CN101027404A - 对映选择性生物转化制备蛋白酪氨酸激酶抑制剂中间体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备1－(2，6－二氯－3－氟苯基)乙醇的对映体纯的立体异构体的生物催化方法。公开了制备所需(S)－对映异构体的方法，该方法是基于对1－(2，6－二氯－3－氟苯基)乙基酯的酶法拆分、化学酯化和化学水解伴随反转的联用，或用诸如酶或微生物等生物催化剂立体选择性生物还原2，6－二氯－3－氟－苯乙酮。手性(S)－对映异构体可以用于合成某些对映体富集的、醚连接的2－氨基吡啶化合物，该化合物能有效抑制人肝细胞生长因子受体自磷酸化作用。

Description

对映选择性生物转化制备蛋白酪氨酸激酶抑制剂中间体
发明领域
本发明涉及制备1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的对映体纯的立体异构体的方法，该立体异构体在对映体富集的醚连接的2-氨基吡啶类似物的合成中是有用的中间体，该类似物可有效抑制人肝细胞生长因子受体的自磷酸化作用，从而可用于治疗癌症和其它过度增殖性病症。
发明背景
获得化合物的单一对映异构体的策略在药物开发中正变得日益重要，因为经常一种对映异构体是有效的药物，而另一对映异构体具有不符合需要的生物活性。理想的是，设计不对称合成来仅仅生产所需的对映异构体。不幸的是，不对称合成常常不能被设计，或者花费高得惊人。
虽然用从硼氢化钠、三甲基硅烷基氯化物和催化量的(S)-α，α-二苯基吡咯烷甲醇制备的还原剂将1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮对映选择性地还原为了(1R)-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇，其中对映体纯度为96％对映体过量(ee)(Jiang等人.Tetrahedron Lett.，2000，第41卷，第10281-10283页)，但是仍然不能化学合成生产(1S)-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇，该化合物是在某些对映体富集的醚连接的2-氨基吡啶类似物的合成中的中间体，该类似物可有效抑制人肝细胞生长因子受体(HGFR或c-MET)的自磷酸化作用。c-MET(HGFR)抑制剂的实例、其合成和用途可以在2004年2月26日提交的标题为“Aminoheteroaryl Compounds as Protein Kinase Inhibi tors”的美国专利申请系列第10/786,610号及2004年2月26日提交的相同标题的相应国际申请PCT/US2004/005495中找到，其公开内容被全文引入本文作为参考。
我们尝试使用不同的化学试剂，例如(R)-2-甲基-CBS-唑硼烷/BH3-二甲基硫醚复合物(BMS)(J.Am.Chem.Soc.1987，第109卷，第7925页)；硼氢化钠、三甲基硅烷基氯化物和催化量的(S)-α，α-二苯基吡咯烷甲醇(Jiang等人.Tetrahedron Lett.，2000，第41卷，第10281-10283页)；唑硼烷/BH3-二甲基硫醚复合物(BMS)(J.Org.Chem.1993，第58卷，第2880页)；和(-)-B-chlorodiisopinocamphenylborane(DIP-Cl)(TetrahedronLett.1997，第38卷，第2641页)，通过1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮的手性还原，制备具有足够的对映体纯度的(1S)-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇，但并不成功。
已知可以使用诸如酶或微生物等生物催化剂通过立体选择性还原生产对映体纯的醇。例如，来自棒状杆菌菌株ST-10的苯乙醛还原酶有很宽的作用底物范围，可将各种前手性芳族酮和β-酮酯还原，生成对映体纯度大于98％对映体过量(ee)的旋光仲醇，Itoh等人，Eur.J.Biochem.，2002，第269卷，第2394-2402页。根据生物催化剂不对称还原酮类领域中近来发展的综述，例如，为了还原2-甲基-3-氧代丁酸乙酯，在450个菌株中发现了肺炎克雷白杆菌IFO 3319能以＞99％ee.生成相应的(2R，3S)-羟基酯，K.Nakamura等人.Tetrahedron：Asymmetry，2003，第14卷，第2659-2681页。美国专利第5,310,666号公开了深红酵母菌株，它100％还原己酮可可碱，生成S-醇。美国专利第6,451,587号提供了从酮2-氯-1-[6-(2，5-二甲基-吡咯-1-基)-吡啶-3-基]-乙酮制备醇(K)-2-氯-1-[6-(2，5-二甲基-吡咯-1-基)-吡啶-3-基]-乙醇的微生物不对称还原法。美国专利第6,642,387和6,515,134号公开了利用微生物还原制备某些旋光羟乙基吡啶衍生物。美国专利第5,391,495号公开了立体选择性还原某些含酮的磺酰胺化合物形成相应的含羟基的化合物，利用能够催化所述还原的微生物或酶。全细胞生物催化剂用于还原3，4-二氯苯酰甲基氯，以高产率和良好ee.到高ee.生成(K)-或(S)-氯乙醇，Barbieri等人.Tetrahedron：Asymmetry，1999，第10卷，第3931-3937页。在非水性环境——无水己烷中通过生物还原苯乙酮获得R和S构型和高对映体纯度的非外消旋的1-苯基乙基醇。Zymanczyk-Duda等人，EnzymeMicrobiol.Technol.，2004，第34卷，第578-582页。WO 02/077258描述了通过微生物还原制备某些(S)-1-(2，4-取代的-苯基)乙醇衍生物。然而，1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮的立体选择性微生物还原和酶还原仍是未知的。
可选择地，可以分离对映异构体的混合物。然而，对映异构体混合物很难、而且常常不可能分离，因为对映异构体的物理性质对于非手性物质是相同的，而且只有通过它们对于其它手性物质的行为才能得以区分。使用手性固相的色谱法已经被用于分离对映异构体混合物，但是手性固体载体很昂贵，并且拆分能力通常很差。
分离对映异构体混合物的可选择的方法是通过将它们与手性试剂反应。在这种方法中，对映异构体混合物与手性试剂反应形成非对映异构体，在其对于非手性物质的性质的基础上，所述非对映异构体彼此之间是可区分的，因此可以通过诸如重结晶或色谱等技术分离。这种方法很耗时，并且导致产率损耗，因为它需要两个额外的反应步骤(即一个反应是将手性助剂添加到对映异构体中，另一个反应是在非对映异构体已被分离之后将其取出)。
在一些情况下，手性试剂与一种对映异构体的反应会比与对映异构体混合物中另一对映异构体的反应快得多。在这种情况下，反应较快的对映异构体可以在另一对映异构体形成之前被取出。这种方法也需要两个额外的反应步骤来加入手性助剂和分离之后将其取出。
上述方法不能总是成功地应用于特定系统，当它们可以应用时，它们经常是很昂贵的、耗时的、且导致产率损耗。因此，对于从对映异构体混合物中获得单一对映异构体的新方法还存在着需求。
已知化合物的手性拆分可以利用酶例如酯酶、脂肪酶、和蛋白酶或微生物来实现。例如，美国专利第6,703,396号描述了核苷对映异构体的外消旋混合物的手性拆分，其是基于C5’-核苷酯的酶水解。美国专利第6,638,758号描述了利用诸如酶或微生物等生物催化剂进行的内酰胺外消旋酯的酶法拆分。美国专利第5,928,933号公开了对于N-(烷氧羰基)-4-酮-D，L-脯氨酸烷基酯对映体过量值为95％的酶，这是对44种酶的反应特异性进行了大量的实验的结果，包括蛋白酶、脂肪酶和酯酶。例如在Danda等人，Tetrahedron，1991，第47卷，第8701-8716页；Vanttinen等人.Tetrahedron：Asymmetry，1995，第6卷，第1779-1786页；和Liu等人，Chirality，2002，第14卷，第25-27页中描述了通过联用酶水解和化学转化制备某些旋光仲醇。
虽然生物催化剂对于分离对映异构体混合物是非常有用的，因为对映异构体的选择性和产物的光学纯度可根据对酶或微生物的选择以及底物的化学结构而改变，仍然需要大量的努力来寻找适合于底物的生物催化剂的联合。尤其是，还没有发现利用生物催化剂分离对映异构的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的方法。
发明概要
提供了制备1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的对映体纯的立体异构体的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇，它至少70％不含(1K)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇；优选至少80％不含(1K)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇；更优选至少90％不含(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇；最优选至少95％不含(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离对映异构的式(I)的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的方法：
Figure A20058003240900091
其中，R是氢、C1-C20-烷基、C3-C8-环烷基、C6-C14-芳基、C7-C15-芳烷基、C1-C20-烷氧基或C1-C20-烷氨基，其中，所述烃基可以任选被羟基、甲酰基、氧基、C1-C6-烷氧基、羧基、巯基、磺基、氨基、C1-C6-烷氨基、硝基或卤素单取代或多取代，
该方法包括下列步骤：
在水溶液、有机溶剂、或有机溶剂和含水溶剂的混合物中，将式(I)的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯与生物催化剂接触，其中，只有一种对映异构体被选择性水解，生成1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的旋光异构体和1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的未反应的旋光异构体，和
将1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的旋光异构体与未反应的旋光1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯分离。
在又一个实施方案中，本发明提供了制备(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的方法，包括下列步骤：
将对映异构的式(I)的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物：
Figure A20058003240900101
其中，R是氢、C1-C20-烷基、C3-C8-环烷基、C6-C14-芳基、C7-C15-芳烷基、C1-C20-烷氧基或C1-C20-烷氨基，其中，所述烃基任选被羟基、甲酰基、氧基、C1-C6-烷氧基、羧基、巯基、磺基、氨基、C1-C6-烷氨基、硝基或卤素单取代或多取代，
与生物催化剂在水溶液、有机溶剂、或有机溶剂和含水溶剂的混合物中接触，其中，只有(R)-对映异构体被选择性水解，生成(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物；和
将(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物转变成(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
该方法中的其它具体实施方案包括那些，其中，转变步骤包括：
a)在非质子溶剂中将(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物中的(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇与有机磺酰卤反应，形成(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的有机磺酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物；
b)在非质子溶剂中进一步将(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的有机磺酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物中的(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的有机磺酸酯与脂肪族羧酸的碱金属盐反应，形成(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的脂肪族羧酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物；和
c)将(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的脂肪族羧酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物转化成(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
该方法的又一些其它具体实施方案包括那些，其中：
R是甲基；
生物催化剂是猪肝酯酶；
在反应步骤a)中，有机磺酰卤是甲磺酰氯，和非质子溶剂是吡啶；
在反应步骤b)中，脂肪族羧酸的碱金属盐是醋酸钾，和非质子溶剂是二甲基甲酰胺；
转化步骤c)是在含醇或含水溶剂中，在碱性物质的存在下的溶剂分解作用。
该方法的又一些具体实施方案包括那些，包括在接触步骤之前通过高通量筛选法选择生物催化剂的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供了制备1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的旋光异构体的方法，包括以对映选择性的方式通过生物催化剂还原1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮，生成1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的旋光异构体的步骤。
该方法的其它具体实施方案包括那些，包括在接触步骤之前通过高通量筛选法选择生物催化剂的步骤。
该方法的其它具体实施方案包括那些，其中：
生物催化剂是马肝醇脱氢酶或红酵母属微生物。
定义
术语“生物催化剂”当用于本文中时指的是酶或微生物。
本发明中所用的酶的活性用″单位″表示。单位被定义为室温下以μmol/min表示的对硝基苯基丙酸酯的水解速率。
术语″生物转化″当用于本文中时指的是物质利用酶或微生物转化成其它化合物。
术语″生物还原″当用于本文中时指的是其中利用酶或微生物将电子加到原子或离子上(如通过加氢或去氧)的过程；该过程总是伴随着还原剂的氧化而发生。
术语″辅因子″或“辅酶”指的是激活酶或者对于酶的正常活性必需的物质。术语″辅因子″或“辅酶”当用于本文中时，指的是构成酶还原系统的任何适当的辅因子或辅酶诸如NADH、NADPH、FADH、FMNH和/或PQQ等，或与微生物中的酶伴随存在的任何适当的辅因子或辅酶。
术语″酶″包括那些那些酶，其是已知的，或者有关领域技术人员可获得的，且能够完成本发明所公开的立体选择性反应。
术语″酶还原系统″指的是合适的氧化还原酶和对于该氧化还原酶还原形式的辅因子。构成酶还原系统的酶可为游离形式或为固定化形式，例如在柱内，或附着到珠粒上。
术语″酶法拆分″、″酶过程″、″酶方法″或″酶促反应″表示的是利用酶或微生物的本发明的拆分、过程、方法或反应。
术语″拆分″表示的是外消旋形式的对映异构体的部分的、以及优选完全的分离。
术语″立体选择性水解″指的是一种对映异构体相对于另一种对映异构体的优先水解。
术语″混合物″当用于本文中涉及对映异构化合物时，表示的是具有等量(外消旋)或不等量对映异构体的混合物。
术语″对映体过量(ee)″与先前的术语″光学纯度″有关。在纯对映异构体(S或R)和外消旋体的混合物中，对映体过量是对映异构体相对于外消旋体的过量百分比。对映体过量(“ee”)可以用下列方程式1表示，例如：
方程式1
ee = [ S ] - [ R ] [ S ] + [ R ]
[S]＝S对映异构体的浓度
[R]＝R对映异构体的浓度
术语″对映选择性值″或“E值”表示的是以下定义的外消旋体的各个对映异构体的特异性常数的比(Kcat/Km)。E值可以解释为酶对一种对映异构体比对另一种反应性更大的倍数(例如，E值为50表示一种对映异构体反应比另一种快大约50倍)。
为了确定生物催化剂对纯对映异构体(S或R)的对映选择性，需要获得对映选择性值(E)(方程式2)。
方程式2
E = K catS / K S K catR / K R = ln [ 1 - c ( 1 + ee p ) ] ln [ 1 - c ( 1 - ee p ) ] = ln [ 1 - c ( 1 - ee s ) ] ln [ 1 - c ( 1 + ee s ) ]
KcatS＝对映异构体S的一级酶速率常数
KS＝米氏常数
c＝转化程度
eep＝产物的对映体过量
ees＝底物的对映体过量
例如，对于生物催化剂进行的酯的立体选择性水解来说，程序(Ee2软件-University of Graz)可以精确地计算E值，如果醇或酯在一个特定酶转化下的对映体过量(ee)已知的话。可以例如从方程式1获得ee值。可以例如通过HPLC获得[S]和[R]数据。
术语“HPLC”表示高压液相色谱。
术语“RP-HPLC”表示反相HPLC。
术语“PLE”表示猪肝酯酶。
术语″微生物还原″表示由酶还原系统、构成酶还原系统的微生物还原酶、完整微生物或其任何制品等等完成的立体选择性还原。
术语″微生物″包括任何完整的微生物或由此得到的制品，包括例如，微生物的破碎细胞制品；微生物的脱水制品，例如丙酮粉酶制品；冲洗过不含例如发酵培养基和培养肉汤等的微生物；固定的微生物，例如在柱内、附着到珠粒上等等。
当用于本文中时，术语″光学纯的″、″对映体纯的″、″纯对映异构体″和″光学纯的对映异构体″指的是包含化合物的一种对映异构体的组合物，且基本上不含该化合物相对的对映异构体。典型的光学纯的化合物包含大于约80％重量的该化合物的一种对映异构体，和小于约20％重量的该化合物相对的对映异构体，更优选大于约90％重量的该化合物的一种对映异构体，和小于约10％重量的该化合物相对的对映异构体，甚至更优选大于约95％重量的该化合物的一种对映异构体，和小于约5％重量的该化合物相对的对映异构体，最优选大于约97％重量的该化合物的一种对映异构体，和小于约3％重量的该化合物相对的对映异构体。
术语″适当的突变体″包括那些微生物，它们是相关领域技术人员已知的或可获得的，且虽然有这样的突变，却仍然能够完成本发明中公开的立体选择性反应。
术语″卤(代)″或“卤素”，当用于本文中时，除非另外说明，表示氟、氯、溴或碘。优选的卤素基团是氟、氯和溴。
术语″烷基″，当用于本文中时，除非另外说明，包括具有直链或支链部分的饱和单价烃基。
术语″烷氧基″，当用于本文中时，除非另外说明，包括O-烷基，其中烷基如上定义。
术语“Me”表示甲基，  “Et”表示乙基，和“Ac”表示乙酰基。
术语“环烷基”，当用于本文中时，除非另外说明，指的是非芳香的、饱和或部分饱和的、单环或稠合的、螺环或非稠合双环或三环的烃，在本文中指代包含总共3到10个碳原子，优选5-8个环碳原子。示范性的环烷基包括具有3-7个、优选3-6个碳原子的单环，例如环丙基，环丁基，环戊基，环己基和环庚基等。
术语″芳基″当用于本文中时，除非另外说明，包括通过去除一个氢而从芳族烃衍生的有机基团，如苯基或萘基。
发明的详细说明
本发明涉及制备1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的对映体纯的立体异构体的生物催化方法。公开的是制备所需的(S)-对映异构体的方法，该方法是基于对1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯的酶法拆分、化学酯化和化学水解伴随反转的联合，或用诸如酶或微生物等生物催化剂立体选择性生物还原2，6-二氯-3-氟-苯乙酮。
I.自动生物催化剂筛选法
根据本发明，使用有效且实用的高通量筛选(HTS)法从数百种诸如酶或微生物等潜在的生物催化剂中鉴定所需的生物催化剂，以及多种潜在的反应参数中，在这些参数下它们可以最佳发挥作用。包括溶剂、溶剂含量、pH、温度、时间和协同底物等在内的这些参数在很多时候是非线性相关的这一事实使得筛选工作更具挑战性。
已经在Pfizer内部经多个整体项目验证有效的总体HTS方案描述在Yazbeck等人，Adv.Synth.Catal.，2003，第345卷，第524-532页中。使用该方案，可以建立起数百个反应，并在数日内进行分析，否则利用简单的小瓶反应制品可能需要花费数周时间。使用该方案获得的主要优点在于它只需要极少量的生物催化剂例如可能相当昂贵的酶，以及所筛选的外消旋底物，该底物通常是以有限量提供的药物中间体。在该HTS方案背后的根本基础在于酶可以在某些制备条件下在适当的96-孔板中被稳定并保存数月。第二个基本的要求在于很多不同的分析仪器可用来分析经由这些96-孔板筛选的许多种底物。可用的一些分析工具包括高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)、气相色谱(GC)、UV分光光度法和液相色谱质谱联用(LC-MS)。选择利用哪个分析工具取决于底物的性质，主要是它的吸光度特性和挥发性。通常首先分析酶对底物的反应性，接着利用手性方法分析反应标的(reactive hits)。同一采样的96-孔板既可以用于分析反应性又可以用于分析对映选择性。该筛选方案与统计学优化算法联用可以迅速有效地让用户预测重要条件，和提出在哪里应进行进一步优化。
II.通过联用酶法拆分和化学转化制备旋光1-(2，6-二氯-3-氟苯基) 乙醇
提供了拆分1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇对映异构体混合物的方法。
在一个实施方案中，该方法包括使用诸如酶或微生物等优先催化混合物中一种对映异构体的反应的生物催化剂。在优选实施方案中，该方法包括酶法拆分，其是基于1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯的立体选择性水解。
在另一个实施方案中，基于物理结构的新的区别，反应过的对映异构体可从未反应的对映异构体中分离。
在又一个实施方案中，通过化学转化伴随反转可将反应过的对映异构体转变成另一种对映异构体。
在又一个实施方案中，反应过的对映异构体向另一种对映异构体的转变可在反应过的对映异构体和未反应的对映异构体的混合物中进行。
II(a).基于1-(2，6-二氯氟苯基)乙基酯的立体选择性水解的 酶法拆分
提供了酶法拆分1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇对映异构体混合物的立体选择性水解方法。按照本文的公开，本领域技术人员将能够利用上述高通量筛选(HTS)法选择酶或微生物，所述酶或微生物对于所选择的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯对映异构体是选择性的，或对于不希望的对映异构体是选择性的(作为消除它的方法)，通过选择以下讨论的酶或微生物中的一种，或通过系统评价其它已知的酶或微生物。按照该公开，当对于获得所希望的拆分必需时，本领域技术人员还将能知道如何修饰底物。通过利用手性NMR位移试剂、旋光分析或手性HPLC，可以测定回收的酯或醇的旋光富集。参见例如J.Am.Chem.Soc.1973，第95卷，第512页；Trost等人，J.Org.Chem.1986，第51卷，第2370-2374页；J.Org.Chem.1998，第63卷，第8957页；Tetrahedron：Asymmetry 1995，第6卷，第2385页；Tetrahedron：Asymmetry 1996，第7卷，第3285页。
下列实施例进一步阐示了使用酶或微生物来拆分对映异构体的外消旋混合物。拆分外消旋混合物的其它已知方法可以与本文公开的拆分方法联合使用。参见例如Roger A Sheldon，Chirotechnology：industrial synthesis of optically active compounds，New York，Marcel Dekker，1993。所有这些修饰都认为在本发明范围之内。
在该实施方案中，该方法包括使1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇对映异构体混合物的羟基与酰基化合物反应，形成酯，其中，1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇在酯的″原醇(carbinol)″末端。然后用生物催化剂处理1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯对映异构体混合物，该生物催化剂优先裂解或水解一种对映异构体，而非另一种对映异构体。
该方法的优点在于它可以用于拆分多种在原醇部分中被任选取代的1-(苯基)乙醇。该方法的宽适用性可以部分在于如下事实：虽然酯的原醇部分可以在生物催化剂区分对映异构体的能力中发挥作用，但是这些生物催化剂的主要识别部位却可以在酯的羧酸部分。进一步地，人们可以成功地将一种生物催化剂/底物研究的结果外推到另一个表面上不同的系统，只要这两种底物的羧酸部分相同或基本相似。
该方法的另一个优点在于未水解的对映异构体和水解的对映异构体从反应混合物中的分离可以相当简单。未水解的对映异构体可以比水解的对映异构体更亲脂，且可以通过用很多非极性有机溶剂或溶剂混合物例如己烷和己烷/乙醚中的一种进行简单萃取而有效回收。然后，亲脂性较弱的、极性较强的水解了的对映异构体可以用极性更大的有机溶剂例如乙酸乙酯萃取获得，或通过冻干，接着例如用乙醇或甲醇萃取。
酶或微生物可单独使用或联合使用。根据所用的酶或微生物的类型，酯的任一种旋光异构体被主要地水解产生旋光醇。可通过选择适当的酶或微生物获得任一种旋光异构体。
将酶和底物适当匹配之后，可以建立起分离任一1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇对映异构体的条件。可以用水解所需的对映异构体的酶处理外消旋混合物(接着用极性溶剂萃取极性水解产物)，或用水解不想要的对映异构体的酶处理外消旋混合物(接着用非极性溶剂除去不想要的对映异构体)，分离所需的对映异构体。
II(b).生物催化剂
在本发明的一个实施方案中，酶法拆分法利用作为立体选择性水解1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯的生物催化剂的酶。催化酯水解的酶的实例包括但不限于酯酶、脂肪酶和蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶(substillisin)和α-糜蛋白酶)。酶可为可从动物、植物、微生物等获得的任何酶。酶可以任何常规形式使用，例如纯化形式、粗制形式、与其它酶的混合物、微生物发酵肉汤、发酵肉汤、微生物体、发酵肉汤的滤液等，或者单独使用，或者联合使用。另外，酶或微生物体可固定在树脂上。
酶的具体实例是在本发明中有用的从动物和植物中获得的那些酶，包括但不限于，牛肝酯酶、猪肝酯酶、猪胰酯酶、马肝酯酶、狗肝酯酶、猪磷酸酶、可从大麦和马铃薯中获得的淀粉酶、和可从小麦中获得的脂肪酶。例如，在不对称合成中应用猪肝酯酶描述在Tetrahedron，1990，第46卷，第6587-6611页；Enzyme Catalysisin Organic Synthesis，第2版，Wiley-VCH 2002，第II卷，第384-397页中。其它实例是从诸如以下的微生物中获得的水解酶，如红酵母属、木霉属、假丝酵母属、汉森酵母属、假单胞菌属、杆菌属、无色杆菌属、诺卡菌属、色杆菌属、黄杆菌属、根霉属、毛霉属、曲霉属、产碱杆菌属、片球菌属、克雷白杆菌属、地霉属、乳杆菌属(Lactobaccilus)、隐球菌属、毕赤氏酵母属、短梗霉属、放射毛霉属(Actinomucor)、肠杆菌属、球拟酵母属、棒状杆菌属、内孢霉属、糖酵母属(Saccaromyces)、节杆菌属、梅奇酵母属(Metshnikowla)、灰侧耳菌属(Pleurotus)、链霉菌属、变形菌属、胶霉属、醋酸杆菌属、长蠕孢属、短杆菌属、埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、犁头霉属、微球菌属、细杆菌属、青霉属和裂褶菌属(Schizophyllium)，以及从地衣和藻类中获得的。
适用于本发明的示范性的商业可获得的酶包括酯酶，如猪肝酯酶(Biocatalytics Inc)，脂肪酶，如Amano PS-30(洋葱假单胞菌)，Amano GC-20(念珠地丝菌)，Amano APF(黑曲霉)，Amano AK(假单胞菌)，萤光假单胞菌脂肪酶(Biocatalytics Ltd.)，Amano Lipase P30(假单胞菌)，Amano P(萤光假单胞菌)，Amano AY-30(柱状假丝酵母)，Amano N(雪白根霉)，Amano R(青霉菌)，Amano FAP(稻根霉)，AmanoAP-12(黑曲霉)，Amano MAP(米赫毛霉)，Amano GC-4(念珠地丝菌)，Sigma L-0382和L-3126(猪胰)，Lipase OF(Sepracor)，Esterase30,000(Gist-Brocarde)，KID Lipase(Gist-Brocarde)，Lipase R(根霉属，Amano)，Sigma L-3001(麦胚)，Sigma L-1754(柱状假丝酵母)，Sigma L-0763(粘稠色杆菌)和Amano K-30(黑曲霉)。另外，来自动物组织的典型的酶包括来自胰腺的糜蛋白酶和胰酶，如猪胰脂肪酶(Sigma)。当执行本发明的方法时，可利用两种或多种以及单个酶。
另外，可以使用丝氨酸羧基肽酶。这些酶来自溶脂念珠菌、酿酒酵母、小麦(Triticum aestivum)和微紫青霉菌。可商购的交联酶结晶也可使用，例如来自Altus Biologics，Inc.(例如ChiroCLEC-CR、ChiroCLEC-PC、ChiroCLEC-EC)。
本发明还涉及耐热酯酶和遗传工程酯酶在酯类拆分中的应用。可购自ThermoGen，Inc.的这些酶尤其适用于工业过程，且易于使用。除了在大范围温度包括高温下起作用以外，这些耐热酶具有延长的储存期，这有利于操作。由于它们在操作条件下的稳定性，这些酶也能耐受通常与工业加工有关的苛刻的非生物条件(pH、盐浓度等)。在多次应用中，它们可以被固定进行再使用，提高了操作过程的费用效益。
在酶法拆分之后分离产物的过程中，酶经常暴露于痕量有机溶剂。另外，发现一些酶法拆分在含水溶剂和有机溶剂的混合物中，或在单独的有机溶剂中能很好地工作。本发明的酯酶相对于常规酶更能耐受很多有机溶剂的变性作用，这带来了更长时间的操作半寿期。大部分酯酶是利用基因克隆的遗传工程技术生产的，这确保了这些酶的纯度，和在规模扩增期间易于过程控制。代替分离的酶，还可利用可以产生任意以上讨论的酶的微生物。
在本发明的另一个实施方案中，酶法拆分法利用微生物作为立体选择性水解1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯的生物催化剂。在本发明中有用的微生物的具体实例包括但不限于小红酵母、深红酵母、克鲁氏假丝酵母、柱状假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、莓实假单胞菌、恶臭假单胞菌、萤光假单胞菌、铜绿假单胞菌、华根霉、微小毛霉、黑曲霉、粪产碱杆菌、耶耳氏球拟酵母、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草杆菌黑色变种、弗罗因德枸橼酸杆菌、变易细球菌、藤黄微球菌、乳酸片球菌、肺炎克雷白杆菌、透孢犁头霉、白地霉、裂褶菌、均匀诺卡菌津山(tsuyanarenus)变种、均匀诺卡菌、巧克力色杆菌、异常汉森酵母ciferrii变种、异常汉森酵母、多形汉森酵母、水解无色杆菌、极小无色杆菌、Achromobactersinplex、白球拟酵母、腐烂棒杆菌、地霉内孢霉、Saccaromycescarrvisial、球形节杆菌、灰色链霉菌、藤黄微球菌、阴沟肠杆菌、马棒状杆菌、干酪乳杆菌、白色隐球菌、多形毕赤氏酵母、常见青霉、出芽短梗霉菌、雅致放射毛霉、灰色链霉菌、普通变形杆菌、粉红粘帚霉、绿粘帚霉、金黄醋杆菌、长蠕孢属、碘色杆菌、青紫色杆菌、泥色黄杆菌、美极梅奇酵母、糙皮侧耳、产氨短杆菌、乳发酵短杆菌、大肠埃希杆菌、小红酵母texensis变种、长枝木霉、爪哇毛霉、树状黄杆菌、肝素黄杆菌和荚膜黄杆菌。
在本发明中所用的酶和/或微生物可为粗产物形式或为固定化形式。它们可以固定在各种固体载体上而不丧失其立体专一性或改变其立体选择性。固体载体可以是惰性吸附剂，酶不共价键合到它上面。取而代之的是，酶例如通过蛋白质的疏水或亲水部分与惰性吸附剂的相似区域的相互作用，通过氢键，通过盐桥形成，或通过静电相互作用而被吸附。惰性吸附材料包括但不限于，合成聚合物(例如聚苯乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯和聚酰胺)，矿物化合物(mineralaceous compounds)(例如硅藻土和漂白土)，或天然存在的聚合物(例如纤维素)。这样的材料的具体实例包括Celite 545硅藻土、Abelite XAD-8聚合树脂珠粒和聚乙二醇8000。
酶也可固定在酶与之共价键合的载体(例如环氧乙烷-丙烯酸珠粒和戊二醛活化的载体)上。具体实例包括Eupergit C环氧乙烷-丙烯酸珠粒和戊二醛活化的Celite 545。其它可能的固定系统是公知的，且对于酶固定化领域的技术人员来说是易于获得的。
代替上述常规固定法，还可通过用硫酸铵简单沉淀出用过的酶，而将酶方便地再循环重复利用。沉淀出的酶-硫酸铵可以直接用于下一酶水解。盐通常用于酶的纯化。它们通常通过降低溶剂的活性而保护蛋白质酶。例如硫酸铵、硫酸钾、磷酸钾、氯化钠等可以用于使酶活性恢复再生。
酶或微生物可单独使用或联合使用。根据所用的酶或微生物的类型，酯的任一旋光异构体被主要水解生成旋光醇。可通过选择适当的酶或微生物获得任一旋光异构体。
II(c).底物
利用所选的酶系统通过评价多种同系物可以确定用于酯化1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的最有效的酰基，而不需过度的实验。可以被评价用于具体的酶或微生物的酰基的非限制性实例包括烷基羧酸和取代的烷基羧酸，包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸。对于某些酶或微生物来说，可能优选使用显著吸电子的酰基化合物以通过弱化酯键而促进水解。吸电子酰基的实例包括α-卤代酯，如2-氯丙酸、2-氯丁酸和2-氯戊酸。α-卤代酯对于脂肪酶是极好的底物。另外，使用琥珀酸酐作为酰化剂通过脂肪酶-催化的酰化作用来实践拆分芳基-烷基醇已经报道在了Bouzemi等人.Tetrahedron Lett.，2004，第45卷，第627-630页中。
本领域已知的不同酯化方法可用于制备1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯底物。参见例如J.Chem.Soc.Chem.Commun.1989，第18卷，第1391页；J.Org.Chem.1994，第59卷，第6018页。
II(d).酶水解的反应条件
本发明的酶水解可通过将1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯与酶或微生物接触来进行，通常在适当搅拌的含水缓冲介质中。
缓冲介质可为无机酸盐缓冲液(例如磷酸二氢钾、磷酸二氢钠)、有机酸盐缓冲液(例如柠檬酸钠)、或任何其它合适的缓冲液。缓冲液的浓度可为0.005到2M，优选0.005到0.5M，这将取决于特定1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯和所用的酶或微生物。
在非均一条件下进行的酶水解可能会导致重现性差。因此，优选水解在均一条件下进行。根据1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯的溶解度，通过使用表面活性剂可以实现均一性。优选的表面活性剂包括但不限于非离子表面活性剂，如烷基芳基聚醚醇。优选的表面活性剂是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，以Triton X-100(Sigma Chemical Company)可商购。使用有效量的表面活性剂。典型的量可以是0.05％到约10％(v/v)。
然而，这些表面活性剂不仅仅帮助溶解原料，它们还增强产物的水溶性。因此，虽然通过加入非离子表面活性剂可以比在非均一条件下更有效地进行酶促反应，然而回收的原料和产物的分离却可能更困难。可以用适当的色谱和化学(例如选择性盐形成)技术分离产物。
有时优选加入有效量的有机共溶剂来增大产物的溶解度以促进反应。共溶剂的实例包括但不限于乙腈、THF、DMSO、DMF、醇类等。有效量的共溶剂包括1％到30％(v/v)，这取决于特定1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯和所用的酶或微生物。
酶水解通常是用催化量的酶在含水缓冲液中进行，该缓冲液具有接近于所述酶的最佳pH的pH。当反应进行时，由于释放出的羧酸而导致pH下降。可以加入含水的碱来将pH维持在接近于该酶的pH的最佳值。通过监测pH改变和维持pH所需的碱的量可以很容易地确定反应进程。
缓冲液的pH或反应的pH通常为4到10，优选5到9，最优选7到8。反应温度可为0到100℃，且要取决于具体的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯和所用的酶或微生物。反应时间通常为1小时到70小时，且要取决于具体的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯、酶浓度和所用的酶或微生物。正常地，允许酶水解进行足以产生令人满意量的所需的酯或令人满意光学纯度的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的一段时间。当反应进行时，可以通过HPLC和手性HPLC监测所需的酯或醇的量及其光学纯度。正常地，转化进行至大约50％，之后可经过分离以良好的产率获得醇和酯。
所用的酶的量可在很大范围内变化，从5单位到12,000单位的酶每摩尔原料。所需的酶的量将取决于温度，具体的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯，所用的酶和/或微生物，以及所需的反应时间。在一些情况下也可能想要使用大量的酶来确保实践中很短的反应时间，尤其是当酶是固定化的且可以重复利用多次周转的时候。酯底物的浓度可为0.1g/L到500g/L，这取决于具体的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯和所用的酶和/或微生物。
II(e).产物分离
可以使用常规方法从水解混合物中分离所需的产物，光学纯的(或富集的)未反应的酯和光学纯的(或富集的)醇，上述方法例如提取、酸-碱提取、过滤、色谱法、结晶或其组合。Andreas Liese，等人，Industrial Biotransformations，Weinheim：WILEY-VCH，2000。回收的酶或微生物可如上所述再循环利用。
II(f).基于酯化和化学水解伴随反转的对映异构转化
根据本发明，任一1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇对映异构体可转化为另一种1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇对映异构体，如果需要的话。可通过例如伴随着立体反转的C-1处的亲核取代反应进行这种转化。可以使用亲核试剂进行这样的反应。
将旋光醇转化成对应的对映异构体的方法包括但不限于以下方法。
例如，一种方法包括将特定对映异构体的不对称碳原子上的羟基转化成有机磺酸酯，优选甲磺酸酯或对甲苯磺酸酯，其经由其一种羧酸酯及其随后的溶剂分解或水解，通过亲核取代和构型反转直接转变成另一种对映异构体。磺酸酯是由已知方法制备的，通过将任一1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇对映异构体与有机磺酰卤、优选甲磺酰氯和对甲苯磺酰氯反应，在非质子溶剂、优选吡啶和二氯甲烷中反应，如果适当的话，在碱例如三乙胺的存在下。
例如在Danda等人，Tetrahedron，1991，第47卷，第8701-8716页；和Wang等人，J.Med.Chem.，2000，第43卷，第13期，第2566-2574页中描述了一种方法，包括用发烟HNO3或甲磺酰氯将旋光醇酯化成硝酸酯或甲磺酸酯，在中性(在0.7到2.0当量CaCO3或NaOAc的存在下)、碱性(K2CO3)或酸性条件(2.5％H2SO4水溶液或2.5％HNO3水溶液)下立体反转水解所得的硝酸酯或甲磺酸酯。
例如在J.Am.Chem.Soc.，1965，第87卷，第3682页；和J.Chem.Soc.，1954，第965页中描述了一种方法，包括将旋光醇转化成诸如对甲苯磺酸酯等磺酸酯，让有机酸盐诸如醋酸四乙铵和醋酸钠(和乙酸)与所得的磺酸酯反应，立体反转成相应的有机酸酯，并水解所得的有机酸酯。
例如在Chem.Lett.，1976，第893页中描述了一种方法，包括将旋光醇酯化成诸如三氯乙酸酯等羧酸酯，并在诸如75％H2O-二烷等水-醚溶剂中水解所得的酸酸酯。
另一个实例是Mitsunobu反应，该反应包括将旋光醇与有机酸在三芳基膦(例如三苯基膦)和偶氮二羧酸酯如偶氮二羧酸二乙酯的存在下反应，形成立体反转的相应的有机酸酯，并水解所得的酯。有机酸包括例如甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸和苯甲酸等。有机酸酯的形成可在例如约-60℃到60℃的温度下进行。反应可在惰性溶剂如芳族烃(例如苯、甲苯等)和醚(例如四氢呋喃等)中进行。基于1摩尔旋光醇，三烷基膦、有机酸和偶氮二羧酸酯的比例分别是约0.7到2.0摩尔。通过诸如酸性水解或碱性水解等常规方法可以进行有机酸酯的水解。参见例如Synthesis，1981，第1页；Danda等人，Tetrahedron，1991，第47卷，第8701-8716页；Vanttinen等人.Tetrahedron：Asymmetry，1995，第6卷，第1779-1786页；和Liu等人，Chiraliry，2002，第14卷，第25-27页。
II(g).酶水解、酯化和化学水解伴随反转的联用
酶法拆分法的一个主要的限制在于最大产率是基于外消旋体的50％。作为克服这个限制的方法，可使用酶水解、酯化和化学水解伴随反转的联用。参见例如Danda等人，Tetrahedron，1991，第47卷，第8701-8716页；Vanttinen等人.Tetrahedron：Asymmetry，1995，第6卷，第1779-1786页；和Liu等人，Chirality，2002，第14卷，第25-27页。
根据本发明，基于上述过程的一锅内的酯化和化学水解伴随反转，通过酶水解获得的光学纯的(或富集的)未反应的酯和光学纯的(或富集的)醇的粗混合物可以进行对映异构的转变。
根据1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯底物，适当的酶或微生物可以用于酶水解，且可以选择适当的化学水解条件。例如，未反应的(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯和反应过的(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇未分离的粗反应物可以用甲磺酰氯来酯化，如在Danda等人，Tetrahedron，1991，第47卷，第8701-8716页；和Wang等人，J.Med.Chem.，第43卷，第2566-2574页中所述。接着，所得的相应的(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基甲磺酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯未纯化的粗混合物可以水解得到(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇，(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基甲磺酸酯反转了，而(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯保留。在具体实施方案中，1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯底物是1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯。在具体实施方案中，酶是猪肝酯酶。
将(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇转化成(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的方法也可以应用于将(S)-对映异构体转变成(R)-对映异构体。
II(h).外消旋作用和应用于动态动力学拆分
任一光学纯的(或富集的)未反应的酯和光学纯的(或富集的)醇可以被外消旋化，如果想要的话。光学纯的(或富集的)未反应的酯可以在适当条件下，在适当碱中，通过加热而被外消旋化。可选择地，光学纯的(或富集的)未反应的酯可以在适当条件下，在醇的存在下，在酸中通过加热而被外消旋化。光学纯的(或富集的)未反应的醇也可以在适当条件下，在酸中，通过加热而外消旋化和转变成外消旋的酯。以这种方式，通过这种联用立体选择性酶水解和外消旋技术可以获得极好产率的任一光学纯的(或富集的)未反应的酯或光学纯的(或富集的)醇。
例如，动态动力学拆分法(或二级不对称转化)可以用于仲醇，其中，在酶法拆分过程中，醇被诸如基于钌的催化系统等金属催化剂不断地外消旋化。Dijksman等人，Tetrahedron：Asymmetry，2002，第13卷，第879-884页；Kim等人，J.Am.Chem.Soc.，2003，第125卷，第11494-11495页；Choi等人，J.Org.Chem.，2004，第69卷，1972-1977。
II(i).酶催化的酰化作用
酶促反应已被证明对于通过动力学拆分从外消旋形式中获得光学富集的化合物是一种方便的方法。C.-H.Wong和G.M.Whitesides，Enzymes in Synthetic Organic Chemistry，Pergamon，Oxford(1994)；K.Faber，Biotransformations in Organic Chemistry，Springer，Berlin(1995)；Gotor，Vicente.“Enzymes In OrganicSolvents：The Use Of Lipases And(R)-Oxynitrilase For ThePreparation Of Products Of Biological Interest.”Molecules[Electronic Publication]2000，第5卷，第290-292页。
例如，在通常不可逆的反应中，醇可以用烯醇酯通过脂肪酶-催化的酯交换(酰化)而拆分。Y.F.Wang，J.J.Lalonde，M.Momongan，D.E.Bergbreiter and C.-H.Wong.J.Am.Chem.Soc.1988，第110卷，第7200-7205页。然而，制备感兴趣的是，该过程需要(i)高对映选择性因子E，(ii)从产物(酯)中容易分离未反应的底物(醇)。已显示使用环酐作为酰化剂为该需求提供了便利的解决方法。Bouzemi等人.Tetrahedron Lett.，2004，第45卷，第627-630页。所产生的酸-酯可以通过简单的碱水溶液-有机溶剂液-液萃取而从未反应的醇中容易地分离。而且，由于这些化合物的分离是容易的，即使产物和未反应的底物的量有很大区别，也可以从外消旋底物获得高对映体纯度的醇，即使在E值很低的情况下，只要酰化作用进行到了高转化率。
可以用溶于二乙醚的外消旋底物进行反应。然后可以加入乙酸乙烯酯或乙酸异丙烯酯(2当量)或琥珀酸酐(1当量)，接着加入酶。例如，可以使用可商购的脂肪酶，如萤光假单胞菌脂肪酶(PFL)和南极假丝酵母脂肪酶B(CAL B)，这是一种固定化酶。所得的混合物可以在室温下搅拌合适的时间，以达到大约50％的转化率。用烯醇酯作为酰化剂，通过硅胶快速色谱分离未反应的醇和所产生的乙酸酯。在分离之前用手性HPLC通过分析可测定这两种化合物的ee。用琥珀酸酐作为酰化剂，未反应的醇例如(S)-醇和所产生的(R)-单琥珀酸酯可以通过碱水溶液-有机溶剂液-液萃取分离。可以用氢氧化钠使水相变成碱性，所得的(R)-醇用有机溶剂萃取。未反应的(S)-富集的-醇和所产生的(R)-富集的-醇的对映体过量可以通过例如手性HPLC来评价。
III.1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮的对映选择性生物还原
本发明提供了制备1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇旋光异构体的方法，包括以对映选择性的方式在水溶液、有机溶剂、或有机溶剂和含水溶剂的混合物中，通过生物催化剂还原1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮，得到1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇旋光异构体的步骤。根据本文的公开，通过选择一种本文讨论的酶或微生物，或通过系统评价其它已知的酶或微生物，本领域技术人员将能够利用上述高通量筛选(HTS)法选择将1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮选择性还原成任一1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇对映异构体的酶或微生物。本领域技术人员将在本文提供的说明的基础上明白如何选择生物还原反应的条件，以实现所需的立体选择性。通过使用手性NMR位移试剂、旋光分析或手性HPLC，可以测定回收的醇的光学富集。参见例如J.Am.Chem.Soc.1973，第95卷，第512页；Trost等人，J.Org.Chem.1986，第51卷，第2370-2374页；J.Org.Chem.1998，第63卷，第8957页；Tetrahedron：Asymmetry 1995，第6卷，第2385页；Tetrahedron：Asymmetry 1996，第7卷，第3285页。
然后在它优选在某些对映体富集的、醚连接的2-氨基吡啶类似物(该2-氨基吡啶类似物能有效抑制人肝细胞生长因子受体的自磷酸化作用)的合成中用作中间体(如本文实施例3所述)之前，从任何残留的底物和其它反应组分中，利用本领域公知的方法(例如可以用适当的溶剂如MeOH萃取反应混合物，和用RP-HPLC分析；相应的醇可以从其它有机物中通过快速色谱分离，和纯化了的醇可以用手性HPLC分析，参见例如Allenmark等人.Enzyme Microbial Technol.，1989，第11卷，第177-179页)，任选分离所需的对映异构体，例如(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
一般而言，通过本发明的立体选择性生物还原过程，只有极少量(例如约1％ee到约5％ee)(如果有的话)的所需的对映异构体被生产出来。然而如果希望，所需的对映异构体的量可以从不想要的对映异构体的量中被实质分离出来，例如通过结晶。
本发明的方法很容易实现。因此，在一定量底物1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮的存在下，酶或微生物或者被温育(酶、破碎的细胞制品、脱水制品或任何其它合适的微生物制品)，或者被发酵(完整的微生物)，由此一步产生比不想要的对映异构体更大量的所需的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇对映异构体，导致光学富集的对映异构体。
对于本发明方法来说原则上适合的是能够将羰基化合物或醛还原成醇的所有微生物，如真菌、酵母或细菌，或酶或酶系统，如各种醇和醛脱氢酶，乳酸或甲酸脱氢酶，优选醇和醛脱氢酶。在培养后(湿生物量)或在冻干后(干物质)，微生物可以直接用于本发明的方法。有利地使用的微生物或酶是能够将1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮还原成所需的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇对映异构体，且对映体纯度超过85％ee，优选超过90％ee，和特别优选超过9 5％ee的那些微生物或酶。合适的微生物的实例是下列各属的生物：产碱杆菌属、曲霉属、白僵菌属、假丝酵母属、隐球菌属、弯孢霉属、色二孢属、拟内孢霉属、地霉属、汉森酵母属、克勒克酵母属、克鲁维酵母属、乳杆菌属、毛霉属、诺卡菌属、青霉属、Pfaffia、毕赤氏酵母属、假单胞菌属、红球菌属、红酵母属、糖酵母属、裂殖糖酵母属、Sporidiobolus、链霉菌属、球拟酵母菌属或耶氏酵母属。有利地使用上述属的以下种：富养产碱菌、黑曲霉、烟曲霉、巴西安白僵菌、吉利蒙假丝酵母、溶脂念珠菌、璞膜假丝酵母、Candida methylica、近平滑念珠菌、木兰假丝酵母(Candida magnoliae)、皱摺假丝酵母、产朊假丝酵母、镰形弯孢霉、棉色二孢、瘦弱隐球菌、念珠地丝菌、异常汉森酵母、Hansenulabeckii、Hansenula holstii、温奇氏汉森酵母、多形汉森酵母、毛霉属、珠红诺卡菌、Pfaffia rhodozyma、Pichia glucozyma、发酵性毕赤氏酵母、Pichia capsulata、季也蒙毕赤氏酵母、膜醭毕赤氏酵母、巴斯德毕赤氏酵母、萤光假单胞菌、洋葱假单胞菌、红串红球菌、赤红球菌、深红酵母、纤细红酵母、胶粘红酵母、小红酵母、Rhodotorulatermusruber、酿酒酵母、葡萄汁酵母、乳品酵母、鲁酵母、巴斯德酵母、Saccharomyces kluyveri、日本裂殖糖酵母、解苹果酸裂殖糖酵母、八孢裂殖糖酵母、粟酒裂殖糖酵母、Torulopsis enokii、Torulopsis methanothermo和解脂耶氏酵母。优选使用各种酵母属，如假丝酵母属、汉森酵母属、克勒克酵母属、克鲁维酵母属、Pfaffia、毕赤氏酵母属、红酵母属、糖酵母属、裂殖糖酵母属、球拟酵母菌属和耶氏酵母属。尤其优选使用的是下列属和种：吉利蒙假丝酵母、溶脂念珠菌、璞膜假丝酵母、Candida methylica、近平滑念珠菌、木兰假丝酵母、皱摺假丝酵母、产朊假丝酵母、异常汉森酵母、Hansenulabeckii、Hansenula holstii、温奇氏汉森酵母、多形汉森酵母、Pfaffiarhodozyma、Pichia glucozyma、发酵性毕赤氏酵母、Pichiacapsulata、季也蒙毕赤氏酵母、膜醭毕赤氏酵母、巴斯德毕赤氏酵母、深红酵母、纤细红酵母、胶粘红酵母、小红酵母、Rhodotorulatermusruber、酿酒酵母、葡萄汁酵母、乳品酵母、Saccharomyceskluyveri、鲁酵母、巴斯德酵母、Saccharomyces kluyveri、日本裂殖糖酵母、解苹果酸裂殖糖酵母、八孢裂殖糖酵母、粟酒裂殖糖酵母、Torulopsis enokii、Torulopsis methanothermo和解脂耶氏酵母，非常特别优选下列属和种：深红酵母、酿酒酵母、葡萄汁酵母、日本裂殖糖酵母、发酵性毕赤氏酵母、多形汉森酵母、纤细红酵母、产朊假丝酵母和木兰假丝酵母。
微生物可进行遗传转化，以提高细胞内的酶生产，在同一细胞内提供辅酶-再生的酶，由于细胞内存在底物特异性重叠但对映选择性不同的两个以上的酶而提高较差的对映选择性，解决过度代谢的问题，等等，例如在Nakamura等人.Tetrahedron：Asymmetry，2003，第14卷，第2659-2681页中所述。
一种或多种任何适合的微生物可用于本发明的过程。如早先所述，在主题过程中所用的微生物可以是完整的，其任何适合的制品，例如其破碎的细胞制品、其脱水的制品，且是游离的或固定化的。然而，当不完整的微生物用于本发明的时候，例如破碎的细胞制品，如细胞提取物、丙酮粉酶制品、或由此得到的酶，本领域技术人员将能理解，酶的适当的辅因子也包括在内。
本领域技术人员将从本文提供的说明及其相关知识中理解如何制备合适的破碎细胞制品，例如描述在Patel等人，Appl.Environ.Microbiol.，1979，第38卷，第219-223页中。本领域技术人员将从本文提供的说明及其相关知识中理解如何制备合适的丙酮粉酶制品，例如描述在Nakamura等人，Tetrahedron Lett.，1996，第37卷，第1629-1632页；Nakamura等人，Tetrahedron：Asymmetry，2003，第14卷，第2659-2681页中。
酶可为可从动物、植物、微生物等中获得的任何酶。酶可以任何常规形式被利用，例如以纯化形式、粗产物形式、与其它酶的混合物、微生物发酵肉汤、发酵肉汤、微生物体、发酵肉汤滤液等等，或者单独，或者联用。另外，酶或微生物体可固定在树脂上。
另外，任何合适的微生物的酶(例如氧化还原酶)也可用于本主题过程，并且这种酶可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法从微生物中分离，且如同完整的微生物，可以游离形式或固定化形式用于本主题过程。本领域技术人员将从本文提供的说明及其相关知识中理解如何分离并纯化合适的微生物的酶，例如描述在WO 03/093477中。
适用于本发明的典型可商购的酶包括脱氢酶和还原酶，其分类为E.C.1.1.1，且能够催化羰基还原，例如来自Biocatalytics，Inc.的KRED-M27 KIT酮还原酶，马肝醇脱氢酶(Grunwald等人，J.Am.Chem.Soc.，1986，第108卷，第6732-6734页；Johansson等人，Eur.J.Biochem.，1995，第227卷，第551-555页；Adolph等人，Biochemistry，2000，第39卷，第12885-12897页；Wong等人.Terahedron Organic Chemistry，1994，第12卷，第149-150页)，酵母醇脱氢酶，Thermoanaerobium brokii醇脱氢酶和高加索酸奶乳杆菌醇脱氢酶。
酶的天然底物是醇，如乙醇、乳酸酯、甘油等，和相应的羰基化合物；然而，非天然的酮也可以被对映选择性还原。为了表现出催化活性，酶需要辅酶，如NADH或NADPH，氢化物从该辅酶被转移到底物羰基碳。有四种立体化学模式能使氢化物从辅酶NAD(P)H转移到底物。对于E1和E2酶，氢化物攻击羰基的si-面，而对于E3和E4酶，氢化物攻击re-面，这分别导致(R)和(S)-醇的形成。另一方面，E1和E3酶转移辅酶的前-(R)-氢化物，而E2和E4酶则利用前-(S)-氢化物。E1-E3酶的实例如下：
E1：假单胞菌醇脱氢酶
高加索酸奶乳杆菌醇脱氢酶
E2：念珠地丝菌甘油脱氢酶
爪哇毛霉菌二羟基丙酮还原酶
E3：酵母醇脱氢酶
马肝醇脱氢酶
莫拉菌醇脱氢酶
酶的定向进化可用于改善酶的还原功能，或用于还原的生物催化剂可通过利用例如Nakamura等人.Tetrahedron：Asymmetry，2003，第14卷，第2659-2681页中所述的催化抗体技术而得以修饰。
适用于本主题的立体选择性微生物还原的微生物可通过本领域技术人员已知的任何适当的方法制备。下面提供了从商业购买的原种制备微生物的适当方法的实例。下面提供的方法可用于适用于本发明方法的任何微生物，本领域技术人员将会从本文提供的说明中明白如何修改操作的任何部分，例如制备游离或固定的、洗过的或未洗过的微生物的方法；将一定量的底物与微生物接触的方法；生长培养基组分和条件，例如温度和pH等；或培养条件，以在任何特定方法中达到想要的结果。
本领域技术人员将从本文提供的说明中明白如何制备合适的固定化的微生物，例如在Bauer等人，Biotechnol.Lett.，1996，18，第343-348页中所述，或合适的固定化的酶，例如在Svec，F.；Gemeiner，P.“Engineering aspects of carriers for immobilizedbiocatalysts.”Biotechnology & Genetic Engineering Reviews1996，第13卷，第217-235页中所述。
将一定量的底物与微生物或酶还原系统接触的任何合适的方法可以用于本发明。底物可以以任何合适的顺序与微生物或酶还原系统接触。例如，底物可以添加到培养基中，例如包含微生物的培养肉汤，微生物是游离的或固定的，或其某种组合；或培养基可以包含底物，然后微生物可以添加到这样的培养基中；或底物和微生物可以一起添加到这样的培养基中；或底物可以添加到其破碎的细胞制品中；或底物可以添加到微生物的脱水制品中；或底物或者微生物或酶还原系统任一者可以添加到包含另一者的适当的溶剂中；等等。例如，酶还原系统可以添加到略微有机的溶剂中，通过将底物添加到该溶剂中而发生接触。本领域技术人员也将根据本说明书明白如何通过添加吸附到树脂上的底物而进行接触。而且，本领域技术人员将从本文提供的说明中明白如何按照期望修改主题方法的任何部分。
对于本发明的方法来说，微生物可以首先在限制氮的条件下培养，在例如通过离心分离收获细胞之后，用于本发明的方法。可以用完整的细胞、从细胞获得的细胞消化液或酶粗提物、或纯化的酶进行还原。该方法可以在水性介质中，在碳源的存在下(在全细胞的情况下)，或在诸如NADH或NADPH等还原剂的情况下，和在辅因子再循环的情况下(例如借助于甲酸脱氢酶和甲酸，并且适当的话，其它酶)(在细胞消化液、粗提物或纯酶的情况下)进行。在全细胞的还原中进一步添加营养素，例如氮源、维生素或磷酸盐是不适当的，因为在这些条件下观察到了不希望的副反应，例如，可以导致产物品质缺陷，或后处理问题。对于微生物适合的碳源是能够给细胞提供还原所必需的还原当量的所有碳源。在此可提及的碳源的实例是单糖或二糖，如葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖，伯醇或仲醇，如甲醇、乙醇、丙醇，多元醇，如甘油，低级羧酸，如乳酸、苹果酸，或氨基酸，如谷氨酸。在碳源的存在下，在水溶液中，用微生物转化前体有如下优点，前体或产物都不会被代谢，且不会形成副产物。
生物还原反应可以在纯水中或在含水缓冲液中进行，而不用添加其它溶剂或溶剂混合物。为了提高前体1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮的溶解度，加入水可混溶的有机溶剂是有可能的，例如四氢呋喃、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二甲基乙酰胺、伯醇或仲醇、羧酸、诸如γ-丁内酯等内酯，其能够为反应提高前体1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮的溶解度。
反应可在0℃到50℃下进行，优选10℃到45℃，特别优选15℃到40℃。
反应时间取决于微生物或酶，从1到72小时，优选1到48小时。
微生物的生长，将微生物与一定量的底物相接触，将底物与微生物温育的任何合适的持续时间都可以用于本发明。例如在约24h、48h或72h内可实现微生物的适合的生长，在这个时间时，一定量底物在适当溶剂优选乙醇中的溶液的适当等份可添加到培养物中。然后发酵可持续例如约2天到约6天，优选例如约5天。用有机溶剂提取产物以后，通过常规方法可以很容易地追踪反应进程。可使用任何适当的提取方法提取发酵肉汤，借由例如适当的溶剂，例如乙酸乙酯、甲基异丁基酮、甲基乙基酮、二氯甲烷等，优选乙酸乙酯，从发酵肉汤中除去有机组分。甲醇也可以用于从细胞中提取物质到甲醇-水混合物中。提取发酵肉汤和分离有机相和水相之后，可用任何适当的方法、如色谱法、优选手性HPLC，确定构成有机剩余物的化合物。
反应优选在需氧条件下进行，即在用微生物转化的情况下通气，优选温和通气。然而，在厌氧条件下的转化也是可能的。过程可以持续进行或分批进行。
可通过相分离和/或提取到适当溶剂如二氯甲烷中而纯化任何上述反应的产物，此后，如果需要的话可进行色谱层析。
也可使用连续生产法进行上述反应，包括在反应或细胞固定中连续再循环有机相，将有机溶液中的底物通过柱内的固定生物量、循环式反应器或其它类似反应器。
因此，如本领域技术人员将会理解的，可以改变生长培养基、发酵条件、和/或还原条件(例如温度、pH和底物的量)的变化来控制所得化合物的产率及其相对的生产速率。一般而言，将根据工业效率选择本发明中采用的技术。本文所述的生长培养基，发酵条件，和微生物或酶还原系统的相对量，和底物的相对量仅仅只是对范围很大的可适用于本发明的培养基、发酵条件和原料的量进行了举例说明，如同本领域技术人员将会理解的，并不打算以任何方式作限定。
分离和/或纯化主题方法的任何产物的任何适当的方法都可用于本发明，包括过滤、提取、结晶、柱色谱、薄层色谱、制备型低压液相色谱或HPLC，或这些方法的任何适当的联合。
本发明通过下列实施例进行举例说明。本发明的上述和下述说明和各个实施方案并不打算限制本发明，而是对其进行解释说明。因此，可以理解的是，本发明不限于这些实施例的具体细节。
实施例
材料.
从VWR international获得合适的96孔板和配件。分析仪器包括Tecan Genesis 2000 Workstation(Research Triangle Park，NC)，Agilent 220 HPLC自动采样器和6890N GC(Agilent Technologies，CA)，SpectraMax Plus 384(Molecular Devices，USA)，BeckmanCoulter P/ACE MDQ(Fullerton，CA)和Waters/Micromass ZQ LC/MS(Waters，MA)从它们各自的供应商购买。Eppendorf thermomixer-R购自VWR。分析中使用的手性HPLC柱获自于Chiral Technologies(Exton，PA)和Phenomenex(Torrance，CA)。
在筛选板中使用的大多数酶获自于多个酶供应商，包括Amano(Nagoya，Japan)，Roche(Basel，Switzerland)，Novo Nordisk(Bagsvaerd，Denmark)，Altus Biologics Inc.(Cambridge，MA)，Biocatalytics(Pasadena，CA)，Toyobo(Osaka，Japan)，Sigma和Fluka。表1举例说明了对应于各种酶的具体酶来源。Lipase-PSActivity kit购自于Sigma。商业上可获得的猪肝酯酶购自于Biocatalytics(Pasadena，CA)，其作为粗制硫酸铵混悬液以商品名PLE AS(Catalog # ICR-123)销售。
优化过程中使用的大多数溶剂获自于EM Science(Gibbstown，NJ)，是可获得的最高纯度。
HPLC方法
在具有96孔自动采样器的Agilent 1100 HPLC上进行筛选样品的HPLC分析。在Eppendorf thermomixer-R(VWR)中进行反应。
每一HPLC样品通过从反应混合物取2×50μL，然后合并并用2mL乙腈稀释而制得。进一步用400μL乙腈稀释100μL所述溶液并注入HPLC中。
非手性HPLC方法
所用检测器波长254nm；Phenomenex luna C18柱，3μm，C18，4.6×30mm；流速2.0mL/min；注射体积：5μL；流动相：A：水-0.1％三氟乙酸(TFA)B：乙腈-0.1％TFA；样品运行梯度(运行后(post-run)0.5min)
     时间    ％B     ％C    ％D
1    0.00    5.0     0.0    0.0
2    1.67    65.0    0.0    0.0
3    2.00    95.0    0.0    0.0
4    2.50    95.0    0.0    0.0
5    2.60    5.0     0.0    0.0
6    3.00    5.0     0.0    5.0
手性HPLC方法
醇1：使用检测器波长：254nm；Chiralcel ADR-H，3μm，C18，4.6×150mm；流速0.8mL/min；注射体积：10μL；流动相：A：水B：乙腈；恒组成：50％B15分钟。
醋酸酯2：手性方法使用检测器波长：254nm；Chiralcel OJ-RH，3μm，C18，4.6×150mm；流速0.6mL/min；注射体积：10μL；流动相：A：水B：乙腈；恒组成：50％B15分钟。
制备筛选板
根据Yazbeck等人，Adv.Synth. Catal.，2003，第345卷，第524-532页进行了筛选板的制备。
具体而言，制备通常花费1-2天，且要求制备酶母液(100mg/mL)和将这些母液分配到96孔筛选板，或“筛选试剂盒”中。由自动液体处理工作站将母液分配到筛选板中，该工作站可以被编程为将10μL各种酶精确分配到每个96孔板的适当位置。
当选择96孔板格式时，该板必须能抵抗溶剂和温度，因此，推荐使用聚丙烯板。还需要考虑板容积和形态学。本文的反应都在板中100μL的反应容积内进行，不大于500μL。V底板易于提高溶液搅动，且离心分离后易于清洁器取样。
一旦板子制备好，就可以用粘合箔或用可透的垫盖将它们密封，在-80℃贮藏数月甚至数年。
在需要无水条件的情况下，例如酰化作用和酰胺化反应，筛选板使用前必须冻干。为了从每个孔中除去水分，筛选板在-20℃的腔室温度下冷冻干燥10到24小时。冻干后，筛选板可以在4到8℃下贮藏。
酶筛选方法
如下所述拆分1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯。将如上述制备的96孔板解冻5分钟。然后使用多道吸移管将80μL的磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.2)分配到孔中。然后通过多道吸移管将10μL的底物母液(50mg/mL乙腈)加入到各个孔中，96个反应在30℃和750rpm条件下孵育。16小时后对反应采样，通过将25μL的反应混合物转移到新的96孔板中，然后通过加入150μL的乙腈将其淬灭。接着将96孔板离心分离，从每个孔中将有机上清液转移到另一96孔板中。然后使用可透的垫盖密封采样的反应，转移到HPLC系统中进行分析。同时利用HPLC上交替的柱，利用相同的板子来分析试样的反应性和对映选择性。
实施例1
联用酶法拆分和化学转化制备旋光1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇
仅为了举例说明的目的，本发明的方法通过下述外消旋1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯生物转化的实施例演示，其中生物转化由路线1表示。
路线1
Figure A20058003240900381
酶法拆分1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸(2)
该方法包括进行四个主要步骤：
1)制备外消旋1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯
2)使用商业上可获得的脂肪酶、蛋白酶和酯酶进行酶筛选；
3)优化反应条件例如pH、温度以及酶和底物的量；和
4)通过开发酶水解、酯化作用和化学水解伴随反转的联用方法而使酶法拆分方法的产率最大化。
1)制备外消旋1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯(化合物2)
化合物1
1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇
Figure A20058003240900391
将硼氢化钠(90mg，2.4mmol)加到2’，6’-二氯-3’-氟-苯乙酮(Aldrich，catalog # 52，294-5)(207mg，1mmol)的2mL无水CH3OH溶液中。反应混合物在室温下搅拌1小时，然后蒸发得到无色油状剩余物。通过快速色谱法(用0→10％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化剩余物得到无色油状化合物1(180mg；0.88mmol；86.5％产率)；MS(APCI)(M-H)-208；1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 1.64(d，J＝6.82Hz，3H)3.02(d，J＝9.85Hz，1H)6.97-7.07(m，1H)7.19-7.33(m，1H)。
化合物2
1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯
Figure A20058003240900392
将醋酸酐(1.42mL，15mmol)和吡啶(1.7mL，21mmol)顺序地加入到化合物1(2.2g，10.5mmol)的20mL CH2CL2溶液中。反应混合物在室温下搅拌12小时，然后蒸发得到微黄色油状剩余物。通过快速色谱法(用7→9％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化剩余物得到无色油状化合物2(2.26g；9.0mmol；85.6％产率)；1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 1.88(d，J＝6.82Hz，3H)2.31(s，3H)6.62(q，J＝6.82Hz，1H)7.25(t，J＝8.46Hz，1H) 7.49(dd，J＝8.84，5.05Hz，1H)。
2)酶筛选
筛选商业上可获得的一系列水解酶后鉴定用于动力学拆分外消旋1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯(化合物2)的最适合的催化剂。使用一般的酶筛选方法来筛选表1中所示的94种商业上可获得的酶。
表1
生物转化组酶筛选试剂盒(G3)
Figure A20058003240900411
PGRD# 酶 供应商代码
1 空白[缓冲液] 空白
2 空白[ACN] 空白
3 猪胰脂肪酶 Altus03
4 CALA，lyo. Altus11
5 溶脂念珠菌脂肪酶 Altus12
6 CALB，lyo. Altus13
7 念珠地丝菌脂肪酶 Altus28
8 铜绿假单胞菌脂肪酶 Altus50
9 黑曲霉脂肪酶 Amano Lipase A
10 洋葱假单胞菌脂肪酶 Amano Lipase AH
11 荧光假单胞菌脂肪酶 Amano Lipase AK
12 皱摺假丝酵母脂肪酶 Amano Lipase AY
13 德列马根霉脂肪酶 Amano Lipase D
14 稻根霉脂肪酶 Amano Lipase F
15 沙门氏柏干酪青霉脂肪酶 Amano Lipase G
16 爪哇毛霉脂肪酶 Amano Lipase M
17 洋葱假单胞菌脂肪酶 Amano Lipase PS
18 娄地青霉脂肪酶 Amano Lipase R
19 曲霉属蛋白酶 BioCatalytics101
20 假单胞菌脂肪酶 BioCatalytics103
21 真菌脂肪酶 BioCatalytics105
PGRD# 酶 供应商代码
22 Micorbial，lyo.脂肪酶 BioCatalytics108
23 CALB，lyo. BioCatalytics110
24 假丝酵母，lyo BioCatalytics111
25 CALA，lyo. BioCatalytics112
26 Thermomyces sp脂肪酶 BioCatalytics115
27 产碱杆菌属，lyo.脂肪酶 BioCatalytics117
28 粘稠色杆菌脂肪酶 Altus 26
29 CalB，L2 Sol Chriazyme L2 Sol
30 产朊假丝酵母脂肪酶 Fluka6
31 雪白根霉脂肪酶 Sigma L8
32 假单胞菌属物种脂蛋白脂肪酶 Sigma L13
33 Thermomuces lanuginosus脂肪酶 Sigma L9 Lipolase
34 Thermomuces lanuginosus脂肪酶 Sigma L10 Novo871
35 米赫根毛霉脂肪酶 Sigma L6 Palatase
36 假单胞菌属物种脂肪酶 Sigma L14 Type XIII
37 小麦胚脂肪酶 Sigma L11
38 少根根霉脂肪酶 Sigma L7 Type XI
39 胰脂肪酶250 Valley Research V1
40 胰蛋白酶 Altus33
41 糜木瓜蛋白酶 Altus38
42 菠萝蛋白酶 Altus40
43 黑曲霉蛋白酶 Altus41
44 米曲霉蛋白酶 Altus42
45 青霉物种蛋白酶 Altus43
46 曲霉属蛋白酶 Altus45
47 Renin小牛胃蛋白酶 Sigma P24
48 枯草杆菌蛋白酶Carlsberg Altus10
PGRD# 酶 供应商代码
49 迟缓芽孢杆菌蛋白酶 Altus53
50 黑曲霉蛋白酶 Amano Acid Protease A
51 雪白根霉蛋白酶 Amano Acid Protease II
52 雪白根霉蛋白酶 Amano Newlase F
53 稻根霉蛋白酶 Amano Peptidase R
54 枯草芽孢杆菌蛋白酶 Amano Proleather FGF
55 米曲霉蛋白酶 Amano Protease A
56 米曲霉蛋白酶 Amano Protease M
57 枯草芽孢杆菌蛋白酶 Amano Protease N
58 蜂蜜曲霉 Amano Protease P
59 嗜热脂肪芽孢杆菌蛋白酶 Amano Protease SG
60 猪肝酯酶，lyo BioCat Chirazyme E1
61 猪肝酯酶，lyo BioCat Chirazyme E2
62 链霉菌蛋白酶 BioCatalytics118
63 Tritirachium album蛋白酶 Fluka P6 Proteinase K
64 牛胰蛋白酶 Sigma P18 alphachymotrypsin I
65 灰色链霉菌蛋白酶 Sigma P16 Bacterial
66 牛胰蛋白酶 Sigma P21 Betachymotrypsin
67 溶组织梭菌蛋白酶 Sigma P13 Clostripain
68 牛肠蛋白酶 Sigma P17 Enteropeptidase
69 猪肠蛋白酶 Sigma P25 Enteropeptidase
70 杆菌物种蛋白酶 Sigma P8 Esperase
71 米曲霉蛋白酶 Sigma P1 Flavourzyme
72 解淀粉芽孢杆菌蛋白酶 Sigma P5 Neutrase
73 番木瓜蛋白酶 Sigma P12 Papain
74 Bacillus thermoproteolyticus rokko Sigma P10 Protease
75 Pyrococcus furiosis蛋白酶 Sigma P14 Protease S
PGRD# 酶 供应商代码
76 杆菌物种蛋白酶 Sigma P9 Savinase
77 牛胰蛋白酶 Sigma P19 Type 1( 粗品)
78 多粘芽孢杆菌蛋白酶 Sigma P7 Type IX
79 藓样芽孢杆菌蛋白酶 Sigma P6 Type VIII
80 Aspergillus saitoi蛋白酶 Sigma P3 Type XIII
81 酱油曲霉蛋白酶 Sigma P4 Type XIX
82 米曲霉蛋白酶 Sigma P2 Type XXIII
83 细菌蛋白酶 Sigma P11 Type XXIV
84 根霉物种newlase Sigma 15 Newlase
85 Validase FP Conc. Valley05
86 Bromelian Conc Valley10
87 曲霉属的酰基转移酶 Amano Aml
88 猪肾酰基转移酶 Sigma A-S2 Acylase I
89 青霉素G酰基转移酶 Altus06
90 米赫毛霉的酯酶 Fluka
91 皱摺假丝酵母酯酶 Altus31
92 猪胰弹性蛋白酶 Altus35
93 胆固醇酯酶 BioCatalytics
94 PLE-硫酸铵 BioCatalytics 123
95 兔肝酯酶 Sigma ES2
96 胆固醇酯酶荧光假单胞菌 Sigma ES4
用在pH7.2的100mM磷酸钾缓冲液中的5％底物负荷进行初筛后，几种水解酶被鉴定为对于将外消旋醇酯2酶水解为醇R-1有用(路线2)。
路线2
Figure A20058003240900451
化合物R-1
(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇
Figure A20058003240900452
通过快速色谱法(用15→17％EtOAc的己烷溶液洗脱)由化合物S-2纯化化合物R-1得到无色油状化合物R-1(92.7mg；0.45mmol)。
化合物S-2
(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯
Figure A20058003240900453
通过快速色谱法(用9→10％EtOAc的己烷溶液洗脱)由化合物R-1纯化化合物S-2得到无色油状化合物S-2(185.9mg；0.74mmol)。
如表2所示，几种酶对1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯(2)显示了活性。分析E值显示其中五种酶显示了E值大于100的良好的对映选择性。德列马根霉脂肪酶和猪肝酯酶(PLE)显示E值＞150。然而，PLE显示了对(R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯((R)-2)的最高的反应性。
表2
酶 E值 反应性
水解(R)-乙酸酯的选择性
南极假丝酵母脂肪酶B(CAL-B)、猪肝酯酶(PLE)、德列马根霉脂肪酶、猪肾酰基转移酶、胆固醇酯酶 高(＞100) 高
牛肠蛋白酶、Sigma protease P6 type VIII、皱摺假丝酵母脂肪酶 低
稻根霉脂肪酶、沙门氏柏干酪青霉脂肪酶、假单胞菌脂肪酶、Thermomyces sp.脂肪酶、产碱杆菌脂肪酶、粘稠色杆菌脂肪酶、米赫根毛霉脂肪酶、Thermomyceslanuginosus脂肪酶、小麦胚脂肪酶、菠萝蛋白酶、黑曲霉蛋白酶、雪白根霉蛋白酶、Aspergillus saitoi蛋白酶、曲霉的酰基转移酶 低(＜20) 低
水解(S)-乙酸酯的选择性
南极假丝酵母脂肪酶A(CAL-A)、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(藓样芽孢杆菌的蛋白酶)、稻根霉蛋白酶 低(＜10) 低
德列马根霉脂肪酶 高
通过与如路线3所示的相似底物的已知反应相比较，最初指定PLE水解产生的醇(1)的绝对构型，其描述在Bouzemi，N.等人，Tetrahedron Letters，2004，第627-630页中。
路线3
在实验室中测试的和指定的(假定酶不改变识别模式)
Figure A20058003240900472
如路线3所示，使用CAL-B的1-苯基乙醇的酶酰化作用产生了1-苯乙基乙酸酯的R-对映异构体，留下了未反应的1-苯基乙醇的S-对映异构体(Bouzemi，N.等人，Tetrahedron Letters，2004，第627-630页)。可以假设当CAL-B与rac-1反应时，底物识别应当相同；相应地，获得的酯产物被指定为R-对映异构体。
当与用PLE酶水解rac-1(相反反应)中获得的化合物相比时，观察到了醇的R异构体，明显来自于R-乙酸酯的水解作用。
可以基于Mosher’s酯产生的非对映异构体的NMR测定直接确定PLE水解产物产生的醇(1)的绝对构型。
Figure A20058003240900473
用文献Tetrahedron：Asymmetry 2002，第13卷，第2283页；Tetrahedron Lett.1988，第29卷，第6211页中报道的方法合成化合物A和化合物B。将这两种化合物进行1H-NMR实验，比较化合物A和化合物B甲基的化学位移来确定化合物A具有“S”构型，化合物B具有“R”构型。
合成化合物A：将DCC(N，N’-二环己基碳二亚胺)(1.1mmol)加到(s)-(+)-a-甲氧基苯乙酸(1mmol)的5mL无水THF溶液中。室温下在氮气环境下搅拌反应混合物15分钟。将化合物S-1(1mmol)和DMAP(4-二甲基氨基吡啶)(0.2mmol)顺序加到反应混合物中，所得混合物在室温下搅拌36小时。蒸发混合物，在甲醇中研磨，过滤和浓缩得到剩余物。通过HPLC纯化剩余物得到化合物A。
合成化合物B：将DCC(N，N’-二环己基碳二亚胺)(1.1mmol)加到(s)-(+)-a-甲氧基苯乙酸(1mmol)的5mL无水THF溶液中。室温下在氮气环境下搅拌反应混合物15分钟。将化合物R-1(1mmol)和DMAP(4-二甲基氨基吡啶)(0.2mmol)顺序加入到反应混合物中，所得混合物在室温下搅拌36小时。蒸发混合物，在甲醇中研磨，过滤和浓缩得到剩余物。通过HPLC纯化剩余物得到化合物B。
3)优化使用PLE-AS的反应条件
PLE是由Roche生产的酶，以从猪肝制备的粗酯酶制品通过Biocatalytics Inc.销售，通常称为PLE-AS(购自Biocatalytics，名为ICR-123，以硫酸铵混悬液销售)。该酶在CAS登记中被分类为“羧酸-酯水解酶，CAS no.9016-18-6”。相应的酶分类编号是EC 3.1.1.1。已知该酶对水解许多酯具有宽的底物特异性。使用基于在pH滴定器中水解丁酸乙酯的方法测定脂肪酶活性。1LU(脂肪酶单位)是22℃、pH8.2条件下每分钟释放1μmol可滴定丁酸的酶的量。本文报道的制剂(PLE-AS，作为混悬液)通常作为不透明的褐绿色液体运送，宣称活性＞45 LU/mg(蛋白质含量约40mg/mL)。
该反应中被优化的主要参数是底物和酶浓度、pH和缓冲液的类型。使用液体形式的酶进行大多数实验，该酶以PLE-AS在商业上是可获得的。pH对反应的作用不是非常关键的。进行反应的合理的pH范围包括pH6-9，pH8.0结果最佳。大多数优化实验在室温下进行。试验的缓冲液：Tris、磷酸盐和醋酸钙。该反应可以在三种缓冲液的10-100mM浓度范围内进行而得到非常相似的结果。进行反应可以使用的其它缓冲液包括2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、哌嗪-N，N’-二(2-乙磺酸)(PIPES)、N，N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIZMA)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(TRICINE)、N，N-二(2-羟乙基)甘氨酸(BICINE)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)，或pKa值在6到9之间的任何其它缓冲液。所有实验使用正常的搅拌速度(500-1000rpm)。发现5-10％(v/v)酶含量可以有效地以接近20％的效率催化酶促反应。发现预混合酶和缓冲液后加入底物和强烈搅拌对于在最小浓度进行反应是有益的。使用对于酶负荷的那些优化条件，测试0.2-2M的底物负荷并发现1-2M的浓度在24小时内提供了接近50％的转变。商业上不可获得的其它形式的酶也可以使用，包括固定在固体载体(例如陶瓷、硅藻土、Eupergit、丙烯酸珠粒等)上的酶，交联酶晶体(CLEC)，或交联酶聚集物(CLEA)，硫酸铵小球，或活性和对映选择性可以被保存或增强的任何其他形式。
根据路线4使用猪肝酯酶拆分外消旋1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯(2)，大规模制备化合物R-1和S-2。
路线4
Figure A20058003240900501
向装有pH电极、悬空搅拌装置和碱添加管线的5L反应器中加入PLE-AS溶液(0.125L)和2.17L的磷酸钾缓冲溶液。使用718 StatTitrino-Metrohm pH滴定器(Brinkman instruments，Inc)进行反应。通过将2.17L的水、15.6mL的1M K2HPO4溶液和6.2mL的KH2PO4混合而制备磷酸钾缓冲溶液。
然后，加入外消旋1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯(2)(250g，1mol)。接着在室温下搅拌混悬液22小时。通过加入2N NaOH将溶液的pH值维持在7.0。接着通过RP-HPLC观察产物的转变和％ee而追踪反应，原料消耗51-52％后停止(加入～240mL碱)。
反应完成后，加入甲基-叔丁基醚(MTBE)(900mL)，搅拌混合物5分钟。将所得乳状液通过硅藻土滤垫，然后转移到分离漏斗/提取器中。该阶段包括用去离子水将硅藻土和浆，然后倾入Buchner漏斗中制备硅藻土垫。过滤酶乳状液之前除去水滤液。分层之后，各用900mLMTBE再萃取水层两次。用Na2SO4干燥合并的MTBE层，真空浓缩得到242g粗醇和乙酸酯混合物。
4)通过开发酶水解、酯化作用和化学水解伴随反转的联用方法而 使酶法拆分方法的产率最大化。
一旦发展了酶动力学拆分，就探索到“R-1”醇到“S-2”乙酸酯的化学转化。该过程根据路线5进行。
路线5
Figure A20058003240900511
向装有pH电极、悬空搅拌装置和碱添加管线(1M NaOH)的50mL加套烧瓶中加入1.2ml的100mM磷酸钾缓冲液pH7.0和0.13ml的PLE AS混悬液。然后，逐滴加入化合物2(0.13g，0.5mmol，1.00eq)，所得混合物在室温下搅拌20小时；使用1M NaOH维持反应的pH值恒定在7.0。通过RP-HPLC监测反应的转变和ee，原料消耗50％后停止(在这些条件下近似17小时)。然后用10mL乙酸乙酯萃取混合物三次以回收酯和醇作为R-1和S-2的混合物。
在氮气环境下将甲磺酰氯(0.06mL，0.6mmol)加入到R-1和S-2混合物(0.48mmol)的4mL吡啶溶液中。室温下搅拌反应混合物3小时，然后蒸发得到了油。将水(20mL)加入到混合物中，然后加入EtOAc(20mL×2)萃取水溶液。合并有机层，干燥，过滤，蒸发得到R-3和S-2混合物。该混合物不进一步纯化用于下一步反应。1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 1.66(d，J＝7.1Hz，3H)1.84(d，J＝7.1Hz，3H)2.09(s，3H)2.92(s，3H)6.39(q，J＝7.0Hz，1H)6.46(q，J＝6.8Hz，1H)6.98-7.07(m，1H)7.07-7.17(m，1H)7.23-7.30(m，1H)7.34(dd，J＝8.8，4.80Hz，1H)。
氮气环境下将醋酸钾(0.027g，0.26mmol)加入到R-3和S-2混合物(0.48mmol)溶液的4mL DMF溶液中。将反应混合物加热到100℃持续12小时。将水(20mL)加入到反应混合物中，加入EtOAc(20mL×2)萃取水溶液。干燥合并的有机层，过滤，蒸发得到油状S-2(72mg，两步骤产率61％)。手性ee：97.6％。1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm1.66(d，J＝7.1Hz，3H)2.09(s，3H)6.39(q，J＝6.8Hz，1H)7.02(t，J＝8.5Hz，1H)7.22-7.30(m，1H)。
在0℃氮气环境下将甲醇钠(19mmol；0.5M的甲醇溶液)缓慢加入到化合物S-2(4.64g，18.8mmol)中。室温下搅拌所得混合物4小时。蒸发溶剂，加入H2O(100mL)。用醋酸钠-醋酸缓冲溶液中和冷却的反应混合物至pH值为7。加入乙酸乙酯(100mL×2)萃取水溶液。用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，蒸发得到白色固体状S-1(4.36g，94.9％产率)；SFC-MS：97％ ee。1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 1.65(d，J＝6.8Hz，3H)5.58(q，J＝6.9Hz，1H)6.96-7.10(m，1H)7.22-7.36(m，1H)。
实施例2
对映选择性生物还原1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮
当前的工艺过程开发是通过使用全细胞催化的反应和商业上可获得的酶达到的。该过程包括进行三个主要步骤：
1)筛选主要包含酵母和真菌菌株的内部全细胞(或分离出的酶)收集物(商业上可获得的醇脱氢酶和酮还原酶)；
2)进行对pH、温度及酶和底物量的反应优化；
3)开发生物催化剂再循环的方法。
全细胞筛选
如下所述对能够对映选择性还原1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮的菌株进行筛选。微生物菌株在9 6孔板(5μL/孔)中从冻干的原种生长。将200μL无菌YM培养基(Difco培养基271120)接种到各个孔中。所有菌株在28℃和250rpm转速的旋转振荡器上生长。2天后，从10％母液乙醇溶液加入底物使各个孔中达到1mg/mL。然后将板子在相同速度和温度下振荡，2-7天后分析反应。利用非手性柱通过HPLC分析反应。
将显示于表3的188种不同的微生物菌株分布到96孔板中，如上所述在底物浓度不超过1mg/mL下进行测试。发现属于红酵母属、链孢霉属、红冬孢酵母属、Aerobasidium和假丝酵母属物种的30种不同的菌株显示了所需的活性。所有菌株都显示了S选择性。然后将那些菌株再筛选，选择属于红酵母属物种的酵母UC2387用于更大规模制备S-1。
表3
ATCC标号或其它编号 菌株名 ATCC标号或其它编号 菌株名
ATCC 18101 红酵母属 UC2401 红酵母属
ATCC 18818 Rhodotorula diffluens UC2395 假丝酵母
ATCC 14023 粘性红酵母 UC2466 Rhodosporibium dibovstum
ATCC 18813 Rhodotorula buffonii UC2461 深红酵母
ATCC 20804 禾木科红酵母 UC2454 胶粘红酵母
ATCC 10656 Cryptococcus flavus UC2447 红酵母属
ATCC 24010 Rhodotorula javanica UC2431 掷孢酵母属
ATCC 28954 Rhodotorula bacarum UC17612 未知酵母
ATCC 28322 Rhodotorula sonckii UC17613 未知酵母
ATCC 20837 红酵母属 UC2472 深红酵母
ATCC 20254 红酵母属 UC2471 小红酵母
ATCC 28135 Rhodotorula hordea UC2468 禾木科红酵母
ATCC 22078 Rhodotorula araucariae UC17463 未知酵母
ATCC 10659 粘性红酵母 UC16748 未知酵母
ATCC 58914 Rhodotorula futronensis UC16508 未知酵母
ATCC 52903 Rhodotorula phylloplana UC4229 Rhodosporidium sphacrocarpum
ATCC 52902 Rhodotorula hinnulea UC4235 Rhodosporidium sphacrocarpum
ATCC 52907 Rhodotorula armeniaca UC4246 异常汉森酵母
表3
ATCC 标号或其它编号 菌株名 ATCC标号或其它编号 菌株名
ATCC 42713 Rhodotorula acuta UC4254 挪威假丝酵母
ATCC 32034 Rhodotorula pustula UC4265 Candida zeylenoides
ATCC 10658 小红酵母 UC4281 白色隐球菌
ATCC 42552 Rhodotorula matritensis UC4247 Hanseniaspora uvarum
ATCC 28983 红酵母属 UC4255 深红酵母
ATCC 76737 Rhodotorula ferulica UC4266 皱摺假丝酵母
ATCC 90775 Rhodotorula aurantiaca UC4282 汉逊德巴利酵母
ATCC 10655 Rhodotorula aurantiaca UC4248 近平滑念珠菌
ATCC 52823 Rhodotorula fujisanensis UC4256 汉逊德巴利酵母
ATCC 90391 乳糖红酵母 UC4238 酿酒酵母
ATCC 32764 Rhodotorula aurantiaca UC4272 热带假丝酵母
ATCC 32768 禾木科红酵母 UC4288 Trichosporan cutaneum
ATCC 52902 Rhodotorula nothofagi UC4242 劳伦梯隐球菌
ATCC 13546 劳伦梯隐球菌 UC4250 Candida tenius
ATCC 16727 禾木科红酵母 UC4259 假丝酵母
ATCC 18176 乳糖红酵母 UC4275 红酵母属
ATCC 16182 Cystofilobasidiuminfirmo-miniatum UC4289 Candida raghii
ATCC 886 红酵母属 UC4244 Rhodosporidium sphacrocarpum
ATCC 22946 Rhodotorula fujisanensis UC4253 多形假丝酵母
ATCC 22993 Rhodotorula ingeniosa UC4263 果蝇红酵母
ATCC 22875 Rhodotorula hylophila UC4277 粘性红酵母
ATCC 18809 Rhodotorula bogoriensis UC4294 挪威假丝酵母
ATCC 34886 Rhodotorula muscorum UC1787 Aerobasidium sp.
ATCC 44533 Rhodotorula pilati UC2387 Aerobasidium sp.
ATCC 24121 Rhodotorulaaur iculariae UC1827 布勒掷孢酵母属
ATCC 18820 Rhodotorula foliorum UC1846 地丝菌属
ATCC 28485 巴斯德毕赤氏酵母 UC1281 假丝酵母
ATCC 17697 Alcaligenes euntrophus UC1763 布勒掷孢酵母属
ATCC 999 玫瑰色红球菌 UC1765 Aerobasidium sp.
ATCC 35411 高加索酸奶乳杆菌 UC1247 红酵母属
表3
ATCC 标号或其它编号 菌株名 ATCC 标号或其它编号 菌株名
ATCC 27337 厌氧消化链球菌 UC1256 红酵母属
ATCC 26012 多形汉森酵母 UC1264 假丝酵母
ATCC 17798 梭菌属 UC1268 隐球菌属
ATCC 25619 铜绿假单胞菌 UC1276 红酵母属
ATCC 23973 恶臭假单胞菌 UC1202 红冬孢酵母属
ATCC 12276 雪白曲霉 UC1209 隐球菌属
ATCC 10436 斜卧青霉 UC1213 隐球菌属
ATCC 66815 Thorulaspora sp. UC1235 假丝酵母
ATCC 7159 Beauveria sulfurences UC1240 隐球菌属
ATCC 21766 Corynebacterium dyoxidans UC1184 假丝酵母
ATCC 33305 不动杆菌属 UC1779 Aerobasidium sp.
ATCC 1207a 卷枝毛霉菌 UC1185 红酵母属
ATCC 22792 Dipodascus uninucleatus UC1190 红酵母属
ATCC 12975 聚集红球菌 UC1192 红冬孢酵母属
ATCC 7924 Mucor racemosum UC1195 假丝酵母
ATCC 11048 红串红球菌 UC5113 Aerobasidium mansonii
ATCC 9692 Mucor rammanianus UC5098 Cryptococcus laurentii  varlaurentii
ATCC 29670 玫瑰色红球菌 UC5084 Cryptococcus laurentii varlaurentii
NRRL Y-164 粟酒裂殖糖酵母 UC4317 Candida tenius
ATCC 10613 葡萄汁酵母 UC4310 红酵母属
ATCC35047 Thermoanaerobacter brokii UC5110 吉利蒙假丝酵母
ATCC 10788 Rhodotorula toruloides UC5093 Cryptococcus laurentii varlaurentii
ATCC 35091 硫磺矿硫化叶菌 UC4327 深红酵母
ATCC 8527 Clostridiumkluyver-anaerobic UC4316 弯假丝酵母
ATCC 14692 粗糙链孢霉 UC4309 深红酵母
ATCC 16617 解脂氏酵母 UC5103 假丝酵母
ATCC 21664 红球菌属 UC5089 Hanseniaspora uvarum
表3
ATCC 标号或其它编号 菌株名 ATCC 标号或其它编号 菌株名
ATCC 38191 拉曼被孢霉 UC4324 隐球菌属
ATCC 10640 Kloeckera corticis UC4315 假丝酵母
ATCC 10679 T.variabilis UC4305 Candida tenius
ATCC 39213 恶臭假单胞菌 UC5101 Matschinkowia bucuspibata
ATCC 49097 Bacillus simplex UC5088 异常汉森酵母
UC 2390 红酵母属 UC4321 Cryptococcus albidus varalbidus
UC2387 红酵母属 UC4313 溶脂念珠菌
UC2386 小红酵母 UC4304 热带假丝酵母
UC2385 Cryococcus sp. UC5100 挪威假丝酵母
UC2371 假丝酵母 UC5087 克鲁斯念珠菌
UC2419 假丝酵母 UC4319 Torulobsis candida
UC2411 红酵母属 UC4312 皮状丝孢酵母
UC2405 德巴利酵母属 UC4297 Sacharomyces laurentii
UC4272 未知酵母 UC4289 未知酵母
UC4288 未知酵母 UC4244 未知酵母
UC4242 未知酵母 UC4253 未知酵母
UC4250 未知酵母 UC4263 未知酵母
UC4259 未知酵母 UC4277 未知酵母
UC4275 未知酵母 UC4294 未知酵母
通过利用红酵母属菌株Y2-UC2387还原1-(2，6-二氯-3-氟苯基) 乙酮而大规模制备(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇(S-1)的方法
根据下述路线6利用红酵母属菌株Y2-UC2387将1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮生物还原为  (1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇(S-1)。
路线6
建立两阶段发酵步骤，其中预培养物(第一阶段)从摇瓶中的新鲜接种物(从琼脂平板挑取的菌落)生长两天。第二阶段培养物通过将预培养物加入到新鲜培养基(1/50-1/100稀释)开始，所得培养物在加入10％乙醇溶液的底物前生长1天。YM培养基(Difco培养基271120)用于液体培养物和琼脂基平板。为了还原2g(9.6mmol)的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮，需要1L制品。包含10mL YM和完整培养物的第一阶段培养物用于接种第二阶段培养物(1L)。生长3天后，加入净底物，搅拌反应7天。1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮到所需醇S-1异构体的转变和S-1的ee都通过RP-HPLC来监测。达到57％的转变后停止反应，以5,000rpm的速度离心分离除去酵母细胞。剩余的原料和所需的产物通过萃取(0.5体积的乙酸乙酯三次)回收。
对最大底物负荷和酵母细胞再循环的研究
测试1-20g/L的底物浓度，选择2.5g/L，因为其得到了最好的空间-时间产率(～0.5g/L/d)，相当于每天每克微生物0.1g的产物形成速度。分离产物的产率在50至100％的范围内。前体在水中＜2.5g/L的差溶解度妨碍了更高底物负荷的使用。已知非离子XAD树脂(Rohm和Hass生产)吸附有机化合物(根据D’Arrigo，等人，Tetrahedron：Asymmetry，1997，第8卷，第2375-2379页的论文)，可以用于底物或产物的捕获(主要提供了底物的缓慢释放和避免了底物对细胞的毒性或酶抑制)。该技术允许使用20g/L或更高的底物负荷。
根据Rotthaus，等人，Tetrahedron，2002，第58卷，第7291-93页的方法固定在藻酸钙中的细胞，证明是实用的方案用于再循环和更好地使用催化剂。所捕获的酵母细胞对机械应激更加抵抗，并且同时观察到产物回收明显改善。还看到了与使用全细胞中观察到的相似的底物负荷。
筛选商业上可获得的酶
如下所述对能够对映选择性还原1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮的酶进行筛选。试验了27种不同的酮还原酶(以KRED-M27 KIT购自Biocatalytics，Inc)，和4种获自Sigma Aldrich的醇脱氢酶(马肝醇脱氢酶(HLADH)、酵母醇脱氢酶、Thermoanaerobium brokii醇脱氢酶和高加索酸奶乳杆菌醇脱氢酶)。在1mg/mL的底物负荷下进行Kred酶反应，使用NADPH作为还原剂。使用NADH和NADPH测试醇脱氢酶。仅马肝醇脱氢酶(HLADH)催化了1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮选择性还原而得到(S)-1，根据路线7。
路线7
Figure A20058003240900591
先前已经报道HLADH遵照普瑞洛格规则(Prelog，V，Pure App.Chem.，1964，第9卷，119)还原多种底物(根据Nakamura，等人，Tetrahedron asymmetry，2003，第14卷，第2659-2681页，其作为E3型ADH起作用)。
表4包括所评价的底物与酶(S∶E)的比率。
表4
比率  转变(％)
S∶E  NADPH  NAD  Rx时间(h)
1∶1  6  15  18
1∶2  13  25  18
1∶5  20  41  18
1∶10  42  55  64
化合物S-1
(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇
Figure A20058003240900601
通过快速色谱法(用15→20％EtOAc的己烷溶液洗脱)将化合物S-1从原料酮中纯化出来得到无色油状化合物S-1(229.8mg；1.1mmol)；SFC-MS：100％ee.1H NMR(400MHz，MeOD)δppm 1.58(d，J＝7.1Hz，3H)5.61(q，J＝6.8Hz，1H)7.14(t，J＝8.6Hz，1H)7.35(dd，J＝9.0，4.9Hz，1H)。
实施例3.
(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇在合成人肝细胞生长因子受 体酪氨酸激酶抑制剂中的用途
根据路线8，(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇在手性合成人肝细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂中用作中间体，合成过程如下所述。
路线8
化合物3
3-[(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-2-硝基吡啶
Figure A20058003240900612
在氮气环境下将3-羟基-2-硝基吡啶(175mg，1.21mmol)、三苯基膦(440mg，1.65mmol)顺序加入到搅拌的S-1(229.8mg，1.1mmol)的THF(10mL)溶液中。在室温下维持反应混合物1小时，然后在0℃下加入二异丙基偶氮二羧酸酯(0.34mL，1.65mmol)。再搅拌该混合物12小时，真空蒸发反应混合物得到油。通过快速色谱法(用20→25％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化剩余物得到化合物3的白色固体(321.5mg；0.97mmol；88.3％产率)；MS(APCI)(M+H)+331；SFC-MS：99.5％ee.1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 1.85(d，J＝6.6Hz，3H)6.10(q，J＝6.6Hz，1H)7.04-7.13(m，1H)7.21(dd，J＝8.5，1.14Hz，1H)7.30(dd，J＝9.0，4.9Hz，1H)7.37(dd，J＝8.6，4.6Hz，1H)8.04(dd，J＝4.6，1.3Hz，1H)。
化合物4
3-[(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]吡啶-2-胺
在0℃下向搅拌的化合物3(321mg，0.97mmol)在EtOH(2mL)和2M HCl(0.2mL)的混合物中的溶液中加入铁(365mg)。将所得溶液加热到85℃ 2小时。将硅藻土(0.5g)加入到冷却的反应混合物中。通过硅藻土垫过滤该混合物，蒸发得到深色油状化合物4。MS(APCI)(M+H)+301。不进行进一步纯化将化合物4用于下一步反应中。
化合物5
3-[(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-碘代-吡啶-2-胺
Figure A20058003240900622
向搅拌着的化合物4在乙酸(3mL)和H2O(0.5mL)的混合物中的溶液中连续加入高碘酸(60mg，0.24mmol)、碘(130mg，0.5mmol)和硫酸(0.03mL)。将所得溶液加热到80℃ 5小时。用Na2SO3(80mg)淬灭冷却的反应混合物，用饱和Na2CO3(2×100mL)碱化至pH为7。加入CH2Cl2(2×50mL)萃取水溶液，用Na2SO4干燥合并的有机层，然后过滤，真空浓缩。通过快速色谱法(用35→40％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化剩余物得到黄色油状化合物5(254mg；0.6mmol；61.6％产率)；MS(APCI)(M+H)+426。1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 1.81(d，J＝6.8Hz，3H)4.86(s，2H)5.98(q，J＝6.57Hz，1H)6.96(d，J＝1.5Hz，1H)7.08(dd，J＝9.0，8.0Hz，1H)7.31(dd，J＝8.8，4.8Hz，1H)7.78(d，J＝1.8Hz，1H)。
化合物6
4-[4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯甲酰基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
Figure A20058003240900631
在惰性环境下将1，1’-羰基-二咪唑(360mg，2.2mmol)加入到4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯甲酸(515mg，2mmol)的CH2Cl2(50mL)溶液中。室温下搅拌反应混合物30分钟，然后加入1-哌嗪-甲酸叔丁酯(390mg，2mmol)。在惰性环境下搅拌所得混悬液12小时。将混合物倾入水(50mL)中搅拌，加入CH2Cl2(2×50mL)萃取水溶液。干燥合并的有机层，过滤，浓缩得到无色油状剩余物。通过快速色谱法(用20→25％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化剩余物得到化合物6的白色固体(461mg；1.1mmol；55.4％产率)；  MS(APCI)(M+H)+417。1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 1.34(s，12H)1.45(s，9H)3.26-3.42(m，4H)3.44-3.56(m，2H)3.66-3.89(m，2H)7.37(d，J＝8.1Hz，2H)7.84(d，J＝8.1Hz，2H)。
化合物7
4-(4-{6-氨基-5-[(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]吡啶-3-基}苯甲酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
Figure A20058003240900641
将化合物6(300mg，0.72mmol)加入到化合物5(254mg，0.6mmol)的7mL DME(乙二醇二甲醚)溶液中。用氮气吹洗混合物几次，然后加入二氯双(三苯基膦)钯(II)(50mg，0.06mmol)。将碳酸钠(200mg，1.8mmol)的1.5mL水溶液加入到反应混合物中，加热所得溶液至85℃2小时。向反应混合物加入水(50mL)以淬灭反应。然后加入EtOAc(2×50mL)萃取水溶液。干燥合并的EtOAc层，过滤，蒸发得到褐黄色油状剩余物。通过硅胶色谱法(用75→80％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化剩余物得到化合物7的白色固体(255.5mg；0.43mmol；72.9％产率)；MS(APCI)(M+H)+589。1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm1.45(s，9H)1.85(d，J＝6.6Hz，3H)4.92(s，2H)6.10(q，J＝6.8Hz，1H)6.97(d，J＝1.8Hz，1H)7.01-7.10(m，1H)7.29(dd，J＝9.0，4.9Hz，1H)7.36-7.42(m，3H)7.58-7.64(m，1H)7.87(d，J＝1.5Hz，1H)。
化合物8
3-[(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-[4-(哌嗪-1-基羰基)苯基]-吡啶-2-胺
将盐酸(1.3mL，4.8mmol)加入到化合物7的乙醇(10mL)溶液中。室温下搅拌反应混合物12小时，真空蒸发得到油。通过快速色谱法(用25→40％CH3OH的己烷溶液洗脱)纯化剩余物得到化合物8的白色固体(180.4mg；0.37mmol；85.2％产率)；MS(APCI)(M+H)+489；SFC-MS：100％ee。1H NMR(400MHz，MeOD)δppm 1.88(d，J＝6.8Hz，3H)2.92-3.21(m，4H)3.58-4.07(m，4H)6.21(q，J＝6.8Hz，1H)7.02(d，J＝1.8Hz，1H)7.18-7.27(m，1H)7.41-7.45(m，1H)7.46(s，4H)7.78(d，J＝1.8Hz，1H)。C24H23Cl2FN4O22 HCl 1.25 H2O的分析计算值C：49.29，H：4.74，N：9.58。实测值C：49.53，H：4.82，N：9.29。
尽管通过参考具体和优选的实施方案举例说明了本发明，本领域的技术人员将认识到可以通过常规实验和本发明的实践进行变化和修饰。因此，本发明不意欲被前述说明所限制，而是被所附的权利要求和等同形式定义。
本发明说明书中引述的专利和专利申请和非专利出版物的全部公开内容都通过参考并入本文。

Claims (14)

1.(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇，其至少95％不含(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
2.分离对映异构的式(I)的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的方法：
Figure A2005800324090002C1
其中，R是氢、C1-C20-烷基、C3-C8-环烷基、C6-C14-芳基、C7-C15-芳烷基、C1-C20-烷氧基、C1-C20-烷氨基，其中所述烃基可以任选被羟基、甲酰基、氧基、C1-C6-烷氧基、羧基、巯基、磺基、氨基、C1-C6-烷氨基或硝基或卤素单取代或多取代，
该方法包括以下步骤：
在水溶液、有机溶剂、或有机溶剂和含水溶剂的混合物中将式(I)的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯与生物催化剂接触，其中，只有一种对映异构体被选择性水解，生成1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的旋光异构体和未反应的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的旋光异构体，和
将1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的旋光异构体与未反应的旋光1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯分离。
3.制备(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的方法，包括以下步骤：
将对映异构的式(I)的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物：
Figure A2005800324090003C1
其中，R是氢、C1-C20-烷基、C3-C8-环烷基、C6-C14-芳基、C7-C15-芳烷基、C1-C20-烷氧基、C1-C20-烷氨基，其中所述的烃基可以任选地被羟基、甲酰基、氧基、C1-C6-烷氧基、羧基、巯基、磺基、氨基、C1-C6-烷氨基或硝基或卤素单取代或多取代，
在水溶液、有机溶剂、或有机溶剂和含水溶剂的混合物中与生物催化剂接触，其中，只有(R)-对映异构体被选择性水解，生成(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)-乙醇酯的混合物；
将(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物转变为(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇；和
回收(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
4.根据权利要求3的方法，其中，转变步骤包括：
a)在非质子溶剂中将(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯混合物中的(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇与有机磺酰卤反应，形成(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的有机磺酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物；
b)在非质子溶剂中进一步将(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的有机磺酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯混合物中的(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的有机磺酸酯与脂肪族羧酸的碱金属盐反应，形成(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的脂肪族羧酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物；和
c)将(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的脂肪族羧酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物转化为(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
5.根据权利要求4的方法，其中，转化步骤c)包括：
在碱性物质的存在下，在含醇或含水溶剂中，将(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的脂肪族羧酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物进行溶剂分解，形成(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
6.根据权利要求5的方法，其中，在转化步骤c)中，在甲醇钠的存在下，在甲醇中，将(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的脂肪族羧酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物进行溶剂分解，形成(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
7.根据权利要求6的方法，其中：
R是甲基；
在反应步骤a)中，有机磺酰卤是甲磺酰氯，非质子溶剂是吡啶；
在反应步骤b)中，脂肪族羧酸的碱金属盐是醋酸钾，非质子溶剂是二甲基甲酰胺。
8.根据权利要求3的方法，其中，生物催化剂是选自Amano D(德列马根霉脂肪酶)、Amano AY(皱摺假丝酵母脂肪酶)、Amano F(稻根霉脂肪酶)和猪肝酯酶的酶。
9.根据权利要求8的方法，其中，基于100重量份的对映异构1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物，酶的使用量是0.1到100重量份。
10.根据权利要求3的方法，其中，对映异构1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物与生物催化剂的接触步骤在0到60℃水溶液中进行，并维持pH值为4到12。
11.制备1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的旋光异构体的方法，包括在水溶液、有机溶剂、或有机溶剂和含水溶剂的混合物中通过生物催化剂以对映选择性方式还原1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮而得到所述1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇旋光异构体的步骤。
12.根据权利要求11的方法，进一步包括回收所述1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇旋光异构体的步骤。
13.根据权利要求11或12的方法，其中，所述1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的旋光异构体是(1S)-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
14.根据权利要求11-13任一项的方法，其中，生物催化剂是酶。
15.根据权利要求11-14任一项的方法，其中，酶是马肝醇脱氢酶。
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