CN114806902A - 一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用 - Google Patents

一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114806902A
CN114806902A CN202210512199.0A CN202210512199A CN114806902A CN 114806902 A CN114806902 A CN 114806902A CN 202210512199 A CN202210512199 A CN 202210512199A CN 114806902 A CN114806902 A CN 114806902A
Authority
CN
China
Prior art keywords
trichoderma reesei
strain
seq
malic acid
endogenous
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210512199.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114806902B (zh
Inventor
王玮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN202210512199.0A priority Critical patent/CN114806902B/zh
Publication of CN114806902A publication Critical patent/CN114806902A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114806902B publication Critical patent/CN114806902B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01037—Malate dehydrogenase (1.1.1.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01038—Malate dehydrogenase (oxaloacetate-decarboxylating) (1.1.1.38)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01039—Malate dehydrogenase (decarboxylating) (1.1.1.39)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/0104—Malate dehydrogenase (oxaloacetate-decarboxylating) (NADP+) (1.1.1.40)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01001—Pyruvate carboxylase (6.4.1.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明首次鉴定出里氏木霉内源的四碳二元羧酸转运蛋白、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶、葡萄糖转运蛋白四种功能的基因；并首次通过改造上述四种内源基因的表达强度，构建出大量生产L‑苹果酸的基因工程改良株。利用所述改良株发酵生产L‑苹果酸，其最高产量可超过90g/L。所述改良株为非转基因物种，不含有任何异源基因和筛选标记，其生产的L‑苹果酸为非转基因食品，可应用于非转基因食品行业。本发明公开的改良株的获取方法，为微生物发酵生产L‑苹果酸提供了新的方法，也为转基因安全和无标记基因编辑提供了很好的研究思路。

Description

一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和 应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用。
背景技术
苹果酸，学名2-羟基丁二酸，是一种重要的四碳二元羧酸。苹果酸的分子中有一个不对称的C原子，由此存在三种形式的苹果酸：L-苹果酸、D-苹果酸与D/L-苹果酸。天然存在的苹果酸属于L-苹果酸，在微生物、动物植物和细胞中分布广泛。
在食品和饮料工业中，L-苹果酸被广泛用作酸味剂和风味增强剂。与柠檬酸相比，L-苹果酸酸度更大、味道更柔和、滞留更持久，被认为是最好的食品酸味剂。在医药行业中，L-苹果酸作为三羧酸循环中的中间产物，直接参与人体的新陈代谢中，具有保护人体的肾脏、肝脏、心脏的作用，及用于降低抗癌药物对普通细胞的毒副作用；L-苹果酸也被加入药片中，使其具有水果天然酸味；苹果酸还可以配入氨基酸溶液中，来提高氨基酸吸收率等。在化工领域，L-苹果酸可以作为牙膏中的清洁剂及烟草中除臭剂，焊锡中的助焊剂，各种金属容器的除锈剂，染料工业中的增效剂和护色剂；在高聚物材料领域，L-苹果酸也是合成聚苹果酸的前体物质；在化学合成领域，L-苹果酸可以转化为许多高价值的生物基化学品。2004年起，美国能源部将苹果酸确定为12种基本化学物质之一。
L-苹果酸的生产方法有：直接提取法、酶转化法、化学合成法和微生物发酵法。直接提取法：是最早大量制备L-苹果酸的方法，其原理是在富含L-苹果酸的果汁中加入碳酸钙，使其沉淀为L-苹果酸钙盐，收集后用硫酸溶解，得到L-苹果酸。这一方法虽然工艺简单，产物纯度高，但原料来源有限、原料中L-苹果酸含量相对少、成本高等原因，批量生产有困难。酶转化法：是指以富马酸为底物，在特定条件下以富马酸酶为生物催化剂，将其转化为L-苹果酸。酶转化法生产L-苹果酸可以实现连续、高效的工业化生产，是工业上生产L-苹果酸的主要方式。但是该技术以石油基产品富马酸为原料，对环境不友好，及存在成本高和产品含有杂酸的缺点。化学合成法：主要有高温高压水合法、水解法、糠醛氧化法等。高温高压水合法是最常用的化学合成苹果酸的方法，已被用于苹果酸的工业化。高温高压水合法其步骤是以苯为原料，经催化氧化得到顺丁烯二酸，加热至120℃生成D/L-苹果酸的混合物，不是纯的L-苹果酸。生物发酵法：以糖质为原料，利用微生物的L-苹果酸合成途径，得到目标产物L-苹果酸。该法生产L-苹果酸具有原料来源丰富、条件温和、安全性高、对环境友好等优点，被认为是最具有发展前途的生产方式，但目前该法还未应用于工业化大量生产中。
里氏木霉是重要的工业生产菌株，符合GRAS(Generally Regarded as Safe)标准，其发酵产物已被广泛应用于食品、饲料等行业。已知里氏木霉菌株不能发酵生产L-苹果酸，可以通过转基因改造，引入外源基因，整合到里氏木霉的基因组上，构建转基因的里氏木霉工程菌，使其具备发酵生产L-苹果酸的能力，但是可能会带来转基因操作的安全性和转基因食品政策的限制性等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。该方法在不添加任何外源基因的前提下，通过强化自身的L-苹果酸转运系统及胞质rTCA途径，提高L-苹果酸的转运及合成能力，构建出不含有任何外源基因序列的高产L-苹果酸的改良株。改良株属于非转基因物种，其生产的L-苹果酸属于非转基因食品，避免了转基因涉及的安全性和政策的限制性等问题，也为微生物发酵来源的L-苹果酸提供了非转基因的新方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株，以丝状真菌里氏木霉菌或者里氏木霉菌的衍生菌为出发菌株，在不引入任何外源基因的前提下，对所述出发菌株的基因组定向分子改良，使所得的里氏木霉改良株能够生产L-苹果酸。
优选的是，对所述出发菌株的基因组定向分子改良，包括：通过同源比对鉴定出发菌株内源的四碳二元羧酸转运蛋白、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶、葡萄糖转运蛋白的编码基因；过表达所鉴定的出发菌株内源的四碳二元羧酸转运蛋白、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶和葡萄糖转运蛋白的编码基因中的至少一种。
优选的是，所述里氏木霉菌包括里氏木霉菌株QM6a，QM9414，Rut-C30，RL-P37，NG14或PC-3-7。
本发明还提供一种获取所述的改良株的方法，包括以下步骤：利用里氏木霉菌内源的强启动子过表达所述里氏木霉菌内源的四碳二元羧酸转运蛋白、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶和葡萄糖转运蛋白的编码基因中的至少一种。
优选的是，所述里氏木霉菌内源的四碳二元羧酸转运蛋白的编码基因包括如SEQID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13所示序列的基因；所述里氏木霉菌内源的丙酮酸羧化酶的编码基因包括如SEQ ID NO：17所示序列的基因；所述里氏木霉菌内源的苹果酸脱氢酶的编码基因包括如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：23所示序列的基因；所述里氏木霉菌内源的苹果酸酶的编码基因包括如SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：29所示序列的基因；所述里氏木霉菌内源的葡萄糖转运蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35所示序列的基因。
优选的是，所述里氏木霉菌内源的强启动子包括里氏木霉菌丙酮酸脱羧酶基因的启动子和里氏木霉菌烯醇化酶基因的启动子。
本发明还提供利用所述的改良株生产L-苹果酸的方法，包括将非转基因的里氏木霉改良株接种液体培养基中发酵培养，获取L-苹果酸。
优选的是，所述液体发酵培养基包括如下浓度的组分：碳源50-100g/L，蛋白胨6g/L，KH2PO4 0.15g/L，K2HPO4 0.15g/L，CaCl2·2H2O 0.10g/L，MgSO4·7H2O 0.10g/L，碳酸钙40-80g/L，NaCl 0.05g/L和1mL/L微量元素液；所述微量元素溶液包括以下质量的组分：1.6g MnSO4·4H2O,5g FeSO4·7H2O，2g CoCl2·6H2O，1.4g ZnSO4·7H2O，用水溶解并定容至1L；所述碳源包括甘油、葡萄糖、木糖、糖化淀粉、纤维素或者纤维素水解液中任一种。
本发明还提供所述的改良株，或所述的方法在生产L-苹果酸中的应用。
本发明还提供所述的改良株，或所述的方法在制备非转基因食品中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以里氏木霉菌为出发菌株，通过非转基因的基因组定向分子改造，过表达内源的四碳二元羧酸转运蛋白、和/或丙酮酸羧化酶、和/或苹果酸脱氢酶、和/或苹果酸酶、和/或葡萄糖转运蛋白基因，使原先不具备L-苹果酸生产能力的里氏木霉，改造为可以高效生产L-苹果酸的工程菌株，避免转基因安全性问题。本发明获得的改良后的工程菌株不携带转基因成分，不含有任何外源基因序列，不含有抗性筛选标记，能以甘油、葡萄糖、木糖、糖化淀粉、纤维素或纤维素水解液等常见碳源为基础，直接发酵生产大量的L-苹果酸，其最高产量可达90g/L。改良株属于非转基因物种，其生产的L-苹果酸属于非转基因食品。本发明为微生物发酵来源的L-苹果酸提供了非转基因的新方法，也为转基因安全和无标记基因编辑提供了一个很好的研究思路，可应用于L-苹果酸的工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中表达载体和工程菌株构建流程图；A：pOEtrmae1/2/3/4表达载体及其工程菌株Trmalic01和TrmalicW01；B：pOEtrpyc表达载体及其工程菌株Trmalic02和TrmalicW02；C：pOEtrmdh1/2表达载体及其工程菌株Trmalic03；D：pOEtrme1/2/表达载体及其工程菌株Trmalic04；E：pOEtrhxt1/3表达载体及其工程菌株Trmalic05和TrmalicW05；
图2为本发明中以葡萄糖为碳源时，不同基因工程菌株的L-苹果酸产量；
图3为本发明中以甘油、木糖、糖化淀粉、纤维素、纤维素水解液为碳源时，非转基因工程菌TrmalicW05的L-苹果酸产量。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1基因工程菌的L-苹果酸发酵
1、球磨纤维素悬浊液
在500mL体积的三角瓶中，加入20g微晶纤维素，200ml去离子水，加入直径为0.5-1cm的玻璃珠(铺平底部为宜)，灭菌(121℃，20min)。用橡皮袋扎紧瓶口，以免水分挥发，再放入摇床中，200rpm摇10-15天后，取出，再灭菌一次(115℃，20min)。制成10％的球磨纤维素悬浊液。
2、糖化淀粉溶液
将0.5g氯化钙溶解于60℃的1kg热水中，然后加入1kg玉米淀粉，再加入0.5g的高温ɑ-淀粉酶(商业酶，宁夏夏盛实业集团有限公司)制成面糊，并将此面糊的pH调节至6.0。随后在97-98℃下保持1.5h，然后降温至60-62℃，将pH调节至4.0，加入0.8mL的葡萄糖淀粉酶(商业酶，宁夏夏盛实业集团有限公司)，在60-62℃保持27-28h。加入蒸馏水定容至2.5L，随后再115℃湿热灭菌30min，即获得含糖量约为400g/L的糖化淀粉溶液。
3、纤维素水解液
经过碱预处理的干玉米秸秆中含有62.6％的纤维素，21.4％的半纤维素和8.2％的木质素。纤维素水解实验可在摇瓶中进行，以预处理的玉米秸秆作为底物，底物的装载量为15％(150g秸秆干物质/反应总体积为1L)。加入两种酶水解纤维素：纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶(商业酶，宁夏夏盛实业集团有限公司)的装载量为20FPU/g干生物质；β-葡萄糖苷酶(商业酶，宁夏夏盛实业集团有限公司)的装载量为40CBU/g干生物质。将反应摇瓶置于50℃(100rpm)，pH 5.0反应96h。反应结束后，离心去除不溶物，上清水解液最终的葡萄糖浓度使用葡萄糖氧化酶法测定试剂盒分析。根据测量值加入适量的无菌水稀释至最终葡萄糖浓度为80g/L，随后再115℃湿热灭菌30min，即为纤维素水解液。
4、发酵培养基
表1发酵培养基
Figure BDA0003639773460000051
Figure BDA0003639773460000061
分装27.5mL于250mL摇瓶中，115℃灭菌30min。接种前加入12.5mL浓度为400g/L的甘油、葡萄糖、木糖、或糖化淀粉溶液，加入10mL浓度为400g/L的CaCO3悬浊液至CaCO3终浓度为80g/L。微量元素配方(1000mL)：1.6g MnSO4·4H2O，5g FeSO4·7H2O，2g CoCl2·6H2O，1.4g ZnSO4·7H2O，溶于水中，定容至1L。
5、纤维素发酵培养基
表2纤维素发酵培养基
Figure BDA0003639773460000062
分装45mL于250mL摇瓶中，115℃灭菌30min。接种前加入5mL浓度为400g/L的CaCO3悬浊液，至CaCO3终浓度为40g/L无菌CaCO3悬浊液。
6、纤维素水解液发酵培养基
表3纤维素水解液发酵培养基
Figure BDA0003639773460000063
Figure BDA0003639773460000071
分装13.75mL于250mL摇瓶中，115℃灭菌30min。接种前加入31.25mL的纤维素水解液，加入5mL的400g/L的CaCO3悬浊液，至CaCO3终浓度为40g/L无菌CaCO3悬浊液。
7、基因工程菌的L-苹果酸发酵
将基因工程菌接种至250mL三角瓶中的50mL以甘油、葡萄糖、木糖、糖化淀粉、纤维素或者纤维素水解液为碳源的上述发酵培养基中。接种量为108个孢子/50mL培养基，28℃，220rpm培养，第八天取样测定L-苹果酸含量。
8、L-苹果酸含量测定
发酵液样品于离心管中，加入1倍体积的2mol/L H2SO4，放入80℃，100rpm的水浴摇床震荡30min，将发酵液与管壁上的水珠混匀后，取1mL液体于1.5mL离心管中，14000×g离心30min，吸取上清，测定L-苹果酸含量。
处理后的样品用高效液相色谱(HPLC)测定L-苹果酸含量：流动相：5mM H2SO4；流速：0.6mL/min；柱温：35℃；检测器：紫外检测器；波长：210nm；柱子：AmineX HPX-87X，(300mm×7.8mm)。
实施例2在里氏木霉中过表达自身的四碳二元羧酸转运蛋白编码基因
通过同源比对鉴定出里氏木霉菌内源的四碳二元羧酸转运蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13所示序列的基因。
1、内源的四碳二元羧酸转运蛋白编码基因过表达载体pOEtrmae1的构建
1)利用引物Trmae1-F1和Trmae1-F2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trmae1的上游序列Trmae1-F；
Trmae1-F1：5’-ATTACGAATTCTTAATTAAGGACGAGGCATCGTATGTTGAT-3’；
Trmae1-F2：5’-CATTATACGAAGTTATTCTAGAGTGACATCGCCAGAGAAGGT-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trmae1-F1/Trmae1-F2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃25sec，运行30个循环；68℃5min。
Trmae1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2)利用引物pdc-F和pdc-R，以里氏木霉基因组为模板扩增启动子Ppdc序列；
pdc-F：5’-CTAGTGAGCTCATTTGAAAGGAGGGAGCATTCTTCGA-3’；
pdc-R：5’-CATGATTGTGCTGTAGCTGCG-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物pdc-F/pdc-R各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃45sec，运行30个循环；68℃5min。
Ppdc的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3)利用引物Trmae1-1和Trmae1-2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trmae1部分基因序列Trmae1-O；
Trmae1-1：5’-AGCTACAGCACAATCATGAAAGCGGCATTCCCTCATG-3’；
Trmae1-2：5’-AGTGCCAAGCTTATTTAGACAACAGCAATGACGGCAAT-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trmae1-1/Trmae1-2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃45sec，运行30个循环；68℃5min。
Trmae1-O的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
Trmae1完整基因序列为Trmae1-OC如SEQ ID NO：4所示。
4)以LML2.0a(Zhang et al.Light-inducible genetic engineering andcontrol of non-homologous end-joining in industrial eukaryoticmicroorganisms:LML 3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761)为骨架构建表达载体，在已有质粒LML2.0a上的限制性内切酶PacI/XbaI进行双酶切，利用Vazyme OneStep Clone Kit进行无缝连接，连入上游序列Trmae1-F；用SwaI进行单酶切，利用VazymeOne Step Clone Kit进行无缝连接，连入启动子Ppdc和部分基因序列Trmae1-O；构建出Trmae1的过表达质粒pOEtrmae1(图1A)。
2、自身的四碳二元羧酸转运蛋白编码基因过表达载体pOEtrmae2的构建
1)利用引物Trmae2-F1和Trmae2-F2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trmae2的上游序列序列Trmae2-F；
Trmae2-F1：5’-ATTACGAATTCTTAATTAATGCTGCTCGGTGTCTGCTA-3’；
Trmae2-F2：5’-CATTATACGAAGTTATTCTAGAGGAGGTTGTGAAGAAGGATTGC-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trmae2-F1/Trmae2-F2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃25sec，运行30个循环；68℃5min。
Trmae2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
2)利用引物Trmae2-1和Trmae2-2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trmae2部分基因序列Trmae2-O；
Trmae2-1：5’-AGCTACAGCACAATCATGGGTACCGGTATCGTTGCAATC-3’；
Trmae2-2：5’-AGTGCCAAGCTTATTTGCCAAGAGCAACCACAATCCAT-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trmae2-1/Trmae2-2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃35sec，运行30个循环；68℃5min。
Trmae2-O的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
Trmae2完整基因序列为Trmae2-OC如SEQ ID NO：7所示。
3)以LML2.0a(Zhang et al.Light-inducible genetic engineering andcontrol of non-homologous end-joining in industrial eukaryoticmicroorganisms:LML 3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761)为骨架构建表达载体，在已有质粒LML2.0a上的限制性内切酶PacI/XbaI进行双酶切，利用Vazyme OneStep Clone Kit进行无缝连接，连入上游序列Trmae2-F；用SwaI进行单酶切，利用VazymeOne Step Clone Kit进行无缝连接，连入启动子Ppdc和部分基因序列Trmae2-O；构建出Trmae2的过表达质粒pOEtrmae2(图1A)。
3、自身的四碳二元羧酸转运蛋白编码基因过表达载体pOEtrmae3的构建
1)利用引物Trmae3-F1和Trmae3-F2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trmae3的上游序列序列Trmae3-F；
Trmae3-F1：5’-ATTACGAATTCTTAATTAACCGTAACAAGGCATGTGAATTGA-3’；Trmae3-F2：5’-CATTATACGAAGTTATTCTAGAACCAGTGCTATGATTGTCCGAAT-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trmae3-F1/Trmae3-F2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃25sec，运行30个循环；68℃5min。
Trmae3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
2)利用引物Trmae3-1和Trmae3-2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trmae3部分基因序列Trmae3-O；
Trmae3-1：5’-AGCTACAGCACAATCATGGCATCAACAACAGCCCTG-3’；
Trmae3-2：5’-AGTGCCAAGCTTATTTGGAGCAGGCGAAGATCATCATG-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trmae3-1/Trmae3-2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃30sec，运行30个循环；68℃5min。
Trmae3-O的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
Trmae3完整基因序列为Trmae3-OC如SEQ ID NO：10所示。
3)以LML2.0a(Zhang et al.Light-inducible genetic engineering andcontrol of non-homologous end-joining in industrial eukaryoticmicroorganisms:LML 3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761)为骨架构建表达载体，在已有质粒LML2.0a上的限制性内切酶PacI/XbaI进行双酶切，利用Vazyme OneStep Clone Kit进行无缝连接，连入上游序列Trmae3-F；用SwaI进行单酶切，利用VazymeOne Step Clone Kit进行无缝连接，连入启动子Ppdc和部分基因序列Trmae3-O；构建出Trmae3的过表达质粒pOEtrmae3(图1A)。
4、自身的四碳二元羧酸转运蛋白编码基因过表达载体pOEtrmae4的构建
1)利用引物Trmae4-F1和Trmae4-F2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trmae4的上游序列Trmae4-F；
Trmae4-F1：5’-ATTACGAATTCTTAATTAAGCTCATAGGTATGCTCGCATCA-3’；
Trmae4-F2：5’-CATTATACGAAGTTATTCTAGATGCAGGAGGAGGATCTGGCT-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trmae4-F1/Trmae4-F2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，56℃30sec，68℃20sec，运行30个循环；68℃5min。
Trmae4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
2)利用引物Trmae4-1和Trmae4-2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trmae4部分基因序列Trmae4-O；
Trmae4-1：5’-AGCTACAGCACAATCATGGCCGCCCCTCACCGT-3’；
Trmae4-2：5’-AGTGCCAAGCTTATTTGAGACATGCGTCAAGACAGGA-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trmae4-1/Trmae4-2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，57℃30sec，68℃25sec，运行30个循环；68℃5min。
Trmae4-O的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
Trmae4完整基因序列为Trmae4-OC如SEQ ID NO：13所示。
3)以LML2.0a(Zhang et al.Light-inducible genetic engineering andcontrol of non-homologous end-joining in industrial eukaryoticmicroorganisms:LML 3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761)为骨架构建表达载体，在已有质粒LML2.0a上的限制性内切酶PacI/XbaI进行双酶切，利用Vazyme OneStep Clone Kit进行无缝连接，连入上游序列Trmae4-F；用SwaI进行单酶切，利用VazymeOne Step Clone Kit进行无缝连接，连入启动子Ppdc和部分基因序列Trmae4-O；构建出Trmae4的过表达质粒pOEtrmae4(图1A)。
5、将表达载体pOEtrmae1～pOEtrmae4导入里氏木霉，获得四碳二元羧酸转运蛋白质编码基因过表达菌株
本发明所述表达，是农杆菌介导里氏木霉转化及克隆筛选，将里氏木霉内源基因整合到里氏木霉基因组进行表达。本发明所述转化方法为根瘤农杆菌介导的结合转移。
1)将表达质粒pOEtrmae1～pOEtrmae4分别电转至农杆菌，然后将含有表达质粒的农杆菌分别与里氏木霉宿主菌株QM6a(ATCC 13631)，QM9414(ATCC 26921)，Rut-C30(ATCC56765)，RL-P37(NRRL 15709)，NG14(ATCC 56767)，PC-3-7(ATCC66589)在IM平板(Covertet al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Fusariumcircinatum.Mycol.Res.105(3):259-264)共培养，进行根瘤农杆菌介导的结合转移，共培养两天后将转化子转接于含有头孢噻肟(300μg/mL)和潮霉素B(75μg/mL)的PDA平板中进行筛选，直至转化子长出菌丝和孢子，然后进行验证。
2)将上述转化子接种至250mL三角瓶中的50mL以葡萄糖为碳源的发酵培养基(见实施例1)中，接种量为108个孢子/50mL培养基，28-30℃，200rpm培养，第8天取样测定L-苹果酸含量，来验证其生物学功能。
3)四碳二元羧酸转运蛋白质可以将苹果酸转运出细胞外。因此，四碳二元羧酸转运蛋白质在里氏木霉菌株中大量表达后，菌株能在发酵液中显著积累L-苹果酸。其中产量最高的转化株命名为Trmalic01，葡萄糖为碳源时L-苹果酸产量可超过50g/L。
4)筛选标记缺失：选取Trmalic01菌株进行筛选标记缺失。所述筛选标记缺失方法为：将获得的阳性重组里氏木霉菌株接种于木糖土豆液体培养基(含20g/L木糖，100g/L土豆，无琼脂)中诱导抗性基因缺失，28℃、200rpm摇床培养48h后，挑取少量菌丝点到木糖土豆固体培养基(含20g/L木糖，100g/L土豆，20g/L琼脂)平板上，在28℃下培养5-7天，收集孢子。孢子按浓度梯度稀释至木糖土豆固体培养基平板上。28℃下培养48h，选择合适的孢子浓度，使里氏木霉菌株可以单克隆的形式，从木糖土豆固体培养基平板上长出。挑取有里氏木霉单克隆菌株的琼脂块于葡萄糖土豆固体培养基(含20g/L葡萄糖，100g/L土豆，20g/L琼脂)平板上，28℃下培养24h，使琼脂块中的真菌菌丝蔓延到平板上。再挑取此琼脂块至有抗性的葡萄糖土豆培养基(含20g/L葡萄糖，100g/L土豆，20g/L琼脂，150μg/ml潮霉素和150μg/ml头孢霉素)，28℃下培养48h，验证抗性缺失是否成功：若不能在抗性土豆培养基中生长，说明抗性发生缺失。挑取琼脂块后的土豆平板，继续在28℃下培养4-6天，让蔓延出来的菌丝充分生长，并生产出孢子，收集抗性缺失菌株的孢子。该菌株即为无抗性标记的菌株TrmalicW01，葡萄糖为碳源时其L-苹果酸产量也可达到56.3g/L(图2)。
实施例3在里氏木霉菌株TrmalicW01中过表达自身的丙酮酸羧化酶编码基因
实施例3的实验是在实施例2基础上，以实施例2的工程菌株TrmalicW01为出发菌株，继续定向优化改良。通过同源比对鉴定出里氏木霉菌内源的丙酮酸羧化酶的编码基因包括如SEQ ID NO：17所示序列的基因。
1、自身的丙酮酸羧化酶编码基因过表达载体pOEtrpyc的构建
1)利用引物Trpyc-F1和Trpyc-F2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trpyc的上游序列序列Trpyc-F；
Trpyc-F1：5’-ATTACGAATTCTTAATTAAATGAGGTACGGCACGAGTGT-3’；
Trpyc-F2：5’-CATTATACGAAGTTATTCTAGAGCAAACGGAAAGCAAAGCAAGA-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trpyc-F1/Trpyc-F2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃25sec，运行30个循环；68℃5min。
Trpyc-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。
2)利用引物eno-F和eno-R，以里氏木霉基因组为模板扩增启动子Peno序列；
eno-F：5’-CTAGTGAGCTCATTTTGATTCCGTCCTGGATTGCC-3’；
eno-R：5’-TTTGAAGCTATTTCAGGTGGCTG-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物eno-F/eno-R各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃45sec，运行30个循环；68℃5min。
Peno的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
3)利用引物Trpyc-1和Trpyc-2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trpyc部分基因序列Trpyc-O；
Trpyc-1：5’-CCTGAAATAGCTTCAAAATGGCTGGCACTCCGGTTC-3’；
Trpyc-2：5’-AGTGCCAAGCTTATTTGGCGAGATAAGCTCCGACAGG-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trpyc-1/Trpyc-2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃30sec，运行30个循环；68℃5min。
Trpyc-O的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
Trpyc完整基因序列为Trpyc-OC如SEQ ID NO：17所示。
5)以LML2.0a(Zhang et al.Light-inducible genetic engineering andcontrol of non-homologous end-joining in industrial eukaryoticmicroorganisms:LML 3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761)为骨架构建表达载体，在已有质粒LML2.0a上的限制性内切酶PacI/XbaI进行双酶切，利用Vazyme OneStep Clone Kit进行无缝连接，连入上游序列Trpyc-F；用SwaI进行单酶切，利用VazymeOne Step Clone Kit进行无缝连接，连入启动子Peno和部分基因序列Trpyc-O；构建出Trpyc的过表达质粒pOEtrpyc(图1B)。
2、将表达载体pOEtrtrpyc导入里氏木霉TrmalicW01，获得丙酮酸羧化酶基因过表达菌株
本发明所述表达，是农杆菌介导里氏木霉转化及克隆筛选，将相关的里氏木霉内源基因整合到里氏木霉基因组进行表达。本发明所述转化方法为根瘤农杆菌介导的结合转移。
1)将表达质粒pOEtrtrpyc分别电转至农杆菌，然后将含有表达质粒pOEtrtrpyc的农杆菌与里氏木霉TrmalicW01在IM平板(Covert et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Fusarium circinatum.Mycol.Res.105(3):259-264)共培养，进行根瘤农杆菌介导的结合转移，共培养两天后将转化子转接于含有头孢噻肟(300μg/mL)和潮霉素B(75μg/mL)的PDA平板中进行筛选，直至转化子长出菌丝和孢子，然后进行验证。
2)将上述转化子接种至250mL三角瓶中的50mL以葡萄糖为碳源的发酵培养基(见实施例1)中，接种量为108个孢子/50mL培养基，28-30℃，200rpm培养，第8天取样测定L-苹果酸含量，来验证其生物学功能。
3)丙酮酸羧化酶负责将丙酮酸羧化为草酰乙酸，而草酰乙酸是L-苹果酸的前提。因此，丙酮酸羧化酶大量表达后，菌株能在发酵液中显著积累更多的L-苹果酸。实验发现，与实施例2中的TrmalicW01相比，绝大多数转化子生产L-苹果酸能力显著提高，其中产量最高的转化株命名为Trmalic02，葡萄糖为碳源时L-苹果酸产量可超过70g/L。
4)筛选标记缺失：选取Trmalic02菌株进行筛选标记缺失。所述筛选标记缺失方法同实施例2中TrmalicW01的筛选方法。经筛选得到的无抗性标记的菌株TrmalicW02，葡萄糖为碳源时其L-苹果酸产量也可达到77.4g/L(图2)，比实施例2中的TrmalicW01提高了37％。
实施例4在里氏木霉TrmalicW02中过表达自身的苹果酸脱氢酶编码基因
实施例4的实验是在实施例3基础上，以实施例3的工程菌株TrmalicW02为出发菌株，继续定向优化改良。通过同源比对鉴定出里氏木霉菌内源的苹果酸脱氢酶的编码基因包括如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：23所示序列的基因。
1、自身的苹果酸脱氢酶编码基因过表达载体pOEtrmdh1的构建
1)利用引物Trmdh1-F1和Trmdh1-F2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trmdh1的上游序列序列Trmdh1-F；
Trmdh1-F1：5’-ATTACGAATTCTTAATTAAGGAGCAATTCACAGCACCAATG-3’；
Trmdh1-F2：5’-CATTATACGAAGTTATTCTAGAAGACGGATTGGAGACGATGGT-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trmdh1-F1/Trmdh1-F2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，56℃30sec，68℃25sec，运行30个循环；68℃5min。
Trmdh1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。
2)利用引物Trmdh1-1和Trmdh1-2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trmdh1部分基因序列Trmdh1-O；
Trmdh1-1：5’-AGCTACAGCACAATCATGTTCGCCGCTCGAATCCA-3’；
Trmdh1-2：5’-AGTGCCAAGCTTATTTGGTGGTTGCTCTGGCTGAAGA-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trmdh1-1/Trmdh1-2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃30sec，运行30个循环；68℃5min。
Trmdh1-O的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。
Trmdh1完整基因序列为Trmdh1-OC如SEQ ID NO：20所示。
3)以LML2.0a(Zhang et al.Light-inducible genetic engineering andcontrol of non-homologous end-joining in industrial eukaryoticmicroorganisms:LML 3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761)为骨架构建表达载体，在已有质粒LML2.0a上的限制性内切酶PacI/XbaI进行双酶切，利用Vazyme OneStep Clone Kit进行无缝连接，连入上游序列Trmdh1-F；用SwaI进行单酶切，利用VazymeOne Step Clone Kit进行无缝连接，连入启动子Ppdc(实施例2)和部分基因序列Trmdh1-O；构建出Trmdh1的过表达质粒pOEtrmdh1(图1C)。
2、自身的苹果酸脱氢酶编码基因过表达载体pOEtrmdh2的构建
1)利用引物Trmdh2-F1和Trmdh2-F2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trmdh2的上游序列序列Trmdh2-F；
Trmdh2-F1：5’-ATTACGAATTCTTAATTAACACAAGCCTTTGGAAACCATCC-3’；
Trmdh2-F2：5’-CATTATACGAAGTTATTCTAGAAGGAGAAGCAAGCAGAGGAGAG-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trmdh2-F1/Trmdh2-F2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，56℃30sec，68℃25sec，运行30个循环；68℃5min。
Trmdh2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示。
2)利用引物Trmdh2-1和Trmdh2-2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trmdh2部分基因序列Trmdh2-O；
Trmdh2-1：5’-AGCTACAGCACAATCATGGTCAAAGCAGGTATGTCTCAA-3’；
Trmdh2-2：5’-AGTGCCAAGCTTATTTGGCGTTGATGTTGAAGAGGTC-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trmdh2-1/Trmdh2-2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃30sec，运行30个循环；68℃5min。
Trmdh2-O的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示。
Trmdh2完整基因序列为Trmdh2-OC如SEQ ID NO：23所示。
3)以LML2.0a(Zhang et al.Light-inducible genetic engineering andcontrol of non-homologous end-joining in industrial eukaryoticmicroorganisms:LML 3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761)为骨架构建表达载体，在已有质粒LML2.0a上的限制性内切酶PacI/XbaI进行双酶切，利用Vazyme OneStep Clone Kit进行无缝连接，连入上游序列Trmdh2-F；用SwaI进行单酶切，利用VazymeOne Step Clone Kit进行无缝连接，连入启动子Ppdc(实施例2)和部分基因序列Trmdh2-O；构建出Trmdh2的过表达质粒pOEtrmdh2(图1C)。
3、将表达载体pOEtrmdh1、pOEtrmdh2导入里氏木霉TrmalicW02，获得苹果酸脱氢酶基因过表达菌株
本发明所述表达，是农杆菌介导里氏木霉转化及克隆筛选，将里氏木霉内源基因整合到里氏木霉基因组进行表达。本发明所述转化方法为根瘤农杆菌介导的结合转移。
1)将表达质粒pOEtrmdh1、pOEtrmdh2分别电转至农杆菌，然后将含有表达质粒的农杆菌分别与里氏木霉TrmalicW02在IM平板(Covert et al.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of Fusarium circinatum.Mycol.Res.105(3):259-264)共培养，进行根瘤农杆菌介导的结合转移，共培养两天后将转化子转接于含有头孢噻肟(300μg/mL)和潮霉素B(75μg/mL)的PDA平板中进行筛选，直至转化子长出菌丝和孢子，然后进行验证。
2)将上述转化子接种至250mL三角瓶中的50mL以葡萄糖为碳源的发酵培养基(见实施例1)中，接种量为108个孢子/50mL培养基，28-30℃，200rpm培养，第8天取样测定L-苹果酸含量，来验证其生物学功能。
3)苹果酸脱氢酶可以将草酰乙酸还原成L-苹果酸。因此，苹果酸脱氢酶在里氏木霉菌株中大量表达后，可能会增加L-苹果酸的产量。其中产量最高的转化株命名为Trmalic03，葡萄糖为碳源时L-苹果酸产量为75.9g/L(图2)，与出发菌株TrmalicW02差异不大。
实施例5在里氏木霉TrmalicW02中过表达自身的苹果酸酶编码基因
实施例5的实验是在实施例3基础上，以实施例3的工程菌株TrmalicW02为出发菌株，继续定向优化改良。通过同源比对鉴定出里氏木霉菌内源的苹果酸酶的编码基因包括如SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：29所示序列的基因。
1、自身的苹果酸酶编码基因过表达载体pOEtrme1的构建
1)利用引物Trme1-F1和Trme1-F2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trme1的上游序列Trme1-F；
Trme1-F1：5’-ATTACGAATTCTTAATTAACTTCTGTCTGCCAATCTTGAGC-3’；
Trme1-F2：5’-CATTATACGAAGTTATTCTAGAATCAGCCTGCGACTGGAAATG-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trme1-F1/Trme1-F2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，56℃30sec，68℃25sec，运行30个循环；68℃5min。
Trme1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示。
2)利用引物Trme1-1和Trme1-2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trme1部分基因序列Trme1-O；
Trme1-1：5’-AGCTACAGCACAATCATGAAGTTGGCGTCCCTTGAC-3’；
Trme1-2：5’-AGTGCCAAGCTTATTTAACGCCATTGACGCCAAGG-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trme1-1/Trme1-2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃25sec，运行30个循环；68℃5min。
Trme1-O的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。
Trme1完整基因序列为Trme1-OC如SEQ ID NO：26所示。
4)以LML2.0a(Zhang et al.Light-inducible genetic engineering andcontrol of non-homologous end-joining in industrial eukaryoticmicroorganisms:LML 3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761)为骨架构建表达载体，在已有质粒LML2.0a上的限制性内切酶PacI/XbaI进行双酶切，利用Vazyme OneStep Clone Kit进行无缝连接，连入上游序列Trme1-F；用SwaI进行单酶切，利用VazymeOne Step Clone Kit进行无缝连接，连入启动子Ppdc(实施例2)和部分基因序列Trme1-O；构建出Trme1的过表达质粒pOEtrme1(图1D)。
2、自身的苹果酸脱氢酶编码基因过表达载体pOEtrme2的构建
1)利用引物Trme2-F1和Trme2-F2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trme2的上游序列序列Trme2-F；
Trme2-F1：5’-ATTACGAATTCTTAATTAAGCCATCATAGTCCGTGTCGATT-3’；
Trme2-F2：5’-CATTATACGAAGTTATTCTAGAAGGAGGATGAGGAGCGAGGTT-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trme2-F1/Trme2-F2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，56℃30sec，68℃25sec，运行30个循环；68℃5min。
Trme2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示。
2)利用引物Trme2-1和Trme2-2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trme2部分基因序列Trme2-O；
Trme2-1：5’-AGCTACAGCACAATCATGTCTTCTAGCAAGCCCACCA-3’；
Trme2-2：5’-AGTGCCAAGCTTATTTGTTGTCTGTGCCGCAGTCTAG-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trme2-1/Trme2-2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，56℃30sec，68℃25sec，运行30个循环；68℃5min。
Trme2-O的核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示。
Trme2完整基因序列为Trme2-OC如SEQ ID NO：29所示。
3)以LML2.0a(Zhang et al.Light-inducible genetic engineering andcontrol of non-homologous end-joining in industrial eukaryoticmicroorganisms:LML 3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761)为骨架构建表达载体，在已有质粒LML2.0a上的限制性内切酶PacI/XbaI进行双酶切，利用Vazyme OneStep Clone Kit进行无缝连接，连入上游序列Trme2-F；用SwaI进行单酶切，利用VazymeOne Step Clone Kit进行无缝连接，连入启动子Ppdc(实施例2)和部分基因序列Trme2-O；构建出Trme2的过表达质粒pOEtrme2(图1D)。
3、将表达载体pOEtrme1、pOEtrme2导入里氏木霉TrmalicW02，获得苹果酸酶基因过表达菌株
本发明所述表达，是农杆菌介导里氏木霉转化及克隆筛选，将里氏木霉内源基因整合到里氏木霉基因组进行表达。本发明所述转化方法为根瘤农杆菌介导的结合转移。
1)将表达质粒pOEtrme1、pOEtrme2分别电转至农杆菌，然后将含有表达质粒的农杆菌分别与里氏木霉TrmalicW02在IM平板(Covert et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Fusarium circinatum.Mycol.Res.105(3):259-264)共培养，进行根瘤农杆菌介导的结合转移，共培养两天后将转化子转接于含有头孢噻肟(300μg/mL)和潮霉素B(75μg/mL)的PDA平板中进行筛选，直至转化子长出菌丝和孢子，然后进行验证。
2)将上述转化子接种至250mL三角瓶中的50mL以葡萄糖为碳源的发酵培养基(见实施例1)中，接种量为108个孢子/50mL培养基，28-30℃，200rpm培养，第8天取样测定L-苹果酸含量，来验证其生物学功能。
3)苹果酸酶可以将丙酮酸直接羧化并还原成L-苹果酸。因此，苹果酸酶在里氏木霉菌株中大量表达后，可能会增加L-苹果酸的产量。其中产量最高的转化株命名为Trmalic04，葡萄糖为碳源时L-苹果酸产量为65.9g/L(图2)，与出发菌株TrmalicW02项次轻微下降。
实施例6在里氏木霉TrmalicW02中过表达自身的葡萄糖转运蛋白质编码基因
实施例6的实验是在实施例3基础上，以实施例3的工程菌株TrmalicW02为出发菌株，继续定向优化改良。通过同源比对鉴定出里氏木霉菌内源的葡萄糖转运蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35所示序列的基因。
1、自身的葡萄糖转运蛋白质编码基因过表达载体pOEtrhxt1的构建
1)利用引物Trhxt1-F1和Trhxt1-F2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trhxt1的上游序列Trhxt1-F；
Trhxt1-F1：5’-ATTACGAATTCTTAATTAACGGCATTGCGTGTTGAAGAA-3’；
Trhxt1-F2：5’-CATTATACGAAGTTATTCTAGAAACTGGTGGATGTGATGAGGAG-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trhxt1-F1/Trhxt1-F2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，55℃30sec，68℃25sec，运行30个循环；68℃5min。
Trhxt1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示。
2)利用引物Trhxt1-1和Trhxt1-2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trhxt1部分基因序列Trhxt1-O；
Trhxt1-1：5’-AGCTACAGCACAATCATGGGATTCTTGAACAAAAAAGCCG-3’；
Trhxt1-2：5’-AGTGCCAAGCTTATTTCGCTCTCCTCGTCAATCTTGG-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trhxt1-1/Trhxt1-2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，57℃30sec，68℃30sec，运行30个循环；68℃5min。
Trhxt1-O的核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示。
Trhxt1完整基因序列为Trhxt1-OC如SEQ ID NO：32所示。
以LML2.0a(Zhang et al.Light-inducible genetic engineering and controlof non-homologous end-joining in industrial eukaryotic microorganisms:LML3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761)为骨架构建表达载体，在已有质粒LML2.0a上的限制性内切酶PacI/XbaI进行双酶切，利用Vazyme One Step Clone Kit进行无缝连接，连入上游序列Trhxt1-F；用SwaI进行单酶切，利用Vazyme One Step Clone Kit进行无缝连接，连入启动子Ppdc(实施例2)和部分基因序列Trhxt1-O；构建出Trhxt1的过表达质粒pOEtrhxt1(图1E)。
2、自身的葡萄糖转运蛋白质编码基因过表达载体pOEtrhxt3的构建
1)利用引物Trhxt3-F1和Trhxt3-F2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trhxt3的上游序列Trhxt3-F；
Trhxt3-F1：5’-ATTACGAATTCTTAATTAACCATCTCCATCCCTCCATCCT-3’；
Trhxt3-F2：5’-CATTATACGAAGTTATTCTAGAGTTGGCTGCTCTCGAAGACTCA-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trhxt3-F1/Trhxt3-F2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃25sec，运行30个循环；68℃5min。
Trhxt3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示。
2)利用引物Trhxt3-1和Trhxt3-2，以里氏木霉基因组为模板扩增Trhxt3部分基因序列Trhxt3-O；
Trhxt3-1：5’-AGCTACAGCACAATCATGGCGGGCGACACCTCG-3’；
Trhxt3-2：5’-AGTGCCAAGCTTATTTGACTCAGGGACAAGAGGTAGCAGG-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；10μM引物Trhxt3-1/Trhxt3-2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，60℃30sec，68℃30sec，运行30个循环；68℃5min。
Trhxt3-O的核苷酸序列如SEQ ID NO：34所示。
Trhxt3完整基因序列为Trhxt3-OC如SEQ ID NO：35所示。
3)以LML2.0a(Zhang et al.Light-inducible genetic engineering andcontrol of non-homologous end-joining in industrial eukaryoticmicroorganisms:LML 3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761)为骨架构建表达载体，在已有质粒LML2.0a上的限制性内切酶PacI/XbaI进行双酶切，利用Vazyme OneStep Clone Kit进行无缝连接，连入上游序列Trhxt3-F；用SwaI进行单酶切，利用VazymeOne Step Clone Kit进行无缝连接，连入启动子Ppdc(实施例2)和部分基因序列Trhxt3-O；构建出Trhxt3的过表达质粒pOEtrhxt3(图1E)。
3、将表达载体pOEtrhxt1、pOEtrhxt3导入里氏木霉TrmalicW02，获得葡萄糖转运蛋白质基因过表达菌株
本发明所述表达，是农杆菌介导里氏木霉转化及克隆筛选，将里氏木霉内源基因整合到里氏木霉基因组进行表达。本发明所述转化方法为根瘤农杆菌介导的结合转移。
1)将表达质粒pOEtrhxt1、pOEtrhxt3分别电转至农杆菌，然后将含有表达质粒的农杆菌分别与里氏木霉TrmalicW02在IM平板(Covert et al.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of Fusarium circinatum.Mycol.Res.105(3):259-264)共培养，进行根瘤农杆菌介导的结合转移，共培养两天后将转化子转接于含有头孢噻肟(300μg/mL)和潮霉素B(75μg/mL)的PDA平板中进行筛选，直至转化子长出菌丝和孢子，然后进行验证。
2)将上述转化子接种至250mL三角瓶中的50mL以葡萄糖为碳源的发酵培养基(见实施例1)中，接种量为108个孢子/50mL培养基，28-30℃，200rpm培养，第8天取样测定L-苹果酸含量，来验证其生物学功能。
3)葡萄糖转运蛋白可以将发酵液中的葡萄糖转运进入细胞内。葡萄糖是微生物生长的碳源，也是L-苹果酸合成的前体物。因此，葡萄糖转运蛋白在里氏木霉菌株中大量表达后，可能会增加L-苹果酸的产量。实验发现，与实施例3中的TrmalicW02相比，绝大多数转化子生产L-苹果酸能力显著提高，其中产量最高的转化株命名为Trmalic05，葡萄糖为碳源时L-苹果酸产量超过85g/L。
4)筛选标记缺失：选取Trmalic05菌株进行筛选标记缺失。所述筛选标记缺失方法同实施例3TrmalicW02的筛选方法。筛选得到的菌株即为无抗性标记、非转基因的改良菌株TrmalicW05，葡萄糖为碳源时其L-苹果酸产量也可达到90.4g/L(图2)，比实施例3中的TrmalicW02提高了17％。
实施例7在里氏木霉TrmalicW05在不同碳源条件下发酵生产L-苹果酸
将工程菌株TrmalicW05接种至250mL三角瓶中的50mL以甘油、木糖、糖化淀粉、纤维素、纤维素水解液等常见碳源的发酵培养基(见实施例1)中，接种量为108个孢子/50mL培养基，28-30℃(该温度范围内能得到相同的效果)，200rpm培养，第8天取样测定L-苹果酸含量，来验证其代谢水平。
工程菌株TrmalicW05能发酵利用甘油、木糖、糖化淀粉、纤维素、纤维素水解液，生产L-苹果酸(图3)。实验说明工程菌株TrmalicW05可以利用多种碳源进行L-苹果酸发酵。
经过上述实施例可见，本发明经过非转基因的里氏木霉定向基因改良方法，成功构建了高产L-苹果酸的非转基因的改良株。本发明的研究成果是首次表明非转基因的里氏木霉，能以葡萄糖、木糖、甘油、糖化淀粉、纤维素或纤维素水解液等常见碳源，直接发酵生产L-苹果酸，其最高产量可达90g/L。改良株属于非转基因物种，其生产的L-苹果酸属于非转基因食品，避免了转基因涉及的安全性和政策的限制性等问题。并且实验证实了非转基因的里氏木霉工程菌株发酵生产苹果酸的潜力，为苹果酸的工业化生产提供了优良的菌株，也为微生物发酵来源的L-苹果酸提供了非转基因的新方法，也为非转基因操作和无标记基因编辑提供了一个很好的研究思路。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 王玮
<120> 一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 737
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggacgaggca tcgtatgttg atactgctgc agagacgccc tcgggcggaa taaccgacgt 60
agcttttgtt ctggagacct gacaaaacgc atcgaactca tcgaatggga gacacctatt 120
ttcttagcca tgagacggat ggaccttgat tgcgacgtct gagcttttgc tgcaactctc 180
ttgagtcaga ccctctgtgc gcagcacatc tccattcgcc atctgcccgt tctttgcttg 240
tcccttcgaa gggggccacc ggatgtcagg gagctgccgg gggggtaaga gagagggcaa 300
gggtcttgaa tttcgtcaaa gtggcccaag agcaaacaga ccccggggtg gagagagatt 360
gtgcgcagca ggagtagtac ttagatatga aaggtcctcg aacggtggcc gagggcttgt 420
tcgaaggaag tgtctaaaca gaacaaaaaa acaaaagtct tttcttccaa tttccattct 480
agacattcct ttgatgagct ctcgtttgat actgctctga gacttttttg tttgacttat 540
acttgccgct ttagctgggc tctctcacag cacatacccg tccaaggaaa cagttttgct 600
tttcgatacc ccctgataga atcgaccaca actacaagaa aaagatgacg agaccatttg 660
gtcctatgga cgacagcgat gttgaaaggg gacacctcgt atccagccac acgcgaacct 720
tctctggcga tgtcact 737
<210> 2
<211> 1303
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaaggaggg agcattcttc gacttgcggc aattgcatgc acatgtacga ttggaagcgc 60
gggcgatgta ttcgcaatca tgtttagaag gacggcgttt ggaaacgttg ggatgctgtt 120
gaagcgttgg aaacaggggc aattagaaac accgagccag acagagtcaa tggtacgagg 180
tcagccagta tcatgacctg tgtgcgcatg gtggcgagag attccgagcc atgccacggg 240
agacgagcaa tgaaaaaact cttcactcac ttgtcgaggc tctctcaacc tatcgactta 300
tcaagtagac gatgaaagcc ttgcaactgt ggtgatgtgg ctcatcaatg tgcgacgtcg 360
tatccatgtc tgaggccatt cgatatcgtg atgcgactac ctagtaaagc ccggccagag 420
ggcaaaccgg ggcgacaggg gcaggcaatt gaccggatgg ctgcatgtgc cgaagcagcc 480
ccgatggaat cgagatgtct gtcggatgga ccgctgagcg gcctggcaag gtgtcccaga 540
tacgaagatg gaagtgaagt cagaggtggt cgttaattgt ccgacgagcg aatcggccgc 600
tccttcggat tgccggctct gctgtatgta ccgtgcatga agccacccgg gatccatgtt 660
acgatggata ggttccaact ctctagtagc tatagtggac ctgaggctat ctagtatcac 720
tggaggagca gccgtccact atcgtcgagc gctgtagaag cagctgcatt agcggctgcc 780
cacccgcgca gaaatggccc cattacatca ctatcatgac agcggcgcgt ccaaaagtga 840
gctcatgctt gccgatggca cgagcagctg caactggcgg ggctcctgcc tgccgtctcc 900
ggtgccgctg cccatttgag tttgtccgag ctgttgatgg ttgaaaccga gaccgatgga 960
tgattcaaca cttcgaagtc taggtagata aaaaacatct atatatcctc attcattgcc 1020
ctgtcagtgt gttggctcac gtctccaatc ctccgcccct cctcctgcaa agtaaatacc 1080
ttctcaaaac acgtctggaa tcctgcaagt ctccatcaca aggagcttct tcatcaacca 1140
ccttatacga gcaacatcat ttgcatcatc gttgatccac atctcctcgc gcctcagagt 1200
gtcgtcacca gtataaataa ccgcatcaag ctctcgtcct tcttcgttcc acaatccaag 1260
aagcacctca aaacgatcaa agcagcgcag ctacagcaca atc 1303
<210> 3
<211> 901
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaaagcgg cattccctca tgccgtcgac ataaacgacc cgaaccgacc aaagcttcct 60
atccgacaga ggcttcagca cttcacatgg gcgtggtaca ctctgcccat gagcacgggg 120
ggtctctccc tgctcatcta cgcacagcca taccagttcg cgggcgaaag ggtgattggc 180
ttagtcgtat acattatcaa cctcatcatc ttttccttgg tgacaatggc catgatggct 240
cgcttcttcc tacacgccgg agagtttgtc cggtccatca ctcatccccg tgaaggcttc 300
ttcgtcccca cattcttcct gtctctggcc accatcatca cgagcacgca gcgttatgcc 360
ataccggacg accatccgat actggaacct gccgtcaaga ttgcattctg ggtgtacgtc 420
gccctgacgg cggttctagc cctgggccag tacagctacg tctttgcggc ccataacctc 480
agcctcaaga ccttcatgcc aaccttgatt ctgcccatct tccccatcat gctttcagga 540
accattgcat ccgtcatcgc gggcacgcag cccgagttcg atgcgatgcc catcctagtc 600
gccggcctca cctgccaggg cctcggcatg tctgtggcca tcctcatgta cgcccacatg 660
attgggcgcc tgctccagtt cggcctgccc aaccgggagc atcgacccgg tctcttcatg 720
tgcgtcggtc cgccggcatt taccgccttg gccctggtcg gcatggccaa cggcgtgcct 780
gagggcatca gcgagctggg catcgacaag agcgtcatcc aggtcgtggc tatcctcgtc 840
gccgtgttcc tgtgggcgct gagcttctgg tggtttggca ttgccgtcat tgctgttgtc 900
t 901
<210> 4
<211> 1143
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaaagcgg cattccctca tgccgtcgac ataaacgacc cgaaccgacc aaagcttcct 60
atccgacaga ggcttcagca cttcacatgg gcgtggtaca ctctgcccat gagcacgggg 120
ggtctctccc tgctcatcta cgcacagcca taccagttcg cgggcgaaag ggtgattggc 180
ttagtcgtat acattatcaa cctcatcatc ttttccttgg tgacaatggc catgatggct 240
cgcttcttcc tacacgccgg agagtttgtc cggtccatca ctcatccccg tgaaggcttc 300
ttcgtcccca cattcttcct gtctctggcc accatcatca cgagcacgca gcgttatgcc 360
ataccggacg accatccgat actggaacct gccgtcaaga ttgcattctg ggtgtacgtc 420
gccctgacgg cggttctagc cctgggccag tacagctacg tctttgcggc ccataacctc 480
agcctcaaga ccttcatgcc aaccttgatt ctgcccatct tccccatcat gctttcagga 540
accattgcat ccgtcatcgc gggcacgcag cccgagttcg atgcgatgcc catcctagtc 600
gccggcctca cctgccaggg cctcggcatg tctgtggcca tcctcatgta cgcccacatg 660
attgggcgcc tgctccagtt cggcctgccc aaccgggagc atcgacccgg tctcttcatg 720
tgcgtcggtc cgccggcatt taccgccttg gccctggtcg gcatggccaa cggcgtgcct 780
gagggcatca gcgagctggg catcgacaag agcgtcatcc aggtcgtggc tatcctcgtc 840
gccgtgttcc tgtgggcgct gagcttctgg tggtttggca ttgccgtcat tgctgttgtc 900
tcgtcgccgc caaagtattt ccatctgggc tggtgggcca tggtgtttcc caacacgggc 960
tttacgctgg cgacgatttc cattgccaag gagttgctta gtcctagtct gcagtgggtt 1020
actattggta tgagctgctg catctttacc atcttcatct ttgtctttgt gaaccatgtt 1080
cgtgctgtga tcatccagga catcatgtat ccgggacgag atgagaatgt ggaggatcac 1140
tga 1143
<210> 5
<211> 780
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgctgctcgg tgtctgctat ggcaatccac gattgagtct cattggctct tggacatggc 60
tgatgggctt tcttcaacga agtgacggac ccttttacca aacacggagc tcgagatgac 120
ttgtagtacg gcgggtgtca agaggagtcg agtaagtcaa gcgatctgga ccgagaatgt 180
tccacttacc tagtcaggga ttgcgagcct acgatgttgc agtttgacgc tatatgccgg 240
catatatata tattccttca atcgcgtttg acgttggctg tacttcgatg ttctggccta 300
gaatcctttg gtcgcctcaa cgtactacct ctctttgcgc cgacgctctc ttcatgtccc 360
ggtagatcgg aaccgccatg ctgtcatccg cgggaggagc atcgtctgct gttgatgcga 420
tcggcgctac atctgtctcg aggcatgccg cggagaacat cgtcgcctct ttgacgactt 480
tgtcaccgcc acaagaggat gacgcaacag atccagcagc aaaggttctg cagaacgaag 540
tagacataga agatgtggac tcgacttctc tccagaagcg cgagaagaat atatggattg 600
tcgtccgcgc attcactccg gcgtaagttc ttgttctaga tatccatcat tacactgtct 660
gtcgatgttc tggcgaaaga atacggttga gttcctttct ggacttgtgt ctaaagcctc 720
ttaggtggtt tacaatcaat atgggtaccg gtatcgttgc aatccttctt cacaacctcc 780
<210> 6
<211> 1183
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgggtaccg gtatcgttgc aatccttctt cacaacctcc catataacgg aacctggtta 60
tactggatct cgatcgtcct tttcgttcta aatatagcgc tttttgttct tttcacattg 120
atatccgcgc tccgatactt tgcatatcca gggctgttta tgactatgat tcggcatcct 180
gctgtacctc tgctcctggg agccttcccg attgccctct gcacaatcat tgagatgatt 240
gtcttggtct gcgtgcccgc atggggtgag tgggcggtta ctctggtaag tcctagtgta 300
cgatggcaac aaaacgaata tactgacttt cgtcaatagg catgggcgct gtggtggatt 360
gacgtagcta tatccattgt catttcctac gttatcccat tcattatgtg agtgacctag 420
acggtcatga ggaatcttct caactaatag caccttcagt atgcatgtcc atcatgtaga 480
gctggccacg ctttctgcaa cctggcttct ccccgtcgcc gctgccatcg tcgcgtctgc 540
catcggcgcc gtcgttgccg gagccctcga aaatgaacag catgctcttt ggactctcat 600
cacatcctac ttcctatggg gcaccgcaat gccactgtcg ttcacttgct tggtcattta 660
ctttcaacgc ctctcaatgc acagcctacc gccgcctgaa gccatcgtct ccatgttctt 720
acccgtggcg ccccttggcc agggcggatt tgcaattata cagctgggga aggtcgctgc 780
cgaggtgttt ccaaagactg agactttggg aaagatgggc actcattctg gagagatatt 840
gtacgttgtg ggctggatag ttgggtttat catgtgggca aatggcctgg catggatttt 900
ctttgcgctg gccagcatca gtcgacgcag gtttcccttc aacattggct ggtggggatt 960
tacttttcct cttggtgtat gggctggtgc aacgattgcg attgggcagg aaatgccatc 1020
tcgattcttc aatgttctgg gaacagtaag ttgtgccttt gctttctccg ggcaactcaa 1080
ttcgtggtat tggttataga gagacgtata cgagagctaa ccgatgcgca tatagattgc 1140
cgcgatcatt gtcatgcttc tatggattgt ggttgctctt ggc 1183
<210> 7
<211> 1276
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgggtaccg gtatcgttgc aatccttctt cacaacctcc catataacgg aacctggtta 60
tactggatct cgatcgtcct tttcgttcta aatatagcgc tttttgttct tttcacattg 120
atatccgcgc tccgatactt tgcatatcca gggctgttta tgactatgat tcggcatcct 180
gctgtacctc tgctcctggg agccttcccg attgccctct gcacaatcat tgagatgatt 240
gtcttggtct gcgtgcccgc atggggtgag tgggcggtta ctctggtaag tcctagtgta 300
cgatggcaac aaaacgaata tactgacttt cgtcaatagg catgggcgct gtggtggatt 360
gacgtagcta tatccattgt catttcctac gttatcccat tcattatgtg agtgacctag 420
acggtcatga ggaatcttct caactaatag caccttcagt atgcatgtcc atcatgtaga 480
gctggccacg ctttctgcaa cctggcttct ccccgtcgcc gctgccatcg tcgcgtctgc 540
catcggcgcc gtcgttgccg gagccctcga aaatgaacag catgctcttt ggactctcat 600
cacatcctac ttcctatggg gcaccgcaat gccactgtcg ttcacttgct tggtcattta 660
ctttcaacgc ctctcaatgc acagcctacc gccgcctgaa gccatcgtct ccatgttctt 720
acccgtggcg ccccttggcc agggcggatt tgcaattata cagctgggga aggtcgctgc 780
cgaggtgttt ccaaagactg agactttggg aaagatgggc actcattctg gagagatatt 840
gtacgttgtg ggctggatag ttgggtttat catgtgggca aatggcctgg catggatttt 900
ctttgcgctg gccagcatca gtcgacgcag gtttcccttc aacattggct ggtggggatt 960
tacttttcct cttggtgtat gggctggtgc aacgattgcg attgggcagg aaatgccatc 1020
tcgattcttc aatgttctgg gaacagtaag ttgtgccttt gctttctccg ggcaactcaa 1080
ttcgtggtat tggttataga gagacgtata cgagagctaa ccgatgcgca tatagattgc 1140
cgcgatcatt gtcatgcttc tatggattgt ggttgctctt ggcacgatac ggaaagtgat 1200
agatggcaag atattcacag caccggattt tgaacaatgg aataaggata agcgtagagc 1260
cttggagtcg gcctga 1276
<210> 8
<211> 788
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgtaacaag gcatgtgaat tgatgcaagg cagattaggg gggggaatga atcacatcaa 60
agaagacagc aagctgcatg taatctatcg ccaggaaagt tggggagttg ccaatggacg 120
aggcagtttt gctgcataca tacacatagg tatcaagatg tgcaggacag acagccaatc 180
attttcagct tcgaacattc tacatattac ctaccgaaca acaactgggg acagaaatcg 240
aaagccacat gagagctgaa aggaagccgt tggtctagca gaactactag tagtagcagg 300
cttagatcgg cctgcagcca gtgcatcacc cgagaagcgg aactggaatg ccaacggctg 360
caaaaaaaaa aaaaaaaaag agacgagaaa aaaaatacta atgtttggcc ttgatacgag 420
gcgcaatgac tcaagggtgc ttttctaaca ccagcttttt ctctctctta ttataccggc 480
aatcggcgta cgttccgtcg catatagttc taggcctttc ctccttgtaa gctggagaaa 540
agaacttgca ggcttgctca ccccctttcg gctcagcctt tccgagcgac actacgccaa 600
cgatttattt tgccctgccg gtgtggacgg acatgggatc aacgtcatag tgcccgaatc 660
ccgagaaagc cacttcttgt ctatataaat cgagagagag agagatctag tcacagtctt 720
ttcacgatat acagggacaa cctccagact ctgaccaagt agtcaattcg gacaatcata 780
gcactggt 788
<210> 9
<211> 821
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggcatcaa caacagccct gcctccagac agccagatgt caaccgagaa gccgccaaac 60
ccttccgatg acgacgacgg cagcagcagc gatccggatg ctcaggatcc catacaaaac 120
agcaacgaca acaacaacaa caacaatagc agcaacaatg ctccgaattc ttgtccgtca 180
agaaagccct gcaaaaacaa tcgcggctgg cggaaaatcg tccgcaactt tacaccatcg 240
tatgccgtcc catacacaca cccttcttcc ctttcttcat ctacacactc ctcttcctct 300
ctcatcatcc tctttttttt tttctaccta ataccattcc atcttatatg tgtacctatg 360
tactgacggt cttatataga tggttcgcca taaacatggg cacgggcatc gtctccatcc 420
tgctcttcaa cctcccctgg aacggctact ggctgcacgt catctcgtac atcttcttcg 480
ccctcaacgt cctcctcttc gtcatcttct gcatcatctc cttcttgaga tacacgctgt 540
accctgagat ctggcccgcc atgatttcgc atccggccca atccctgttc ctgggttgct 600
tccccatggg ctttgcaagt aagctacatc tctccctcac ttctcccccc ttattcctct 660
tccccatcat ctcccagata tatctcctct cttttctcct ccctactata tcgcatcata 720
catcatctta tacatcatct cccctccatc tccatcatca caacaaacag ctaattcgtt 780
cccccccagc aatcatcaac atgatgatct tcgcctgctc c 821
<210> 10
<211> 1741
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggcatcaa caacagccct gcctccagac agccagatgt caaccgagaa gccgccaaac 60
ccttccgatg acgacgacgg cagcagcagc gatccggatg ctcaggatcc catacaaaac 120
agcaacgaca acaacaacaa caacaatagc agcaacaatg ctccgaattc ttgtccgtca 180
agaaagccct gcaaaaacaa tcgcggctgg cggaaaatcg tccgcaactt tacaccatcg 240
tatgccgtcc catacacaca cccttcttcc ctttcttcat ctacacactc ctcttcctct 300
ctcatcatcc tctttttttt tttctaccta ataccattcc atcttatatg tgtacctatg 360
tactgacggt cttatataga tggttcgcca taaacatggg cacgggcatc gtctccatcc 420
tgctcttcaa cctcccctgg aacggctact ggctgcacgt catctcgtac atcttcttcg 480
ccctcaacgt cctcctcttc gtcatcttct gcatcatctc cttcttgaga tacacgctgt 540
accctgagat ctggcccgcc atgatttcgc atccggccca atccctgttc ctgggttgct 600
tccccatggg ctttgcaagt aagctacatc tctccctcac ttctcccccc ttattcctct 660
tccccatcat ctcccagata tatctcctct cttttctcct ccctactata tcgcatcata 720
catcatctta tacatcatct cccctccatc tccatcatca caacaaacag ctaattcgtt 780
cccccccagc aatcatcaac atgatgatct tcgcctgctc ccactggggc cccggcctca 840
tctacctcgc ctgggcattc tggtggctcg acgcaatcat ctccatggcg acctgcatct 900
ccatgccctt catcgtcatg caccgccacc gcccaggcct cgacaagacc accgccaccc 960
tcctcctccc catcgtcccg gccgtcgtcg ccgccgcaac aggcggcatc gtcgccgacg 1020
ccctgccctc gcccggccac gcctacgcca ccctcgtcgt ctcctacgcc ctctggggca 1080
tcggccaggc cctctccggc tgcgtcctcg ccctctactt ccaccgcctc accatccact 1140
ccctgccccc gcgcgacgtc atcgtctccg tcttcctccc catcggtccc ctcggccagg 1200
gcggcttcgg catccagcag ctcggcaagg tcgccctcaa ggtcgtgccc cagacggcca 1260
tgtttcgcgt ctccggcgtc gatgccgccc gtggagcaga gttcctctac ttcctcggcg 1320
tcttcttcgg catcgtcatg tgggggttcg cgctggcctg ggtctgcttc gcgctcatca 1380
gcttgagaac cacgcgctcg ttccccttca acatgggctg gtgggggttc acgttcccgc 1440
tgggcgtgtg ggcgacgtgt tcgaatgcgc tgtggcagaa tctgagcagc gagtttttca 1500
aatatgtgac aacggtgagc ctttttacca tgatttgcct gaactttttc ggaagagcta 1560
cgtttctaac cccttttccc ccacctcaaa gatcatcagt ctctcggtcg tccttctctg 1620
gatcctcgtc agcctgagga cagttcagct catcattacg ggcgaaatgt tcttcgcccc 1680
gtgcctcaag gatcttcgcg agaaagagga agcatccggc agcgaagacg gggcagtctg 1740
a 1741
<210> 11
<211> 666
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gctcataggt atgctcgcat catttgcaat tcttttcttc tccttccaag gcataaaact 60
acttacctac tatacctatg tctcattgac aaaatgaatc ataaaagggt tctatgacga 120
cagctgcgga atactagcac cagcatttgc cttggcaggt gtcacctcgc ggcaactggc 180
gatgcaaccc gaaacccctg catctctgtc cctcccacca caatccgccg tccaattgct 240
ccctctcctc cagctcacga ctcgccggag ccgagctgct gaccccattc gatgccaaac 300
aaaaaccgga ggactaaaca gaagcgggaa tcgcctctct tttccacctt cgtttcacgt 360
cttttttatc tcgcacttcc gggaccccac cacgactgat taggaatcat tcgctctcca 420
tcggcaccca aaccgctcga accgccgccc tttttcgcct cgcagaccct ctgcagtccc 480
tctgcagtcc ccttttcctc ctccgcattc acggtagcat cagcatccca cggcgtccct 540
ccggcccgag atgcctctgg ccaatctggg gtcgctgctc ctggagaacg ccgtcttcct 600
gattcacctc atctacgtgc acatcgccct cactgatgcc gggcccagcc agatcctcct 660
cctgca 666
<210> 12
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggccgccc ctcaccgtga tgccctggta ggctcttcca ctccgactga cggctacgag 60
tcgcccaccg aggaaaacca gcccgccttc ttcttcggcc caactccgac cgcctctggg 120
gcgacgacgc cggccaggat cccgataaca tgccaggcct cagtagcagc cggcgtcacg 180
ttccttgagc gcgctcaccc gcgtctcggt cgcttgcagc aggcccgtgc tcgccagccc 240
ccaagtcgcg atcccagccc agatggctat cagtcgtcga atgggccgtc caatcttgac 300
gctgtcgttc gagatactga gaagagcagc gtacaccgcc aggttgggct caaagaccgc 360
attgcttgct atcaatggca gttcttcacc atggtaagtt gcaagaggag gggcaggaag 420
cgattcatgc cgttacatga actcgaggca aacgtttcgg accgtcggct caccattccc 480
accagacaat ggcaaccgga ggagtagcca gcgcacttca tggatgtagg atcagccacc 540
tctccctcct ctctcactct cacgatgtat actaacgtga agacaagtgg tctaccaagc 600
cgagtgggtg actggctttg gcattgcctt ctgcctcctc aatattgtgc tcttcctcac 660
caactgcgtc ttgatctcta tgcgattcta tttccgtccc ggaagcctca ccaaatcgtt 720
cacagatcaa gtggaatcct tgttcatacc cgcttttgta agacttggct cactctctct 780
tcgtcctgtc ttgacgcatg tctc 804
<210> 13
<211> 2002
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atggccgccc ctcaccgtga tgccctggta ggctcttcca ctccgactga cggctacgag 60
tcgcccaccg aggaaaacca gcccgccttc ttcttcggcc caactccgac cgcctctggg 120
gcgacgacgc cggccaggat cccgataaca tgccaggcct cagtagcagc cggcgtcacg 180
ttccttgagc gcgctcaccc gcgtctcggt cgcttgcagc aggcccgtgc tcgccagccc 240
ccaagtcgcg atcccagccc agatggctat cagtcgtcga atgggccgtc caatcttgac 300
gctgtcgttc gagatactga gaagagcagc gtacaccgcc aggttgggct caaagaccgc 360
attgcttgct atcaatggca gttcttcacc atggtaagtt gcaagaggag gggcaggaag 420
cgattcatgc cgttacatga actcgaggca aacgtttcgg accgtcggct caccattccc 480
accagacaat ggcaaccgga ggagtagcca gcgcacttca tggatgtagg atcagccacc 540
tctccctcct ctctcactct cacgatgtat actaacgtga agacaagtgg tctaccaagc 600
cgagtgggtg actggctttg gcattgcctt ctgcctcctc aatattgtgc tcttcctcac 660
caactgcgtc ttgatctcta tgcgattcta tttccgtccc ggaagcctca ccaaatcgtt 720
cacagatcaa gtggaatcct tgttcatacc cgcttttgta agacttggct cactctctct 780
tcgtcctgtc ttgacgcatg tctcattaac tgaccattcc ttgacagttt gtgtcgtaag 840
tttgtccatt gttctccatt cttcgagacg aacttctcat acattgccag cattgccgtc 900
atcctcacca acatatgcca gtatggcgct ccgcattgtg gtgtttggct cctcaagacc 960
ttgcaaatcc tgttctggat atacacagga ctgagcgcgg ctgccagcgc tggcctgtat 1020
ctcatcctgt ggtcaacctt gtaagttgcg tcttcggttc gtcaacctcg tgcctatgct 1080
tatgcaacaa tagggtgttc ccaatccata tgatgacgcc gacctgggtt ttccctgcat 1140
atccgctcat gctcacggct ccgtttgccg gtaacctcat tgcggcggcc tccgccactg 1200
gtcgtatcga cgtgttgtat gctccagcgg ttgctctatc agctgttgcc actcaaggca 1260
cgggatgttt gatatctctc atgatatcgt ccgctttcat ttataggctg atgacacaga 1320
aactaccccg ggacttccaa cggcctggtg ttgtaggtct ttcccgagag gctttgcacc 1380
cagttttcgc gtcaaacaac taaccatgcc tgttagttca tctcgattgg accctacgct 1440
ttcactgctg cgtcaattgg taagtatatg ctgcctcact tctcagacca tggatgatca 1500
agcaattcta actcgcactg aagcacaact cggaagtcaa gccaatgtta tcctcccctc 1560
gggtttcctc ggcacagtac acggtgccga catcatcaag gtcatttcca ttcttgtagc 1620
cctttggctg tacggccttt ccacgtggtt tttcctggtt tctgtcggat cactatggaa 1680
gtatgtccgg acgggaaagg gcatgccatt ccagatgact tggtggtcat ttgtatttcc 1740
caatacggct ctcgtaagca tcttaacaac aacccctgtc acttcccatg atcaccttgc 1800
ctaatcattt actcacgtct tctcctcctg tctttaggtc agcgcaaccg aaatcatggg 1860
gaccattttc gagagccggg gcctgcagct gtttggatgc gccatgacga ttgctcttgt 1920
cattgcgtgg gttagcatct ttgcgacgat gattgtttgc atcaggcaga agaagctgct 1980
ttggccaaag accaaagcat aa 2002
<210> 14
<211> 760
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgaggtacg gcacgagtgt cccgcttgat gtcatggtat ataatacaca atataaagca 60
catcttgcta ctactagcac atgcaagcac taccttgcca tggccaacgt cagtgtcacc 120
gtggaccttg aggggtgtcg agtgcgtgag gagcgctgct gagtcgggga tcctgcttcc 180
agcttctccg gctgatactt gatgcttgga tttatcgtga tttgccagcc ctgtgccgtg 240
acagacttgc tccgccttcg acgtctggtg ctttcttcag ttgatgcctg cgctgtttct 300
tgtccaaggg ctgaaagttc ccaagttcca tgatggctga tactagtaca cggtacatgt 360
acaccatgcg accacactca caacaccaac agcgtcgtac cagtaccttg tgtcattcgt 420
ccctcctgcc cgtccgctgc aactcagcgt cacaagcgct ggaagctttg acttccgggc 480
tgcaagaacc ccacccccca ccttctgcag caccccgcca gccattgatt cctgcccccc 540
cgcccctcca aacagccccg aaaccgtggg ccgagctccc ctgttctgtt ctgtgctgct 600
cgtacctctt aaaaggcagc cgatccggcc atttctctgt ctcgagctct cccctctgtg 660
ctgagctgct ctcctttttc cctccctctc ttgtctctcc atatccccta cgtcttcgag 720
ccagtatccc ttattctatc ttgctttgct ttccgtttgc 760
<210> 15
<211> 1490
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgattccgtc ctggattgcc aactccttga cgccaaacgg cccgatagaa ttgccctgcc 60
cctgatcgct cgacagcctt gccggccatc gtaagcatag gcacaagatt cgaaccgatc 120
tcgcttctcc ctctagttct gtcgaggctt gatcatgccc tcctgcacga tgtagtaaac 180
gacggtagag tcattgtgca gcgcagcgag gacaatgcgc ttcgcccgct tgcgagcctc 240
cggaagggcg tccatgacgg cggcgaggct ggacagcgtc cacttctcgg cgagatggac 300
ggccagcacc cattcgtact cggcgtcgtg ctgcgccctt gtccctgttg acttttcata 360
tgcaagcgct gctatctggt cgtcggggtg gagatacaga aggcgtggcg ggaggccgcg 420
gatcattggc cgcgacaggc ctgggaggcg atggatttgc agcgaggccc attggtgctg 480
ctcttgcagg ttctcaaata ccgcagaggc gacatcggcc gcgaactgat gtgacgcatc 540
catggggggg gggaggctca atggacgtgt aggtactacg tataggcagt actatgtagg 600
aagtaagaca aatgacgaga gaatgagaag cgagaagcga gcgggatcag aaatggtcgc 660
aatgatatta caaagcgctg cgtctttcgt ccatgatctt cttcgtatct taggtatctg 720
cccgcatcag gccaagcggc cgctgcgtcg cgatagaaac tttttcgctg agaggccgga 780
gaaataggac tagcgtttct cgctgtctac cgattcacgt aacccggcag gcaagtggcc 840
caattattac ctcacaagca ccccagctgc gcctgccctg ccggttgaga gctccgtttc 900
tcgttaggta acttgcagtg ctaatccagt tatctgcgag ggaaggcatg acttgcccca 960
cccgtctcgc tctctctgga cccctccatt tctctcgaca acaaaaacac catccttctt 1020
ccttttccct ccccaagatt ctctcgactt gctcaatcac gcctcacagc aagagcctga 1080
gacactcaat ccatttctcc actacaggta cggtgcctcc ctttacttga tctctacaag 1140
aggcagacct tgttctctgt cgtccaagct tctgcccctc tttcccgttt cagccttccc 1200
agctacccct ccatttgggg gggcagagct gctgaaagac gcggcgtctg gcggaacgtg 1260
ttgaggcata ttctcaatat acttgtttcg ctcctctggc tggattttgc tatccgcggg 1320
agctcttgta taccagagga atgatgcatt gccatcgaac ttggctccgt catctcgcgc 1380
gggcttcact ttcgatgtcg tgatcgccca gctacctacc tcccgagata gcttcgaata 1440
cacctgctaa cagacattgg gtccatccag ccacctgaaa tagcttcaaa 1490
<210> 16
<211> 847
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atggctggca ctccggttcc tcaccctcag cagacgctga ccttcaacga cgtcttcgag 60
gacgacgacg tcgacgagcc caaggagaag cagaccatcc accacatccg cgccaactcc 120
agcatcatgc agctcaagaa gatcctgggt gagttcagct cggcctcggc agtgtctcgc 180
cggcgccaat tggcgctctt gtcaggcgag aggagagtgg gaaactgttt actgacatgc 240
tggccgctgc gctgaatagt tgccaaccgt ggtgaaatcc gtgagtccta ctaccaaaat 300
cccccaccat ggctcttgtc gcgacatgct cttgctaacg cccctcgcag ccatcagagt 360
acgttgaaca gagaccgagt cgtttcccgc tccgccgcag cagcgacaca ttgcgatacc 420
ctgctaacgc gcccttgtcg catcgcgcat agattttcag aacagtcagt cttgcccctc 480
tctgcccgcc gctgccgacc tcgcgcagcc tggtcgatcc aaagcttacc cctcctcgca 540
ggcccacgaa ctgtcattac acacaatcgc tgtcttcagg taaatggatg ctgtcatccc 600
gctgaaataa cgtttagcca gtccttaggg cgcagggcta acttttggtt tttttttctg 660
cccagctatg aggaccggct gtcgatgcat cgccagagta agattgaagc aatcatcaat 720
agattcctta tcacatgcac cccgcggcaa gacccagcac tgacagcgct ttttttgctc 780
agaggccgac gaagcctacg tcattggcaa gcgaggccag tacacccctg tcggagctta 840
tctcgcc 847
<210> 17
<211> 4390
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atggctggca ctccggttcc tcaccctcag cagacgctga ccttcaacga cgtcttcgag 60
gacgacgacg tcgacgagcc caaggagaag cagaccatcc accacatccg cgccaactcc 120
agcatcatgc agctcaagaa gatcctgggt gagttcagct cggcctcggc agtgtctcgc 180
cggcgccaat tggcgctctt gtcaggcgag aggagagtgg gaaactgttt actgacatgc 240
tggccgctgc gctgaatagt tgccaaccgt ggtgaaatcc gtgagtccta ctaccaaaat 300
cccccaccat ggctcttgtc gcgacatgct cttgctaacg cccctcgcag ccatcagagt 360
acgttgaaca gagaccgagt cgtttcccgc tccgccgcag cagcgacaca ttgcgatacc 420
ctgctaacgc gcccttgtcg catcgcgcat agattttcag aacagtcagt cttgcccctc 480
tctgcccgcc gctgccgacc tcgcgcagcc tggtcgatcc aaagcttacc cctcctcgca 540
ggcccacgaa ctgtcattac acacaatcgc tgtcttcagg taaatggatg ctgtcatccc 600
gctgaaataa cgtttagcca gtccttaggg cgcagggcta acttttggtt tttttttctg 660
cccagctatg aggaccggct gtcgatgcat cgccagagta agattgaagc aatcatcaat 720
agattcctta tcacatgcac cccgcggcaa gacccagcac tgacagcgct ttttttgctc 780
agaggccgac gaagcctacg tcattggcaa gcgaggccag tacacccctg tcggagctta 840
tctcgccggc gacgagatca tcaagattgc tgttgagcac ggcgctcagc tggttcaccc 900
tggtgagttg gactttgctg tcatatttca attttgatat cacacgcgag gtgagagaat 960
tgttgctaat ctcgctaggc tacggtttcc tgtccgagaa cgccgagttc gcacgcaatg 1020
tcgaaaaggc cggcctgatt gtaagtcctc ggccagcgtc ggagacccta gcatgctagc 1080
atcccttggc ccggctaaca ttgatgccct ccagttcgtc ggccccactg ccgatgttat 1140
tgatgccctt ggtgacaagg tctcggctcg caagcttgcc attgccgccg gcgtccccgt 1200
cgtccccggt accgagggtg ccgttgagac ctttgaggag gtcaagggct tcaccgacaa 1260
gtatggcttc cccgtcatca tcaaggccgc ctacggtggc ggtggccgtg gcatgcgagt 1320
tgtgcgcgac gccgagagcc tcaaggagag ctttgagcga gccacttccg aggccaagac 1380
tgccttcggc aacggcaccg tcttcgtcga gcggttcctc gacaagccca agcacatcga 1440
ggtccagttg ctcggcgaca accacggcaa catcgtccac ctgtacgagc gtgactgctc 1500
cgttcagcgc cgacaccaga aggtggtcga gattgctccc gccaaggatc tccctgccga 1560
ggtccgagac gccatcctga acgatgctgt cagactggcc aagtctgtca actaccgcaa 1620
tgcaggcact gccgagttct tggtcgacca gcagaaccgc tactacttca tcgagatcaa 1680
cccccgtatc caggtcgagc ataccatcac cgaggagatt acgggcattg atattgtcgc 1740
cgcccagatc cagattgccg ctggcgcgac tcttgctcag ctcggcctta cccaggatcg 1800
catctccact cgcggctttg ccatccagtg ccgtatcacc accgaggacc ctgctgagaa 1860
cttccgacca gacaccggaa agattgaggt ctaccgatct gccggcggta acggcatccg 1920
tctcgatggt ggtaacggct ttgctggcgc cgtcatcacc ccccactacg actccatgtt 1980
ggtcaagtgc acggtatgtg gctttcgtct tgccgacatt gttgtccggc aaaggcatat 2040
atactaacag cgaataggcg catggcagca catacgaaat cgctcgcaga aaggtcctcc 2100
gtgcccttat cgagttccgt atccgcggtg tcaagaccaa cattcccttc ctggcttctc 2160
tcctgacgca ccctaccttt atcgatggaa actgctggac aaccttcatc gacgataccc 2220
cgcagctgtt cgacctcgtc ggcggccaga accgcgctca gaagctgctg gcctacctcg 2280
cagacgttgc cgtcaacggc agctccatca agggccagat tggcgagccc aagttcaagg 2340
gcgagatcat tcctccggaa ctcttcaact ccgccggcga gaagattgac gtcagcaagc 2400
cctgcgagaa gggttggagg aagatcatcc ttgagcaggg ccccaaggcc ttcgccaagg 2460
ctgttcgcga gtacaagggc tgccttctca tggacaccac ctggcgagat gcccaccagt 2520
ctctgctggc cacccgagtc cgaaccattg acctcctcgg catcgctaag gaaacgagcc 2580
acgccctctc caacctctac agtttggagt gctggggtgg tgccaccttt gacgttgcgc 2640
tgaggttcct ccacgaggat tcgttcgacc gactgcgcaa gctgagggcg ctggtgccca 2700
acatcccctt ccagatgctg ctccgtggag ccaacggtgt ggcctactct tcgctgcccg 2760
acaatgctat tgaacatttc gtcgagcagg ccaagaagaa cggcgtcgac atcttccgag 2820
tgtttgacgc cttgaacgac gtcagccaac tcgaggttgg catcaaggcc gttcacaagg 2880
ctggcggtgt tgtggagggt accgtgtgca tttccggcga catgctcaac cctcacaaga 2940
agtacaacct gccctactac ctggacctgg ttgacaagct cgtcggcctc gacatccacg 3000
tcctgggtat caaggacatg gctggtgtgc tcaagcccca tgcggccaag ctcctgatcg 3060
gatccatccg cgagaagtac cccgatctgc cgattcacgt ccacacccac gactctgccg 3120
gcacgggtgt tgcctccatg gttgcttgcg cccacgctgg tgccgacgcc gtcgatgccg 3180
ccacagacag cctgtctggc atgacttccc agcccagcat caacgccatc ctggcctccc 3240
tggagggtac cgatctggac cccggcctgg atcacaagca ggtccgagcc ttggacacgt 3300
actggcagca gctgcgtctg ctgtactctc cgttcgaggc tcaccttgcc gggcccgacc 3360
ccgaggtgta cgagcacgag attcccggtg gccagttgac caacatgatg ttccaggctt 3420
cgcagctggg tctcggatcg aagtggctcg agaccaagaa ggcctacgaa caggccaacg 3480
acctgcttgg cgatatcgtc aaggtcaccc ccacctccaa ggttgtcggt gaccttgccc 3540
agttcatggt gtccaacaag ctgtcccccg aagacgtcaa ggctcgcgct tccgagctcg 3600
acttccccga gtcagtgctc gagttcttcg agggcctgat gggccaaccc tacggcggct 3660
tccccgagcc tctccgcaca aacgcccttc gtggacgacg gaagctcgac aagcgccctg 3720
gcctctacct cgaacctgtc gactttgtca aggtcaagcg tgaaatgggc aagaagtttg 3780
gcgcgcccgt caccgagtgc gacattgcct cgtacgtcat gtaccccaag gtctttgagg 3840
actacaagaa gatcaccgac gagtttggcg acttgtcggt cctgccgacc aggtacttcc 3900
ttgctcgacc cgagattggt gaggagttta acgtacagct cgagaagggc aaggtcctca 3960
ttctgaagct cctcgctatt ggtcctctga gcgagcagac cggtctccgc gaggtcttct 4020
tcgagatgaa cggtgaggtc cgacaggtca ccgtcgtcga caagaaggct gccgttgaga 4080
acatcagccg ccccaaggct gaccctggcg actccagcca ggtgggcgcc cccatgtctg 4140
gtgtcctggt tgagcttcgc gttcacgaag gctccgaagt gaagaagggc gaccctcttg 4200
ctgttttgtc agccatgaag atggtaagat ctttcatact cgtccttctc agtcaagggc 4260
atgttgctaa cagtcatgac aggaaatggt tatctcagcg cctcacagcg gaaaggttgc 4320
cagtctgcag gtcaaggagg gcgactccgt cgacggctca gacttggtgt gcagaatcac 4380
aaaggcctag 4390
<210> 18
<211> 703
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggagcaattc acagcaccaa tgtctcaaag tgcgctggtc attgcgccga gtgacacttt 60
gcatcatggt ggggctgcaa ttcgagagac cgagggagtg aggcagcgtc acatctcgag 120
ctcctcggtg cactcatgcg tttcccgccc aatggagcac caattgtatg ttttgtaatc 180
atatcgtcca acattacagc cacaagttca ttgctagtcc tagtctcagc aataaggaag 240
gtatcatgac atgccaggct gtgagaccat ccaatgtcat ggaacgtctc ttcttctcat 300
ctcagcccta ctacctacct aggtatgtag acactcccaa gcctcagcaa ggtctatctt 360
tgtcagctgc ccctgcacgg caattatgtg ccaattcgtc cggcaatctc acctcaacgg 420
cggccccacg agacaaatgc cacaaaccat tgacctgctt ccatccggcc ggtccgtctg 480
ttttttgtcg ctgcttgtgc ctggcaatcc tcgttacccg atggcttgga ctggacccgg 540
cggcattaag gcgggcttga ggcttgcacc aaaagcggtt gagccgggaa atcccggact 600
atagccgggg tggtgcctca gccgtgcgca ctttgtcctc tccatacaag aaccggcaac 660
ccaaaccttt tccttgctct gcaccatcgt ctccaatccg tct 703
<210> 19
<211> 900
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atgttcgccg ctcgaatcca gcgcagggcc ttctctgcct ctgcccgcaa cgtaagacct 60
tccccttcta cttcccctcc cccgcctgtc gtcgattctc tcccttcgtc gtcattgccc 120
agcacttcta gctgtaagcc tcatcgtgtg cttgtgctaa ccagcttcgc catttccttc 180
actatagctc tccaaggttg ctgtcctcgg cgctgccggt ggcattggcc agcctctctc 240
tctcctgctc aagctcaaca cccgtgtcac cgagcttgct ctgtacgaca tccgtggcgg 300
acccggtaag ttgctctcca tgatgtcccc ttcatgcgcc aattttcctc tgcgcacttt 360
tccacacccg cccattgctc caacatgacg gcatgacaca atggctaata tgctctctgt 420
cttctctctc tcctcctcca ggtgtcgccg ccgacatctc ccacgtcaac accaagtccc 480
tcgtcaaggg ctatgaggcc actcccagcg gcctcgccgc cgccctcaag ggctccgaca 540
tcgtcctgat ccccgccggc gtcccccgca agcccggcat gacccgtgac gacctcttca 600
acaccaacgc ctccatcgtc cgcgacctgg ccaaggctgt tgccgagtcc gcccccaagg 660
ccaagctgct catcatctcc aaccccgtca actccaccgt ccccatctgc gccgaggtct 720
tcaaggcccg cggcgtctac gaccccaaga agctcttcgg cgtcaccacc ctcgacgtcg 780
tccgcgccag ccgcttcgtc tccgagatca agggcaccga ccccaaggac gagaacatca 840
ccgtcgtcgg cggccactcc ggcgtcacca tcgtccccct cttcagccag agcaaccacc 900
<210> 20
<211> 1280
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atgttcgccg ctcgaatcca gcgcagggcc ttctctgcct ctgcccgcaa cgtaagacct 60
tccccttcta cttcccctcc cccgcctgtc gtcgattctc tcccttcgtc gtcattgccc 120
agcacttcta gctgtaagcc tcatcgtgtg cttgtgctaa ccagcttcgc catttccttc 180
actatagctc tccaaggttg ctgtcctcgg cgctgccggt ggcattggcc agcctctctc 240
tctcctgctc aagctcaaca cccgtgtcac cgagcttgct ctgtacgaca tccgtggcgg 300
acccggtaag ttgctctcca tgatgtcccc ttcatgcgcc aattttcctc tgcgcacttt 360
tccacacccg cccattgctc caacatgacg gcatgacaca atggctaata tgctctctgt 420
cttctctctc tcctcctcca ggtgtcgccg ccgacatctc ccacgtcaac accaagtccc 480
tcgtcaaggg ctatgaggcc actcccagcg gcctcgccgc cgccctcaag ggctccgaca 540
tcgtcctgat ccccgccggc gtcccccgca agcccggcat gacccgtgac gacctcttca 600
acaccaacgc ctccatcgtc cgcgacctgg ccaaggctgt tgccgagtcc gcccccaagg 660
ccaagctgct catcatctcc aaccccgtca actccaccgt ccccatctgc gccgaggtct 720
tcaaggcccg cggcgtctac gaccccaaga agctcttcgg cgtcaccacc ctcgacgtcg 780
tccgcgccag ccgcttcgtc tccgagatca agggcaccga ccccaaggac gagaacatca 840
ccgtcgtcgg cggccactcc ggcgtcacca tcgtccccct cttcagccag agcaaccacc 900
ccgagctctc ctccaacgcc gagctcgtca accgcgtcca gttcggcggt gacgaggtcg 960
tcaaggccaa ggacggcgcc ggctccgcca ccctctccat ggcctttgcc ggtgcccgca 1020
tggccgactc cctcctccgc gccgccgacg gcgagaaggg cgtcatcgag cccacctttg 1080
tcgactctcc cctctacaag gaccagggca tcgacttctt cagcagcaac gtcgagctcg 1140
gccccaacgg cgtcgagaag atccacccca ttggcaagat cgacgccaac gaggagaagc 1200
tcatccaggc ctgcctgggc gacctcaaga agaacattgc caagggcgtc gctttcgtca 1260
acgagaaccc cggcaaataa 1280
<210> 21
<211> 764
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cacaagcctt tggaaaccat ccatggttat cgggatcagc aggccggtcg gaacatgacg 60
gggaacaggg ggtaaacggg gatccgaggt tcatgttatt ttctttctgg cggaggtttg 120
ggtgatattg ctgctgcacc ctttctgagc atgttacagc gtacctgtct cggcctgtag 180
atctgatagc ctagagaggc tttacagaat accaattcct gttatgcaca tgaaatccgg 240
atttccttgt aataccaaag catctagtta ctattctaga ctcccgattg gccaagccca 300
ggctcattcc gcgccagaca agcactcacg agcagtatct gagctacctg agaagagctt 360
gacccaatag cagagaccag acaagcgaga gcacaagcac gtacccaagg agaacaagag 420
ccacctccgt ttaaaccagg aaaaaatccc caacacattt gcatagtcag gtacttgtta 480
acaccttacg agtacagcag tacctgggtt tgtactccag tgagtggagg cacctggtct 540
gagaataata aggcaggtac ctaccaaggt agcgcgattg ccccctttgc agctgggctg 600
ggctggaccg ggcaagagcc atcccgcttc cgtacaagca acgacccctt cccgttctta 660
cgcaatgccc ctcttgcaag aatccctttt gcgcgataga taatcccatc ctctcctcca 720
ttctcccgcc cttggccaac tttctctcct ctgcttgctt ctcc 764
<210> 22
<211> 803
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atggtcaaag caggtatgtc tcaactttcc accagctcag ctcaagaatt gcccctcaac 60
cccgcaccgc cagcgacgag gggcggcagc tgggtgctgt gcgaaacaga gctcgcgtca 120
tcgaggccaa agggcgcaat tgaacagcgg ccgtgatgga ctctcaaaag gctgaccact 180
acgatagttg ttgctggcgc ctctggaggc attggacagg tatgatgccg tacccctctt 240
gcccggatgg gttctcgcaa cccgtctctc ccctggtgtc tcttgtcgct aactctgcgc 300
gtcctttgcc gtcttcgcat agcccttgtc cctgctcctc aagggcagcc ctctcatcga 360
cgagctggct ctgtacgatg ttgtcaacac tcctggtgtt gctgccgacc tctcccacat 420
ctcctctccc gcggtaagct cccagctcca acctcattca tccgtcgcca actccgcatc 480
accgaactac caacagcttg agcttccctt ggcccgacct ctgcaataaa cccccagctc 540
gctaacgacg ctgtggttta atagaaagtt actggctacc tgcccgccaa tgacggtgcc 600
aaggccgctt tcaaggatgc cgacatcatc atcatccccg ctggcattcc ccgtacgtat 660
ccaaggttac acatagtcac tacaggcttc tgcagcctcg gcatgtgatt ggaccctcct 720
gtttgatcat tggctgttaa cactacgatt gctcaacagg caagcctgga atgacccgtg 780
acgacctctt caacatcaac gcc 803
<210> 23
<211> 1673
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atggtcaaag caggtatgtc tcaactttcc accagctcag ctcaagaatt gcccctcaac 60
cccgcaccgc cagcgacgag gggcggcagc tgggtgctgt gcgaaacaga gctcgcgtca 120
tcgaggccaa agggcgcaat tgaacagcgg ccgtgatgga ctctcaaaag gctgaccact 180
acgatagttg ttgctggcgc ctctggaggc attggacagg tatgatgccg tacccctctt 240
gcccggatgg gttctcgcaa cccgtctctc ccctggtgtc tcttgtcgct aactctgcgc 300
gtcctttgcc gtcttcgcat agcccttgtc cctgctcctc aagggcagcc ctctcatcga 360
cgagctggct ctgtacgatg ttgtcaacac tcctggtgtt gctgccgacc tctcccacat 420
ctcctctccc gcggtaagct cccagctcca acctcattca tccgtcgcca actccgcatc 480
accgaactac caacagcttg agcttccctt ggcccgacct ctgcaataaa cccccagctc 540
gctaacgacg ctgtggttta atagaaagtt actggctacc tgcccgccaa tgacggtgcc 600
aaggccgctt tcaaggatgc cgacatcatc atcatccccg ctggcattcc ccgtacgtat 660
ccaaggttac acatagtcac tacaggcttc tgcagcctcg gcatgtgatt ggaccctcct 720
gtttgatcat tggctgttaa cactacgatt gctcaacagg caagcctgga atgacccgtg 780
acgacctctt caacatcaac gccggcatcg tcaagggcct catcgagacc attgccgatg 840
tggcccccaa tgccttcatc ctcgtcatct ccaaccctgt caactccacc gtccccatct 900
ccgccgaggt cctcaaggcc aagaaggtct tcaaccccaa gcgcctcttt ggtgtcacca 960
cgctcgacat tgtccgtgcc gagacctttg tcgccgagat tgttggcgag tctcagcccc 1020
agaagctcac catccccgtt gttggtggcc actctggcga gaccattctg cccctcttca 1080
gcaaggccaa ccctgctgtc aagatcccag acgacaagta cgatgcgctt gtcaaccgcg 1140
tgcagtttgg cggtgacgag gttgtcaagg ccaaggatgg tgctggttcc gccaccctct 1200
ccatggctta tgctggcttc cggtaagact cgccgaggca gttttgtcat ttcaaacttt 1260
atattctgac gtgcgcgcct atagattcgc cgagaagctg ctgcgtgccg ccaagggcga 1320
aaagggcctt gtcgagccca gctacgttta cctgcccggc gtgcccggag gcgaggccat 1380
tgccaaggcc accggtgtcg acttcttctc cgtccccgtg gaacttggcg taagtttcga 1440
cggattctct cccccccccc cccccccccc cccctctccc cccccaaata cttgacttgc 1500
caaagaggcg tgcttggcta acctttacgc agcctgaagg tgtggaaaag gccaccaacc 1560
ccctggaggg tatcaccgag aaggagaagg aactcctggg caaggctgtc gagggcctca 1620
aggccaacat tcagaagggc gtcgactttg cccacaaccc tccccaaaag taa 1673
<210> 24
<211> 709
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cttctgtctg ccaatcttga gctctctttc tttgcatttt ccctctggcc cctggctaca 60
aaccccttcc cccttttgct tgtgcctcac acttgtttcc cccttccacg gccgttttgt 120
cgtctcgtga tgcccatgca gagattggcc tccactgccc tctgaaacga acccgagtct 180
gcccagaccc caaagcactt cagcttcacg tccccttcaa ccccccccct agctccacgt 240
tgtcctgtca tgggtcacca gtcgttagtt ttggcatcac gtcttgcgag cggatctcgt 300
ggagggctgg ggttgttatt gagaaaccgc aaccccatgc tcctccgcag gggccagacg 360
tccatagctg ccgctgctat taaaccattg gcatccgcgc ctacatctgc ctctgcctct 420
gcctctgctt cgagaccagt gtcctcttct cctacaccac atccaagcag tgactcaggt 480
agtcatcctg caacatcttc tttctgcccg ccttcagctt cctcgctgaa caacagccca 540
gctctgcgtc ccccaccaat ggcgtcgagt gcccgcagtg ccgacagctc agatatctct 600
actccccgat caacttcacc ttcgccgtcc ctagcttcgg cccggtcttc ccaccggtcc 660
tcgcgcacct ccgcatccca ccgcgtctcc atttccagtc gcaggctga 709
<210> 25
<211> 733
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atgaagttgg cgtcccttga ccagcaccga ggctacgctc aggaccacta ttccgaggtt 60
aagcaagacc acgagaccga gccaatggag gaatccgagg catccggcta tcaggttatt 120
cgagagccat tgtggaataa aggtaggata actcgcactg cgctttctac tactcttggc 180
tactcttacc ttgaacgctc tacacttacc catattttgc ctttacgact ttcactctag 240
ctcctcctcc cctagacccc ttgtttaccc cgccgcaagc agtcgctaac ttaccgtttc 300
tatcatgaaa ggtctctcat tcacccccga gcaacgcgtt gcaaagaacc taaccggtct 360
cctgccccac gccatggaga gcctcgagac tcaatgtgcc agggccatga aaatgatcca 420
gagccgccag acaaacatag acaagtacct gtatctgtcc accgtcaagg ggcagaacgt 480
ggacctcttc taccgcctgc tcatggacaa catccgcgag ctgatgcccc tcgtctacac 540
ccccaccatc ggtgacgtct gtctgcaata ctccaccctc tacacccgac ccgaagccct 600
ctacatttcg atcaagcagc gcaagtccat ccggaccatg ctgcgcaact ggcccggtcc 660
cgaacccgag atctgcgtcg tcaccgatgg atcgcgaatc ctcggcctgg gtgaccttgg 720
cgtcaatggc gtt 733
<210> 26
<211> 2110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atgaagttgg cgtcccttga ccagcaccga ggctacgctc aggaccacta ttccgaggtt 60
aagcaagacc acgagaccga gccaatggag gaatccgagg catccggcta tcaggttatt 120
cgagagccat tgtggaataa aggtaggata actcgcactg cgctttctac tactcttggc 180
tactcttacc ttgaacgctc tacacttacc catattttgc ctttacgact ttcactctag 240
ctcctcctcc cctagacccc ttgtttaccc cgccgcaagc agtcgctaac ttaccgtttc 300
tatcatgaaa ggtctctcat tcacccccga gcaacgcgtt gcaaagaacc taaccggtct 360
cctgccccac gccatggaga gcctcgagac tcaatgtgcc agggccatga aaatgatcca 420
gagccgccag acaaacatag acaagtacct gtatctgtcc accgtcaagg ggcagaacgt 480
ggacctcttc taccgcctgc tcatggacaa catccgcgag ctgatgcccc tcgtctacac 540
ccccaccatc ggtgacgtct gtctgcaata ctccaccctc tacacccgac ccgaagccct 600
ctacatttcg atcaagcagc gcaagtccat ccggaccatg ctgcgcaact ggcccggtcc 660
cgaacccgag atctgcgtcg tcaccgatgg atcgcgaatc ctcggcctgg gtgaccttgg 720
cgtcaatggc gttggcattt ctgtgagttc gatttttgct ccgtccgtac aacttcgtcg 780
tggagctgtc gactgacgct gccgcagatc ggtaaactgg ccctgtacac agcagctgcc 840
ggcattcacc ccgccaagac gctgcccatc gtcttggata cgggcactaa caatgagagc 900
aacctccgcg acccgttcta cctgggtctg cgccagaagc gagttcctgt cgatgtccag 960
caggacttca tggacgaatt catggctgcc gtaaaggatg tatatcccaa catggtcgtc 1020
cagtttgagg actttgatag tgaaaaggcc ttcaactatc tggatcgata caggcacaat 1080
tacagggcct tcaacgacga tatccagggc accggtgccg ttgtccttgc tgggtgagtg 1140
gatcgcgtcg tttcggaatg tgtttcgtct tcgtcggcat cgagtcgcta acgatcggtg 1200
tagatatatc aacgctgtca acctgtcggg cgttcccctg gcagagcagc gactcgtctt 1260
catgggcgcg ggctcggccg gcgtgggtgt cgctaagcag ctcgtagagt attatacgcg 1320
aagaggcctg tcggagaagg aagcgcgtga caagttctac ctggtggata ccaagggtct 1380
ggtcacgatg gatcgcggtg acaggcttgc cgagcacaag aagtactttg cccggactga 1440
caacgccggc caccagttcc gcaccctgga agaagtcatt gagtacgtca agccgagtgc 1500
tcttgtcggt ctcgctgcca cttttggtat cttcaccgag tcgattatcc gaggtctcaa 1560
ggcgtctgtg gacgctggcg gtctcggacg acgacccatc ctcttccccc tcagcaaccc 1620
tctgaccaag gccgagtgta cttttgagca agccgtgcag tggaccgacg ggtccgtcgt 1680
ctttgcctcg ggttctcctt tctcctcttt cacgctcaag attggcggtg aggcgggtga 1740
tatcacctat catcccaacc agggaaacaa cgtgtacgtc ttccccggtc ttggtctggg 1800
tgccatcctc gccaaagcaa ctcgcatcac cgacgagatg gtgtatacgt cggctgcggc 1860
gcttgctggc tctctcaatg ccgaggaagt ccacatgggc ttgatctacc ccaagatcga 1920
ccgggtccgc gaggccagca tcacggtcgc ccgtgaggtc atgaaggcgg cgcgtcgtga 1980
cggcgtatcc gaacttccag aatctctctg ggtagagtgg gaggagtggg gtgacgttgc 2040
tttgacaaac tacatcaagc gacgtgtata taatcccact tcctttgagg aggccaaggg 2100
ccgtctgtag 2110
<210> 27
<211> 724
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gccatcatag tccgtgtcga ttcggtttct ccttctgggg aagatttgcc cacatcggcg 60
cggctcccag cgctcctaca taaatatcta ccttaccttt tgctatgtga ctaatttggc 120
cctgtgtatg atctgttgtt gttcccattg tgtgtgtcaa gatctcgggt ggcgtatacg 180
ctatttctag gctggaagtt gaaggctgcg gagacgacaa cggctatttt gtagttgaac 240
caagtcgtac aacatctgca actgtgaggc aacaaatgag ggaaaatagg agagaataag 300
gcttatgaaa cctgccactt ttcctcatgt cccaatctgg aagtgtgcag aagatcatgt 360
atgtatcgtg acctcgtggt aactgctgct gtacgtcgtc accacatggt tacgtcactc 420
gagccgttcg ctccatcttc ggcatccatc ttaccggatt atcgtgcaac tctcatgagg 480
cacaagtacg acctgcctgt atatattata cctcaacacc aaagccgtcc ctatcatcac 540
gctcttatta catattcttc ccctcacttg gcctctatct gtagatgccg gtatgaacag 600
catcctaaga acaacctcgt ctcgcctcag caaatcctct aatatacatt gcacatcaac 660
cctcagatac tcaccacaac gatcatcatc acccctctgc tgtaaacctc gctcctcatc 720
ctcc 724
<210> 28
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atgtcttcta gcaagcccac caagttcagc catctcccgc ttagcacgac cggccccctc 60
gagtgcgccc tcaccggcac cgccctcctc aacagcccca tcttcaacaa gggctctgcc 120
tttccgctgt ccgagcgtcg acagttcaac ctgaccggac tgctcccggc aaacgagcag 180
accctggaca accaggtcaa gcgcgcatac cagcagtacc agtccagggg cgacgacctg 240
gccaagaaca cgttcctgac ctcgctcaag gaccagaacg aggtgctgta cttcaagctg 300
ctgctcaccc acctcaagga aatgtttagc gtcgtgtata cgccgacaga gggcgatgcc 360
attcagaact actcgaggct gtttcgtcgg ccagagggct gcttcttgaa tattgagaat 420
cccgaactcg tggagcagga ccttgctctt tggggaactg ctgatgatgt cgactacatc 480
tgcgttacag gtgatgctga cctcatgttt tgacagctca atctacggcc acttactaac 540
tctcgtcaca gatggcgaag agattcttgg aatcggtgac caggtatgct tcatagcacc 600
tcatactgtc aaagtgtagt cttgctaacc tgccctcagg gcgtgggcgg cattctcata 660
tccggagcaa agctgaccct cacgtccctc tgcgccggta ttcaccccaa ccgcactctc 720
cctgtagtcc tagactgcgg cacagacaac 750
<210> 29
<211> 2041
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atgtcttcta gcaagcccac caagttcagc catctcccgc ttagcacgac cggccccctc 60
gagtgcgccc tcaccggcac cgccctcctc aacagcccca tcttcaacaa gggctctgcc 120
tttccgctgt ccgagcgtcg acagttcaac ctgaccggac tgctcccggc aaacgagcag 180
accctggaca accaggtcaa gcgcgcatac cagcagtacc agtccagggg cgacgacctg 240
gccaagaaca cgttcctgac ctcgctcaag gaccagaacg aggtgctgta cttcaagctg 300
ctgctcaccc acctcaagga aatgtttagc gtcgtgtata cgccgacaga gggcgatgcc 360
attcagaact actcgaggct gtttcgtcgg ccagagggct gcttcttgaa tattgagaat 420
cccgaactcg tggagcagga ccttgctctt tggggaactg ctgatgatgt cgactacatc 480
tgcgttacag gtgatgctga cctcatgttt tgacagctca atctacggcc acttactaac 540
tctcgtcaca gatggcgaag agattcttgg aatcggtgac caggtatgct tcatagcacc 600
tcatactgtc aaagtgtagt cttgctaacc tgccctcagg gcgtgggcgg cattctcata 660
tccggagcaa agctgaccct cacgtccctc tgcgccggta ttcaccccaa ccgcactctc 720
cctgtagtcc tagactgcgg cacagacaac caagatctgc tcaacgatga tctctatctc 780
ggtctgcgcc agcctcgagt tcgcggaaag cgctacgatg actttatcca gacattcgtc 840
gaagctgcta ggaagctgtt tcctcgagcc tacattcact ttgaggactt tggcacgaaa 900
aacggtagag atatttcccg gcttcagttc tgcagcaaag gctaacggtc gtttgtaact 960
gcagcccggc gtcttctgga gctctaccgc cctaagattg cttgcttcaa tgacgacgtt 1020
cagggcacag gctgcgtgac acttgccgcc ctcctggcag cgttgcatgc cagcgaccag 1080
aagctcagcg actcccgcat cgtcatcttt ggcgccggca gtgctggagt cggaattgca 1140
gaccaagtca gagacgccat tgccacggag cagaacatta gtcacgagaa ggcttcgcag 1200
cagatttggt acgatactcg atccatatac aatgctctct acccaatcta aattccccca 1260
aatactaatg cttcacaggt taattgacaa ggaaggcctc ctgacaacca agtcagacgt 1320
ctcggccgcc caaaaggggt acgtcaaaga cgcctccgag tggagtgata acaccaccct 1380
cctctccgtc gtccagcagg tcaaccccaa catcctcatc ggcacgtcca ccgtgcccgg 1440
cgccttcacc gaggaaatcg tcaaggccat gcacgagaac gcgccccggc ccatcatctt 1500
cccgctgtcc aacccgaccc ggctccacga ggcgaagccg gcggacctcc tcaactggac 1560
gaacggcaag gcgctggtcg ccaccgggtc gccgttcgat cccgtgacgg ggccctgggg 1620
tcaagatggc ggggatgtga cgattgaggt tgccgagtgc aacaactcgg tggttttccc 1680
cggcataggc ctcggctgcg tgctcagccg ggcaaagctg ctcacggata agatgctcgt 1740
cgcggccgtc gagggcgtcg cctcactgag ccctgcgctc aaagacgcaa cggcgccctt 1800
actcccagac gttgaagacg tgcgccccgt gagcgtccag gtagccaagc acgtgatcca 1860
ggccgccgtg aaggagggcg tggccacaga agaagggatt ccttcggacg acggcgagct 1920
cgaggagtgg atcagggagc agatgtggaa tcccgagtac cgcccgctga agctggtcaa 1980
gatggagaac gcgacgaggg cggccaaggg agagcttggg aaggcgatgc cggggctgta 2040
g 2041
<210> 30
<211> 703
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cggcattgcg tgttgaagaa aaaatgctcc gagatgcagg ccaaagtggg ctcaagagtg 60
gaacggcgag tgggaacggc acgtcagttc tgacaggggc cggtcgccct ttgacagcga 120
tccggaagcg gcagatgggc cagatgggct tcggcagtgg cttgaccgga cattccggcg 180
tacagtgtgc cagagcatgt ggaaccgtct cgagacagga acccaggacg ggtatgactc 240
ggcgtgatgg ggcccgtacg acgagtatct ccgacgagtt tccccgaact cagcctcatg 300
atggtaacgg tacttcgtac ttgaacagca gatgggccac cggaatgggc ctcaggagga 360
tctgctcgag acttcttctc gtctctcccg tctggtgatg tacaactaga caccacggga 420
ccacgatggg tttgaagtcg ctgctccagc ggcccgcaaa gacaccgaga tggacgcgag 480
cgcaagcagg cttttatatc tcgctgtggg actatcccta ttgccatgcc ctcacatacg 540
agtaatacct tgtgcattcc aagttccagt agcattgcag ccattagctt gcaaagactt 600
tatctatcag cccagacgct gtttctccgg attctccagt ctcatctccc aatttctcct 660
ccccattgat tgtgaccaac cctcctcatc acatccacca gtt 703
<210> 31
<211> 922
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atgggattct tgaacaaaaa agccgatgct cctgcgcagg agcccaagag ggatccctcg 60
cccagcagtg gaggctctga gacgactccc tcgcagcagg agagagtcac cctccttgcc 120
tgtgccctgg gagccattgc cgccattgga ggcttcatct ttggctatgt caggtaggcc 180
ctcaaaacac acctccgtat ctatctttta tcttcacatt ggttcgtcat atctgacaat 240
gcttcccgct ttattagtgg tcagatctcg ggtttcttct tgatgaagga ctatgcccgc 300
cgcttcggag agctgcagag tgatggatca tacgacttca gcgctgcccg ccagggcacc 360
atcgtcggtc tcctctgcgt gggagccctc attggctccc tagttgccgg caagatggca 420
gacaccgtcg gccgtcgcct gtccatctcc atgttcgcct tcttcgcctg tgtcggaacc 480
attatcgaga tctcctcgtc gacccactgg gttcagtttg ccgttggccg tctcgtcact 540
ggtctgagca tcggtgccct ctccgtcgtc gtccccatgt accagtcaga gagtacccct 600
gccgtcatcc gcggtgtcat cgtctcgtcg taccagctgc tcattaccat gggtatctgg 660
acggccgaga tggtcaactg gggaaccgag accaggccca acagcgccgc atggagaatc 720
cccaacggcc tcacctttgc ttgggccctg gtcctcggtg ctggcatcct gttcctcccc 780
gaaagccccc ggtttgccta cagccgcggc cgcgtcgatg aggctcgcca gacgattgcc 840
cgtctccatg gcctctccac cgactcggac attgtcaaca accagatcgc cgacatccag 900
gccaagattg acgaggagag cg 922
<210> 32
<211> 1835
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atgggattct tgaacaaaaa agccgatgct cctgcgcagg agcccaagag ggatccctcg 60
cccagcagtg gaggctctga gacgactccc tcgcagcagg agagagtcac cctccttgcc 120
tgtgccctgg gagccattgc cgccattgga ggcttcatct ttggctatgt caggtaggcc 180
ctcaaaacac acctccgtat ctatctttta tcttcacatt ggttcgtcat atctgacaat 240
gcttcccgct ttattagtgg tcagatctcg ggtttcttct tgatgaagga ctatgcccgc 300
cgcttcggag agctgcagag tgatggatca tacgacttca gcgctgcccg ccagggcacc 360
atcgtcggtc tcctctgcgt gggagccctc attggctccc tagttgccgg caagatggca 420
gacaccgtcg gccgtcgcct gtccatctcc atgttcgcct tcttcgcctg tgtcggaacc 480
attatcgaga tctcctcgtc gacccactgg gttcagtttg ccgttggccg tctcgtcact 540
ggtctgagca tcggtgccct ctccgtcgtc gtccccatgt accagtcaga gagtacccct 600
gccgtcatcc gcggtgtcat cgtctcgtcg taccagctgc tcattaccat gggtatctgg 660
acggccgaga tggtcaactg gggaaccgag accaggccca acagcgccgc atggagaatc 720
cccaacggcc tcacctttgc ttgggccctg gtcctcggtg ctggcatcct gttcctcccc 780
gaaagccccc ggtttgccta cagccgcggc cgcgtcgatg aggctcgcca gacgattgcc 840
cgtctccatg gcctctccac cgactcggac attgtcaaca accagatcgc cgacatccag 900
gccaagattg acgaggagag cgagaacacg gccgcgttca gctggaccga gatcttcacc 960
ggccctcgca tgttctaccg tacggtcctc ggtgtcgttc tccaggccgg ccagcagctc 1020
actggcgcca acttcttctt ctactttggc acgaccgtct tcgctgccac tggcatcagc 1080
aacagctatg tcacgcagat tatcctcgga tcggtcaacg tgtttgccac catcatcggt 1140
ctcttcatca ttgaccgatt tggccgacgt gtcattctca tggctggtgc ctcctggatg 1200
atgatgtgct tcctgtaagt cccacttctc cccctttctt tcaaatggtg gaacaaggta 1260
gtaacaggtc ttgatagtgt ctacgccttt gtcggtcact ttgctctcga ccacgagaac 1320
cccatgctca cccccaaggc tggatccgcc ctggtcacct tctcttgcct ggccattgcc 1380
gccttcgccg tcagttgggg acccctggtc tggactgtca acgccgagct gtaccccatc 1440
cgctaccgaa gcttctgcat gggcattgcc actgcctcca actggttctg gaacttcctc 1500
atctccttct tgtaagtctt gctgataaga aattacctgg caatgcaatc gcggcatctg 1560
actaacggat gtgatttagc actcgattca tcaccgacaa gatcgactac ttctacggcc 1620
tcattttcgc cggatgctgt gccgccctcg tcgtcatcgt cttcttcttc ctgatcgagt 1680
ccaaggaccg cacgctcgag gagattgaca ccatgtacgt ccagcacgtc aaccccatta 1740
cgtcgagccg atggaacgcc gcccagttcc gagacgagat gagggagacg cagaccaacg 1800
atgtgcgaga gcacgctcac gaggatgaga aataa 1835
<210> 33
<211> 700
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
accatctcca tccctccatc ctactagtag tagctgtcat cggcattcgt cctcgtcaga 60
agctgagcat gaccacatgg aactcggggc ctcgcgcggg aaccgctgcc caagctgttg 120
tcccagagtt ctggttctcg ccttggtcta cggggattct ccagcttctc ccacttcccc 180
atgacagagt cagcatccca agacacgaga tcgtggagat gagacatgtt tccccctact 240
taggattgaa tagtttcctt tgaacacttc ctctccgcaa tgatgccctg gattttgcgg 300
agagagccga gcaaatgtga cgagattttg actcgcggcc ctcgcaagtg ccggctttcg 360
caccggactt cggcctccta gctgccggca ttcggccact cgctctggcg ctttgcagcg 420
gacaacgtcc attgcgagtt gaaccgtcga gatggtgcaa tgttgattta caaacaattc 480
caagctcaac gatccggtca tcaacaggaa agccagcggc ggctttcaaa gacttcgatg 540
tctcaaagat gctatatatg tcgtgaatga tcctgtcatt ttctcgcctc ctggagaggg 600
tgacaggaac ggtagcattg ggaacgcggt ctaacgcgat caaggttttg ctgcaaggat 660
acagacgctc atatcgcctg agtcttcgag agcagccaac 700
<210> 34
<211> 780
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
atggcgggcg acacctcgtc ggtagacctc tctgtgggtc accggttgaa gcagttcaac 60
agcaccatcc tgttcatcat gctgtaagtc gccgtttgat gacatcccga tcgggtccga 120
ggcttctaat caccgtacaa cactacagtt atatgtgcag ttgcgccttc aactttggct 180
acgacgtcgg caactttggg ggagtccaag gcatgcaaag cttcggcaaa cggtttggcg 240
aatgtaatga agctggcgtc tgcaagcttc ccccatggct gtcttctctc atgacctctc 300
tgcctttcct gggcaaagct ctgggtgcaa tcgcctgtgg gtcgattgcg gagcggttcg 360
gacgcaagat gtgtgttcta gttctggctt gcttgtcctt cgtgtaagtc gacccctttg 420
atttagatgg gattttgtat attgtatcat cactaacacc ggattctgca gtggcgttct 480
tctacagaca accgcaacga cgagcgcaca attcaccgtg gggagattca tcagcttcgc 540
catgacggga atgactatcg tcgtggtccc catctacctg gccgagacat caccaaaggt 600
cctccgcggt atgatgacgt ccacgctaca actgatgatt gtctttggcc agttggttgc 660
ttcgctggtt acttttggca ctcagcacat ttcgggtgac aagggctggc agattccagt 720
cggcctgcaa tttattgccc cggcattcat cgtgggcctg ctacctcttg tccctgagtc 780
<210> 35
<211> 1786
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
atggcgggcg acacctcgtc ggtagacctc tctgtgggtc accggttgaa gcagttcaac 60
agcaccatcc tgttcatcat gctgtaagtc gccgtttgat gacatcccga tcgggtccga 120
ggcttctaat caccgtacaa cactacagtt atatgtgcag ttgcgccttc aactttggct 180
acgacgtcgg caactttggg ggagtccaag gcatgcaaag cttcggcaaa cggtttggcg 240
aatgtaatga agctggcgtc tgcaagcttc ccccatggct gtcttctctc atgacctctc 300
tgcctttcct gggcaaagct ctgggtgcaa tcgcctgtgg gtcgattgcg gagcggttcg 360
gacgcaagat gtgtgttcta gttctggctt gcttgtcctt cgtgtaagtc gacccctttg 420
atttagatgg gattttgtat attgtatcat cactaacacc ggattctgca gtggcgttct 480
tctacagaca accgcaacga cgagcgcaca attcaccgtg gggagattca tcagcttcgc 540
catgacggga atgactatcg tcgtggtccc catctacctg gccgagacat caccaaaggt 600
cctccgcggt atgatgacgt ccacgctaca actgatgatt gtctttggcc agttggttgc 660
ttcgctggtt acttttggca ctcagcacat ttcgggtgac aagggctggc agattccagt 720
cggcctgcaa tttattgccc cggcattcat cgtgggcctg ctacctcttg tccctgagtc 780
tccccgatgg taagcatcat gctgtatttt tcgaagactc gaagtagagt taagctgatt 840
aattgcaaac tgtaggctcc tctctcagag caaggtcgaa gaagcaaagg tgtccctgcg 900
aagactgtac aagaatcata cagaggccga aatcgagcaa gagatcgaca tcctccgtca 960
tgctcactct accgagcaaa agggctcctg ggcagaggtt ttcaacatgg acaaccgaaa 1020
gcgaaccatg gttgctgtca ttgccatgtt cggccagcag attactggtc aggccttttc 1080
cagccagtac tctgtcgtct tttaccaatc ccagggctac aagagccagg cgttcctatt 1140
caacatcctc agtaacgtca ctggtctcgt ctgcctcgtt actacctggt tcttgatcga 1200
tcaggtcggc agacgcccca tgcttatgat tggtggttcc ggcatggcca tcttcctctt 1260
catcgtgggc ggagttggac ttgagaagaa ccctaatgac tctgagagag cagcattggt 1320
aagccttggt gttgagcgtc cctctcgaat ctcatgctta caaatttctt aggtggcgtc 1380
tttcatcttg tttgcttgtt cttacaacct gtcttgggca cctgtttcat acgtggtggt 1440
atctgaagcc gcttccactc gagtcaagga aaagacgaac ctttttgcat ccgtcatatc 1500
catcatcacc acctttgtca cgtctttcac catcccgtat ctccttaacg cgccgtatgc 1560
cgccttgggt gccaaggtcg gtttcatcta cggctccatc aactgggtca tggttggcgt 1620
agcttacttc ttcattccgg aaatgaaagg ccggagcctt gaagaggttg acgagctgtt 1680
tgcggctgga acagcgatgc gggactttag caagacgagg acgactccca cgacgatcta 1740
cattgaggac actgctcgaa agcagacgcc ccctgatgag gcttag 1786

Claims (10)

1.一种非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株，其特征在于，以丝状真菌里氏木霉菌或者里氏木霉菌的衍生菌为出发菌株，在不引入任何外源基因的前提下，对所述出发菌株的基因组定向分子改良，使所得的里氏木霉改良株能够生产L-苹果酸。同时，改良株属于非转基因物种，其生产的L-苹果酸属于非转基因食品。
2.如权利要求1所述的改良株，其特征在于，对所述出发菌株的基因组定向分子改良，包括：通过同源比对鉴定出发菌株内源的四碳二元羧酸转运蛋白、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶、葡萄糖转运蛋白的编码基因；过表达所鉴定的出发菌株内源的四碳二元羧酸转运蛋白、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶和葡萄糖转运蛋白的编码基因中的至少一种。
3.如权利要求1所述的改良株，其特征在于，所述里氏木霉菌包括里氏木霉菌株QM6a，QM9414，Rut-C30，RL-P37，NG14或PC-3-7。
4.一种获取如权利要求1所述的改良株的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用里氏木霉菌内源的强启动子过表达所述里氏木霉菌内源的四碳二元羧酸转运蛋白、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶和葡萄糖转运蛋白的编码基因中的至少一种。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述里氏木霉菌内源的四碳二元羧酸转运蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13所示序列的基因；所述里氏木霉菌内源的丙酮酸羧化酶的编码基因包括如SEQ ID NO：17所示序列的基因；所述里氏木霉菌内源的苹果酸脱氢酶的编码基因包括如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：23所示序列的基因；所述里氏木霉菌内源的苹果酸酶的编码基因包括如SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：29所示序列的基因；所述里氏木霉菌内源的葡萄糖转运蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35所示序列的基因。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述里氏木霉菌内源的强启动子包括里氏木霉菌丙酮酸脱羧酶基因的启动子和里氏木霉菌烯醇化酶基因的启动子。
7.利用如权利要求1-3任一项所述的改良株生产L-苹果酸的方法，其特征在于，包括将非转基因的里氏木霉改良株接种液体培养基中发酵培养，获取L-苹果酸。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基包括如下浓度的组分：碳源50-100g/L，蛋白胨6g/L，KH2PO4 0.15g/L，K2HPO4 0.15g/L，CaCl2·2H2O 0.10g/L，MgSO4·7H2O 0.10g/L，碳酸钙40-80g/L，NaCl 0.05g/L和1mL/L微量元素液；所述微量元素溶液包括以下质量的组分：1.6g MnSO4·4H2O,5g FeSO4·7H2O，2g CoCl2·6H2O，1.4gZnSO4·7H2O，用水溶解并定容至1L；所述碳源包括甘油、葡萄糖、木糖、糖化淀粉、纤维素或者纤维素水解液中任一种。
9.如权利要求1-3任一项所述的改良株，或权利要求7-9任一项所述的方法在生产L-苹果酸中的应用。
10.如权利要求1-3任一项所述的改良株，或权利要求7-9任一项所述的方法在制备非转基因食品中的应用。
CN202210512199.0A 2022-05-12 2022-05-12 一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用 Active CN114806902B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210512199.0A CN114806902B (zh) 2022-05-12 2022-05-12 一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210512199.0A CN114806902B (zh) 2022-05-12 2022-05-12 一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114806902A true CN114806902A (zh) 2022-07-29
CN114806902B CN114806902B (zh) 2024-04-02

Family

ID=82513600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210512199.0A Active CN114806902B (zh) 2022-05-12 2022-05-12 一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114806902B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110053233A1 (en) * 2009-09-01 2011-03-03 Novozymes, Inc. Methods for improving malic acid production in filamentous fungi
US20180171369A1 (en) * 2015-02-15 2018-06-21 Tianjin Institute Of Industrial Biotechnology, Chinese Academy Of Sciences Dibasic organic acid producing strain and preparation and application of same
WO2019128454A1 (zh) * 2017-12-29 2019-07-04 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种新型木霉及其应用
CN111218408A (zh) * 2020-01-21 2020-06-02 天津科技大学 一株高效生产苹果酸的黑曲霉菌株、构建方法及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110053233A1 (en) * 2009-09-01 2011-03-03 Novozymes, Inc. Methods for improving malic acid production in filamentous fungi
US20180171369A1 (en) * 2015-02-15 2018-06-21 Tianjin Institute Of Industrial Biotechnology, Chinese Academy Of Sciences Dibasic organic acid producing strain and preparation and application of same
WO2019128454A1 (zh) * 2017-12-29 2019-07-04 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种新型木霉及其应用
CN111218408A (zh) * 2020-01-21 2020-06-02 天津科技大学 一株高效生产苹果酸的黑曲霉菌株、构建方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114806902B (zh) 2024-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11225675B2 (en) D-lactate dehydrogenase, engineered strain containing D-lactate dehydrogenase and construction method and use of engineered strain
EA025990B1 (ru) Полипептиды с оксидоредуктазной активностью и их применение
CN109207373B (zh) 一株高产柠檬酸的微生物菌株及其发酵淀粉糖质生产柠檬酸的方法
CN112458065B (zh) 水飞蓟来源黄酮3-羟化酶及其应用
CN105802943B (zh) 一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤酵母突变株
WO2019008131A1 (en) PSEUDOMONAS PUTIDA RECOMBINANT FOR THE PRODUCTION OF D-XYLONATE FROM D-XYLOSE
CN113025548B (zh) 基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌及其方法和应用
CN112391300B (zh) 水飞蓟来源的黄酮3β-羟化酶及其辅酶的应用
WO2004081216A1 (ja) 酢酸菌のアルコール脱水素酵素遺伝子
EP2222854A1 (en) Dicarboxylic acid production in a filamentous fungus
CN114761553A (zh) 用于生产来自黑曲霉的β-呋喃果糖苷酶的核酸、载体、宿主细胞和方法
CN106574236A (zh) 遗传修饰的产生(r)‑乳酸的嗜热细菌
CN111424048A (zh) 一种表达酸性β-甘露聚糖酶的基因及其载体和应用
CN114806913B (zh) 具有线粒体定位还原tca途径的高产琥珀酸酵母工程菌株及其构建方法和应用
CN115433721B (zh) 一种羰基还原酶突变体及其应用
CN114806902B (zh) 一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用
KR102177743B1 (ko) 4-하이드록시발레르산을 생산하는 형질전환된 슈도모나스 푸티다
CN114746548A (zh) 用于生产来自日本曲霉的果糖基转移酶的核酸、载体、宿主细胞和方法
CN114806899B (zh) 一种生产l-苹果酸的里氏木霉工程菌及其应用
CN112575022A (zh) 一种体外人工脚手架蛋白介导海藻糖多酶复合体的构建方法
CN101892228B (zh) 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用
JP2006230329A (ja) 酢酸発酵能が増強された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
CN115011537B (zh) 一株双厌氧启动子诱导产高光学纯l-乳酸的工程菌及其制备方法与应用
KR102613937B1 (ko) 갈락토스 이용에 관여하는 모든 유전자가 결손된 효모 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질 생산방법
CN114561417B (zh) 用于制备阿洛酮糖的谷氨酸棒杆菌工程菌株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant