MX2007002247A - Biotransformacion enantioselectiva para la preparacion de intermedios de inhibidores de la proteina tirosina quinasa. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a procedimientos biocataliticos para preparar estereoisomeros enantiomericamente puros de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol. Se describen procedimientos de preparacion del enantiomero (S) deseado, dichos procedimientos basandose en una combinacion de resolucion enzimatica, esterificacion quimica e hidrolisis quimica con inversion de esteres 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanolicos o bio - reduccion estereoselectiva de 2,6-dicloro-3-fluoroacetofenona con un biocatalizador tal como una enzima o microorganismo. El enantiomero (S) quiral se puede usar en la sintesis de ciertos compuestos 2-aminopiridina unidos a eter enantiomericamente enriquecidos, que inhiben potentemente la autofosforilacion de receptor de factor de crecimiento de hepatocitos humanos.

Description

BIOTRANSFORMACION ENANTIOSELECTIVA PARA LA PREPARACIÓN DE INTERMEDIOS DE INHIBIDORES DE LA PROTEINA TIROSINA QUINASA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a procedimientos para preparar estereoisómeros enantioméricamente puros de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofen¡l)etanol que son intermedios útiles en la síntesis de análogos de 2-aminopiridina unidos a éter, enantioméricamente enriquecidos que inhiben potentemente la autofosforilación del receptor de factor de crecimiento de hepatocitos humanos y por lo tanto pueden ser útiles en el tratamiento de cáncer y otros trastornos hiperproliferativos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las estrategias para obtener un enantiómero individual de un compuesto han llegado a ser importantes en el descubrimiento de fármacos debido a que menudo un enantiómero es un fármaco eficaz mientras el otro enantiómero tiene actividad biológica indeseable. De manera ideal, se diseña una síntesis asimétrica para producir solamente el enantiómero deseado. Desafortunadamente, más a menudo que no, una síntesis asimétrica no se puede diseñar o es prohibitivamente cara.

Aunque 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanona se redujo enantioselecfivamente a (1 R)-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol con una pureza enantiomérica de 96% de exceso enantiomérico (ee) usando un agente reductor preparado a partir de borohidruro de sodio, cloruro de trimetilsilílo y una cantidad catalítica de (S)-a,a-difenilpirrolidinametanol (Jiang y col., Tetrahedron Lett., 2000, vol. 41 , pp. 10281 - 10283), no existe una síntesis química disponible para producir (1S)-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol, que es un intermedio en la síntesis de ciertos análogos de 2-amínopiridina unidos a éter, enantíoméricamente enriquecidos que inhiben potentemente la autofosforilación del receptor de factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HGFR o c-MET). Los ejemplos de inhibidores de c-MET (HGFR), su síntesis y uso, se pueden encontrar en la solicitud de patente de Estados Unidos N° de serie 10/786.610, titulada "Aminoheteroaryl Compounds as Proteín Kinase Inhibitors", presentada el 26 de febrero de 2004, y la solicitud internacional correspondiente PCT/US2004/005495 del mismo título, presentada el 26 de febrero de 2004, cuyas descripciones se incorporan en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad. Los intentos de los inventores para preparar (1S)-(2,6-dicloro-3-fluorofeníl)etanol con pureza enantioméricamente adecuada mediante reducción quíral de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanona usando diferentes reactivos químicos, por ejemplo, complejo (R)-2-metil-CBS-oxazoborolidina/BH3-dimetilsulfuro (BMS) (J. Am. Chem. Soc. 1987, vol. 109, pp. 7925); borohidruro de sodio, cloruro de trimetilsililo y una cantidad catalítica de (S)-a,a-difenilpirrolidinametanol (Jiang y col., Tetrahedron Lett., 2000, vol. 41 , pp. 10281 - 10283); complejo oxazaborolidina/BH3-dimetilsulfuro (BMS) (J. Org. Chem. 1993, vol. 58, pp. 2880); y (-)-(B)-clorodiisopinocanfenílborano (DIP-CI) (Tetrahedron Lett. 1997, vol. 38, pp. 2641 ), no tuvieron éxito. Se sabe que los alcoholes enantioméricamente puros se pueden producir mediante reducción estereoselectiva usando biocatalizadores tales como enzimas o microorganismos. Por ejemplo, la fenilacetaldehído reductasa de la cepa ST-10 de Corynebacterium tiene un intervalo amplio de sustrato y reduce diversas cetonas aromáticas proquirales y ß-cetoésteres para producir alcoholes secundarios ópticamente activos con una pureza enantiomérica de más de 98% de exceso enantiómerico (ee). Itoh y col., Eur. J. Biochem., 2002, v. 269, pp. 2394 - 2402. Según una revisión sobre desarrollos recientes en la reducción asimétrica de cetonas con biocatalizadores, por ejemplo, para la reducción de 2-metil-3-oxobutanoato de etilo, Klebseilla pneumoniae IFO 3319 de 450 cepas bacterianas se encontró que proporcionaba el (2R,3S)hidroxiéster correspondiente con > 99% de ee. K. Nakamura y col Tetrahedron: Asymmetry, 2003, vol. 14, 2659 - 2681. La patente de Estados Unidos N° 5.310.666 describe una cepa de Rhodotorula rubra, que reduce pentoxifilina a 100% para producir el S-alcohol. La patente de Estados Unidos 6.451.587 proporciona procedimientos de reducción asimétrica microbiana para preparar el alcohol (R)-2-cloro-1-[6-(2,5-dimet¡lpirrol-1-il)pir¡din-3-il]etanol a partir de la cetona 2-cloro-1-[6-(2,5-d¡metilp¡rrol-1-il)p¡ridin-3-il]etanona. Las patentes de Estados Unidos Números 6.642.387 y 6.515.134 describen la preparación de ciertos derivados de hidroxietílpiridina ópticamente activos que usan reducción microbiana. La patente de Estados Unidos N° 5.391.495 describe la reducción estereoselectiva de ciertos compuestos de sulfonamida que contienen ceto para formar los compuestos correspondientes que contienen grupo hídroxilo utilizando un microorganismo o una enzima capaz de catalizar la reducción. Los biocatalizadores de células enteras se usaron para reducir 3,4- diclorofenacilcloruro para proporcionar la (R) o (S)-clorohidrina con altos rendimientos y de buenos a altos ee. Barbieri y col., Tetrahedron Asymmetry, 1999, vol. 10, pp. 3931 - 3937. Se obtuvo 1-feniletilalcohol no racémico de configuración R y S y de alta pureza enantiomérica mediante bio - reducción de acetofenona en ambiente de hexano anhidro no acuoso. Zymanczyk - Duda y col., Enzyme Microbiol. Technol., 2004, vol. 34, pp. 578 - 582. El documento WO 02/077258 describe la preparación de ciertos derivados de (S)-1-(2,4- sustituido-feníl)etanol mediante reducción microbiana. Sin embargo, la reducción microbiana y enzimática estereoselectiva de 1-(2,6-dicloro-3- fluorofenil)etanona no se ha conocido. Como alternativa, se puede separar la mezcla de enantiómeros. Sin embargo, las mezclas de enantiómeros son difíciles, y a menudo imposibles, de separar debido a que las propiedades físicas de los enantiómeros son idénticas con respecto a las sustancias quírales y solamente se pueden distinguir por su comportamiento con respecto a otras sustancias quirales. Se han utilizado procedimientos cromatográficos que usan una fase sólida quiral para separar las mezclas enantioméricas, pero los soportes sólidos quirales son costosos y, típicamente, la resolución es escasa. Un procedimiento alternativo de separación de mezclas enantioméricas es haciéndolas reaccionar con un reactivo quiral. En este procedimiento, la mezcla de enantiómeros reacciona con el reactivo quiral para formar diastereómeros que son distinguibles entre sí basándose en sus propiedades respecto a sustancias quirales, y por lo tanto, se pueden separar mediante técnicas tales como recristalización y cromatografía. Este procedimiento requiere tiempo largo y da como resultado pérdida de rendimiento debido a que requiere dos etapas adicionales de reacción (es decir, una reacción para añadir el auxiliar quiral a los enantiómeros y la otra reacción para eliminarlo después de que los diastereómeros se hayan separado). En algunos casos, un reactivo quiral reaccionará mucho más rápido con un enantiómero que con otro el enantiómero en la mezcla enantiomérica. En este caso, el enantiómero que reacciona más rápido se puede eliminar antes de que se forme el otro enantiómero. Este procedimiento también necesita dos etapas adicionales de reacción para añadirle auxiliar quiral y eliminarlo después de la separación. Los procedimientos descritos anteriormente no se pueden aplicar siempre con éxito a un sistema particular, y cuando se pueden aplicar, son a menudo caros, requieren largo tiempo y dan como resultado pérdida en rendimiento. Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos procedimientos para obtener un enantiómero individual a partir de una mezcla enantiomérica. Se sabe que se puede lograr la resolución quiral de compuestos usando enzimas, tales como esterasas, lipasas, y proteasas o microorganismos. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.703.396 describe la resolución quiral de una mezcla racémica de enantiómeros de nucleósidos basándose en hidrólisis enzimática de esteres de C5'-nucleósidos. La patente de Estados Unidos N° 6.638.758 describe la resolución enzimática de esteres racémicos de lactama usando un biocatalizador, tal como una enzima o un microorganismo. La patente de Estados Unidos N° 5.928.933 describe una enzima con un valor de exceso enantiómeríco de 95% para esteres alquílícos de N-(alcoxicarbonil)- 4-ceto-D, L-prolina como resultado de experimentos extensos para especificidad de reacción de 44 enzimas, incluyendo proteasas, lipasas y esterasas. La preparación de ciertos alcoholes secundarios ópticamente activos mediante combinación de hidrólisis enzimátíca y transformación química se describe, por ejemplo, en Danda y col., Tetrahedron, 1991 , vol. 47, pp.8701 - 8716; Vanttinen y col., Tetrahedron: Asymmetry, 1995, vol. 6, pp. 1779 - 1786; y Liu y col., Chirality , 2002, vol. 14, pp. 25 - 27. Aunque los biocatalizadores son muy útiles para la separación de mezclas de enantiómeros, debido a la selectividad para enantiómeros y la pureza óptica de productos puede variar dependiendo de la elección de una enzima o microorganismo y de las estructuras químicas de sustratos, se requieren esfuerzos intensivos para encontrar combinaciones de biocatalizadores adecuados para sustratos. Especialmente, en ninguna parte se encuentra un procedimiento para separar esteres 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólicos enantioméricos usando un bíocatalizador.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan procedimientos para preparar estereoisómeros enantioméricamente puros de 1 -(2, 6-d icloro-3-f luorofenil )etanol. En una realización, la presente invención proporciona (1 S)-1- (2,6- dicloro-3-fluorofenil)etanol que está al menos 70% libre de (1 R)-1-(2,6-dicloro- 3-fluorofenil)etanol; preferiblemente al menos 80% libre de (1 R)-1-(2,6-dicloro- 3-fluorofenil)etanol; más preferiblemente al menos 90% libre de (1R)-1-(2,6- dicloro-3-fluorofenil)etanol; y lo más preferiblemente al menos 95% libre de (1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofeníl)etanol. En otra realización la presente invención proporciona un procedimiento de separación de esteres 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólicos enantioméricos de fórmula (I): en la que R es hidrógeno, alquilo Ci - C20, cicloalquílo C3 - C8, arilo C6 - C14, arilalquilo C - C15, alcoxi Ci - C2o, o alquil d - C20 amino, en la que dichos radicales hidrocarburo pueden estar opcionalmente monosustituidos o polisustituidos con hidroxilo, formilo, oxi, alcoxi Ci - C6, carboxi, mercapto, sulfo, amino, alquil Ci - C6 amino, nitro o halógeno, comprendiendo el procedimiento las etapas de: poner en contacto los esteres 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólicos de fórmula (I) con un biocatalizador en una solución acuosa, un disolvente orgánico, o una mezcla de disolventes orgánicos y acuosos en la que solamente un enantiómero se hidroliza selectivamente para proporcionar un isómero ópticamente activo de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol y un isómero ópticamente activo sin reaccionar de éster 1-(2,6-dícloro-3- fluorofenil)etanólico, y separar el isómero ópticamente activo de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol del éster 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólico ópticamente activo sin reaccionar.

Todavía en otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar (1 S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol que comprende las etapas de: poner en contacto una mezcla de esteres 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólicos enanfioméricos de fórmula (i): en la que R es hidrógeno, alquilo Ci - C2o, cicloalquilo C3 - C8, arilo Ce - C14, arilalquilo C7 - C15, alcoxi C1 - C20, o alquil C-i - C20 amino, en la que dichos radicales hidrocarburo pueden estar opcionalmente monosustituidos o polisustituidos con hidroxílo, formílo, oxí, alcoxi C1 - C6, carboxi, mercapto, sulfo, amino, alquil C1 - C6 amino, nitro o halógeno, con un biocatalizador en una solución acuosa, un disolvente orgánico, o una mezcla de disolventes orgánicos y acuosos en la que solamente el enantiómero (R)- se hidroliza selectivamente para proporcionar una mezcla de (1 R)-1-(2,6-dicloro-3- fluorofeníl)etanol y un éster (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólico; y convertir la mezcla de (1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofeníl)etanol y el éster (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólíco en (1S)-1-(2,6-dicloro-3- fluorofenil)etanol. Otras realizaciones específicas de este procedimiento incluyen aquellas en las que la etapa de conversión comprende: a) hacer reaccionar (1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol en la mezcla de (1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol y el éster (1 S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólico con un haluro de sulfonilo orgánico en un disolvente aprótico para formar una mezcla de un éster de ácido sulfónico orgánico de (1 R)-1- (2,6- dícloro-3-fluorofenil)etanol y el éster (1S)-1-(2,6-dícloro- 3- fluorofenil)etanólico; b) adicionalmente hacer reaccionar el éster de ácido sulfónico orgánico de (1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol en la mezcla del éster de ácido sulfónico orgánico de (1 R)-1-(2,6- dicloro-3- fluorofenil)etanol y el éster (1S)-1-(2,6-dicloro-3- fluorofenil)etanólíco con una sal de metal alcalino de un ácido carboxílíco alifático en un disolvente aprótico para formar una mezcla de un éster de ácido carboxílico alifático de (1S)-1- (2,6- dicloro-3-fluorofeníl)etanol y el éster (1S)-1-(2,6-dicloro- 3- fluorofenil)etanólico; y c) transformar la mezcla del éster del ácido carboxílico alifático de (1S)-1- (2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol y el éster (1 S)-1- (2,6-dícloro-3- fluorofenil)etanólico en (1S)-1-(2,6-dicloro-3- fluorofeníl)etanol.

Todavía otras realizaciones específicas del procedimiento incluyen aquellas en las que: R es metilo; el catalizador es esterasa de hígado de cerdo; en la etapa de reacción a) el haluro de sulfonilo orgánico es cloruro de metanosulfonilo y el disolvente aprótico es piridina; en la etapa de reacción b) la sal de metal alcalino del ácido carboxílico alifático es acetato de potasio y el disolvente aprótico es dimetilformamida; la etapa de transformación c) es solvolísis en un disolvente alcohólico o acuoso en presencia de una sustancia básica. Todavía otras realizaciones de este procedimiento incluyen las que comprenden la etapa de seleccionar el biocatalizador a través de un procedimiento de selección de alto rendimiento antes de la etapa de puesta en contacto. En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar un isómero ópticamente activo de 1-(2,6-dicloro-3- fluorofeníl)etanol que comprende la etapa de reducir 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanona mediante un biocatalízador de una manera enantioselectiva para proporcionar el isómero ópticamente activo de 1-(2,6-dícloro-3- fluorofenil)etanol. Otras realizaciones específicas del procedimiento incluyen las que comprenden la etapa de seleccionar el biocatalizador a través de un procedimiento de selección de alto rendimiento antes de la etapa de puesta en contacto. Otras realizaciones específicas del procedimiento incluyen aquellas en las que: el biocatalízador es la alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo o un microorganismo del género Rhodotorula.

Definiciones El término "biocatalizador", como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a una enzima o un microorganismo. Las actividades de las enzimas usadas en esta invención se expresan en "unidades". Unidades se definen como la relación de hidrólisis de propionato de p-nitrofenilo expresada en µmoles/minuto a temperatura ambiente. El término "biotransformación", como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a conversión de una sustancia en otros compuestos que emplean una enzima o microorganismo. El término "biorreducción", como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a un procedimiento en el que se añaden electrones a un átomo o ion (como mediante la adición de hidrógeno o eliminación de oxígeno) que emplea una enzima o microorganismo; dicho procedimiento siempre se produce acompañado de oxidación del agente reductor. El término "co - factor" o "coenzima" significa una sustancia, que activa una enzima o es necesario para la actividad normal de una enzima. El término "cofactor" o "coenzima" como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a cualquier cofactor o coenzima adecuado que comprende el sistema de reducción enzímática tal como, por ejemplo, NADH, NADPH, FADH, FMNH, y/o PQQ o cualquier cofactor o coenzima adecuado, que se produce con la enzima en el microorganismo. El término "enzima" incluye aquellas enzimas que se conocen o de otra manera se pueden obtener por los expertos en la técnica relevante y son capaces de lograr las reacciones estereoselectivas descritas en la presente invención. El término "sistema de reducción enzimática" significa una enzima oxidorreductasa adecuada y la forma reducida de un cofactor para la enzima oxidorreductasa. La enzima que comprende el sistema de reducción enzimátíca puede estar o bien en forma libre o inmovilizada, por ejemplo, en una columna o unida a una perla. El término "resolución enzimática", "proceso enzimático", "procedimiento enzimático" o "reacción enzímática" significa una resolución, proceso, procedimiento o reacción de la presente invención que emplea una enzima o microorganismo. El término "resolución" significa separación parcial, así como, preferiblemente separación completa de los enantiómeros de una forma racémica. El término "hidrólisis estereoselectiva" se refiere a la hidrólisis preferencial de un enantiómero con relación a otro. El término "mezcla" como se usa en esta memoria descriptiva en relación a compuestos enantioméricos, significa mezclas que tienen cantidades iguales (racémícas) o desiguales de enantiómeros. El término "exceso enantiómerico (ee)" se refiere al término antiguo de "pureza óptica". En una mezcla de un enantiómero puro (S o R) y un racemato, exceso enantiómerico es el exceso en porcentaje del enantiómero sobre el racemato. Exceso enantiómerico ("ee") se puede expresar en la siguiente ecuación 1 , por ejemplo: ECUACIÓN 1 ee = [SMR] [S]+[R] [S] = concentración de enantiómero S [R] = concentración de enantiómero R El término "valor de enantioselectividad" o "valor E" significa la relación de constantes de especificidad para cada enantiómero del racemato (Kcat/Km) definido más adelante. El valor E se puede interpretar como el número de veces que la enzima es más reactiva respecto a hacia un enantiómero con relación al otro (por ejemplo, un valor E de 50 significa que un enantiómero reacciona aproximadamente 50 veces más rápido que el otro.) Con el fin de determinar la enantioselectividad del biocatalizador respecto a un enantiómero puro (S o R), se necesita obtener el valor de enantioselectívidad (E) (Ecuación 2).

ECUACIÓN 2 KC KS In [l-c(l + ee )] In [l-c(l - eej] E = Kcat¿KR ln [1'c(1 " eep)] ln ll'c 1 + ee Kcass = constante de velocidad enzimática de primer orden para el enantiómero S Ks = constante de Michaelis c = grado de conversión eep = exceso enantiómerico del producto ees = exceso enantiómerico del sustrato Por ejemplo, la hidrólisis estereoselectiva de esteres mediante bíocatalizadores, un programa (software Ee2 de la Universidad de Graz) puede calcular el valor E de forma precisa si se conocen el exceso enantiómerico (ee) de o bien el alcohol o el éster en una conversión enzimática particular. El valor ee se puede obtener, por ejemplo, a partir de la ecuación 1. Los datos [S] y [R] se pueden obtener, por ejemplo, mediante HPLC. El término "HPLC" significa cromatografía líquida de alta presión. El término "RP-HPLC" significa HPLC de fase inversa.

El término "PLE" significa esterasa de hígado de cerdo. El término "reducción microbiana" significa la reducción estereoselectiva que se logra mediante el sistema de reducción enzimática, comprendiendo la reductasa microbiana el sistema de reducción enzimátíca, el microorganismo intacto, o cualquier preparación de los mismos, o similares. El término "microorganismo" incluye cualquier microorganismo intacto o preparación del mismo, que incluye, por ejemplo, una preparación de células rotas del microorganismo; una preparación deshidratada del microorganismo, por ejemplo, una preparación enzimática en polvo en acetona; un lavado de microorganismos libre de, por ejemplo, medio de fermentación, caldo de cultivo, y similares; microorganismo inmovilizado, por ejemplo, en una columna, unido a perlas, y similares. Como se usa en esta memoria descriptiva, los términos "ópticamente puro", "enantioméricamente puro", "enantiómero puro", y "enantiómero ópticamente puro" significa una composición que comprende un enantiómero de un compuesto y está sustancialmente libre del enantiómero opuesto del compuesto. Un compuesto ópticamente puro típico comprende más de aproximadamente 80% en peso de un enantiómero del compuesto y menos de aproximadamente 20% en peso del enantiómero opuesto del compuesto, más preferiblemente mayor que aproximadamente 90% en peso de un enantiómero del compuesto y menos que aproximadamente 10% en peso del enantiómero opuesto del compuesto, incluso más preferiblemente mayor que aproximadamente 95% en peso de un enantiómero del compuesto y menos que aproximadamente 5% en peso del enantiómero opuesto del compuesto, y lo más preferiblemente mayor que aproximadamente 97% en peso de un enantiómero del compuesto y menor que aproximadamente 3% en peso del enantiómero opuesto del compuesto. El término "mutantes adecuados" incluyen aquellos microorganismos que se conocen o de otra manera se pueden obtener por los expertos en la técnica relevante y son capaces, a pesar de tal mutación, llevar a cabo las reacciones estereoselectivas descritas en la presente invención. El término "halo" o "halógeno", como se usa en esta memoria descriptiva, salvo que se indique de otra manera, significa fluoro, cloro, bromo o yodo. Los grupos halo preferidos son fluoro, cloro y bromo. El término "alquilo", como se usa en esta memoria descriptiva, salvo que se indique otra cosa incluye radicales hidrocarburo monovalentes saturados que tienen restos lineales o ramificados. El término "alcoxi", como se usa en esta memoria descriptiva, salvo que se indique otra cosa incluye grupos O-alquilo en los que alquilo es como se ha definido anteriormente. El término "Me" significa metilo, "Et" significa etilo, y "Ac" significa acetilo. El término "cicloalquilo", como se usa en esta memoria descriptiva, salvo que se indique otra cosa se refiere a un hidrocarburo no aromático, saturado o parcialmente saturado, monocíclico o condensado, espiro o bicíclico o tricíclico no condensado mencionado en esta memoria descriptiva que contiene un total de entre 3 y 10 átomos de carbono, preferiblemente 5 - 8 átomos de carbono de anillo. Los cicloalquilos ejemplares incluyen anillos monocíclicos que tienen entre 3 y 7, preferiblemente entre 3 y 6 átomos de carbono, tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentílo, ciclohexílo, cicloheptílo y similares. El término "arilo", como se usa en esta memoria descriptiva, salvo que se indique otra cosa, incluye un radical orgánico derivado de un hidrocarburo aromático mediante la eliminación de un hidrógeno, tal como fenilo o naftilo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a procedimientos biocatalíticos para preparar estereoisómeros enantioméricamente puros de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol. Se describen procedimientos de preparación del enantiómero (S) deseado, dichos procedimientos se basan en una combinación de resolución enzimática, esterificación química, e hidrólisis química con inversión de esteres 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etílicos o biorreduccíón esteroeoselectiva de 2,6-dicloro-3-fluoroacetofenona con un biocatalizador tal como una enzima o un microorganismo.

I. Procedimientos de selección de biocatalizadores automática Según la presente invención, un procedimiento de selección de alto rendimiento (HTS) práctico y eficaz se usa para identificar los biocatalizadores deseados a partir de cientos de biocatalizadores potenciales tales como enzimas o microorganismos así como numerosos parámetros de reacción potenciales bajo los que pueden funcionar óptimamente. El hecho de que tales parámetros, incluyendo disolvente, contenido en disolvente, pH, temperatura, tiempo, y co - sustratos, estén muchas veces correlacionados de manera no lineal hace la tarea de selección incluso más desafiante. Un protocolo general de HTS que se ha validado mediante un número de proyectos globales en Pfizer se describe en Yazbeck y col., Adv. Synth. Cata!., 2003, vol. 345, pp. 524 - 532. Usando este planteamiento, cientos de reacciones se pueden establecer y analizar en días, que de otra manera podría requerir semanas usando preparación de reacciones de viales simples. Una gran ventaja ganada mediante el uso de este protocolo es que requiere cantidades muy pequeñas tanto de los catalizadores, por ejemplo, enzimas, que pueden ser muy caros, como de los sustratos racémicos que se seleccionan, que son comúnmente intermedios farmacéuticos disponibles en cantidades limitadas. La base fundamental detrás de este protocolo de HTS es que las enzimas se pueden estabilizar y almacenar durante meses en placas de 96 pocilios adecuadas en ciertas condiciones preparativas. Un segundo requerimiento esencial es que esté disponible un número de instrumentos analíticos diferentes para analizar una diversidad de sustratos seleccionados mediante estas placas de 96 pocilios. Alguna de las herramientas analíticas disponibles incluye cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), electroforesis capilar (EC), cromatografía de gas (CG), espectrometría UV, y cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (CL - EM). La elección de herramienta analítica para usar depende de la naturaleza del sustrato, principalmente sus propiedades de absorbancia y volatilidad. La reactividad de la enzima respecto a los sustratos usualmente se analiza primero, seguida del análisis de los impactos reactivos que usan procedimientos quirales. Se puede usar la misma placa de 96 pocilios muestreada para analizar tanto reactividad como enantioselectividad. La combinación de este protocolo de selección con algoritmos de optimización estadística puede permitir rápidamente y eficazmente al usuario predecir condiciones importantes y sugerir dónde debería darse una optimízación adicional.

II. Preparación de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol ópticamente activo mediante combinación de resolución enzimática y transformación química Se proporciona un procedimiento para la resolución de mezclas de enantiómeros 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol. En una realización, el procedimiento implica el uso de un biocatalizador tal como una enzima o microorganismo que preferiblemente cataliza una reacción de un enantiómero en una mezcla. En la realización preferida, el procedimiento implica una resolución enzimática, que se basa en hidrólisis estereoselectiva de esteres 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etílicos. En otra realización, el enantiómero que reacciona se puede separar del enantiómero que no ha reaccionado basándose en la nueva diferencia de estructura física. Todavía en otra realización, el enantiómero que ha reaccionado se puede convertir en otro enantiómero mediante transformación química con inversión. Todavía en otra realización, la conversión del enantiómero que ha reaccionado en otro enantiómero se puede realizar en la mezcla del enantiómero que ha reaccionado y el enantiómero que no ha reaccionado.

II (a) Resolución enzimática basada en la hidrólisis estereoselectiva de esteres 1-(2,6-dícloro-fluorofenil)etílicos Se proporciona un procedimiento de hidrólisis estereoselectiva para la resolución enzimática de mezclas de enantiómeros de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol. Dada la descripción en esta memoria descriptiva, los expertos en la técnica son capaces de elegir, usando el procedimiento de selección de alto rendimiento (HTS) descrito anteriormente, una enzima o microorganismo que es selectivo para el enantíómero del éster 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etílico de elección o selectivo para el enantiómero no deseado, como un procedimiento de eliminarlo, seleccionando una de las enzimas o microorganismos descritos más adelante o mediante evaluación sistémica de las otras enzimas o microorganismos conocidos. Dada esta descripción, los expertos en la técnica también saben cómo modificar el sustrato según sea necesario para lograr la resolución deseada. A través del uso de reactivos de desplazamiento de RMN quiral, polarimetría, o HPLC quiral, se puede determinar el enriquecimiento óptico del éster o alcohol recuperado. Véase, por ejemplo, J. Am. Chem. Soc. 1973, v. 95, p. 512; Trost y col., J. Org. Chem. 1986, v. 51 , pp. 2370 - 2374; J. Org. Chem. 1998, v. 63, p. 8957; Tetrahedron: Asymmetry 1995, v. 6, p. 2385; Tetrahedron: Asymmetry 1996, v. 7, p. 3285. Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente el uso de enzimas o microorganismos para resolver mezclas racémicas de enantiómeros. Se pueden usar otros procedimientos conocidos de resolución de mezclas racémicas en combinación con el procedimiento de resolución descrito en esta memoria descriptiva. Véase por ejemplo, Roger A Sheldon, Chirotechnology: Industrial synthesis of optically active compounds, Nueva York, Marcel Dekker, 1993. Todas estas modificaciones se consideran dentro del alcance de la invención. En esta realización, el procedimiento incluye hacer reaccionar el grupo hidroxilo de una mezcla de enantiómeros de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol con un compuesto acilo para formar esteres en los que 1-(2,6-dicloro-3- fluorofeníl)etanol está en el extremo "carbinol" del éster. La mezcla de enantiómeros del éster 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etílico después se trata con un bíocatalizador que escinde preferiblemente, o hidroliza, uno de los enantiómeros y no el otro.

Una ventaja de este procedimiento es que se puede usar para resolver una amplia diversidad de 1-(fenil)etanoles que están opcíonalmente sustituidos en el resto carbinol. La amplia aplicabilidad de este procedimiento puede residir en parte en el hecho de que aunque la porción carbinol del éster puede jugar un papel en la capacidad de un biocatalízador de diferenciar enantiómeros, el sitio de reconocimiento principal para estos biocatalízadores puede estar en la parte de ácido carboxílico del éster. Además, uno puede ser capaz de extrapolar con éxito los resultados de un estudio de biocatalizador/sustrato a otro, sistema aparentemente diferente, con tal que las porciones de ácido carboxílico de los dos sustratos sean iguales o sustancialmente similares. Todavía otra ventaja de este procedimiento es que la separación del enantiómero no hidrolizado y el enantiómero hidrolizado de la mezcla de reacción puede ser bastante simple. El enantiómero no hidrolizado puede ser más lipófilo que el enantiómero hidrolízado y se puede recuperar eficazmente mediante extracción simple con uno de una amplía diversidad de disolventes orgánicos no polares o mezclas de disolventes, por ejemplo, hexano y hexano/éter. El enantiómero menos lipófilo, más polar, hidrolizado se puede después obtener mediante extracción con un disolvente orgánico más polar, por ejemplo, acetato de etilo, o mediante liofilización, seguido de extracción, por ejemplo, con etanol o metanol. La enzima o microorganismos se pueden usar solos o en combinación. Dependiendo del tipo de enzima o microorganismo usado, uno cualquiera de los isómeros ópticos del éster se hidroliza predominantemente para proporcionar el alcohol ópticamente activo. Se puede obtener uno cualquiera de los isómeros ópticos medíante la selección de una enzima o microorganismo adecuado. Con el acoplamiento apropiado de enzima y sustrato, se pueden establecer condiciones para el aislamiento de cualquier enantiómero de 1-(2,6- 3-fluorofenil)etanol. El enantiómero deseado se puede aislar mediante tratamiento de la mezcla racémica con una enzima que hidroliza el enantiómero deseado (seguido de extracción del hidrolizado polar con un disolvente polar) o mediante tratamiento con una enzima que hidrolíza el enantiómero no deseado (seguido de la eliminación del enantiómero no deseado con un disolvente no polar).

II ( b) Biocatalizadores En una realización de la presente invención, el procedimiento de resolución enzimátíca emplea una enzima como biocatalízador para hidrólisis estereoselectiva de esteres 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etílicos. Los ejemplos de enzimas que catalizan la hidrólisis de esteres incluyen, pero no se limitan a, esterasas, lipasas y proteasas (substilisina y a-quimotripsina). La enzima puede ser cualquier enzima obtenible de anímales, plantas, microorganismos, etc. La enzima se puede emplear de cualquier forma convencional tal como en una forma purificada, una forma bruta, una mezcla con otras enzimas, un caldo de fermentación microbiana, un caldo de fermentación, un cuerpo microbiano, un filtrado de caldo de fermentación, y similares, bien solos o en combinación. Además, la enzima o cuerpo microbiano se puede inmovilizar sobre una resina. Los ejemplos específicos de la enzima son los obtenidos a partir de animales y plantas útiles en la presente invención incluyendo, pero sin limitación, esterasa de hígado de vaca, esterasa de hígado de cerdo, esterasa de páncreas de cerdo, esterasa de hígado de caballo, esterasa de hígado de perro, fosfatasa de cerdo, amilasa obtenible de cebada y patata y lipasa obtenible de trigo. Por ejemplo, las aplicaciones de esterasa de hígado de cerdo en síntesis asimétrica se describen en Tetrahedron, 1990, vol. 46, pp. 6587 - 6611 ; Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, edición 2a, Wiley - VCH 2002, vol. II, pp. 384 - 397. Otros ejemplos son hidrolasas obtenidas a partir de microorganismos tales como Rhodotorula, Trichoderma, Candida, Hansenula, Pseudomonas, Bacillus, Achromobacter, Nocardia, Chromobacterium, Flavobacterium, Rhizopus, Mucor, Aspergillus, Alkaligenes, Pediococcus, Klebsiella, Geotrichum, Lactobaccilus, Cryptococcus, Pichia, Aureobasidium, Actinomucor, Enterobacter, Torulopsis, Corynebacterium, Endomyces, Saccaromyces, Arthrobacter, Metshnikowla, Pleurotus, Streptomyces, Proteus, Gliocladium, Acetobacter, Helminthosporium, Brevibacterium, Escherichia, Citrobacter, Absidia, Micrococcus, Microbacterium, Penicillium y Schizophyllium así como a partir de liquen y algas. Las enzimas ejemplares, comercialmente disponibles adecuadas para uso en la presente invención incluyen esterasas tales como, por ejemplo, esterasa de hígado de cerdo (Biocatalytics Inc.), lipasas tales como Amano PS - 30 (Pseudomonas cepacla), Amano GC - 20 (Geotrichum candidum), Amano APF (Aspergillus niger), Amano AK (Pseudomonas sp.), lipasa de Pseudomonas fluorescens (Biocatalyst Ltd.), Amano Lípasa P30 (Pseudomonas sp.), Amano P (Pseudomonas fluorescens), Amano AY - 30 (Candida cylindracea), Amano N (Rhizopus niveus), Amano R (Penicillium sp.), Amano FAP (Rhizopus oryzae), Amano AP - 12 (Aspergillus niger), Amano MAP (Mucor melhei), Amano GC - 4 Geotrichum candidum), Sigma L - 0382 y L - 3126 (pancreasa porcina), Lipasa OF (Sepracor), Esterasa 30.000 (Gist - Brocarde), KID Lípasa (Gist - Brocarde), Lipasa R (Rhizopus sp., Amano), Sigma L - 3001 (germen de trigo), Sigma L - 1754 (Candida cytindracea), Sigma L - 0763 (Chromobacterium viscosum) y Amano K - 30 (Aspergillus niger). Adicíonalmente, enzimas ejemplares derivadas de tejido animal incluyen quimotripsina y pancreafina de páncreas tales como lipasa pancreática porcina (Sigma). Dos o más, así como una única enzima se puede emplear cuando se lleva a cabo el procedimiento de la presente invención. Además, se pueden usar enzimas, que son serina carboxipeptidasas. Estas enzimas se derivan de Candida lipolytica, Saccharomyces cerevisiae, trigo (Triticum aestivum) y Penicillium janthinellum. También se pueden usar cristales de enzimas reticulados comercia Imente disponibles tales como de Altus Biologics, Inc. (por ejemplo, ChiroCLEC-CR, ChiroCLEC-PC, ChiroCLEC-EC). La presente invención también se refiere al uso de esterasas termoestables y esterasas modificadas por ingeniería genética para la resolución de los esteres. Estas enzimas, comercialmente disponibles de ThermoGen, Inc., son especialmente adecuadas para uso en procedimientos industriales y son fáciles de usar. Además de funcionar en un amplio intervalo de temperaturas que incluyen altas temperaturas, estas enzimas termoestables poseen un incremento de vida útil que mejora la manipulación. Las enzimas son también capaces de resistir condiciones severas, no biológicas (pH, concentraciones salinas, etc.) usualmente asociadas a procedimientos industriales debido a su estabilidad en condiciones operativas. Se pueden inmovilizar para reutilizar en múltiples aplicaciones, mejorando la rentabilidad del procedimiento. Durante el aislamiento de los productos después de resolución enzimática, las enzimas se exponen frecuentemente a cantidades pequeñas de disolventes orgánicos. Además, algunas resoluciones enzimáticas se encuentran que trabajan mejor en una mezcla de disolventes acuosos y orgánicos o en disolventes orgánicos solos. Las enzimas esterasas de la presente invención son más tolerantes a la desnaturalización mediante muchos disolventes orgánicos comparadas con enzimas convencionales que permiten semividas operacionales más duraderas. La mayoría de las enzimas esterasas se producen usando técnicas de ingeniería genética de clonación de genes que asegura la pureza de estas enzimas y la facilidad de controles del procedimiento durante el crecimiento en escala. En lugar de enzimas aisladas, se puede emplear también un microorganismo que puede producir cualquier enzima descrita anteriormente. En otra realización de la presente invención, el procedimiento de resolución enzimátíca emplea un microorganismo como biocatalizador para hidrólisis estereoselectiva de esteres 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etílicos. Los ejemplos específicos de los microorganismos útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a Rhodotorula minuta, Rhodotorula rubra, Candida krusei, Candida cylindracea, Candida tropicalis, Candida utilus, Pseudomonas fragi, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Rhizopus chinensis, Mucor pusillus, Aspergillus niger, Alkaligenes faecalis, Torulopsis ernobii, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus pulmilus, Bacillus subtilis var. niger, Citrobacter freundii, Micrococcus varians, Micrococcus luteus, Pediococcus acidlactici, Klebsiella pneumoniae, Absidia hyalospora, Geotrichum candidum, Schizophyllum commune, Nocardia uniformis subtsuyanarenus, Nocardia uniformis, Chromobacterium chocolatum, Hansenula anómala var. ciferrii, Hansenula anómala, Hansenula polymorpha, Achromobacter lyticus, Achromobacter parvulus, Achromobacter sinplex, Torulopsis candida, Corynebacterium sepedonicum, Endomyces geotrichum, Saccaromyces carrvisial, Arthrobacter globiformis, Streptomyces grisens, Micrococcus luteus, Enterobacter cloacae, Corynebacterium ezui, Lactobacillus casei, Cryptococcus albidus, Pichia polimorpha, Penicillium frezuentans, Aureobasidium pullulans, Actinomucor elegans, Streptomyces grisens, Proteus vulgaris, Gliocladium roseum, Gliocladium virens, Acetobacter aurantius, Helminthosporium sp., Chromobacterium iodinum, Chromobacterium violaceum, Flavobacterium lutescens, Metschnikowia pulcherrima, Pleurotus ostreatus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium divaricatum, Escherichia coli, Rodotorula minuta var. texensis, Trichoderma longibrachiatum, Mucor javanicus, Flavobacterium arbonescens, Flavobacterium heparinum, y Flavobacterium capsulatum. Las enzimas y/o microorganismos usados en la presente invención pueden estar en forma bruta o en forma inmovilizada. Se pueden inmovilizar sobre diversos soportes sólidos sin pérdida de estereoespecificidad o cambio en estereoselectividad. Los soportes sólidos pueden ser absorbentes inertes a los que la enzima no está covalentemente unida. En cambio la enzima se absorbe tal como mediante interacciones de porciones hidrófobas o hidrófilas de una proteína con las regiones parecidas del absorbente inerte, mediante enlace de hidrógeno, mediante formación de puentes de sal, o mediante interacciones electrostáticas. Los materiales absorbentes inertes incluyen, pero no se limitan a, polímeros sintéticos (por ejemplo, poliestireno, poli(alcohol vinílíco), polietíleno y poliamidas), compuestos minerales (por ejemplo, tierra de diatomeas y tierra de Fuller), o polímeros de origen natural (por ejemplo, celulosa). Los ejemplos específicos de tales materiales incluyen tierra de diatomeas Celita 545, perlas de resina polimérica Abelite XAD -8 y polietilenglicol 8000. La enzima se puede inmovilizar también sobre el soporte al que la enzima está unida covalentemente (por ejemplo, perlas de oxirano -acrílicas y soportes activados por glutaraldehído). Los ejemplos específicos incluyen perlas de oxirano acrílicas Eupergit C y Celíta 545 activada por glutaraldehído. Otros posibles sistemas inmovilizantes se conocen bien y están fácilmente disponibles para los expertos en la técnica de inmovilización de enzimas. En lugar de procedimientos de inmovilización convencionales descritos anteriormente, las enzimas también se pueden reciclar convenientemente para reutilización simplemente separando por precipitación las enzimas usadas con sulfato de amonio. El conjunto sulfato de amonio -enzima precipitada se puede usar directamente en la siguiente hidrólisis enzimática. Las sales se usan comúnmente en la purificación de enzimas. Generalmente protegen las enzimas proteicas reduciendo la actividad del disolvente. Por ejemplo, se pueden usar sulfato de amonio, sulfato de potasio, fosfato de potasio, cloruro de sodio, etc., en la recuperación de la actividad enzimátíca. La enzima o microorganismos se pueden usar solos o en combinación. Dependiendo del tipo de enzima o microorganismo usado, uno cualquiera de los isómeros ópticos del éster se hidrolíza predominantemente para proporcionar el alcohol ópticamente activo. Se puede obtener uno cualquiera de los isómeros ópticos mediante la selección de una enzima o microorganismo adecuado.

II (c) Sustratos El grupo acilo más eficaz a usar para esterificar 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol se puede determinar sin excesiva experimentación mediante evaluación de un número de homólogos usando el sistema enzimático seleccionado. Los ejemplos no limitantes de grupos acilo que se pueden evaluar para uso con una enzima o microorganismo particular incluyen ácidos alquilcarboxílícos y ácidos alquilcarboxílicos sustituidos, incluyendo ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, y ácido pentanoico. Con ciertas enzimas o microorganismos, se puede preferir usar un compuesto acilo que es significativamente atractor de electrones para facilitar la hidrólisis mediante debilitación de enlace éster. Los ejemplos de grupos acilo atractores de electrones incluyen a-haloésteres tales como ácido 2- cloropropiónico, ácido 2-clorobutírico, y ácido 2-cloropentanoico. Los a- haloésteres son excelentes sustratos para lipasas. Además, el uso de anhídrido succínico como agente acilante para resolución práctica de alcoholes aril - alquílicos mediante acilacíón catalizada por lipasa se ha reseñado en Bouzemi y col., Tetrahedron Lett., 2004, vol. 45, pp. 627 - 630. Los diferentes procedimientos de esterificación conocidos en la técnica se pueden usar para preparar los sustratos de esteres 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etílicos. Véase por ejemplo, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1989, vol. 18, p. 1391 ; J. Org. Chem. 1994, vol. 59, 6018.

II (d). Condiciones de reacción para hidrólisis enzimática La hidrólisis enzimática de la presente invención se puede llevar a cabo poniendo en contacto los esteres 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etílicos con la enzima o microorganismo, usualmente en un medio de tampón acuoso con buena agitación. El medio de tampón puede ser tampones de sales de ácidos inorgánicos (por ejemplo, fosfato diácido de potasio, fosfato diácido de sodio), tampones de sales de ácidos orgánicos (por ejemplo, citrato de sodio), o cualquier otro tampón adecuado. La concentración del tampón puede variar entre 0.005 y 2 M, preferiblemente entre 0.005 y 0.5 M y dependerá del éster 1-(2,6-dicloro-3- fluorofenil)etílico específico y la enzima o microorganismo usado. Las hidrólisis enzimáticas realizadas en condiciones heterogéneas pueden sufrir escasa reproducibilidad. Por lo tanto, se prefiere que la hidrólisis se realice en condiciones homogéneas. Dependiendo de la solubilidad de los esteres 1-(2,6-dicloro-3-fluorofeníl)etílicos, homogeneidad se puede lograr mediante el uso de tensioactivos. Los tensioactivos preferidos incluyen pero no se limitan a tensioactívos no iónicos tales como alcoholes alquilarílpoliéter. Un tensioactivo preferido es octilfenoxipolietoxíetanol, comercialmente disponible como Tritón X - 100 (Sigma Chemical Company). Se usa una cantidad eficaz de tensioactivo. Las cantidades típicas pueden variar entre 0.05% y aproximadamente 10% (v/v). Sin embargo, estos tensioactivos no solamente ayudan en la disolución de los materiales de partida, también potencian la solubilidad acuosa del producto. Por lo tanto, aunque la reacción enzimática puede proceder más eficazmente con la adición de un tensioactivo no iónico que en condiciones heterogéneas, el aislamiento de ambos el material de partida recuperado y el producto se puede hacer más difícil. El producto se puede aislar con técnicas cromatográficas y químicas apropiadas (por ejemplo, formación de sal selectiva). Algunas veces es preferible añadir una cantidad eficaz de un co -disolvente orgánico para incrementar la solubilidad del producto para facilitar la reacción. Los ejemplos de co - disolventes incluyen pero no se limitan a acetonitrilo, THF, DMSO, DMF, alcoholes, etc. Las cantidades eficaces de un co - disolvente incluyen entre 1 % y 30% (v/v) dependiendo del éster 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etílíco específico y la enzima o microorganismo usado. Las hidrólisis enzimáticas se llevan a cabo típicamente con una cantidad catalítica de la enzima es un tampón acuoso que tiene un pH que está cerca del pH óptimo para la enzima en cuestión. A medida que la reacción sigue adelante, el pH cae como resultado de ácido carboxílico liberado. Se puede añadir base acuosa para mantener el pH cerca del valor óptimo para la enzima. El progreso de la reacción se puede determinar fácilmente controlando el cambio en pH y la cantidad de base necesaria para mantener el pH. El pH de los tampones o el pH de la reacción están normalmente entre 4 y 10, preferiblemente entre 5 y 9, más preferiblemente entre 7 y 8. La temperatura de reacción puede variar entre O y 100°C, y dependerá del éster 1- (2,6-dicloro-3-fluorofenil)etílico específico y de la enzima o microorganismo usado. El tiempo de reacción está generalmente entre 1 hora y 70 horas y dependerá del éster 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etílico específico, concentración de enzima y la enzima o microorganismo usado. Normalmente, la hidrólisis enzimática se deja que proceda durante un período suficiente para generar una cantidad satisfactoria del éster deseado o 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol deseado con pureza óptica satisfactoria. A medida que la reacción progresa, la cantidad de éster o alcohol deseado y su pureza óptica se puede controlar mediante HPLC y HPLC quiral. Normalmente, la conversión se lleva a cabo aproximadamente al 50%, después de lo cual el alcohol y los esteres se pueden obtener con buenos rendimientos después de aislamiento. La cantidad de enzima usada puede variar ampliamente entre 5 unidades y 12.000 unidades de enzima por mol de material de partida. La cantidad de enzima necesaria dependerá de la temperatura, el éster 1-(2,6-dicloro-3-fluorofeníl)etílíco específico, las enzimas y/o microorganismo usados, y el tiempo de reacción deseable. También puede ser deseable usar una gran cantidad de enzimas en algunos casos para asegurar un tiempo de reacción prácticamente corto, especialmente cuando las enzimas están inmovilizadas y se pueden reutilizar durante muchos recambios. La concentración del sustrato de éster puede estar entre 0.1 g/l y 500 g/l y depende del éster 1-(2,6-dicloro- 3-fluorofenil)etílico específico y la enzima y/o microorganismo usado.

II (e) Aislamiento de producto Los productos deseados, el éster sin reaccionar ópticamente puro (o enriquecido) y el alcohol ópticamente puro o enriquecido se pueden aislar a partir de la mezcla de hidrólisis usando procedimientos convencionales tales como extracciones, extracciones ácido - base, filtración, cromatografía, cristalización o las combinaciones de los mismos. Andreas Líese, y col., Industrial Biotransformations, Weinheim: WILEY - VCH, 2000. La enzima o microorganismo recuperado se puede reciclar como se ha descrito anteriormente.

II (f) Conversión enantiomérica basada en esterificación e hidrólisis química con inversión Según la presente invención, cualquier enatiómero de 1-(2,6-dicloro-3- fluorofenil)etanol se puede convertir en el otro enantiómero de 1-(2,6-dícloro-3-fluorofenil)etanol sí se desea. Esta conversión se puede realizar, por ejemplo, mediante una reacción de sustitución nucleófila en C - 1 acompañada de una inversión estérica. Tal reacción se llevar a cabo con el uso de un reactivo nucleófilo. Los procedimientos para la conversión de alcohol ópticamente activo en el correspondiente enantiómero incluyen, pero no se limitan a, los siguientes procedimientos.

Por ejemplo, un procedimiento comprende la conversión del grupo hidroxilo en el átomo de carbono asimétrico del enantiómero particular en un éster de ácido sulfóníco orgánico, preferiblemente un éster de ácido metanosulfónico o un éster de ácido p-tolueno sulfónico, que se convierte directamente en el otro enantiómero mediante sustitución nucleofílica e inversión de la configuración mediante uno de sus éteres de ácido carboxílico y su posterior solvolisis o hidrólisis. Los esteres de ácido sulfónico se preparan mediante procedimientos conocidos mediante reacción de cualquier enantiómero de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol con haluros de sulfonilo orgánicos, preferiblemente cloruro de metanosulfonilo y cloruro de p-toluenosulfonilo, en disolventes apróticos, preferiblemente piridina y diclorometano, si es apropiado en presencia de una base, tal como trietilamina. Un procedimiento que comprende la esterificación de un alcohol ópticamente activo con HN03 fumante o cloruro de mesilo para nitrar o mesilar, e hidrolizar el nitrato o mesilato resultante con inversión estérica en condiciones neutras (en presencia de 0.7 a 2.0 equivalentes de CaC03 o NaOAc), básicas (K2C03) o acidas (H2S04 acuoso al 2.5% o HN03 acuoso al 2.5%) se describe, por ejemplo, en Danda y col., Tetrahedron, 1991 , vol. 47, pp. 8701 - 8716; y Wang y col., J. Med. Chem., 2000, vol. 43, N° 13, pp. 2566 - 2574. Se describe un procedimiento que comprende la conversión de un alcohol ópticamente activo en un éster de ácido sulfónico tal como éster del ácido p-toluenosulfónico, permitiendo que una sal de ácido orgánico tal como acetato de tetraetilamonio y acetato de sodio (y ácido acético) reaccione con el éster de ácido sulfónico resultante para invertir estéricamente para dar el éster de ácido orgánico correspondiente, e hidrolizar el éster de ácido orgánico resultante, por ejemplo, en J. Am. Chem. Soc, 1965, v. 87, p. 3682; y J. Chem. Soc, 1954, p. 965. Se describe un procedimiento que comprende la esterificación de un alcohol ópticamente activo en un éster de ácido carboxílico tal como éster de ácido tricloroacétíco, e hídrolizar el éster de ácido carboxílico resultante, en un disolvente de agua - éter tal como H20 al 75% - dioxano, por ejemplo, en Chem. Lett., 1976, p. 893. Otro ejemplo es la reacción de Mitsunobu, dicha reacción comprende hacer reaccionar un alcohol ópticamente activo con un ácido orgánico en presencia de triariífosfina (por ejemplo, trifenilfosfina) y un éster de ácido azodicarboxílíco tal como azodicarboxilato de dietílo para formar el éster de ácido orgánico correspondiente estéricamente invertido, e hidrolizar el éster resultante. El ácido orgánico ¡ncluye, por ejemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido tricloroacético, ácido trifluoroacétíco, ácido benzoico y similares. La formación del éster de ácido orgánico se puede llevar a cabo, por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente -60°C a 60°C. La reacción se puede llevar a cabo en un disolvente inerte tal como un hidrocarburo aromático (por ejemplo, benceno, tolueno, etc.) y un éter (por ejemplo, tetrahidrofurano, etc.) Las proporciones de trialquilfosfina, ácido orgánico y éster de ácido azodicarboxílico basado en 1 mol de alcohol ópticamente activo están respectivamente entre 0.7 y 2.0 moles. La hidrólisis del éster de ácido orgánico se puede llevar a cabo mediante una manera convencional tal como hidrólisis acida o básica. Véase, por ejemplo, Synntesis, 1981 , p. 1 ; Danda y col., Tetrahedron, 1991 , vol. 47, pp. 8701-8716; Vanttinen y col., Tetrahedron: Asymmetry, 1995, vol. 6, pp. 1779-1786; y Liu y col., Chirality, 2002, vol. 14, pp. 25-27.

II (q). Combinación de hidrólisis enzimática, esterificación e hidrólisis química con inversión Una limitación principal del procedimiento de resolución enzimática es que el rendimiento máximo es del 50% basado en el racemato. Como procedimiento para superar esta limitación, se puede usar combinación de hidrólisis enzimática, esterificación e hidrólisis química con inversión. Véase, por ejemplo, Danda y col., Tetrahedron, 1991 , vol. 47, pp. 8701 -8716; Vanttinen y col., Tetrahedron: Asymmetry, 1995, vol. 6, pp. 1779-1786; y Líu y col., Chirality, 2002, vol. 14, pp. 25-27. Según la presente invención, una mezcla bruta del éster sin reaccionar ópticamente puro (o enriquecido) y el alcohol ópticamente puro (o enriquecido) obtenido mediante hidrólisis enzimática, se pueden someter a conversión enantiomérica basándose en esterificación e hidrólisis química con inversión en un recipiente según los procedimientos descritos anteriormente. Dependiendo del sustrato del éster 1-(2,6-dícloro-3- fluorofenil)etílico, se puede emplear una enzima o microorganismo apropiado para hidrólisis enzímática y se pueden elegir condiciones apropiadas para hidrólisis química. Por ejemplo, una mezcla bruta del éster (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etílíco sin reaccionar y el (1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol que ha reaccionado sin separación se puede esterificar con cloruro de mesilo como se describe en Danda y col., Tetrahedron, 1991 , vol. 47, pp. 8701-8716; y Wang y col., J. Med. Chem., vol. 43. pp. 2566-2574. De manera sucesiva, una mezcla bruta resultante del mesilato de (1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etilo correspondiente y éster (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etílico sin purificación se puede hidrolizar para producir, (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol, con inversión de mesilato de (1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofeníl)etilo y retención del éster (1 S)-1- (2,6-dicloro-3-fluorofenil)etílico. En una realización específica, el sustrato del éster 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etílico es acetato de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etílo. En una realización específica, la enzima es esterasa de hígado de cerdo. Los procedimientos para conversión de (1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol en (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol también se pueden aplicar a la conversión del enantiómero (S) en el enantiómero (R).

II (h). Racemización y aplicación a resolución cinética dinámica Cualquier éster sin reaccionar ópticamente puro (o enriquecido) y el alcohol ópticamente puro (o enriquecido) se puede racemizar si se desea. El éster sin reaccionar ópticamente puro (o enriquecido) se puede racemizar calentando en la base apropiada en las condiciones apropiadas. Como alternativa, el éster sin reaccionar ópticamente puro (o enriquecido) se puede racemizar mediante calentamiento en ácido en la presencia de un alcohol en condiciones apropiadas. El alcohol sin reaccionar ópticamente puro (o enriquecido) también se puede racemizar y convertir en los esteres racémicos mediante calentamiento en ácido en condiciones apropiadas. De esta manera, se pueden lograr rendimientos excelentes de cualquier éster sin reaccionar ópticamente puro (o enriquecido) o alcohol ópticamente puro (o enriquecido) mediante esta combinación de técnicas de hidrólisis y racemización enzimática estereoselectiva. Por ejemplo, se puede usar un procedimiento de resolución cinética dinámica (o transformaciones asimétricas de segundo orden) para alcoholes secundarios, en el que los alcoholes se racemizan de manera continua con catalizadores metálicos, tales como sistemas catalíticos basados en rutenio, durante una resolución enzimática. Dijksman y col., Tetrahedron: Asymmetry, 2002, vol. 13, pp. 879- 884; Kim y col., J. Am. Chem. Soc, 2003, vol. 125, pp. 11494- 11495; Choi y col., J. Org. Chem., 2004, vol. 69, 1972-1977.

II (i). Acilación catalizada por enzimas Las reacciones enzimáticas han probado que son un procedimiento conveniente para obtener compuestos ópticamente enriquecidos a partir de su forma racémica mediante resolución cinética. C.-H Wong y G. M. Whítesides, Enzymes in Synthetic Organic Chemistry, Pergamon, Oxford (1994); K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, Springer, Berlín (1995); Gotor, Vicente. "Enzymes In Organic Solvents: The Use Of Lipases And (R)- Oxynitrílase For The Preparation Of Products Of Biological Interest". Molecules [Publicación electrónica] 2000, vol. 5, pp. 290-292. Por ejemplo, los alcoholes se pueden resolver a través de transesterificación catalizada por lipasas (acilación) con esteres enólicos en una reacción generalmente irreversible. Y. F. Wang, J. J. Lalonde, M. Momongan, D. E. Bergbreiter y C.-H. Wong. J. Am. Chem. Soc. 1988, vol. 110, pp. 7200- 7205. Sin embargo, para que sea de interés preparativo tal procedimiento requiere (i) un factor E de alta enantíoselectividad, (ii) fácil separación del sustrato sin reaccionar (alcohol) del producto (éster). Se ha mostrado que el uso de un anhídrido cíclico como agente acilante ofrece una solución conveniente para este requerimiento. Bouzemi y col., Tetrahedron Lett., 2004, vol. 45, pp. 627- 630. El éster ácido producido se puede separar fácilmente del alcohol sin reaccionar mediante una extracción simple líquido -líquido mediante disolvente orgánico base acuosa. Además, ya que la separación de estos compuestos es fácil incluso para cantidades muy diferentes de producto y sustrato sin reaccionar, alcoholes de alta pureza enantiomérica se pueden obtener a partir de un sustrato racémico incluso en los casos de bajos valores de E, con tal que la acilación se lleve a cabo hasta alta conversión.

Las reacciones se pueden llevar a cabo usando sustrato racémico dísuelto en éter dietílico. Acetatos de vinílo o ¡sopropenilo (2 equivalentes) o anhídrido succíníco (1 equivalente), se pueden añadir después, seguido de la enzima. Por ejemplo, lipasas comercialmente disponibles tales como lipasa de Pseudomonas fluorescens (PFL) y lipasa B de Candida antárctica (CAL B), se pueden utilizar como enzima inmovilizada. La mezcla resultante se puede agitar a temperatura ambiente durante el tiempo apropiado para que alcance aproximadamente conversión al 50%. Con esteres enólicos como agentes acilantes, el alcohol sin reaccionar y el acetato producido se separaron mediante cromatografía ultra-rápida sobre gel de sílice. Los ee de ambos compuestos se pueden medir antes de la separación mediante análisis usando HPLC quiral. Con anhídrido succínico como agente acilante, el alcohol sin reaccionar, por ejemplo, alcohol (S), y el monosuccinato (R) producidos se pueden separar mediante extracción líquido-líquido de disolvente orgánico-base acuosa. La fase acuosa se puede hacer alcalina con hidróxido sódico y el alcohol (R) resultante extraerse con un disolvente orgánico. Los excesos enantioméricos de alcohol (S)-enriquecido y el alcohol (R)-enriquecído sin reaccionar producidos se pueden evaluar, por ejemplo, mediante HPLC quiral. lll. Bio-reducción enantioselectiva de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofeniDetanona La presente invención proporciona un procedimiento para preparar un isómero ópticamente activo de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofeníl)etanol que comprende la etapa de reducir 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanona mediante un biocatalizador de una manera enantioselectíva en una solución acuosa, un disolvente orgánico, o una mezcla de disolventes orgánicos y acuosos para proporcionar el isómero ópticamente activo de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol. Dada la descripción en esta memoria descriptiva, los expertos en la técnica serán capaces de elegir, usando el procedimiento de selección de alto rendimiento (HTS) descrito anteriormente, una enzima o microorganismo que reduzca selectivamente la 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanona a cualquier enantiómero de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol, medíante la selección de una de las enzimas o microorganismos descritos en esta memoria descriptiva o mediante evaluación sistémica de otras enzimas o microorganismos conocidos. Los expertos en la técnica entenderán basándose en la descripción proporcionada en esta memoria descriptiva cómo seleccionar las condiciones de la reacción de bio-reducción de manera que se logre la estereoselectividad deseada. A través del uso de reactivos de desplazamiento de RMN quiral, polarimetría, o HPLC quiral, se puede determinar el enriquecimiento óptico del alcohol recuperado. Véase por ejemplo, J. Am. Chem. Soc. 1973, v. 95, p. 512; Trost y col., J. Org. Chem. 1986, v. 51 , pp. 2370-2374; J. Org. Chem. 1998, v. 63, p. 8957; Tetrahedron: Asymmetry 1995, v. 6, p. 2385; Tetrahedron: Asymmetry 1996, v. 7, p. 3285. El enantíómero deseado, por ejemplo, (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol, después se aisla opcionalmente a partir de cualquier sustrato residual y otros componentes de reacción usando procedimientos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, las mezclas de reacción se pueden extraer con un disolvente adecuado tal como MeOH y analizarse medíante RP-?PLC; el alcohol correspondiente se puede separar a partir de los otros compuestos orgánicos mediante cromatografía ultra rápida, y el alcohol purificado se puede analizar mediante HPLC quiral, véase, por ejemplo, Allenmark y col., Enzyme Microbial Technol., 1989, vol. 11 , pp. 177-179), antes de su uso preferido como intermedio en la síntesis de ciertos análogos de 2- aminopiridina unidos a éter, enantioméricamente enriquecidos que inhiben potentemente la autofosforilación de receptor del factor de crecimiento de hepatocitos humanos, como se describe en el ejemplo 3 en esta memoria descriptiva. En general, solamente una muy pequeña cantidad (por ejemplo entre aproximadamente 1 % de ee y aproximadamente 5% de ee), si la hay, del enantiómero no deseado se produce mediante los procedimientos de bio-reducción estereoselectiva de esta invención. Todavía, cuando se desea, la cantidad del enantiómero deseada se puede separar sustancialmente de la cantidad del enantiómero no deseado, por ejemplo, mediante cristalización. Los procedimientos de la presente invención se llevan a cabo fácilmente. De este modo, una enzima o microorganismo o bien se incuba (la enzima, preparación de células rotas, preparación deshidratada, o cualquier otra preparación adecuada del microorganismo) o se fermenta (microorganismo intacto) en presencia de una cantidad del sustrato, 1-(2,6-dicloro-3- fluorofenil)etanona, para producir una mayor cantidad del enantiómero deseado de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol, que del enantiómero no deseado, por lo tanto, en una etapa, dando como resultado el enantiómero ópticamente enriquecido. Adecuados en principio para el procedimiento según la invención son todos los microorganismos tales como hongos, levaduras o bacterias o enzimas o sistemas enzimáticos tales como las diversas alcohol y aldehido deshidrogenasas, las lactato o formiato deshidrogenasas, preferiblemente alcohol y aldehido deshidrogenasas, capaces de reducir compuestos carbonílicos o aldehidos a los alcoholes. Los microorganismos se pueden usar directamente después de cultivo (biomasas húmeda) o después de liofilización (materia seca) para el procedimiento según la invención. Los microorganismos o enzimas usados de manera ventajosa son aquellos capaces de reducir 1-(2,6- dicloro-3-fluorofenil)etanona al enantiómero deseado de 1-(2,6-dicloro-3- fluorofenil)etanol con una pureza enantiómerica que excede de 85% de ee, preferiblemente excediendo de 90% de ee y muy particularmente excediendo preferiblemente de 95% de ee. Los ejemplos de microorganismos adecuados son organismos del género Alcaligenes, Aspergillus, Beauveria, Candida, Cryptococcus, Curvularia, Diplodia, Endomycopsis, Geotrichum, Hansenula, Kloeckera, Kluyveromyces, Lactobacillus, Mucor, Nocardia, Penicillium, Pfaffia, Pichia, Pseudomonas, Rhodococcus, Rhodotorula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sporidiobolus, Streptomyces, Torulopsis o Yarrowia. Las siguientes especies de los géneros anteriormente mencionados se usan de manera ventajosa: Alcaligenes eutrophus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Beauveria bassiana, Candida guilliermondii, Candida lipolytica, Candida membranaefaciens, Candida methylica, Candida parapsilosis, Candida magnoliae, Candida rugosa, Candida utilis, Curvularia falcata, Diplodia gossypina, Cryptococcus macerans, Geotrichum, candidum, Hansenula anómala, Hansenula beckii, Hansenula holstii, wingei, Hansenula polymorpha, Mucor sp., Nocardia rubropertincta, Pfaffia rhodozyma, Pichia glucozyma, Pichia fermentans, Pichia capsúlala, Pichia guilliermondii, Pichia membranaefaciens, Pichia pastoris, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus ruber, Rhodotorula rubra, Rhodotorula gracilis, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula minuta, Rhodotorula termusruber, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces dairensis, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces japonicus, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces pombe, Torulopsis enokii, Torulopsis methanothermo y Yarrowia lipolytica. Los diversos géneros de levaduras tales como Candida, Hansenula, Kloeckera, Kluyveromyces, Pfaffia, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulopsis y Yarrowia se usan preferiblemente. Particular y preferiblemente usados son los géneros y especies Candida guilliermondii, Candida lipolytica, Candida membranafaciens, Candida methylica, Candida parapsilosis, Candida magnoliae, Candida rugosa, Candida utilis, Hansenula anómala, Hansenula beckii, Hansenula holstii, wingei, Hansenula polymoría, Pfaffia rhodozyma, Pichia glucozyma, Pichia fermentans, Pichia capsúlala, Pichia guilliermondii, Pichia membranafaciens, Pichia pastoris, Rhodotorula rubra, Rhodotorula gracilis, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula minuta, Rhodotorula termusruber, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces dairensis, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces japonicus, Schizosaccharomyces, malidevorans, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces pombe, Torulopsis enokii, Torulopsis methanothermo y Yarrowia lipolytica, muy particular y preferiblemente los géneros y especie. Rhodotorula rubra, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces japonicus, Pichia fermentans, Hansenula polymorpha, Rhodotorula gracilis, Candida utilis y Candida magnoliae. Los microorganismos se pueden transformar genéticamente para mejorar la producción de enzima en una célula, para proporcionar enzimas que regeneran coenzimas en la misma célula, para mejorar las enantioselectividades pobres debido a la presencia de enzimas plurales en una célula con especificidades de sustrato que se solapan pero enantioselectividades diferentes, para solucionar el problema de exceso de metabolismo etc, como se describe, por ejemplo, en Nakamura y col., Tetrahedron: Assymetry, 2003, vol. 14, pp. 2659-2681. Uno o más de cualquiera de los microorganismos adecuados se pueden usar en los procedimientos de la presente invención. Como se ha descrito anteriormente, el microorganismo usado en los procedimientos sujetos puede estar intacto, cualquier preparación adecuada del mismo, por ejemplo, una preparación de células rotas del mismo, una preparación deshidratada del mismo, y estar o bien libre o inmovilizado. Sin embargo, cuando se emplea un microorganismo no intacto en la presente ¡nvención tal como, por ejemplo, una preparación de células rotas, por ejemplo, extracto celular, preparación enzimática en polvo en acetona, o la enzima derivada del mismo, los expertos en la técnica entenderían que también está incluido un co-factor adecuado para la enzima. Los expertos en la técnica entenderán a partir de la descripción proporcionada en esta memoria descriptiva y su conocimiento relacionado cómo preparar una preparación de células rotas adecuada tal como se describe, por ejemplo, en Patel y col., Appl. Environ. Microbiol., 1979, vol. 38, pp. 219-223. Los expertos en la técnica entenderán a partir de la descripción proporcionada en esta memoria descriptiva y su conocimiento relacionado cómo preparar una preparación enzimática en polvo en acetona adecuada tal como se describe, por ejemplo, en Nakamura y col., Tetrahedron Lett., 1996, vol. 37, pp. 1629-1632; Nakamura y col., Tetrahedron: Assymetry, 2003, vol. 14, pp. 2659-2681. La enzima puede ser cualquier enzima obtenible de animales, plantas, microorganismos, etc. La enzima se puede emplear en cualquier forma convencional tal como en una forma purificada, una forma bruta, una mezcla con otras enzimas, un caldo de fermentación microbiana, un caldo de fermentación, un cuerpo microbiano, un filtrado de caldo de fermentación, y similares, bien solos o en combinación. Además, la enzima o cuerpo microbiano se puede inmovilizar sobre una resina. Además, una enzima (por ejemplo, una óxidorreductasa) de cualquier microorganismo adecuado se puede usar también en los procedimiento sujeto, y esta enzima se puede aislar a partir del microorganismo mediante cualquier procedimiento conocido adecuado para los expertos en la técnica, como para el microorganismo intacto, se puede usar en el procedimiento sujeto o bien en forma libre o forma inmovilizada. Los expertos en la técnica entenderán a partir de la descripción proporcionada en esta memoria descriptiva y su conocimiento relacionado cómo aislar y purificar la enzima del microorganismo adecuado tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 03/093477. Las enzimas ejemplares, comercialmente disponibles adecuadas para uso en la presente invención incluyen deshidrogenasas y reductasas, que se clasifican bajo E.C.1.1.1 y capaces de catalizar la reducción de grupos carbonilo, tales como, por ejemplo, un kit KRED-M27 de cetona reductasas de Bíocatalytics, Inc., alcoholdeshidrogenasa de hígado de caballo (Grunwald y col., J. Am. Chem. Soc, 1986, vol. 108, pp. 6732-6734; Johansson y col., Eur. J. Biochem., 1995, vol. 227, pp. 551-555; Adolph y col., Biochemistry, 2000, vol. 39, pp. 12885-12897; Wong y col., Tetrahedron Organic Chemistry, 1994, vol. 12, pp. 149-150), alcohol deshidrogenasa de levadura, alcohol deshidrogenasa de Thermoanaerobium brokii y alcohol deshidrogenasa de Lactobacillus kéfir. Los sustratos naturales de las enzimas son alcoholes tales como etanol, lactato, glicerol, etc. y los compuestos carbonilo correspondientes; sin embargo, cetonas no naturales también se pueden reducir enantioselectivamente. Para mostrar actividades catalíticas, las enzimas requieren una coenzima tal como NADH o NADPH a partir de la cual se transfiere un hidruro al carbono carbonilo sustrato. Existen cuatro patrones estereoquímicos que permiten la transferencia del hidruro a partir de la coenzima, NAD(P)H, al sustrato. Con enzimas E1 y E2, el hidruro ataca la cara si del grupo carbonilo, mientras que con las enzimas E3 y E4, el hidruro ataca la cara re, que da como resultado la formación de alcoholes (R) y (S), respectivamente. Por otra parte, las enzimas E1 y E3 transfieren el hidruro pro-(R) de la coenzima, y las enzimas E2 y E4 usan el hídruro pro-(S). Los ejemplos de las enzimas E1-E3 son como sigue: E1 : alcohol deshidrogenasa de Pseudomonas sp. Alcohol deshidrogenasa de Lactobacillus kéfir E2: glicerol deshidrogenasa de Geotrichum candidum Dihídroxiacetona reductasa de Mucor javanicus E3: alcohol deshidrogenasa de levadura Alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo Alcohol deshidrogenasa de Moraxella sp La evolución dirigida de enzimas se puede usar para mejorar la función reductora de las enzimas o biocatalizadores para reducción se pueden confeccionar usando la técnica de anticuerpos catalíticos como se describe, por ejemplo, en Nakamura y col., Tetrahedron: Assymmetry, 2003, vol. 14, pp. 2659-2681. Los microorganismos adecuados para uso en reducción microbiana estereoselectiva sujeto se pueden preparar mediante cualquier procedimiento adecuado conocido para los expertos en la técnica. Un ejemplo de un procedimiento adecuado para la preparación de un microorganismo a partir de una existencia comprada comercialmente se proporciona más adelante. El procedimiento proporcionado más adelante se puede usar para cualquier microorganismo adecuado para uso en el procedimiento de la presente ¡nvención, y los expertos en la técnica entenderán a partir de la descripción proporcionada en esta memoria descriptiva cómo modificar cualquier parte del procedimiento, por ejemplo, procedimiento de preparación del microorganismo, libre o inmovilizado, lavado o no lavado; procedimiento de contacto de la cantidad del sustrato con el microorganismo; componentes y condiciones de medio de crecimiento , por ejemplo, temperatura, pH y similares; o condiciones de incubación, para lograr el resultado deseado en cualquier procedimiento particular.

Los expertos en la técnica entenderán a partir de la descripción proporcionada en esta memoria descriptiva cómo preparar microorganismo inmovilizado adecuado tal como se describe, por ejemplo, en Bauer y col., Biotechnol. Lett., 1996, 18, pp. 343-348 o enzima inmovilizada adecuada tal como se describe, por ejemplo, en Svec, F.; Gemeiner, P. "Engineering aspects of carriers for ¡mmobilized biocatalysts." Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 1996, vol. 13, pp. 217-235. Cualquier procedimiento adecuado de poner en contacto la cantidad del sustrato con el microorganismo o sistema de reducción enzimático se puede usar en la presente invención. El sustrato se puede poner en contacto con el microorganismo o el sistema de reducción enzimátíco en cualquier orden adecuado. Por ejemplo, el sustrato se puede añadir a un medio, tal como un caldo de cultivo, que comprende el microorganismo, libre o inmovilizado, o alguna combinación del mismo; o el medio puede comprender el sustrato y el microorganismo se puede añadir después a tal medio; o el sustrato y el microorganismo se pueden añadir juntos a tal medio; o el sustrato se puede añadir a una preparación de células rotas del mismo; o el sustrato se puede añadir a una preparación deshidratada del microorganismo; o bien el sustrato o el microorganismo o sistema de reducción enzimátíca se puede añadir a un disolvente adecuado que comprende el otro; y similares. Por ejemplo, el sistema de reducción enzimático se puede añadir a un disolvente apreciablemente orgánico con el contacto produciéndose medíante la adición del sustrato a ese disolvente. Los expertos en la técnica también entenderán basándose en la presente descripción cómo poner en contacto mediante la adición del sustrato adsorbido a una resina. Además, los expertos en la técnica entenderán a partir de la descripción proporcionada en esta memoria descriptiva cómo modificar cualquier parte del procedimiento sujeto según se desee. Para el procedimiento según la ¡nvención, los microorganismos se pueden cultivar primero en condiciones limitadas de nitrógeno y, después de recoger las células, por ejemplo, mediante centrifugación, usarse para el procedimiento según la ¡nvención. La reducción se puede llevar a cabo con células enteras, digestiones de células o extractos de enzimas brutas obtenidas a partir de las células o enzimas purificadas. El procedimiento se puede llevar a cabo en medio acuoso en presencia de una fuente de carbono en el caso de células enteras o de un agente reductor tal como NADH o NADPH y de un cofactor que se recicla, tal como con la ayuda de formiato deshidrogenasa y ácido fórmico, y, cuando sea apropiado, otras enzimas en el caso de digestiones celulares, extractos brutos o enzimas puras. La adición de nutrientes adicionales en la reducción con células enteras, tal como una fuente de nitrógeno, vitaminas o fosfatos, es inoportuna debido a que se observan reacciones secundarias no deseadas en estas condiciones, por ejemplo, que pueden dar como resultado calidad de producto deficiente u otros problemas de tratamiento. Adecuados como fuente de carbono para el microorganismo son todas fuentes de carbono capaces de proporcionar las células con los equivalentes necesarios para la reducción. Los ejemplos de fuentes de carbono que se pueden mencionar en esta memoria descriptiva son mono- o disacáridos tales como glucosa, mañosa, maltosa, sacarosa, alcoholes primarios o secundarios tales como metanol, etanol, propanol, polioles tales como glicerol, ácidos carboxílicos inferiores tales como ácido láctico, ácido málico o aminoácidos tal como glutamato. La conversión del precursor con microorganismos en solución acuosa en presencia de una fuente de carbono tiene la ventaja de que ni el precursor ni el producto se metaboliza y no se forman subproductos. La reacción de bio-reducción se puede llevar a cabo en agua pura o en tampones acuosos sin adición de otros disolventes o mezclas de disolventes. Para mejorar la solubilidad del precursor, 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanona, es posible añadir disolventes orgánicos miscibles en agua tales como tetrahidrofurano, acetonitrilo, dímetilformamida, dimetilsulfóxído, dimetilacetamida, alcoholes primarios o secundarios, ácidos carboxílicos, lactonas tal como ?-butirolactona, que son capaces de mejorar la solubilidad del precursor, 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanona, a la reacción. La reacción se puede llevar a cabo a entre 0°C y 50°C, preferiblemente entre 10°C y 45°C, particular y preferiblemente entre 15°C y 40°C. Los tiempos de reacción dependen de microorganismo o enzima y están entre 1 y 72 horas, preferiblemente entre 1 y 48 horas. Cualquier duración adecuada de crecimiento del microorganismo, poniendo en contacto el microorganismo con la cantidad de sustrato, e incubación del sustrato con el microorganismo se puede usar en la presente invención. Se puede lograr crecimiento adecuado del microorganismo, por ejemplo, dentro de aproximadamente 24 horas, 48 horas, o 72 horas, tiempo en el que se puede añadir al cultivo una alícuota adecuada de una solución de la cantidad del sustrato en un disolvente adecuado, preferiblemente etanol. Después la fermentación se puede continuar durante, por ejemplo entre aproximadamente dos a aproximadamente seis días, y preferiblemente, por ejemplo, durante aproximadamente cinco días. El progreso de la reacción se puede seguir fácilmente mediante procedimientos convencionales después de la extracción del producto con un disolvente orgánico. El caldo de fermentación se puede extraer usando cualquier procedimiento de extracción adecuado, por el que, por ejemplo, un disolvente adecuado, tal como, por ejemplo, acetato de etilo, metilisobutilcetona, metiletilcetona, cloruro de metileno, y similares, preferiblemente, acetato de etilo, retira los componentes orgánicos del caldo de fermentación. También se puede usar metanol para extraer material de las células en la mezcla metanol-agua. Después de la extracción del caldo de fermentación y separación de las fases orgánica y acuosa, los compuestos que comprenden el residuo orgánico se pueden determinar usando cualquier procedimiento adecuado, tal como, por ejemplo, cromatografía, preferiblemente, HPLC quiral. La reacción preferiblemente se lleva a cabo en condiciones aerobias, es decir, con aireación en el caso de conversión con microorganismos, preferiblemente con aireación suave. Sin embargo, también es posible la conversión en condiciones anaerobias. El procedimiento se puede llevar a cabo de forma continua o por lotes. El producto a partir de cualquiera de las anteriores reacciones se puede purificar mediante separación por fases y/o extracción en un disolvente adecuado, tal como diclorometano y después, si se requiere, se puede ero matog rafia r. Las reacciones anteriormente mencionadas también se pueden llevar a cabo usando procedimientos de producción en continuo que implica reciclado continuo de la fase orgánica en la reacción o inmovilización de las células y el paso del sustrato en solución orgánica sobre la biomasa inmovilizada en una columna, reactor de bucle u otro reactor similar. Por lo tanto, como entenderían los expertos en la técnica, variación del medio de crecimiento, las condiciones de fermentación, y/o condiciones de la reducción (por ejemplo, la temperatura, pH, y la cantidad de sustrato) se pueden alterar para controlar el rendimiento de los compuestos resultantes y sus velocidades relativas de producción. En general, las técnicas empleadas en la presente ¡nvención se elegirán con relación a la eficacia industrial. El medio de crecimiento, condiciones de fermentación y cantidades relativas de microorganismo, o sistema de reducción enzimátíca, y del sustrato descrito en esta memoria descriptiva, son meramente ilustrativos de la amplia variedad de medios, condiciones de fermentación y cantidades de materiales de partida que se pueden emplear adecuadamente en la presente invención como apreciarían los expertos en la técnica, y no pretenden limitarla de ninguna manera. Cualquier procedimiento adecuado para aislar y/o purificar cualquiera de los productos de los procedimientos sujetos se puede usar en la presente invención incluyendo filtración, extracción, cristalización, cromatografía en columna, cromatografía en capa fina cromatografía líquida de baja presión preparativa o HPLC, o cualquier combinación adecuada de tales procedimientos. La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos. La descripción anterior y siguiente de la presente ¡nvención y las diversas realizaciones no se proponen ser limitantes de la invención sino más bien son ilustrativos de la misma. Por lo tanto, se entenderá que la ¡nvención no se limita a detalles específicos de estos ejemplos.

EJEMPLOS Materiales Se obtuvieron placas de 96 pocilios y accesorios adecuados de VWR international. Los instrumentos analíticos que incluyen la Tecan Génesis 2000 Workstation (Research Triangle Park, NC), automuestreador de HPLC Agilent 220 y 6890N GC (Agilent Technologies, CA), SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, USA), Beckman Coulter P/ACE MDQ (Fullerton, CA), y Waters/Micromass ZQ CL/EM (Waters, MA) se compraron a sus proveedores respectivos. El termomezclador-R Eppendorf se compró en VWR. Se obtuvieron columnas de HPLC quiral usadas en el análisis de Chiral Technologies (Exton, PA) y Phenomenex (Torrance, CA). La mayoría de enzimas utilizadas en la placa de selección se obtuvieron de diversos proveedores de enzimas incluyendo Amano (Nagoya, Japón), Roche (Basel, Suiza), Novo Nordisk (Bagsvaerd, Dinamarca), Altus Biologics Inc. (Cambridge, MA), Bíocatalytics (Pasadena, CA), Toyobo (Osaka, Japón), Sigma y Fluka. El cuadro 1 ilustra fuentes de enzimas específicas que corresponden a cada enzima. El kit de actividad de lipasa-PS se compró en Sigma. La esterasa de hígado de cerdo comercíalmente disponible se compró en Biocatalytics (Pasadena, CA) en forma de una suspensión de sulfato amónico bruto bajo el nombre de PLE AS (n° de catálogo ICR-123). La mayoría de los disolventes utilizados durante la optimización se obtuvo de EM Science (Gibbstown, NJ) y eran de la pureza más alta disponible.

Procedimientos de HPLC El análisis de HPLC de las muestras seleccionadas se realizó sobre una Agilent 1100 HPLC con automuestreador de 96 pocilios. Las reacciones de realizaron en un termomezclador-R Eppendorf (VWR). Cada muestra de HPLC se preparó tomando 2 x 50 µl de la mezcla de reacción, después se combinaron y se diluyeron con 2 ml de acetonitrilo. Se diluyeron posteriormente 100 µl de esa solución con 400 µl de acetonitrilo y se inyectaron en la HPLC.

Procedimiento de HPLC no quiral Usando detector de longitud de onda de 254 nm; columna Phenomenex luna C 18 , 3 µm, C18, 4.6 x 30 mm; caudal 2.0 ml/min; volumen de inyección: 5 µl; fases móviles: A: agua-ácido trifluoroacético (TFA) al 0.1 % B: acetonitrilo-TFA al 0.1 %; las muestras se desarrollaron sobre el gradiente (0.5 minutos después del desarrollo) Tiempo % de B % de C % de D 1 0.00 5.0 0.0 0.0 2 1.67 65.0 0.0 0.0 3 2.00 95.0 0.0 0.0 4 2.50 95.0 0.0 0.0 5 2.60 5.0 0.0 0.0 6 3.00 5.0 0.0 5.0 Procedimientos de HPLC quiral Alcohol 1 : usando detector de longitud de onda: 254 nm; Chiracel ADR-H, 3 µm, C18, 4.6 x 150 mm; caudal 0.8 ml/min; volumen de inyección 10 µl; fases móviles: A: agua B: acetonitrilo; ¡socrático: 50% de B durante 15 minutos. Acetato 2: procedimiento quiral usando detector de longitud de onda: 254 nm; Chiralcel OJ-RH, 3 µm, C18, 4.6 x 150 mm; caudal 0.6 ml/min: volumen de inyección 10 µl; fases móviles: A: agua B: acetonitrilo; ¡socrático: 50% de B durante 15 minutos.

Preparación de placas de selección Se ha llevado a cabo la preparación de placas de selección según Yazbeck y col., Adv. Synth. Catal., 2003, vol. 345, pp. 524-532. Específicamente, la preparación usualmente lleva del orden de 1-2 dias y conlleva la preparación de soluciones madre de enzimas (100 mg/ml) y la dispensación de estas soluciones madre en placas de selección de 96 pocilios, o "kits de selección". La dispensación de estas soluciones madre en una placa de selección se lleva a cabo mediante un puesto de trabajo manipulador de líquido automático, que se programó para dispensar exactamente 10 µl de cada enzima individual en el lugar adecuado en cada placa de 96 pocilios. Cuando se elige un formato de placa de 96 pocilios, las placas necesitan ser resistentes a tanto disolvente como temperatura, por lo tanto, se recomienda el uso de placas de polipropileno. El volumen y morfología de placa también tienen que considerarse. Las reacciones en esta memoria descriptiva se llevan a cabo en volúmenes de reacción de 100 µl en placas no mayores de 500 µl. Las placas de fondo en V tienden a mejorar la agitación de la solución y permiten muestreo más limpio después de centrifugación. Una vez que se preparan las placas, se pueden sellar con cualquier hoja delgada adhesiva o con una cubierta mate penetrable y almacenarse a -80°C durante meses o incluso años. En los casos en los que se requieren condiciones anhidras, tales como reacciones de acilacíón y amidación, las placas de selección se deben liofilizar antes de uso. Con el fin de retirar el agua de cada pocilio, la placa se liofiliza durante 10 a 24 horas en una cámara a temperatura de -20°C.

Después de la liofilización, las placas se pueden almacenar a de 4 a 8 °C.

Procedimiento de selección de enzimas La resolución de acetato de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etilo se llevó a cabo como sigue. Una placa de 96 pocilios preparada como se ha descrito anteriormente se descongeló durante cinco minutos. Después se dispensaron 80 µl de tampón fosfato de potasio (0.1 M, pH 7.2) en los pocilios usando una pipeta multi-canal. Después se añadieron 10 µl de la solución madre de sustrato (50 mg/ml de acetonitrilo) a cada pocilio mediante una pipeta multi-canal, y las 96 reacciones se incubaron a 30°C y 750 rpm. Las reacciones se muestrearon después de 16 horas mediante la transferencia de 25 µl de la mezcla de reacción en una nueva placa de 96 pocilios, que después se inactivo mediante la adición de 150 µl de acetonitrilo. Después la placa de 96 pocilios se centrifugó, y el sobrenadante orgánico se transfirió de cada pocilio en otra placa de 96 pocilios. Después las reacciones muestreadas se sellaron usando una cubierta mate penetrable y se transfirieron a un sistema de HPLC para análisis. La misma placa se usó para analizar las muestras respecto a tanto la reactividad como la enantioselectividad usando columnas alternas sobre la HPLC simultáneamente.

EJEMPLO 1 Preparación de 1-(2,6-d¡cloro-3-fluorofenil)etanol ópticamente activo mediante combinación de resolución enzimática y transformación química Para propósitos ilustrativos solamente, el procedimiento de la presente invención se demuestra mediante el siguiente ejemplo de biotransformación de un acetato de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etilo racémico, cuya biotransformacíón se representa en el esquema 1.

ESQUEMA 1 Resolución enzimática de acetato de 1-(2,6-d¡cloro-3-fluorofeniPetilo (2) El procedimiento implicó la realización de cuatro etapas principales: 1 ) preparar el acetato de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofen¡l)etilo racémico 2) seleccionar enzimas usando las lipasasas, proteasas y esterasas comercialmente disponibles; 3) optimizar las condiciones de reacción tales como pH, temperatura y cantidad de enzima y sustrato; y 4) maximizar el rendimiento del procedimiento de resolución enzímático desarrollando un procedimiento para la combinación de hidrólisis enzimática, esterificacíón e hidrólisis química con inversión.

Preparación de acetato de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etilo racémico (compuesto 2) Compuesto 1 1-(2.6-dicloro-3-fluorofenil)etanol Se añadió borohidruro de sodio (90 mg, 2.4 mmoles) a una solución de 2',6'-dícloro-3'-fluoroacetofenona (Aldrich, n° de catálogo 52.294-5) (207 mg, 1 mmol) en 2 ml de CH3OH anhidro. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora después se evaporó proporcionando un residuo oleoso incoloro. El residuo se purificó mediante cromatografía ultra-rápida (eluyendo con 0 -> 10% de EtOAc en hexanos) proporcionando el compuesto 1 en forma de un aceite incoloro (180 mg, 0.88 mmoles; 86.5% de rendimiento); EM (IQPA) (M-H)" 208; 1H RMN (cloroformo-D, 400 MHz) d ppm 1.64 (d, J = 6.82 Hz, 3 H), 3.02 (d, J = 9.85 Hz, 1 H), 6.97-7.07 (m, 1 H), 7.19-7.33 (m, 1 H).

Compuesto 2 Acetato de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etilo Se añadieron anhídrido acético (1.42 ml, 15 mmoles) y piridina (1.7 ml, 21 mmoles) secuencialmente a una solución del compuesto 1 (2.2 g, 10.5 mmoles) en 20 ml de CH2CI2. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas y después se evaporó proporcionando un residuo oleoso amarillo. El residuo se purificó mediante cromatografía ultra-rápida (eluyendo con 7 ? 9% de EtOAc en hexanos) proporcionando el compuesto 2 en forma de un aceite incoloro (2.26 g, 9.0 mmoles; 85.6% de rendimiento); 1H RMN (cloroformo-D, 400 MHz) d ppm 1.88 (d, J = 6.82 Hz, 3 H), 2.31 (s, 3H), 6.62 (c, J = 6.82 Hz, 1 H), 7.25 (t, J = 8.46 Hz, 1 H), 7.49 (dd, J = 8.84. 5.05 Hz, 1 H). 1 ) Selección de enzimas El catalizador más adecuado para la resolución cinética de acetato de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etilo racémico (compuesto 2) se identificó después de seleccionar una colección de hidrolasas comercialmente disponibles. Un procedimiento de selección de enzimas general se usó para seleccionar 94 enzimas comercialmente disponibles representadas en el cuadro 1.

CUADRO 1 Kit de Rastreo de Biotransformaciones mediante Grupo de Enzimas (G3) Después de la selección inicial usando carga de sustrato al 5% en tampón fosfato de potasio 100 mM a pH 7.2, se identificaron varias hidrolasas como éxitos para la hidrólisis enzimática del éster del alcohol racémico 2 a alcohol R-1 (esquema 2).

ESQUEMA 2 5 gil 20 h Compuesto R-1 (1 R)-1-(2.6-dicloro-3-fluorofenil)etanol El compuesto R-1 se purificó a partir del compuesto S-2 mediante cromatografía ultra-rápida (eluyendo con 15 ? 17% de EtOAc en hexanos) proporcionando el compuesto R-1 en forma de un aceite incoloro (92.7 mg; 0.45 mmoles).

Compuesto S-2 Acetato de (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etilo El compuesto S-2 se purificó a partir del compuesto R-1 mediante cromatografía ultra-rápida (eluyendo con 9 ? 10% de EtOAc en hexanos) proporcionando el compuesto S-2 en forma de un aceite incoloro (185.9 mg; 0.74 mmoles). Como se muestra en el cuadro 2, varias enzimas mostraron actividad hacia acetato de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etilo (2). El análisis de los valores E reveló que cinco de aquellas enzimas mostraban buena enantioselectívidad de valor E mayor de 100. Tanto la lipasa de Rhizopus delemar como la esterasa de hígado de cerdo (PLE) mostraron valores de E > 150. Sin embargo, PLE mostró la más alta reactividad hacia acetato de (R) 1- (2,6-dicloro-3- fluorofeníl)etilo ((R)-2).

CUADRO 2 La configuración absoluta de alcohol (1 ) generado a partir de la hidrólisis con PLE se asignó inicialmente por comparación con una reacción conocida de un sustrato similar como se muestra en el esquema 3 y se describe en Bouzemi, N. y col, Tetrahedron Letters, 2004, pp. 627 - 630.

ESQUEMA 3 Reseña bibliográfica Ensayado en el laboratorio y asignado (asumiendo que la enzima no cambia el patrón de reconocimiento) Como se muestra en el esquema 3, la acilación enzimática de 1-fenilatanol usando CAL - B produjo el enantiómero R de acetato de 1-feniletilo que deja el enantiómero S sin reaccionar de 1-feniletanol (Bouzemi, N. y col., Tetrahedron Letters, 2004, pp. 627 - 630). Se puede asumir que cuando CAL -B se hace reaccionar con rac-1 , el reconocimiento de sustrato debe ser el mismo; de acuerdo a lo anterior, el producto éster obtenido se denominó enantiómero R. Cuando se compara con el compuesto obtenido en la hidrólisis enzímática de rac-1 con PLE (reacción opuesta), se observó el isómero R del alcohol, que procedía claramente de la hidrólisis del acetato R. Una determinación directa de la configuración absoluta del alcohol (1 ) generado a partir del producto de hidrólisis con PLE se puede basar en la determinación por RMN del díastereoisómero producido a partir de los esteres de Mosher. metoxifenilacético - B metoxifenilacético El compuesto A y el compuesto B se sintetizaron usando procedimientos indicados en la bibliografía en Tetrahedron: Asymmetry 2002, vol. 13. p. 2283; Tetrahedron Lett. 1988, vol. 29. p. 6211. Estos dos compuestos se sometieron a experimentos de 1H RMN y los desplazamientos químicos de los grupos metilo de tanto el compuesto A como el compuesto B se comparan para determinar que el compuesto A tiene la configuración "S" y el compuesto "B" tiene la configuración "R". Síntesis del compuesto A: DCC (N,N'-diciclohexilcarbodiim¡da) (1 ,1 mmoles) se añadió a una solución de ácido (s)-(+)-a-metoxífenilacético (1 mmol) en 5 ml de THF anhidro. La mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. El compuesto S-1 (1 mmol) y DMAP (4-dimetilaminopiridína) (0.2 mmoles) se añadieron secuencialmente a la mezcla de reacción y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 36 horas. La mezcla se evaporó, se trituró en metanol, se filtró, y se concentró para conseguir un residuo. El residuo se purificó mediante HPLC proporcionando el compuesto A. Síntesis del compuesto B: DCC (N,N'-diciclohexilcarbodiimida) 1 ,1 mmoles) se añadió a una solución de ácido (s)-(+)-a-metoxifenilacético (1 mmol) en 5 ml de THF anhidro. La mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. El compuesto R-1 (1 mmol) y DMAP (4-dimetilaminopiridina) (0.2 mmoles) se añadieron secuencialmente a la mezcla de reacción y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 36 horas. La mezcla se evaporó, se trituró en metanol, se filtró, y se concentró para conseguir un residuo. El residuo se purificó mediante HPLC proporcionando el compuesto B. 3) Optimización de las condiciones de reacción usando PLE - AS PLE es una enzima producida por Roche y vendida a través de Biocatalytics Inc. como una preparación de estearasa bruta de hígado de cerdo, conocida comúnmente como PLE AS (comprada en Biocatalytics como ICR - 123, vendida en forma de una suspensión de sulfato amónico ). La enzima se clasifica en el registro CAS como una "éster carboxílico hidrolasa, CAS n° 9016 - 18 - 6". El número de clasificación de enzima correspondiente es EC 3.1.1.1. Se sabe que la enzima tiene una amplia especificidad de sustrato hacía la hidrólisis de un amplio intervalo de esteres. La actividad lipasa se determina usando un procedimiento basado en la hidrólisis de butirato de etilo en un ajustador de pH. 1 LU (unidad lípasa) es la cantidad de enzima que libera 1 µmol ajustable de ácido butírico ajustable por minuto a 22°C, pH 8.2. La preparación reseñada en esta memoria descriptiva (PLE -AS, como suspensión) se envía usualmente como un líquido marrón - verde opaco con una actividad declarada de > 45 LU/mg (contenido proteico aproximadamente 40 mg/ml). Los principales parámetros optimizados en esta reacción eran las concentraciones de sustrato y concentraciones de enzima, pH, y tipo de tampón. La mayoría de los experimentos se realizaron usando la forma líquida de la enzima comercialmente disponible como PLE - AS. El efecto del pH en esta reacción no era muy crítico. Un intervalo razonable de pH para realizar la reacción incluye pH 6 - 9 con resultados óptimos a pH 8.0. La mayoría de los experimentos de optimización se realizaron después a temperatura ambiente.

Se ensayaron tampones: Tris, fosfato y acetato de calcio. La reacción se puede realizar en los tres tampones con resultados muy similares en el intervalo entre 10 y 100 mM de concentración. Se pueden usar otros tampones para llevar a cabo la reacción que incluyen ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES), ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfón¡co (BES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), N-(2- hidroxietil)piperazina-N'-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES), ácido N-tris (hidroxímetil)metil-2-aminoetanosulfóníco (TES), tris(hidroximetil)am¡nometano (TRIZMA), N-tris(hidroximetíl)metilgl¡cina (TRICINA), N,N-bis(2- hidroxietíl)glicina (BICINA), ácido N-tris(hidroximetil)metil-3- amínopropanosulfónico (TAPS), o cualquier otro tampón con valores de pKa entre 6 y 9. Se usaron velocidades de agitación normales en todos los experimentos (500 - 1000 rpm). Se encontró que un contenido en enzima de 5 - 10% (v/v) podría catalizar eficazmente la reacción enzimática casi tan eficaz como 20%. La premezcla de enzima y tampón seguido de adición de sustrato y agitación fuerte se encontró que era beneficioso para realizar la reacción a concentraciones mínimas. Usando las condiciones optimizadas para cargas de enzimas se ensayaron, cargas de sustratos entre 0.2 M y 2 M y se encontró que concentraciones entre 1 - 2 M producían cerca de un 50% de conversión en 24 horas. Otras formas de la enzima no comercialmente disponibles también se podrían usar, aquellas incluyen inmovilizadas sobre soporte sólido (tales como cerámica, celita, Eupergit, perlas acrílicas, etc), cristales de enzimas reticuladas (CLEC), o agregados de enzimas reticuladas (CLEA), granulos de sulfato amónico, o cualquier otra forma en la que la actividad y enantioselectividad se puede preservar o potenciar. La preparación a gran escala de los compuestos R-1 y S2 usando resolución con esterasa de hígado de cerdo de acetato de 1-(2,6-dicloro-3- fluorofenil)etilo racémico (2) se realizó según el esquema 4.

ESQUEMA 4 A un reactor de 5 I equipado con un electrodo de pH, un agitador en la parte superior y una línea de adición de base se añadió la solución de PLE - AS (0.125 I) y 2.17 I de solución de tampón fosfato potásico. Se usó un ajustador de pH 718 Stat Tritino - Metrohm (Brinkman instruments, Inc) para realizar la reacción. La solución de tampón fosfato potásico se preparó mezclando 2.17 I de agua, 15.6 ml de solución de K2HPO4 1 M y 6.2 ml de KH2PO4. Después, se añadió acetato de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etilo racémico (2) (250 g, 1 mol). Después la suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 22 horas. El pH de la solución se mantuvo a 7.0 añadiendo NaOH 2 N. La reacción se siguió por RP - HPLC mirando tanto la conversión como % de ee del producto, y se detuvo después de que el 51 - 52% de material de partida se hubiera consumido (aproximadamente 240 ml de base añadida). Después de la terminación de la reacción, se añadió metil terc-butil éter (MTBE) (900 ml), y la mezcla se agitó durante 5 minutos. La emulsión resultante se pasó a través de una almohadilla de filtro de celita y después se transfirió a un embudo de decantación/extractor. Esta fase incluye suspensión de celita con agua desionizada y después el vertido en un embudo Buchner de la almohadilla de celita preparada. El filtrado de agua de desechó antes de pasar la emulsión enzimática. Después se separaron las fases, se extrajo la fase acuosa dos veces más con 900 ml de MTBE cada una. Las fases de MTBE combinadas se secaron con Na2SO4 y se concentraron a vacío produciendo 242 g de mezcla de alcohol bruto y acetato. 4) Maximización de rendimiento del procedimiento de resolución enzimática desarrollando un procedimiento para la combinación de hidrólisis enzimática, esterificación e hidrólisis química con inversión Una vez que se desarrolló la resolución cinética enzimática, se exploró la conversión química del alcohol "R-1 " al acetato "S-2". El procedimiento se realizó según el esquema 5.

ESQUEMA 5 5-2 A un matraz de 50 ml con camisa equipado con un electrodo de pH, un agitador en la parte superior y una línea de adición de base (1 M, NaOH), se añadió 1.2 ml de tampón fosfato potásico 100 mM pH 7.0 y 0.13 ml de una suspensión de PLE AS. Después el compuesto 2 (0.13 g, 0.5 mmoles, 1.00 eq) se añadió gota a gota y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 20 h; manteniendo el pH de la reacción constante a 7.0 usando NaOH 1 M. Tanto la conversión como el ee de la reacción se controlaron mediante RP - HPLC, y se detuvo después de que se había consumido el 50% de material de partida (aproximadamente 17 horas en estas condiciones). Después la mezcla se extrajo tres veces con 10 ml de acetato de etilo recuperando tanto el éster como el alcohol en forma de una mezcla de R-1 y S-2. Se añadió cloruro de metanosulfonilo (0.06 ml, 0.6 mmoles) a una solución de una mezcla de R-1 y S-2 (0.48 mmoles) en 4 ml de piridina en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas después se evaporó obteniendo un aceite. Se añadió agua (20 ml) a la mezcla y después se añadió EtOAc (20 ml x 2) extrayendo la solución acuosa. Las fases orgánicas se combinaron, se secaron, se filtraron, y se evaporaron produciendo una mezcla de R-3 y S-2. La mezcla se usó en la siguiente etapa de reacción sin purificación adicional. 1H RMN (cloroformo-D, 400 MHz) d ppm 1.66 (d, J = 7.1 Hz, 3 H), 1.84 (d, J = 7.1 Hz, 3 H), 2.09 (s, 3 H), 2.92 (s, 3 H), 6.39 (c, J = 7.0 Hz, 1 H), 6.46 (c, J = 6.8 Hz, 1 H), 6.98 - 7.07 (m, 1 H), 7.07 - 7.17 (m, 1 H), 7.23 - 7.30 (m, 1 H), 7.34 (dd, J = 8.8, 4.80 Hz, 1 H). Se añadió acetato de potasio (0.027 g, 0.26 mmoles) a una solución de solución de una mezcla de R-3 y S-2 (0.48 mmoles) en 4 ml de DMF en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se calentó hasta 100°C durante 12 horas. Se añadió agua (20 ml) a la mezcla de reacción y EtOAc (20 ml x 2) extrayendo la solución acuosa. La fase orgánica combinada se secó, se filtró, y se evaporó proporcionando un aceite de S-2 (72 mg, 61 % de rendimiento en dos etapas). Quiralídad ee: 97.6%. 1H RMN (cloroformo-D, 400 MHz) d ppm 1.66 (d, J = 7.1 Hz, 3 H), 2.09 (s, 3 H), 6.39 (c, J = 6.8 Hz, 1 H), 7.02 (t, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.22 - 7.30 (m, 1 H). Se añadió lentamente metóxido de sodio (19 mmoles, 0.5 M en metanol) al compuesto S-2 (4.64 g, 18.8 mmoles) en una atmósfera de nitrógeno a 0°C. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. Se evaporó el disolvente y se añadió H2O (100 ml). La mezcla de reacción enfriada se neutralizó con solución de tampón acetato sódico - ácido acético hasta un pH 7. Se añadió acetato de etilo (100 ml x 2) extrayendo la solución acuosa. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron, y se evaporaron obteniendo S-1 en forma de un sólido blanco (4.36 g, 94.9% de rendimiento); CFS - EM: 97% de ee. 1H RMN (cloroformo-D, 400 MHz) d ppm 1.65 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 5.58 (c, J = 6.9 Hz, 1 H), 6.96 - 7.10 (m, 1 H), 7.22 - 7.36 (m, 1 H).

EJEMPLO 2 Bio - reducción enantioselectiva de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanona El desarrollo del procedimiento actual se acometió usando reacciones catalizadas por células enteras así como enzimas disponibles comercialmente. El procedimiento implicó la realización de tres etapas principales: 1 ) seleccionar una colección de células enteras internas (o enzima aislada) que contenía principalmente cepas de levaduras y hongos (alcoholdeshidrogenasas comercialmente disponibles y cetona reductasas), 2) realizar la optimización de reacción respecto a pH, temperatura y la cantidad de enzima y sustrato; 3) desarrollar un procedimiento para el reciclaje del biocatalizador.

Selección de células enteras La selección de cepas capaces de hacer la reducción enantioselectiva de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanona se llevó a cabo como sigue. Se desarrollaron cepas microbianas a partir de existencias congeladas en una placa de 96 pocilios (5 µl/pocillo). 200 µl de medio YM estéril (medios Difco 271120) se inoculó en cada pocilio. Todas las cepas se desarrollaron a 28°C y 250 rpm en un agitador rotatorio. Después de 2 días, se añadió sustrato de una solución madre al 10% en etanol para alcanzar 1 mg/ml en cada pocilio. Después las placas se agitaron a la misma velocidad y temperatura y las reacciones se analizaron después de 2 - 7 días. Las reacciones se analizaron mediante HPLC usando una columna no quiral. Ciento ochenta y ocho cepas microbianas diferentes mostradas en el cuadro 3 se distribuyeron en placas de 96 pocilios y se analizaron a concentraciones de sustrato no mayores de 1 mg/ml como se ha descrito anteriormente. Treinta cepas diferentes pertenecientes a especies de Rhodotorula, Neurospora, Rhodosporibium, Aerobasidium, y Candida se encontraron que mostraban la actividad deseada. Todas las cepas mostraban selectividad S. Después aquellas cepas se volvieron a seleccionar y las levaduras UC2387 pertenecientes a especies de Rhodotorula se eligieron para la preparación de S-1 a mayor escala.

CUADRO 3 Procedimiento a gran escala para la preparación de (1 S)-1 -(2,6-dicloro- 3-fluorofenil)etanol (S-1 ) mediante reducción de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofeniQetanona usando la cepa de Rhodotorula sp. Y2 - UC2387 La bio - reducción de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanona a (1S)-1-(2,6- dicloro-3-fluorofenil)etanol (S-1) usando la cepa de Rhodotorula sp. Y2 - UC2387 se realizó según el esquema 6 como se muestra a continuación ESQUEMA 6 Un procedimiento de fermentación en dos etapas se estableció cuando el pre - cultivo (primera etapa) se desarrolló a partir de inoculo reciente (colonia recogida de placa de agar) en matraces agitados durante 2 días. El cultivo de la segunda fase se comenzó añadiendo pre - cultivo a medio reciente (dilución 1/50 - 1/100) y el cultivo resultante se desarrolló durante 1 día antes de que se añadiera sustrato de una solución de etanol al 10%. Se usó medio YM (medio Dífco 271120) para ambos cultivos de líquido así como placas a base de agar. Para la reducción de 2 g (9.6 mmoles) de 1-(2,6-dicloro-3- fluorofeníl)etanona, era necesario 1 I de preparación. El cultivo de la primera etapa que contenía 10 ml de YM y el cultivo entero se usaron para inocular el cultivo de la segunda fase (1 I). Después del desarrollo durante 3 días, se añadió sustrato puro y se agitó la reacción durante 7 días. Tanto la conversión de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanona al isómero deseado del alcohol S-1 como el ee de S-1 se controlaron mediante RP - HPLC. La reacción se detuvo después de que se alcanzara 57% de conversión cuando las células de levaduras se separaron mediante centrifugación a 5,000 rpm. El material de partida restante y el producto deseado se recuperaron mediante extracción (tres veces con 0.5 volúmenes de acetato de etilo).

Estudios sobre las cargas máximas de sustrato y reciclado de células de levaduras Se analizó concentración de sustrato en el intervalo de 1 - 20 g/l, y se eligió 2.5 g/l debido a que permitía el mejor rendimiento espacio - tiempo (aproximadamente 0.5 g/l/d) correspondiente a una velocidad de formación de producto de 0.1 g por gramo de microorganismo al día. Los rendimientos de producto aislado están en el intervalo entre 50 y 100%. La escasa solubilidad del precursor en agua < 2.5 g/l evita el uso de cargas de sustrato mayores.

Resinas no iónicas XAD (producidas por Rohm y Hass) conocidas por absorbern compuestos orgánicos (según una publicación de D'Arrigo, y col., Tetrahedron: Asymmetry, 1997, vol. 8, pp. 2375 - 2379) se podrían usar para el atrapamiento del sustrato o producto (principalmente proporcionando una lenta liberación de sustrato y evitar la toxicidad de sustrato a las células o la inhibición de enzimas). Esta técnica permite el uso de cargas de sustrato de 20 g/l o mayores. Células inmovilizadas en alginato de calcio según el procedimiento de Rotthaus, y col., Tetrahedron, 2002, vol. 58, pp. 7291 - 93, demostraron que era una solución práctica para el reciclado y mejor uso del catalizador. Las células de levaduras atrapadas eran más resistentes a la tensión mecánica y al mismo tiempo, se observó mejoras significativas en la recuperación de productos. También se observaron cargas de sustrato similares a las observadas con células enteras.

Selección de enzimas comercialmente disponibles La selección de enzimas capaces de realizar la reducción enantioselectiva de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanona se llevó a cabo como sigue. Se analizaron 27 cetona reductasas diferentes (compradas a Biocatalytics, Inc como un kit KRED - M27), así como 4 alcohol deshidrogenasas (alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (HLADH), alcohol deshidrogenasa de levadura, alcohol deshidrogenasa de Thermoanaerobium brokii y alcohol deshídrogenasa de Lactobacillus kéfir) disponible de Sígma Aldrich. Las reacciones enzimáticas Kred se realizaron a 1 mg/ml de carga de sustrato y usando NADPH como agente reductor. Las alcohol deshidrogenasas se analizaron usando tanto NADH como NADPH. Solamente la alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (HLADH) catalizaba la reducción selectiva de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofeníl)etanona proporcionando (S)-1 según el esquema 7.

ESQUEMA 7 conversión al 55% HLADH se ha reseñado previamente para la reducción de sustratos múltiples (actúa como una ADH tipo E3 según Nakamura, y col., Tetrahedron asymmetry, 2003, vol. 14, pp. 2659 - 2681 ) siguiendo la regla de prelog (Prelog, V, Puré App. Chem., 1964, vol. 9, 119). El cuadro 4 contiene las relaciones sustrato a enzima (S:E) evaluadas.

CUADRO 4 Compuesto S-1 (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol El compuesto S-1 se purificó a partir de la cetona del material de partida mediante cromatografía ultra - rápida (eluyendo con 15 ? 20% de EtOAc en hexanos) proporcionando el compuesto S-1 en forma de un aceite incoloro (229.8 mg, 1.1 mmoles); CFS - EM: 100% de ee. 1H RMN (MeOD, 400 MHz) d ppm 1.58 (d, J = 7.1 Hz, 3 H), 5.61 (c, J = 6.8 Hz, 1 H), 7.14 (t, J = 8.6 Hz, 1 H), 7.35 (dd, J = 9.0, 4.9 Hz, 1 H).

EJEMPLO 3 Uso de (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol en la síntesis de inhibidores de tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento de hepatocitos humanos Se usó (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol como un intermedio en la síntesis quiral de inhibidores de tirosina quinasa del receptorg del factor de crecimiento de hepatocitos humanos según el esquema 8 y procedimientos de síntesis descritos más adelante.

ESQUEMA 8 Ki = S nM Compuesto 3 3-f(1 R)-1-(2.6-dicloro-3-fluorofenil)etoxi1-2-nitropiridina Se añadieron 3-hidroxi-2-nitropiridina (175 mg, 1.21 mmoles), trifenilfosfina (440 mg, 1.65 mmoles) secuencialmente a una solución agitada de S-1 (229.8 mg, 1.1 mmoles) en THF (10 ml) en una atmósfera de nitrógeno . La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora y después se añadió azodicarboxilato de diisopropílo (0.34 ml, 1.65 mmoles) a 0°C. La mezcla se agitó durante 12 horas adicionales. La mezcla de reacción se evaporó a vacío proporcionando un aceite. El residuo se purificó mediante cromatografía ultra - rápida (eluyendo con 20 -> 25% de EtOAc en hexanos) proporcionando el compuesto 3 en forma de un sólido blanco (321.5 mg, 0.97 mmoles; 88.3% de rendimiento); EM (IQPA) (M + H)+ 331 ; CFS - EM: 99.5% de ee. 1H RMN (CLOROFORMO-D, 400 MHz) d ppm 1.85 (d, J = 6.6 Hz, 3 H), 6.10 (c, J = 6.6 Hz, 1 H), 7.04 - 7.13 (m, 1 H), 7.21 (dd, J = 8.5, 1.14 Hz, 1 H), 7.30 (dd, J = 9.0, 4.9 Hz, 1 H), 7.37 (dd, J = 8.6, 4.6 Hz, 1 H), 8.04 (dd, J = 4.6, 1.3 Hz, 1 H).

Compuesto 4 3-[(1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etoxilpiridin-2-amina Se añadió hierro (365 mg) a una solución agitada del compuesto 3 (321 mg, 0.97 mmoles) en una mezcla de EtOH (2 ml) y HCl 2 M (0.2 ml) a 0°C. La solución resultante se calentó a 85°C durante 2 horas. Se añadió celita (0.5 g) a la mezcla de reacción enfriada. Esta mezcla se filtró sobre un lecho de celita y se evaporó proporcionando el compuesto 4 en forma de un aceite oscuro. EM (IQPA) (M + H)+ 301. El compuesto 4 se usó en la siguiente etapa de reacción sin purificación posterior.

Compuesto 5 3-[(1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etoxil-5-vodopiridin-2-amina Se añadieron ácido peryódico (60 mg, 0.24 mmoles), yodo (130 mg, 0.5 mmoles), y ácido sulfúrico (0.03 ml) secuencialmente a una solución agitada del compuesto 4 (0.97 mmoles) en una mezcla de ácido acético (3 ml) y H2O (0.5 ml). La solución resultante se calentó hasta 80°C durante 5 horas. La mezcla de reacción enfriada se inactivo con Na2SO3 (80 mg) y se basificó con Na2CO3 sat (2 x 100 ml) hasta pH 7. Se añadió CH2CI2 (2 x 50 ml) extrayendo la solución acuosa. Se secaron las fases orgánicas combinadas sobre Na2SO , después se filtraron y se concentraron a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía ultra - rápida (eluyendo con 35 ? 40% de EtOAc en hexanos) proporcionando el compuesto 5 en forma de un aceite amarillo (254 mg, 0,6 mmoles; 61.6% de rendimiento); EM (IQPA) (M + H)+ 426. 1H RMN (Cloroformo-D, 400 MHz) d ppm 1.81 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 4.86 (s, 2H), 5.98 (c, J = 6.57 Hz, 1 H), 6.96 (d , J = 1.5 Hz, 1 H), 7.08 (dd, J = 9.0, 8.0 Hz, 1 H), 7.31 (dd, J = 8.8, 4.8 Hz, 1 H), 7.78 (d, J = 1.8 Hz, 1 H).

Compuesto 6 4-[4-(4,4,5,5-Tetrametil-1 ,3,2-d¡oxaborolan-2-¡l)benzoillpiperazina-1- carboxilato de terc-butilo Se añadió 1 ,1 '-carbonildiimidazol (360 mg, 2.2 mmoles) a una solución de ácido 4-(4,4,5,5-tetrametil-1 ,3,2-dioxaborolan-2-il)benzoico (515 mg, 2 mmoles) en CH2CI2 (50 ml) en atmósfera inerte. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se añadió 1-piperazinacarboxilato de terc-butilo (390 mg, 2 mmoles). La suspensión resultante se agitó durante 12 horas en atmósfera inerte. La mezcla se vertió en H2O (50 ml) para agitar y se añadió CH2CI2 (2 x 50 ml) extrayendo la solución acuosa. Se secaron las fases orgánicas combinadas, se filtraron y se concentraron proporcionando un residuo de aceite incoloro. El residuo se purificó mediante cromatografía ultra - rápida (eluyendo con 20 ? 25% de EtOAc en hexanos) proporcionando el compuesto 6 en forma de un sólido blanco (461 mg, 1.1 mmoles; 55.4% de rendimiento); EM (IQPA) (M + H)+ 417. 1H RMN (Cloroformo-D, 400 MHz) d ppm 1.34 (s, 12 H), 1 .45 (s, 9 H), 3.26 - 3.42 (m, 4 H), 3.44 - 3.56 (m, 2 H), 3.66 - 3.89 (m, 2 H), 7.37 (d, J = 8.1 Hz, 2 H), 7.84 (d, J = 8.1 Hz, 2 H).

Compuesto 7 4-(4-(6-am¡no-5-f(1 R)-1-(2.6-dicloro-3-fluorofen¡l)etoxi1piridin-3-il)benzoil)piperazina-1 -carboxilato de terc-butilo Se añadió el compuesto 6 (300 mg, 0.72 mmoles) a una solución del compuesto 5 (254 mg, 0.6 mmoles) en 7 ml de DME (etilen glícoldimetíl éter). La mezcla se purgó con nitrógeno varias veces y después se añadió diclorobis(trifenilfosfino) paladio (II) (50 mg, 0.06 mmoles). Se añadió carbonato de sodio (200 mg, 1.8 mmoles) en 1.5 ml de H2O a la mezcla de reacción y la solución resultante se calentó hasta 85°C durante 12 horas. Se añadió agua (50 ml) a la mezcla de reacción inactivando la reacción. Después se añadió EtOAc (2 x 50 ml) extrayendo la solución acuosa. La fase combinada de EtOAc se secó, se filtró, y se evaporó proporcionando un residuo oleoso amarillo marrón. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con 75 ? 80% de EtOAc en hexanos) proporcionando el compuesto 7 en forma de un sólido blanco (255.5 mg, 0.43 mmoles; 72.9% de rendimiento); EM (IQPA) (M + H)+ 589. 1H RMN (Cloroformo-D, 400 MHz) d ppm 1.45 (s, 9 H), 1.85 (d, J = 6.6 Hz, 3 H), 4.92 (s, 2 H), 6.10 (c, J = 6.8 Hz, 1 H), 6.97 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.01 - 7.10 (m, 1 H), 7.29 (dd, J = 9.0, 4.9 Hz, 1 H), 7.36 - 7.42 (m, 3 H), 7.58 - 7.64 (m, 1 H), 7.87 (d, J = 1.5 Hz, 1 H).

Compuesto 8 3-1(1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etoxi1-5-r4-(piperazin-1 -ilcarbonil)fenillpiridin-2-amina Se añadió ácido clorhídrico (1.3 ml, 4.8 mmoles) a una solución del compuesto 7 en etanol (10 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas y después se evaporó a vacío proporcionando un aceite. El residuo se purificó mediante cromatografía ultra - rápida (eluyendo con 25 ? 40% de CH3OH en EtOAc) proporcionando el compuesto 8 en forma de un sólido blanco (180.4 mg, 0.37 mmoles; 85.2% de rendimiento); EM (IQPA) (M + H)+ 489; CFS - EM: 100% de ee. 1H RMN (MeOD, 400 MHz) d ppm 1.88 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 2.92 - 3.21 (m, 4 H), 3.58 - 4.07 (m, 4 H), 6.21 (c, J = 6.8 Hz, 1 H), 7.02 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.18 - 7.27 (m, 1 H), 7.41 - 7.45 (m, 1 H), 7.46 (s, 4 H), 7.78 (d, J = 1.8 Hz, 1 H). Anal. Calculado para C24H23CI2FN4O2 • 2HCI • 1.25 H2O C: 49.29, H: 4.74, N: 9.58. Encontrado C: 49.53, H: 4.82, N: 9.29. Aunque la invención se ha ilustrado como referencia a realizaciones específicas y preferidas los expertos en la técnica reconocerán que se pueden realizar variaciones y modificaciones mediante experimentación rutinaria y práctica de la invención. De este modo, la invención se propone que está limitada por la descripción anterior, sino que se defina por las reivindicaciones anexas y sus equivalentes. La descripción entera de patentes y solicitudes de patentes y publicaciones de no patentes citadas en la presente memoria descriptiva se incorpora como referencia.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol que está al menos 95% libre de (1 R)-1- (2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol. 2.- Un procedimiento de separación de esteres 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólicos enantioméricos de fórmula (I): en la que R es hidrógeno, alquilo Ci - C20, cicloalquílo C3 - C8, arilo C6 - C1 , arilalquilo C7 - C-?5, alcoxi Ci - C20, alquil Ci - C2o amino, en la que dichos radicales hidrocarburo pueden estar opcionalmente monosustituidos o polisustituidos con hidroxilo, formilo, oxi, alcoxi Ci - C6, carboxi, mercapto, sulfo, amino, alquil Ci - C6 amino, nitro o halógeno, comprendiendo el procedimiento las etapas de: poner en contacto los esteres 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólicos de fórmula (I) con un biocatalízador en una solución acuosa, un disolvente orgánico, o una mezcla de disolventes orgánicos y acuosos en la que solamente un enantiómero se hidroliza selectivamente para proporcionar un isómero ópticamente activo de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol y un isómero ópticamente activo sin reaccionar de éster 1-(2,6-dicloro-3- fluorofenil)etanólicos, y separar el isómero ópticamente activo de 1-(2,6-dicloro-3- fluorofenil)etanol del éster 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólico ópticamente activo sin reaccionar. 3.- Un procedimiento para preparar (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol que comprende las etapas de: poner en contacto una mezcla de esteres 1-(2,6-dicloro-3- fluorofenil)etanólicos enantioméricos de fórmula (I): en la que R es hidrógeno, alquilo Ci - C20, cicloalquilo C3 - C8, arilo C6 - C , arilalquilo C - C15, alcoxi Ci - C20, alquil C-i - C20 amino, en la que dichos radicales hidrocarburo pueden estar opcionalmente monosustituídos o polisustituidos con hidroxilo, formilo, oxi, alcoxi Ci - C6, carboxi, mercapto, sulfo, amino, alquil Ci - C6 amino, nitro o halógeno, con un biocatalizador en una solución acuosa, un disolvente orgánico, o una mezcla de disolventes orgánicos y acuosos en la que solamente el enantiómero (R)- se hidroliza selectivamente para proporcionar una mezcla de (1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol y un éster (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofeníl)etanólico; convertir la mezcla de (1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol y el éster (1 S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólíco en (1S)-1-(2,6-dicloro-3- fluorofeníl)etanol; y recuperar (1 S)-1 -(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol. 4.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la etapa de conversión comprende: hacer reaccionar (1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol en la mezcla de (1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol y el éster (1S)-1-(2,6-dicloro-3- fluorofenil)etanólico con un haluro de sulfonilo orgánico en un disolvente aprótico para formar una mezcla de un éster de ácido sulfónico orgánico de (1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol y el éster (1S)-1-(2,6-dicloro-3- fluorofeníl)etanólico; a) adicionalmente hacer reaccionar el éster de ácido sulfónico orgánico de (1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofeníl)etanol en la mezcla del éster de ácido sulfónico orgánico de (1 R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol y el éster (1 S)-1 -(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólico con una sal de metal alcalino de un ácido carboxílico alifático en un disolvente aprótico para formar una mezcla de un éster de ácido carboxílico alifático de (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol y el éster (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólico; y b) transformar la mezcla del éster del ácido carboxílico alifático de (1S)-1-(2,6- dicloro-3-fluorofenil)etanol y el éster (1 S)-1-(2,6-dicloro-3- fluorofenil)etanólico en (1S)-1 -(2,6-dicloro-3-fluorofeníl)etanol. 5.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la etapa de transformación c) comprende someter a solvolisis la mezcla del éster del ácido carboxílíco alifático de (1 S)- 1-(2,6- dicloro-3-fluorofenil)etanol y el éster (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofeníl)etanólico en un disolvente alcohólico o acuoso en presencia de una sustancia básica para formar (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol. 6.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque en la etapa de transformación c) la mezcla del éster del ácido carboxílico alifático de (1S)-1-(2,6- dicloro-3-fluorofenil)etanol y el éster (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólico se somete a solvolísis en metanol en presencia de metóxido de sodio para formar (1S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol. 7 '.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque: R es metilo; en la etapa de reacción a) el haluro de sulfonilo orgánico es cloruro de metanosulfonilo, el disolvente aprótico es piridína; en la etapa de reacción b) la sal de metal alcalino de los ácidos carboxílícos alifátícos es acetato de potasio y el disolvente aprótico es dimetilformamida. 8.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el biocatalizador es una enzima seleccionada entre el grupo constituido por Amano D (lipasa de R. delemar), Amano AY (lipasa de C. rugosa), Amano F (lipasa de R. oryzae) y esterasa de hígado de cerdo. 9.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la enzima se usa en una cantidad de 0.1 a 100 partes en peso basándose en 100 partes en peso de la mezcla de esteres 1- (2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólicos enantioméricos. 10.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la etapa de poner en contacto la mezcla de esteres 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanólicos enantioméricos con el biocatalizador se lleva a cabo en una solución acuosa entre 0 y 60°C con mantenimiento de pH a de 4 a 12. 11.- Un procedimiento para preparar un isómero ópticamente activo de 1- (2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol comprende la etapa de reducir la 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanonamediante un biocatalizador de una manera enantioselectiva en una solución acuosa, un disolvente orgánico, o una mezcla de disolventes orgánicos y acuosos para proporcionar dicho isómero ópticamente activo de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol. 12.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque comprende adicionalmente la etapa de recuperar dicho isómero ópticamente activo de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol. 13.- El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado además porque dicho isómero ópticamente activo de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol es (S)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol. 14.- El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado además porque el biocatalizador es una enzima. 15.- El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado además porque la enzima es alcoholdeshidrogenasa de hígado de caballo.