CN113930463B - 一种生物催化2-(苯基羰基)乙腈制备手性扁桃酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生物催化制备S‑或R‑扁桃酸的方法。本发明提供的方法,以2‑(苯基羰基)乙腈为底物,经由腈水解酶、扁桃酸脱氢酶和辅酶再生系统组成的酶催化体系催化获得手性扁桃酸,既可以合成R‑扁桃酸,也可以合成S‑扁桃酸;本发明方法用于生产手性扁桃酸,原料转化率超过99%,产品光学纯度大于99.9%;与传统方法相比,提高了原料转化率和产品收率,简化了下游分离精制工艺,可实现方法的可持续性并能降低成本,是一种过程简洁、绿色环保的新工艺,适合大规模工业化生产应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域,尤其涉及生物催化2-(苯基羰基)乙腈反应生成手性扁桃酸中的应用。
背景技术
扁桃酸(mandelic acid)又称作苦杏仁酸、苯乙醇酸或α-羟基苯乙酸,其有两种光学异构体,分别为R-扁桃酸(式Ⅰ)和S-扁桃酸(式Ⅱ)。光学活性的扁桃酸具有很好的生物分解性,是合成许多手性药物的中间体。例如,S-扁桃酸合成用于治疗尿频、尿急和尿失禁药物S-奥昔布宁前体原料,R-扁桃酸用于合成头孢菌素类抗生素羟苄四唑头孢菌素的侧链修饰剂。此外,手性扁桃酸还是重要的手性拆分剂和手性催化剂,而且还能用于测定手性物质的绝对构型及光学纯度等。例如,R-扁桃酸可以用于拆分止咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物。
对于手性纯扁桃酸的制备方法,目前主要以对映体拆分法为主。中国专利CN101691574B、CN101701243B、CN101709323B、CN102533705B分别公开了利用腈水解酶选择性水解消旋扁桃腈中的R-扁桃腈,从而获得手性纯R-扁桃酸的方法。中国专利CN102660471B公开了一种利用S-扁桃酸脱氢酶选择性氧化消旋扁桃酸中的S-扁桃酸,从而获得光学纯R-扁桃酸的方法。中国专利CN104830944B公开了一种利用酯酶选择性水解消旋扁桃酸甲酯中的S-扁桃酸甲酯,从而获得光学纯S-扁桃酸的方法。虽然这些对映体拆分法能够获得单一构型的手性扁桃酸,但理论转化率均不超过50%;剩余未转化的对映体需要回收、消旋化、再拆分,这导致了工艺过程复杂、原料转化率和产品得率不高等问题。另一方面,中国专利CN102086462B公开了一种利用代谢工程菌、以苯丙酮酸为底物,分别制备手性纯R-扁桃酸和S-扁桃酸的方法,这是目前唯一报道能够同时制备R-、S-扁桃酸的方法;但此方法通过代谢工程菌发酵的方式生产手性扁桃酸,产品浓度低于1g/L;并且从发酵液中提取精制产品及其困难,此方法不具备工业化潜力。
因此,有必要提供一种全新的手性扁桃酸合成方法,既可以合成R-扁桃酸,也可以合成S-扁桃;在保持过程简洁绿色的同时提高原料转化率和产品得率,从而可以以较低的成本大规模制备手性扁桃酸。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全新的手性扁桃酸合成方法,以克服现有扁桃酸生产方法所存在的上述缺点和不足。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供一种生产手性扁桃酸的方法,以2-(苯基羰基)乙腈为底物,经酶催化体系催化获得R-或S-扁桃酸,所述酶催化体系由腈水解酶、扁桃酸脱氢酶和辅酶再生系统组成。
具体原理为:采用2-(苯基羰基)乙腈为原料,在还原型辅酶NAD(P)H或氧化型辅酶NAD(P)+存在的条件下,通过一个包含三种酶的催化体系作用,将2-(苯基羰基)乙腈转化为手性扁桃酸。在催化反应过程中,腈水解酶将2-(苯基羰基)乙腈水解为2-(苯基羰基)乙酸;2-(苯基羰基)乙酸在R-扁桃酸脱氢酶催化下生成R-扁桃酸、或在S-扁桃酸脱氢酶催化下生成S-扁桃酸;扁桃酸脱氢酶催化2-(苯基羰基)乙酸生成R-或S-扁桃酸需要NAD(P)H作为辅酶,反应后生成NAD(P)+,而NAD(P)H价格昂贵,所以需要辅酶再生系统再生NAD(P)+为NAD(P)H。反应原理见附图1。
作为优选,所述腈水解酶来源于Apibactersp.ESL0404,NCBI登录号为WP_220264820,或Alcaligenesfaecalis,NCBI登录号为MK888683.1。
作为优选,所述扁桃酸脱氢酶为来源于Lactobacillus brevis的R-扁桃酸脱氢酶(NCBI登录号:NC_008497.1)或来源于Pseudomonasputida的S-扁桃酸脱氢酶(NCBI登录号:AAC15503.1)。
本发明中,所述辅酶再生系统为:以亚磷酸脱氢酶为辅酶再生酶、以亚磷酸为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)+的亚磷酸脱氢酶辅酶再生系统;或者,以醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)+的醇脱氢酶辅酶再生系统;又或者,以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)+的甲酸脱氢酶辅酶再生系统。
以亚磷酸脱氢酶作为辅酶再生酶时,需要同时流加亚磷酸作为辅酶再生底物,反应后的副产物为磷酸,可以在反应过程中或反应结束后,通过添加Ca2+形成磷酸钙沉淀的方式加以去除。以醇脱氢酶为辅酶再生酶时,需要同时流加异丙醇作为辅酶再生底物,反应后的副产物为丙酮,可以在反应过程中或反应结束后,通过减压蒸馏的方式加以去除;以甲酸脱氢酶作为辅酶再生酶时,需要同时流加甲酸作为辅酶再生底物,反应后的副产物为二氧化碳和水,无需额外的副产物分离工艺。
作为优选,所述亚磷酸脱氢酶来源于Pseudomonas stutzeri(NCBI登录号WP_063540370.1);所述醇脱氢酶基因来源于Bacillus stearothermophilus(NCBI登录号NZ_JYNW01000069.1);所属甲酸脱氢酶来源于Candida boidinii(NCBI登录号CAB54834.1)。
作为优选,催化体系中,以酶活力为单位,所述腈水解酶、扁桃酸脱氢酶和辅酶再生酶的添加量均为20~10000U/L;更优选,添加量为100~1000U/L。
催化体系中,底物2-(苯基羰基)乙腈的添加量为10~1000mM;辅酶再生底物的添加量为15~1500mM。辅酶NAD+添加量为0.01~10mM,更优选为0.1~1mM。
作为优选,催化体系中,反应的温度为20~70℃,时间为12~72h;更优选,温度为30~50℃,时间为12~48h。
作为优选,控制反应的pH值为6~9。采用氢氧化钠来控制pH的下降,采用亚磷酸或甲酸来控制pH的上升。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明方法以2-(苯基羰基)乙腈为底物,经由腈水解酶、扁桃酸脱氢酶和辅酶再生系统组成的酶催化体系催化获得手性扁桃酸,既可以合成R-扁桃酸,也可以合成S-扁桃酸;
(2)本发明方法构建了一种全新的三酶催化体系用于生产手性扁桃酸,提高了原料转化率和产品收率,简化了下游分离精制工艺,是一种过程简洁、绿色环保的新工艺,适合大规模工业化生产应用。
附图说明
图1为本发明生物催化2-(苯基羰基)乙腈反应生成手性扁桃酸反应式;
具体实施方式
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法,基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。本发明所涉及表达酶基因的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),以及所用载体为pET-28a(+)购自TAKARA公司。下游催化工艺所用试剂:2-(苯基羰基)乙腈、2-(苯基羰基)乙酸以及扁桃酸,购自阿拉丁化学试剂有限公司;其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。在本申请文本中所使用的氨基酸三字母或单字母表达方式,采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.,138:9-37,1984)。
采用高效液相色谱(HPLC)检测过程中扁桃酸的生成,具体方法为,色谱仪:HP1100;色谱柱型号:QS-C18,5μm,4.6mm×250mm;流动相:0.5%乙酸溶液:乙腈=12:88;检测波长:215nm;流速:1.0mL/min;柱温:30℃。
采用高效液相色谱手性分析产品光学纯度,具体方法为,色谱仪:安捷伦1260;色谱柱型号:DAICELIA,5μm,4.6×250mm;流动相:正己烷:乙醇:三氟乙酸=96:4:0.3;检测波长:215nm;流速:0.8mL/min;柱温:30℃。
实施例1腈水解酶的表达与活力测定
一、腈水解酶基因的获取
通过基因数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)查询不同来源的腈水解酶(Nitrilase,NLase)基因序列或氨基酸序列,进行全基因合成;获得的腈水解酶具体信息如表1所示。
表1腈水解酶来源信息
二、表达腈水解酶的菌株的构建
将腈水解酶基因序列提交给基因合成公司进行全基因合成,并构建在质粒载体pET-28a(+)上,酶切位点为EcoRI/BamHI和HindIII;然后将构建好的质粒导入表达宿主E.coli BL21(DE3)菌株中,即为基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-NLaseⅹ。
三、腈水解酶的重组表达
将构建成功的工程菌接种于LB液体培养基中,37℃摇床中,200rpm震荡培养2~3h,当菌体密度OD600值达到0.8时,降温到25℃,并加入IPTG至其终浓度为0.5mM。之后将三角瓶转入25℃摇床中,200rpm继续培养16h。培养结束后,将培养液4000rpm离心30min,弃上清,收集菌体细胞,然后用100mM、pH8.0磷酸盐缓冲液重悬,超声破碎菌悬液,离心去除沉淀,得到的上清为粗酶液。
四、重组腈水解酶的酶活测定
以2-(苯基羰基)乙腈为底物,来检测重组腈水解酶的酶活,测定体系为:总反应体系为0.5mL,包括400μL 10mM 2-(苯基羰基)乙腈溶液(用100mM、pH8.0磷酸盐缓冲液配置),100μL的工程菌细胞破胞粗酶液。在40℃下震荡反应15min,加入500μL 0.5M盐酸来终止反应。反应混合液12000rpm离心5min,除去细胞和酶蛋白。用高效液相色谱法来测定反应体系中所生成的2-(苯基羰基)乙酸,酶活定义:在40℃下,1min能转化底物生成1μmol产物2-(苯基羰基)乙酸的酶量,即为1U。对所有重组腈水解酶进行活力测定,结果如表4所示。由表2可以看出,来源于Apibactersp.的腈水解酶活力最高,反应12h的底物转化率达到了83.7%。
表2腈水解酶酶活和底物转化率测定
实施例2扁桃酸脱氢酶的表达与活力测定
一、扁桃酸脱氢酶基因的获取
通过基因数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)查询不同来源的扁桃酸脱氢酶(Mandelate dehydrogenase,Mdh)基因序列或氨基酸序列,进行全基因合成;获得的扁桃酸脱氢酶具体信息如表3所示。
表3扁桃酸脱氢酶来源信息
二、表达扁桃酸脱氢酶的菌株的构建
将扁桃酸脱氢酶基因序列提交给基因合成公司进行全基因合成,并构建在质粒载体pET-28a(+)上,酶切位点为EcoRI/BamHI和HindIII;然后将构建好的质粒导入表达宿主E.coli BL21(DE3)菌株中,即为基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-Mdhⅹ。
三、扁桃酸脱氢酶的重组表达
将构建成功的工程菌接种于LB液体培养基中,37℃摇床中,200rpm震荡培养2~3h,当菌体密度OD600值达到0.8时,降温到28℃,并加入IPTG至其终浓度为0.5mM。之后将三角瓶转入28℃摇床中,200rpm继续培养16h。培养结束后,将培养液4000rpm离心30min,弃上清,收集菌体细胞,然后用100mM、pH8.0磷酸盐缓冲液重悬,超声破碎菌悬液,离心去除沉淀,得到的上清为粗酶液。
四、重组扁桃酸脱氢酶的酶活测定
以2-(苯基羰基)乙酸为底物,来检测重组腈水解酶的酶活,测定体系为:总反应体系为0.5mL,包括400μL 10mM 2-(苯基羰基)乙酸溶液(用100mM、pH8.0磷酸盐缓冲液配置,用1M NaOH调pH=8.0),100μL的工程菌细胞破胞粗酶液。在40℃下震荡反应15min,加入500μL 0.5M盐酸来终止反应。反应混合液12000rpm离心5min,除去细胞和酶蛋白。用高效液相色谱法来测定反应体系中所生成的扁桃酸,酶活定义:在40℃下,1min能转化底物生成1μmol产物扁桃酸的酶量,即为1U。对所有重组扁桃酸脱氢酶进行活力测定,结果如表4所示。
表4扁桃酸脱氢酶酶活和选择性测定
实施例3辅酶再生酶酶的表达与活力测定
一、将亚磷酸脱氢酶(Pdh)基因(NCBI登录号WP_063540370.1)、醇脱氢酶(Adh)基因(NCBI登录号NZ_JYNW01000069.1)以及甲酸脱氢酶(Fdh)基因(NCBI登录号CAB54834.1)提交给基因合成公司进行全基因合成,并构建在质粒载体pET-28a(+)上,酶切位点为EcoRI/BamHI和HindIII;然后将构建好的质粒导入表达宿主E.coli BL21(DE3)菌株中,分别得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-Pdh、E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-Adh、E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-Fdh。
二、这三种重组酶的表达与实施例1中腈水解酶的表达操作一致。
三、醇脱氢酶、甲酸脱氢酶和亚磷酸脱氢酶的酶活测定
醇脱氢酶底物、甲酸脱氢酶底物和亚磷酸脱氢酶底物分别为0.1M磷酸盐缓冲液配置的异丙醇溶液、甲酸铵溶液和亚磷酸氢二铵溶液。
取相应底物溶液950μL,加入10mM NADP+溶液25μL,置于金属浴震荡器中,35℃保温10min;加入25μL对应酶液,迅速取出用手震荡、到入比色皿中,迅速放入分光光度计内,以时间为横坐标(单位min)、吸光值为纵坐标测定吸光值随时间的变化率,根据事先测定的NAD(P)H摩尔吸光系数,即可计算酶活。
四、经测定,醇脱氢酶、甲酸脱氢酶和亚磷酸脱氢酶的酶活分别为1.3U/mL、12U/mL、0.8U/mL。
实施例4
取100mL实施例1构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-NLase1的发酵液,12000rpm,10min离心收集菌体,然后用10mL 100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)重悬收集的菌体,破胞获得粗酶液。分别取1mL实施例2构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-Mdh3以及5mL实施例3构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-Pdh的发酵液,12000rpm,10min离心收集菌体,然后用5mL 100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)重悬收集的菌体,破胞获得粗酶液。称取1.0g 2-(苯基羰基)乙腈、2.2g亚磷酸氢钠加入到100mL的三口圆底烧瓶中,加入适量水溶解,用1M NaOH调pH=8.0,定容至35mL。将三种粗酶液混合后加入烧瓶中,再加入NAD+0.03g并开启搅拌,用水浴控制反应温度30℃,用1MNaOH控制反应pH=8.0。反应48h之后用液相色谱法检测反应体系内的2-(苯基羰基)乙腈、2-(苯基羰基)乙酸和扁桃酸的含量,底物的转化率50.3%,产品R-扁桃酸浓度11.3g/L,eeR值大于99%。
实施例5
取100mL实施例1构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-NLase15的发酵液,12000rpm,10min离心收集菌体,然后用10mL 100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)重悬收集的菌体,破胞获得粗酶液。分别取4mL实施例2构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-Mdh3以及2mL实施例3构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-Adh的发酵液,12000rpm,10min离心收集菌体,然后用5mL 100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)重悬收集的菌体,破胞获得粗酶液。称取3.0g 2-(苯基羰基)乙腈、2.0g异丙醇加入到100mL的三口圆底烧瓶中,加入适量水,用1MNaOH调pH=8.0,定容至35mL。将三种粗酶液混合后加入烧瓶中,再加入NAD+0.05g并开启搅拌,用水浴控制反应温度40℃,用1MNaOH控制反应pH=7.5。反应12h之后用液相色谱法检测反应体系内的2-(苯基羰基)乙腈、2-(苯基羰基)乙酸和扁桃酸的含量,底物的转化率99.5%,产品R-扁桃酸浓度69.3g/L,eeR值大于99%。
实施例6
取100mL实施例1构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-NLase15的发酵液,12000rpm,10min离心收集菌体,然后用10mL 100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)重悬收集的菌体,破胞获得粗酶液。分别取12mL实施例2构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-Mdh9以及2mL实施例3构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-Adh的发酵液,12000rpm,10min离心收集菌体,然后用5mL 100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)重悬收集的菌体,破胞获得粗酶液。称取5.0g 2-(苯基羰基)乙腈、3.5g异丙醇加入到100mL的三口圆底烧瓶中,加入适量水,用1M NaOH调pH=8.0,定容至35mL。将三种粗酶液混合后加入烧瓶中,再加入NAD+0.08g并开启搅拌,用水浴控制反应温度35℃,用1M NaOH控制反应pH=8.5。反应35h之后用液相色谱法检测反应体系内的2-(苯基羰基)乙腈、2-(苯基羰基)乙酸和扁桃酸的含量,底物的转化率72.4%,产品S-扁桃酸浓度82.6g/L,eeS值大于99%。
实施例7
取1.0L实施例1构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-NLase15的发酵液,12000rpm,10min离心收集得到菌体4.9g;取80mL实施例2构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-Mdh9的发酵液,12000rpm,10min离心收集得到菌体0.5g;取125mL实施例3构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-Fdh的发酵液,12000rpm,10min离心收集得到菌体1.3g;将三种具体混合,然后用50mL 100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)重悬收集的菌体,破胞获得粗酶液。称取65.0g 2-(苯基羰基)乙腈、20.0g甲酸加入到1000mL的三口圆底烧瓶中,加入适量水,用1M NaOH调pH=7.0,定容至950mL。将三种粗酶液混合后加入烧瓶中,再加入NAD+1.0g并开启搅拌,用水浴控制反应温度45℃,用5%甲酸溶液控制反应pH=7.0。反应22h之后用液相色谱法检测反应体系内的2-(苯基羰基)乙腈、2-(苯基羰基)乙酸和扁桃酸的含量,底物的转化率99.3%,产品S-扁桃酸浓度75.1g/L,eeS值大于99%。
对比例1
取100mL实施例1构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-NLase2的发酵液,12000rpm,10min离心收集菌体,然后用10mL 100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)重悬收集的菌体,破胞获得粗酶液。分别取10mL实施例2构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-Mdh3以及实施例3构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-Adh的发酵液,12000rpm,10min离心收集菌体,然后用5mL 100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)重悬收集的菌体,破胞获得粗酶液。称取1.0g 2-(苯基羰基)乙腈、1.0g异丙醇加入到100mL的三口圆底烧瓶中,加入适量水,用1MNaOH调pH=8.0,定容至35mL。将三种粗酶液混合后加入烧瓶中,再加入NAD+0.1g并开启搅拌,用水浴控制反应温度35℃,用1M NaOH控制反应pH=8.0。反应72h之后用液相色谱法检测反应体系内的2-(苯基羰基)乙腈、2-(苯基羰基)乙酸和扁桃酸的含量,未检测到2-(苯基羰基)乙酸和扁桃酸,底物的转化率为0。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种生产手性扁桃酸的方法,其特征在于:以2-(苯基羰基)乙腈为底物,经酶催化体系催化获得R-扁桃酸或S-扁桃酸;所述酶催化体系由腈水解酶、扁桃酸脱氢酶和辅酶再生系统组成;所述酶催化体系中的腈水解酶来源于Apibacter sp.ESL0404,NCBI登录号为WP_220264820;扁桃酸脱氢酶来源于Lactobacillus brevis的R-扁桃酸脱氢酶,NCBI登录号:NC_008497.1,或来源于Pseudomonas putida的S-扁桃酸脱氢酶,NCBI登录号:AAC15503.1;辅酶再生系统为:以醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)的醇脱氢酶辅酶再生系统;或者以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)的甲酸脱氢酶辅酶再生系统;其中:所述醇脱氢酶基因来源于Bacillus stearothermophilus,NCBI登录号NZ_JYNW01000069.1;甲酸脱氢酶来源Candidaboidinii,NCBI登录号CAB 54834.1;所述酶催化体系为腈水解酶、R-扁桃酸脱氢酶和醇脱氢酶组合;或腈水解酶、S-扁桃酸脱氢酶和甲酸脱氢酶组合。
2.根据权利要求1所述生产手性扁桃酸的方法,其特征在于:催化体系中,以酶活力为单位,所述腈水解酶、扁桃酸脱氢酶和辅酶再生酶的添加量为20-10000U/L。
3.根据权利要求2所述生产手性扁桃酸的方法,其特征在于:催化体系中,以酶活力为单位,所述腈水解酶、扁桃酸脱氢酶和辅酶再生酶的添加量为100-1000U/L。
4.根据权利要求1所述生产手性扁桃酸的方法,其特征在于:反应温度为30-50℃;反应pH值为6-9,采用氢氧化钠、亚磷酸或甲酸来控制pH。
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GR01 | Patent grant | ||
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