98%:2%-90%:10%Tris-HCl缓冲溶液-有机溶剂两相体系中，加入苯甲酰甲腈，使其浓度为10~1000 mM，在20~40 °C和100~160 rpm的恒温摇床上振荡反应2~24 h后，离心除去细胞，利用2 M NaOH溶液调pH至8.5，利用等体积的乙酸乙酯萃取3次，保留水相，然后利用6 M HCl的溶液调pH至1.0，利用等体积的乙醚萃取3次，收集有机相，经无水Na2SO4干燥过夜后减压蒸去溶剂，即得粗产品，然后过硅胶柱纯化，洗脱液为体积比为25:5:1的苯/乙酸乙酯/甲酸溶液，收集的苯乙酮酸溶液通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到黄色苯乙酮酸粉末。
其中步骤一（1）中所述的种子液培养基组成为：葡萄糖5~15 g，蛋白胨5~20 g，酵母膏5~20 g，KH2PO4 1~5 g，NaCl 0.5~2.5 g，MgSO4 0.1~2.5 g，水 1000 mL，pH 6.0~9.0；
其中步骤一（2）中所述的发酵培养基组成为：葡萄糖5~15 g，蛋白胨5~20 g，酵母膏5~20 g，KH2PO4 1~5 g，NaCl 0.5~2.5 g，MgSO4 0.1~2.5 g，诱导剂(I) 0.01~10 g，生长素G0.01~0.1 g，水 1000 mL，pH 6.0~9.0；
上述培养基中所述的诱导剂I为：α-氨基丙腈、丙烯腈、亚氨基二乙腈、乙腈、丁腈、4-氯-3-羟基丁腈、2,3-二氰基吡嗪，羟基乙腈、苯乙腈、苯甲酰甲腈或己内酰胺；
上述培养基中所述的生长素G为：CaCl2、CoCl2 .6H2O、CuSO4、FeSO4 .7H2O、MgSO4、MnSO4 .H2O、Na2MoO4 .2H2O、NiSO4 .7H2O、ZnSO4 .7H2O、生物素、泛酸钙、叶酸、半胱氨酸、甘氨酸、肌醇、尼克酸、核黄素、维生素B1、对氨基苯甲酸钠、盐酸吡哆醛。
其中步骤二中所述的有机溶剂为苯、甲苯、甲醇、乙苯、乙醇、叔丁醇、正己烷、正戊烷、正辛醇、异辛醇、乙酸乙酯、二氧六环或聚乙二醇400-4000。
本发明的优点：本发明利用Rhodococcus sp. CCZU10-1生物催化剂实现苯甲酰甲腈的水解合成苯乙酮酸，具有工艺路线简单、反应条件温和、无污染、无副产物及转化率高等优点。
附图说明
图1是本发明菌株CCZU10-1 CGMCC No. 4911的系统进化树；
图2是利用Rhodococcus sp. CCZU10-1静息细胞催化苯甲酰甲腈生产苯乙酮酸反应进程曲线；
图3是固定化细胞催化的多批反复水解苯甲酰甲腈反应的结果。
符号说明：附图2中，●产物苯乙酮酸，○底物苯甲酰甲腈；附图3中，●固定化细胞，○游离细胞。
具体实施方式
本发明发明人从常州大学白云校区及常州科教城附近的土壤中，经初筛、复筛及分离纯化得到一株腈水解酶菌株，经过16S rDNA及理化特征鉴定，该菌株为红球菌Rhodococcus sp.，编号为Rhodococcus sp. CCZU10-1。该菌株已于2011年5月25日保藏在位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 4911。菌株进化树如图1所示。
上述菌株的筛选过程如下：
采集了不同环境条件下400份土壤样品，利用苯甲酰甲腈为唯一氮源进行两轮液体富集培养，筛选腈水解酶产生菌。通过反复筛选，分离得到一株高活力的腈水解酶产生菌。
本发明中苯乙酮酸的含量用HPLC进行分析。腈水解酶催化剂的活力单位定义：每分钟水解苯甲酰甲腈产生1 μmol苯乙酮酸所需要的生物催化剂量。
菌株理化特征如表1所示:
表 1 CCZU10-1菌株理化特征
理化特征 结果
葡萄糖氧化产酸 +
葡萄糖氧化发酵 -
利用乙酸钠 +
运动 -
VP实验 -
生长条件 好氧
产气 -
水解淀粉 -
过氧化氢酶 +
硝酸盐还原 +
甲基红 -
“+”代表阳性；”-”代表阴性
实施例1 
利用红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1生长细胞，催化苯甲酰甲腈水解生产苯乙酮酸
配制种子培养基(葡萄糖5 g，蛋白胨 5 g，酵母膏 5 g，KH2PO4 1 g，NaCl 0.5 g，MgSO4 0.1 g，水 1000 mL，pH 6.0)，在1 L摇瓶中装入200 mL种子培养基，培养种子液。再配制发酵培养基(葡萄糖5 g，蛋白胨 5 g，酵母膏 5 g，KH2PO4 1 g，NaCl 0.5 g，MgSO4 0.1 g，FeSO4 .7H2O 0.01 g，诱导剂己内酰胺 0.01 g，水 1000 mL，pH 6.0)。在5 L发酵罐中装入2.5 L发酵培养基，消毒后接入1%的种子液，通气量1:0.1 (v/v/m)，搅拌转速200 rpm，温度20 °C，进行发酵培养15 h，加入100 mM苯甲酰甲腈，不同时间取样HPLC分析，当苯乙酮酸分析得率为96%时继续补加经过氢氧化钠中和处理的苯甲酰甲腈溶液100 mM，当产物苯乙酮酸累积浓度达到3 M左右时，停止补料，继续反应使底物苯甲酰甲腈消耗完，当底物残留浓度<0.02%，终止反应。整个培养及反应过程时间为72 h，转化率>99.0%，苯乙酮酸浓度3.08 M，苯乙酮酸产率>98.0%。
实施例2 
利用红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1静息细胞催化苯甲酰甲腈生产苯乙酮酸
配制种子培养基(葡萄糖15 g，蛋白胨20 g，酵母膏20g，KH2PO4 5 g，NaCl 2.5 g，MgSO4 2.5g，水 1000 mL，pH 9.0)，在1 L摇瓶中装入200 mL种子培养基，培养种子液。再配制发酵培养基(葡萄糖15 g，蛋白胨 20 g，酵母膏 20 g，KH2PO4 5 g，NaCl 2.5 g，MgSO4 2.5 g，FeSO4 .7H2O 0.1 g，诱导剂己内酰胺 10 g，水 1000 mL，pH 9.0)。在5 L发酵罐中加入适量占发酵罐体积3.5L的发酵培养基，接种量占发酵培养基体积的10%, 消毒后接种至5 L发酵罐中，通气量1:1:1 (v/v/m)，搅拌转速450 rpm，温度40 °C，时间120 h，离心、洗涤得到静息细胞。称取湿重10 g静息细胞，将细胞悬浮于1000 mL pH 6.0磷酸钾缓冲溶液-甲苯(98%:2%，体积比)中，分别加入苯甲酰甲腈，终浓度为100 mM，在20 °C和100 rpm的恒温摇床振荡反应，将反应液以10,000×g离心10 min，除去细胞，HPLC检测分析。转化200 mM的苯甲酰甲腈，反应8 h后苯乙酮酸的分析得率>99.0%，可见红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1能耐受较高的底物浓度及催化效率。
实施例3 
  分批补料利用红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1静息细胞催化苯甲酰甲腈生产苯乙酮酸
称取实施例2培养获得的湿重10 g静息细胞，将细胞悬浮于1000 mL pH 8.0磷酸钾缓冲溶液-甲苯(90%:10%，体积比)中，分别加入苯甲酰甲腈，终浓度为100 mM，在40 °C和160 rpm的恒温摇床振荡反应，反应12h后，分批补料100 mM底物苯甲酰甲腈进行苯乙酮酸的合成。图2表明，分批补料10次底物(每次补料100 mM)，反应120 h后苯乙酮酸的累计浓度为932 mM。水解苯甲酰甲腈过程中，未发现苯甲酰甲酰胺的生成。
实施例4 
利用固定化细胞催化苯甲酰甲腈生产苯乙酮酸
在底物苯甲酰甲腈浓度为100 mM的1000 mL pH 9.0 Tris-HCl缓冲溶液-甲苯(90%:10%，体积比)反应体系中，加入海藻酸钙固定化细胞80 g，在30 °C、160 rpm的条件下反应10 h，重复操作20次，以游离细胞为对照。结果如图3所示，固定化催化剂可反复回用20次以上，达到了令人满意的效果，具有潜在的工业应用价值。

Claims (5)

1.红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，其保藏号为CGMCC No. 4911。
2.权利要求1所述的红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，CGMCC No. 4911，用于催化苯甲酰甲腈生产苯乙酮酸的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
一、菌株的培养：
（1）种子液的摇瓶培养：将所说的红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，CGMCC No. 4911，采用本领域常规的方法，在种子液培养基中进行扩增培养在20~40 ℃下100~160 rpm的摇床上培养12~36 h，离心、洗涤得到静息细胞；
（2）发酵罐扩大培养：在5 L发酵罐中加入适量占发酵罐体积50-70%的发酵培养基，接种量占发酵培养基体积的1~10%, 接种至5 L发酵罐中，通气量1:0.1~1:1 (v/v/m)，搅拌转速200~450 rpm，温度20~40 °C，时间15~72 h，离心、洗涤得到静息细胞；
二、静息细胞催化苯甲酰甲腈水解生产苯乙酮酸：
将收获的静息细胞，以1~100 g湿重/L悬浮于pH为6.0~8.0的体积比为98%:2%-90%:10%的磷酸钾缓冲溶液-有机溶剂两相体系中，加入苯甲酰甲腈，使其浓度为10~1000 mM，在20~40 °C和100~160 rpm的恒温摇床上振荡反应2~120 h后，离心除去细胞，利用2 M NaOH溶液调pH至8.5，利用等体积的乙酸乙酯萃取3次，保留水相，然后利用6 M HCl的溶液调pH至1.0，利用等体积的乙醚萃取3次，收集有机相，经无水Na2SO4干燥过夜后减压蒸去溶剂，即得粗产品，然后过硅胶柱纯化，洗脱液为体积比为25:5:1的苯/乙酸乙酯/甲酸溶液，收集的苯乙酮酸溶液通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到黄色苯乙酮酸粉末。
3.权利要求2所述的红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，CGMCC No. 4911，用于催化苯甲酰甲腈生产苯乙酮酸的方法，其特征在于其中所述的步骤二采用下述技术方案：海藻酸钙固定化细胞催化苯甲酰甲腈水解生产苯乙酮酸：
将收获的静息细胞采用海藻酸钙进行固定化，将海藻酸钙固定化细胞，以1~200 g湿重/L悬浮于pH为7.0~9.0的体积比为98%:2%-90%:10%Tris-HCl缓冲溶液-有机溶剂两相体系中，加入苯甲酰甲腈，使其浓度为10~1000 mM，在20~40 °C和100~160 rpm的恒温摇床上振荡反应2~24 h后，离心除去细胞，利用2 M NaOH溶液调pH至8.5，利用等体积的乙酸乙酯萃取3次，保留水相，然后利用6 M HCl的溶液调pH至1.0，利用等体积的乙醚萃取3次，收集有机相，经无水Na2SO4干燥过夜后减压蒸去溶剂，即得粗产品，然后过硅胶柱纯化，洗脱液为体积比为25:5:1的苯/乙酸乙酯/甲酸溶液，收集的苯乙酮酸溶液通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到黄色苯乙酮酸粉末。
4.根据权利要求2或3所述的红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，CGMCC No. 4911，用于催化苯甲酰甲腈生产苯乙酮酸的方法，其特征在于其中步骤一（1）中所述的种子液培养基组成为：葡萄糖5~15 g，蛋白胨5~20 g，酵母膏5~20 g，KH2PO4 1~10 g，NaCl 0.1~2.5 g，MgSO4 0.1~2.5 g，水 1000 mL，pH 6.0~9.0；
其中步骤一（2）中所述的发酵培养基组成为：葡萄糖5~15 g，蛋白胨5~20 g，酵母膏5~20 g，KH2PO4 1~10 g，NaCl 0.1~2.5 g，MgSO4 0.1~2.5 g，诱导剂(I) 0.01~10 g，生长素G0.01~0.1 g，水 1000 mL，pH 6.0~9.0；
上述培养基中所述的诱导剂I为：α-氨基丙腈、丙烯腈、亚氨基二乙腈、乙腈、丁腈、4-氯-3-羟基丁腈、2,3-二氰基吡嗪，羟基乙腈、苯乙腈、苯甲酰甲腈或己内酰胺；
上述培养基中所述的生长素G为：CaCl2、CoCl2 .6H2O、CuSO4、FeSO4 .7H2O、MgSO4、MnSO4 .H2O、Na2MoO4 .2H2O、NiSO4 .7H2O、ZnSO4 .7H2O、生物素、泛酸钙、叶酸、半胱氨酸、甘氨酸、肌醇、尼克酸、核黄素、维生素B1、对氨基苯甲酸钠、盐酸吡哆醛。
5.根据权利要求2或3所述的红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，CGMCC No. 4911，用于催化苯甲酰甲腈生产苯乙酮酸的方法，其特征在于其中步骤二中所述的有机溶剂为苯、甲苯、甲醇、乙苯、乙醇、叔丁醇、正己烷、正戊烷、正辛醇、异辛醇、乙酸乙酯、二氧六环或聚乙二醇400-4000。
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