CN105754983B - 一种用于制备依折麦布中间体的固定化酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于制备依折麦布中间体的固定化酶，其由酮基还原酶或羰基还原酶以吸附、共价结合、包埋、微囊化或交联的固定方式固定于固定化酶载体中制备而成，其中，所述酮基还原酶占所述固定化酶载体的质量百分比为0.01%~5%。本发明的固定化酶与液酶相比，降低生产成本和劳动强度，提高酶的利用效率和产品质量，减少三废排放，绿色环保。
Description
技术领域
本发明属于医药化工领域，具体的涉及一种用于制备依折麦布中间体(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的固定化酶，本发明还涉及所述固定化酶的制备方法和应用。
背景技术
依折麦布是由先灵葆雅制药公司(Schering-Plough)和默克公司(Merck)联合开发的新型胆固醇吸收抑制剂，是第一个获得美国FDA批准上市的胆固醇吸收选择性抑制剂类药物，商品名：“益适纯”（EZETROL），化学名（3R,4S）-1-(4-氟苯基)-3-[(3S)-3-(4-氟苯基)-3-羟丙基]-4-(4-羟苯基)-2-氮杂环丁酮。
其作用机制是抑制来源于食物的肠内胆固醇吸收，降低小肠中的胆固醇向肝脏中的转动，降低血浆胆固醇水平，可应用于各型高脂血症，尤其适用于对他汀类药物效果不佳或不能耐受的病人，以及一些遗传性和药源性高脂血症患者。2015年默沙东市场销售额25.2亿美元，目前已成为降血脂药物市场上的重磅炸弹药物，市场前广阔。专利2016年到期，开发生产该药物将有重要的社会效益及巨大的经济效益。
(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮是制备依折麦布（Ezetimibe）药物的关键手性中间体。目前，利用还原法生产(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的方法可分为化学法和生物法，其中化学法生产会产生少量的异构体影响成品的产品质量；生物法以其所具有的反应条件温和，立体专一性强、转化率高等特点被广泛地研究和应用。然而，目前生物法生产该中间体大多利用液酶进行反应，与使用固定化酶相比，每批反应必须换用新的酶液，分离困难，操作繁琐，且降低了酶的利用效率，废液不可回收，产生大量三废污染物，同时产品中可能含有蛋白等菌体杂质。
固定化酶技术的发展已有100多年的历史，到上个世纪70年代末，该技术已经较为成熟，可选择的固定化方法有包埋法、微囊化法、共价连接法、吸附法或组合方法，可选择的载体有无机载体或有机载体、天然载体或合成载体、有孔载体或无孔载体，可以优选的固定化条件有水相、有机溶剂、pH、温度等。随着科学技术的发展，固定化酶的技术也再不断的进步，通过固定化载体、固定化方法和酶的不断改进，提高了许多不具有工业化应用酶的性能，使其具有更高的选择性、活力和耐用性，能够体现出与以往液酶生产无法比拟的技术优势。通过固定化酶的使用，方便了反应混合物的分离，反应器设计较灵活，适用于多种不同反应介质和反应系统，方便过程开发和下游处理，尤其便于过程控制。
到目前为止，对于依折麦布中间体的制备，还没有合适的固定化酶产品应用于生产，对于该反应所特定需要的固定化酶的生产工艺条件摸索也是空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种易于从反应混合液中分离，可重复使用，有效降低工业三废产生，提高生产效率的用于制备依折麦布中间体的固定化酶。
为达到本发明目的，发明人所提供的技术方案为：
一种用于制备依折麦布中间体的固定化酶，其由酮基还原酶或羰基还原酶以吸附、共价结合、包埋、微囊化或交联的固定方式固定于固定化酶载体中制备而成，其中，所述酮基还原酶占所述固定化酶载体的质量百分比为0.01%~5%。
本发明中酮基还原酶又称酮还原酶（Ketoreductase），羰基还原酶类号为EC1.1.1.184。
优选地，本发明所述的用于制备依折麦布中间体的固定化酶，其中，所述酮基还原酶或羰基还原酶占所述固定化酶载体的质量百分比为0.1%~2%。
优选地，本发明所述的用于制备依折麦布中间体的固定化酶，其中，所述固定方式为共价结合，所述固定化酶载体选自环氧基固定化酶载体或氨基固定化酶载体。
进一步优选地，本发明所述的用于制备依折麦布中间体的固定化酶，其制备方法为：将酮基还原酶或羰基还原酶和固定化酶载体分别加入缓冲溶液中，控制固定化反应温度为15~40℃，搅拌反应8~96小时，收集固体，干燥，即得，其中，所述缓冲液的pH值为5~10，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCL缓冲溶液或三乙醇胺缓冲溶液。
进一步优选地，本发明所述的用于制备依折麦布中间体的固定化酶，其中，所述固定化反应温度为25℃，所述缓冲液pH为8，所述缓冲液为磷酸盐缓冲溶液。
本发明进一步提供所述用于制备依折麦布中间体的固定化酶的制备方法。
本发明提供的技术方案为：
制备本发明所述的用于制备依折麦布中间体的固定化酶的方法，其包括以下步骤：将酮基还原酶或羰基还原酶和固定化酶载体分别加入缓冲溶液中，控制固定化反应温度为15~40℃，搅拌反应8~96小时，收集固体，干燥，即得，其中，所述缓冲液的pH值为5~10，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCL缓冲溶液或三乙醇胺缓冲溶液。
本发明还提供一种制备依折麦布中间体的方法。
本发明的技术方案为：
一种采用本发明所述的用于制备依折麦布中间体的固定化酶制备依折麦布中间体的方法，其以(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮为底物，使该底物在固定化酶、辅酶和氢供体的存在下在溶剂中发生不对称还原反应生成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮，具体步骤为：在反应容器中加入溶剂，再依次加入底物(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮，氢供体，固定化酶和辅酶，于温度10℃~60℃下搅拌反应，利用高效液相色谱监测反应的转化率，至转化率达到99.8%以上终止反应，反应时间6~18h，其中，所述的辅酶选自NAD或NADP，所述氢供体选自异丙醇或葡萄糖/葡萄糖脱氢酶组合物，所述溶剂为pH值为5.5~8.5的水相缓冲液，反应起始时反应体系中所述(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮的浓度为1%~25%，固定化酶的浓度为1%~25%，辅酶NAD或NADP的浓度为0.001%~0.05%，所述二价金属离子的浓度为0.1~20mM，当氢供体为异丙醇时，异丙醇的浓度为1%~25%，当氢供体为葡萄糖/葡萄糖脱氢酶组合物时，葡萄糖的浓度为1%~25%，葡萄糖脱氢酶0.001%~0.05%，所述浓度单位均为g/mL。
本行业中，NAD是指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶I），NADP是指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（辅酶II）。
进一步地，本发明所述的采用本发明所述的用于制备依折麦布中间体的固定化酶制备依折麦布中间体的方法，其中，在所述不对称还原反应体系中进一步添加二价金属离子作为酶活力增强剂。
进一步优选地，本发明所述的采用本发明所述的用于制备依折麦布中间体的固定化酶制备依折麦布中间体的方法，其中，反应温度为15~40℃，反应起始时的反应体系中所述(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮的浓度为8%~20%，进一步优选15%，所述固定化酶的浓度为5%~15%，进一步优选10%，所述二价金属离子的浓度为0.5~3mM，进一步优选1.5mM，所述二价金属离子以盐酸盐、硫酸盐的形式存在，所述辅酶NAD或NADP的浓度为0.005%~0.04%，进一步优选0.01%，所述溶剂pH值为6.0~7.5，进一步优选7.0，所述温度为20℃~35℃，进一步优选28℃，当氢供体为异丙醇时，所述异丙醇的浓度为8%~15%，当氢供体为葡萄糖/葡萄糖脱氢酶组合物时，葡萄糖的浓度为5%~15%，进一步优选10%，葡萄糖脱氢酶0.005%~0.03%，进一步优选0.01%。
上述技术方案中，除二价金属离子外，所述浓度是指质量体积比浓度（w/v），单位为g/mL。
优选地，本发明所述的采用本发明所述的用于制备依折麦布中间体的固定化酶制备依折麦布中间体的方法，其中，所述水相缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCL缓冲液。
优选地，本发明所述的采用本发明所述的用于制备依折麦布中间体的固定化酶制备依折麦布中间体的方法，其中，所述二价金属离子为锰离子或镁离子。
进一步优选地，本发明所述的采用本发明所述的用于制备依折麦布中间体的固定化酶制备依折麦布中间体的方法，其中，所述二价金属离子以氯化锰或氯化镁形式加入。
根据本发明，所用的原料 (4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮、酮还原酶、辅酶NAD或NADP均可商购获得。
本发明技术方案带来的技术效果为：
1、固定化酶容易从反应液混合物中分离，可重复使用，大大降低生产成本；反应器设计较灵活；适合于多种不同的反应介质和反应系统；方便过程开发和下游处理，尤其便于过程控制。本发明方法通过添加廉价且来源广泛的辅料，有效地改进了传统酶催化生产过程中底物浓度低、酶反应耗时长等缺点，实现高效、低成本制备(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮。
2、本发明对固定化酶制备过程的工艺参数作出选择和优化，制备出适合于依折麦布中间体生产的固定化酶产品，填补市场空白。
3、本发明采用适当的固定化酶产品，应用于依折麦布中间体制备，与原有液酶催化工艺相比，提高酶利用效率，减小三废产生，简化工艺，提高生产效率，降低劳动成本和劳动强度，所制得的依折麦布中间体纯度好、收率高，适于工业应用和推广。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明并不限于以下实施例所提供的技术方案。
实施例1：固定化酶制备
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM,pH值8.0），并依次加入1g酮基还原酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速150rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例2：固定化酶制备
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM,pH值8.0），并依次加入1g酮基还原酶，40g活化后的氨基固定化酶载体(sepabeads® EC-HA/M)，温度25℃，转速150rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例3：固定化酶制备
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM,pH值8.0），并依次加入1g羰基还原酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速150rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例4：固定化酶制备
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM,pH值8.0），并依次加入1g羰基还原酶，40g活化后的氨基固定化酶载体(sepabeads® EC-HA/M)，温度25℃，转速150rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例5：固定化酶制备
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM,pH值8.0），并依次加入0.01g酮基还原酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速150rpm，反应96小时，收集固定化酶，干燥。
实施例6：固定化酶制备
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM,pH值8.0），并依次加入2g羰基还原酶，40g活化后的氨基固定化酶载体(sepabeads® EC-HA/M)，温度25℃，转速150rpm，反应12小时，收集固定化酶，干燥。
实施例7：(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的制备
在250mL三口烧瓶中加入100mL磷酸盐缓冲溶液（100mM,pH值为7.0）,依次加入底物(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮17.25g，异丙醇15mL，实施例1所得固定化酶15g，氯化锰1.5mM，NADP 0.012g，于28℃下，200rpm搅拌反应，利用液相色谱监测反应的转化率，12小后转化率达到99.8%以上，分离回收固定化酶，反应时间小于18小时，转化率在99.8%以上。所制得的(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮纯度99.5%，收率96%。所分离的固定化酶可重复使用10次以上。
实施例8：(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的制备
在250mL三口烧瓶中加入100mL磷酸盐缓冲溶液（100mM,pH值为7.0）,依次加入底物(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮17.25g，异丙醇15mL，实施例3固定化酶15g，氯化锰1.5mM，NADP 0.012g，于28℃下，200rpm搅拌反应，利用液相色谱监测反应的转化率，12小后转化率达到99.8%以上，分离回收固定化酶，反应时间小于18小时，转化率在99.8%以上。所制得的(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮纯度99.5%，收率95%。上述固定化酶可重复使用10次以上。
实施例9：(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的制备
在250mL三口烧瓶中加入100mL磷酸盐缓冲溶液（100mM,pH值为7.0）,依次加入底物(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮17.25g，葡萄糖10g，葡萄糖脱氢酶0.01g，实施例2固定化酶15g，氯化锰1.5mM，NADP 0.012g，于28℃下，200rpm搅拌反应，利用液相色谱监测反应的转化率，9小后转化率达到99.8%以上，分离回收固定化酶，反应时间小于18小时，转化率在99.8%以上。所制得的(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮纯度99.6%，收率96%。上述固定化酶可重复使用10次以上。
实验例10：(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的制备
在250mL三口烧瓶中加入100mL磷酸盐缓冲溶液（100mM,pH值为7.0）,依次加入底物(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮17.25g，异丙醇15mL，实施例5固定化酶15g，氯化锰1.5mM，NADP 0.012g，于28℃下，200rpm搅拌反应，利用液相色谱监测反应的转化率，15小后转化率达到99.8%以上，分离回收固定化酶，反应时间小于18小时，转化率在99.8%以上。所制得的(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮纯度99.5%，收率94%。上述固定化酶可重复使用10次以上。
实验例11：(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的制备
在250mL三口烧瓶中加入100mL磷酸盐缓冲溶液（100mM,pH值为7.0）,依次加入底物(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮17.25g，异丙醇15mL，实施例5固定化酶15g，NADP 0.012g，于28℃下，200rpm搅拌反应，利用液相色谱监测反应的转化率，17小后转化率达到99.8%以上，分离回收固定化酶，反应时间小于18小时，转化率在99.8%以上。所制得的(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮纯度99.5%，收率92%。上述固定化酶可重复使用10次以上。
Claims (6)
1.一种采用固定化酶制备依折麦布中间体的方法，其特征在于：以(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮为底物，使该底物在固定化酶、辅酶、氢供体和酶活力增强剂的存在下在溶剂中发生不对称还原反应生成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮，具体步骤为：在反应容器中加入溶剂，再依次加入底物(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮，氢供体，固定化酶、辅酶和酶活力增强剂，于温度20℃~35℃下搅拌反应，利用高效液相色谱监测反应的转化率，至转化率达到99.8%以上终止反应，反应时间6~18h，其中，所述的辅酶选自NAD或NADP，所述氢供体选自异丙醇或葡萄糖/葡萄糖脱氢酶组合物，所述酶活力增强剂为二价金属离子，所述溶剂为pH值为6.0~7.5的水相缓冲液，反应起始时反应体系中所述(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮的浓度为8%~20%，固定化酶的浓度为5%~15%，辅酶NAD或NADP的浓度为0.005%~0.04%，所述二价金属离子的浓度为0.5~3mM，所述二价金属离子以盐酸盐、硫酸盐的形式存在，当氢供体为异丙醇时，异丙醇的体积百分浓度为8%~15%，当氢供体为葡萄糖/葡萄糖脱氢酶组合物时，葡萄糖的浓度为5%~15%，葡萄糖脱氢酶0.005%~0.03%，除二价金属离子和异丙醇外，其他所述浓度是指质量体积比浓度（w/v），单位为g/mL；
所述固定化酶由酮基还原酶或羰基还原酶以共价结合的固定方式固定于固定化酶载体中制备而成，所述固定化酶载体选自环氧基固定化酶载体或氨基固定化酶载体，其中，所述酮基还原酶或羰基还原酶占所述固定化酶载体的质量百分比为0.01%~5%，所述共价结合的固定方式的步骤为：将酮基还原酶或羰基还原酶和固定化酶载体分别加入缓冲溶液中，控制固定化反应温度为15~40℃，搅拌反应8~96小时，收集固体，干燥，即得，其中，所述缓冲溶液的pH值为5~10，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCL缓冲溶液或三乙醇胺缓冲溶液。
2.如权利要求1所述的采用固定化酶制备依折麦布中间体的方法，其特征在于：所述酮基还原酶或羰基还原酶占所述固定化酶载体的质量百分比为0.1%~2%。
3.如权利要求1所述的采用固定化酶制备依折麦布中间体的方法，其特征在于：所述共价结合的固定方式的步骤中，所述固定化反应温度为25℃，所述缓冲溶液pH为8，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。
4.如权利要求1所述的采用固定化酶制备依折麦布中间体的方法，其特征在于：所述水相缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCL缓冲液。
5.如权利要求1所述的采用固定化酶制备依折麦布中间体的方法，其特征在于：所述二价金属离子为锰离子或镁离子。
6.如权利要求5所述的采用固定化酶制备依折麦布中间体的方法，其特征在于：所述二价金属离子以氯化锰或氯化镁形式加入。
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