JP2020505043A - 核酸巻き戻し機能を有する膜貫通型ナノポア並びにその構築方法及び用途 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)乾燥両親媒性脂質を調製する工程;並びに(b)乾燥両親媒性脂質を、水性溶媒、浸透剤、及び上記のいくつかの分離されたタンパク質を含む溶液に再懸濁する工程であって、サブユニットとしてのタンパク質が六量体タンパク質に自己組織化することができ、これを、特定の条件下で、導電性細孔を含む膜を形成するのに十分な時間、脂質二重層膜に挿入することができる工程を特徴とする、導電性細孔を含む膜を調製するための方法を提供する。好ましくは、ポリマータンパク質は六量体である。
(a)479位のアミノ酸は、ヒスチジン(H)、リジン(K)、セリン(S)、アスパラギン(N)、トレオニン(T)である;
(b)489位のアミノ酸は、ヒスチジン(H)、リジン(K)、アスパラギン(N)、トレオニン(T)及びセリン(S)である;
(c)530位のアミノ酸は、ヒスチジン(H)、リジン(K)、セリン(S)、アスパラギン(N)、トレオニン(T)である;
(d)529位のアミノ酸は、グルタミン(Q)及びリジン(K)である;
(e)525位のアミノ酸は、ヒスチジン(H)、リジン(K)、セリン(S)、ロイシン(L)、トレオニン(T)である;
(f)504位のアミノ酸は、アスパラギン(N)、リジン(K)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、フェニルアラニン(f)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)である;
(g)328位のアミノ酸は、グルタミン(Q)、リジン(K)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)である;
(h)360位のアミノ酸は、アスパラギン(N)、リジン(K)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)である;
(i)322位のアミノ酸は、アスパラギン(N)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)である;
(j)372位のアミノ酸は、グルタミン(Q)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、プロリン(P)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アスパラギン(N)である;
(k)342位のアミノ酸は、アスパラギン(N)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)である;
(l)334位のアミノ酸は、アスパラギン(N)、ロイシン(l)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)である;
(m)392位のアミノ酸は、アスパラギン(N)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)である;
(n)408位のアミノ酸は、アスパラギン(N)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)である;
(o)396位のアミノ酸は、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)及びトリプトファン(W)、アラニン(A)及びグリシン(G)である;
(p)570位のアミノ酸は、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)である;
(q)574位のアミノ酸は、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)及びフェニルアラニン(F)である;
(r)417位のアミノ酸は、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)及びグリシン(G)である;
(s)421位のアミノ酸は、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)、ロイシン(L)及びイソロイシン(I)である;
(t)383位のアミノ酸は、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)である;
(u)387位のアミノ酸は、ヒスチジン(H)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)である;
(v)323位のアミノ酸は、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(v)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)である;
(w)324位のアミノ酸は、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、プロリン(P)及びバリン(V)である;
(x)565位のアミノ酸は、トレオニン(T)、セリン(S)及びチロシン(Y)である;
(y)426位のアミノ酸は、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)である。
1.空間(変異アミノ酸残基の増減);
2.電荷(例えば、+ev電荷を誘導して核酸とアミノ酸との間の相互作用を増強する);
3.非共有結合(例えば、水素結合を有する特定のヌクレオチドと結合することができるアミノ酸を誘導する);
を通して実現され、これら3つの機構のいずれか又は複数が、将来本発明の細孔がヌクレオチド読み取り特性を有する理由となり得る。
野生型E1−1(306〜577)又はE1−2(306〜605)では、N末端はより狭い末端で開口し、C末端はより広い末端で開口しており、六量体は標準的なキノコ構造を形成する。多数のアルカリ性アミノ酸が形成細孔の内部空洞に分布しており、これがssDNAの負のリン酸基と結合する。従って、野生型E1−1(306〜577)又はE1−2(306〜605)単量体を人工脂質膜に挿入して、イオンが自由に通過できる導電性細孔を形成すると、長期間の印加膜貫通電圧で細孔が脂質膜から落下することが認められた。記録された開放電流ベースラインは変動し、測定されるべき分子が細孔を通過しない場合、小さな非特異的ピーク電流が時として出現する。
LQTEKFDFGTMVQWAYDHKYAEESKIAYEYALAAGSDSNARAFLATNSQAKHVKDCATMVRHYLRAETQALSMPAYIKARCKLATGEGSWKSILTFFNYQNIELITFINALKLWLKGIPKKNCLAFIGPPNTGKSMLCNSLIHFLGGSVLSFANHKSHFWLASLADTRAALVDDATHACWRYFDTYLRNALDGYPVSIDRKHKAAVQIKAPPLLVTSNIDVQAEDRYLYLHSRVQTFRFEQPCTDESGEQPFNITDADWKSFFVRLWGRLDL。
Ttgcagaccgagaaattcgacttcggaactatggtgcaatgggcctatgatcacaaatatgctgaggagtctaaaatagcctatgaatatgctttggctgcaggatctgatagcaatgcacgggcttttttagcaactaacagccaagctaagcatgtgaaggactgtgcaactatggtaagacactatctaagagctgaaacacaagcattaagcatgcctgcatatattaaagctaggtgcaagctggcaactggggaaggaagctggaagtctatcctaactttttttaactatcagaatattgaattaattacctttattaatgctttaaagctctggctaaaaggaattccaaaaaaaaactgtttagcatttattggccctccaaacacaggcaagtctatgctctgcaactcattaattcattttttgggtggtagtgttttatcttttgccaaccataaaagtcacttttggcttgcttccctagcagatactagagctgctttagtagatgatgctactcatgcttgctggaggtactttgacacatacctcagaaatgcattggatggctaccctgtcagtattgatagaaaacacaaagcagcggttcaaattaaagctccacccctcctggtaaccagtaatattgatgtgcaggcagaggacagatatttgtacttgcatagtcgggtgcaaacctttcgctttgagcagccatgcacagatgaatcgggtgagcaaccttttaatattactgatgcagattggaaatctttttttgtaaggttatgggggcgtttagacctg。
二重消化:BamH I、Xho I
順方向プライマー:配列番号10;
CGggatccTTGCAGACCGAGAAAT。
逆方向プライマー:配列番号11
CCGctcgagTTAATGATGATGGTGATGATGCAGGTCTAAACGCCCC。
LQTEKFDFGTMVQWAYDHKYAEESKIAYEYALAAGSDSNARAFLATNSQAKHVKDCAMVRHYLRAETQALSMPAYIKARCKLATGEGSWKSILTFFNYQNIELITFINALKLWLKGIPKKNCLAFIGPPNTGKSMLCNSLIHFLGGSVLSFANHKSHFWLASLADTRAALVDDATHACWRYFDTYLRNALDGYPVSIDRKHKAAVQIKAPPLLVTSNIDVQAEDRYLYLHSRVQTFRFEQPCTDESGEQPFNITDADWKSFFVRLWGRLDLIDEEEDSEEDGDSMRTFTCSARN。
ttgcagaccgagaaattcgacttcggaactatggtgcaatgggcctatgatcacaaatatgctgaagagtctaaaatagcctatgaatatgctttggctgcaggatctgatagcaatgcacgggcttttttagcaactaacagccaagctaagcatgtgaaggactgtgcaactatggtaagacactatctaagagctgaaacacaagcattaagcatgcctgcatatattaaagctaggtgcaagctggcaactggggaaggaagctggaagtctattctaactttttttaattatcagaatattgaattaattacctttattaatgctttaaagctctggctaaaaggaattccaaaaaaaaactgtttagcatttattggccctccaaacacaggcaagtctatgctctgcaactcattaattcattttttgggtggtagtgttttatcttttgccaaccataaaagtcacttttggcttgcttccctagcagatactagagctgctttagtagatgatgctactcatgcttgctggaggtactttgacacatacctcagaaatgcattggatggctaccctgtcagtattgatagaaaacacaaagcagcggttcaaattaaagctccacccctcctggtaaccagtaatattgatgtgcaggcagaggacagatatttgtacttgcatagtcgggtgcaaacctttcgctttgagcagccatgcacagatgaatcgggtgagcaaccttttaatattactgatgcagattggaaatctttttttgtaaggttatgggggcgtttagacctgattgacgaggaggaggatagtgaagaggatggagacagcatgcgaacgtttacatgtagcgcaagaaacacaaatgcagttgattga。
二重消化:BamH I、Xho I
順方向プライマー1:配列番号12
AGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTGggatccTTGCAGACCGAGAAATTCGACTTCG。
逆方向プライマー1:配列番号13
TCAGTCAGTCACGATGCGGCCGctcgagTTAATCAACTGCATTTGTGTTTCTTGCGCTACATGTAAACGTTCGCA。
LQTEKFDFGTMVQWAYDHKYAEESKIAYEYALAAGSDSNARAFLATNSQAKHVKDCATMVRHYLRAETQALSMPAYIKARCKLATGEGSWKSILTFFNYQNIELITFINALKLWLLGIPKKNCLAFIGPPNTGKSMLCNSLIHFLGGSVLSFANHKSHFWLASLADTRAALVDDATHACWRYFDTYLRNALDGYPVSIDRKHKAAVQIKAPPLLVTSNIDVQAEDRYLYLHSRVQTFRFEQPCTDESGEQPFNITDADWKSFFVRLWGRLDLIDEEEDSEEDGDSMRTFTCSARNTNAVD。
GGATCCTTGCAGACCGAGAAATTCGACTTCGGAACTATGGTGCAATGGGCCTATGATCACAAATATGCTGAGGAGTCTAAAATAGCCTATGAATATGCTTTGGCTGCAGGATCTGATAGCAATGCACGGGCTTTTTTAGCAACTAACAGCCAAGCTAAGCATGTGAAGGACTGTGCAACTATGGTAAGACACTATCTAAGAGCTGAAACACAAGCATTAAGCATGCCTGCATATATTAAAGCTAGGTGCAAGCTGGCAACTGGGGAAGGAAGCTGGAAGTCTATCCTAACTTTTTTTAACTATCAGAATATTGAATTAATTACCTTTATTAATGCTTTAAAGCTCTGGCTACTGGGAATTCCAAAAAAAAACTGTTTAGCATTTATTGGCCCTCCAAACACAGGCAAGTCTATGCTCTGCAACTCATTAATTCATTTTTTGGGTGGTAGTGTTTTATCTTTTGCCAACCATAAAAGTCACTTTTGGCTTGCTTCCCTAGCAGATACTAGAGCTGCTTTAGTAGATGATGCTACTCATGCTTGCTGGAGGTACTTTGACACATACCTCAGAAATGCATTGGATGGCTACCCTGTCAGTATTGATAGAAAACACAAAGCAGCGGTTCAAATTAAAGCTCCACCCCTCCTGGTAACCAGTAATATTGATGTGCAGGCAGAGGACAGATATTTGTACTTGCATAGTCGGGTGCAAACCTTTCGCTTTGAGCAGCCATGCACAGATGAATCGGGTGAGCAACCTTTTAATATTACTGATGCAGATTGGAAATCTTTTTTTGTAAGGTTATGGGGGCGTTTAGACCTGATTGACGAGGAGGAGGATAGTGAAGAGGATGGAGACAGCATGCGAACGTTTACATGTAGCGCAAGAAACACAAATGCAGTTGATTAACTCGAG。
LQTEKFDFGTMVQWAYDWKYAEESKIAYEYALAAGSDSNARAFLATNSQAKHVKDCATMVRHYLRAETQALSMPAYIKARCKLATGEGSWKSILTFFNYQNIELITFINALKLWLLGIPKKNCLAFIGPPNTGKSMLCNSLIHFLGGSVLSFANHKSHFWLASLADTRAALVDDATHACWRYFDTYLRNALDGYPVSIDRKHKAAVQIKAPPLLVTSNIDVQAEDRYLYLHSRVQTFRFEQPCTDESGEQPFNITDADWKSFFVRLWGRLDLIDEEEDSEEDGDSMRTFTCSARNTNAVD。
GGATCCTTGCAGACCGAGAAATTCGACTTCGGAACTATGGTGCAATGGGCCTATGATTGGAAATATGCTGAGGAGTCTAAAATAGCCTATGAATATGCTTTGGCTGCAGGATCTGATAGCAATGCACGGGCTTTTTTAGCAACTAACAGCCAAGCTAAGCATGTGAAGGACTGTGCAACTATGGTAAGACACTATCTAAGAGCTGAAACACAAGCATTAAGCATGCCTGCATATATTAAAGCTAGGTGCAAGCTGGCAACTGGGGAAGGAAGCTGGAAGTCTATCCTAACTTTTTTTAACTATCAGAATATTGAATTAATTACCTTTATTAATGCTTTAAAGCTCTGGCTAGGAATTCCAAAAAAAAACTGTTTAGCATTTATTGGCCCTCCAAACACAGGCAAGTCTATGCTCTGCAACTCATTAATTCATTTTTTGGGTGGTAGTGTTTTATCTTTTGCCAACCATAAAAGTCACTTTTGGCTTGCTTCCCTAGCAGATACTAGAGCTGCTTTAGTAGATGATGCTACTCATGCTTGCTGGAGGTACTTTGACACATACCTCAGAAATGCATTGGATGGCTACCCTGTCAGTATTGATAGAAAACACAAAGCAGCGGTTCAAATTAAAGCTCCACCCCTCCTGGTAACCAGTAATATTGATGTGCAGGCAGAGGACAGATATTTGTACTTGCATAGTCGGGTGCAAACCTTTCGCTTTGAGCAGCCATGCACAGATGAATCGGGTGAGCAACCTTTTAATATTACTGATGCAGATTGGAAATCTTTTTTTGTAAGGTTATGGGGGCGTTTAGACCTGATTGACGAGGAGGAGGATAGTGAAGAGGATGGAGACAGCATGCGAACGTTTACATGTAGCGCAAGAAACACAAATGCAGTTGATTAACTCGAG。
AGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTGggatccTTGCAGACCGAGAAATTCGACTTCG。
TCAGTCAGTCACGATGCGGCCGctcgagTTAATCAACTGCATTTGTGTTTCTTGCGCTACATGTAAACGTTCGCA。
蛍光標識切断型E1−2(306〜605)タンパク質:使用した材料は、フッ素標識フルオレセインイソチオシアネート(FITC)コンジュゲートキット(Sigma,St.Louis,Missouri)である。キットの説明書に従って、過剰のFITCをカラムクロマトグラフィによって除去し、FITC結合E1をタンパク質緩衝液(20mMトリス−HCl(pH7.3)、200mM NaCl)で溶出した。SDS−PAGEを用いて確認されたFITC標識E1(306〜605)(図省略、SDS−PAGE上のFITC標識E1−2の位置は、非標識E1−2の位置よりわずかに高い)。
電気生理学的測定:この実施例で使用される機器は、増幅器とデジタル−アナログ変換器(DAC)とを組み込んだHEKA EPC−10 USBであり、これは、一対の銀/塩化銀電極(Ag/AgCl)である、圧力(電圧クランプ)電極と参照電極と呼ばれる2つの電極を有する。この機器を使用して、リン脂質二重層の両側を横切る膜貫通電流を測定した。ここでの試料周波数設定は2kHzであり、ローパスフィルタの周波数は1kHzである;ソフトウェアPatch−masterを使用してデータを収集し、Clampfitを利用して収集したデータを分析した。
先に調製した小胞−タンパク質複合体は、水平ptfe膜のマイクロポア(上述したような)又は垂直ポリホルムアルデヒド樹脂マイクロポア上にE1−2タンパク質ナノポア構造が埋め込まれたBLMを形成する。
E1−2の細孔の安定性に関する試験:本発明では、リン脂質膜上のE1−2及びE1の突然変異体の細孔の安定性及び高電圧ゲート現象をそれぞれ正及び負の電圧下で試験した。結果は以下を示した:正の300mV及び負の300mVの下でE1細孔に関してゲート現象は見られず、E1細孔は、高電圧を与えられたときリン脂質膜上に安定に存在することができた。同時に、コンダクタンス緩衝液(E1タンパク質を保存するために使用される)中のグリセロールが多すぎると、膜に埋め込まれたタンパク質複合体が異常に不安定になり、タンパク質が極めて容易に膜から脱落する又は膜が直接破裂することが認められる。
この実施例で使用されるssDNAは48ntであり、Takara companyから購入され、その詳細な配列は以下のように表される;電解質はHEPES/1M KClである;一般に、この条件下で核酸輸送を達成するための2つの方法がある。
BamHI酵素から得られた二本鎖DNA(dsDNA)をシスチャンバに添加し、転位緩衝液は、ssDNAを含む10mM HEPES/1M KClである。移動シグナルは、それぞれ50mV、70mV、120mV及び150mVの電圧で検出され、dsDNA転位は観察されない。
Q−PCRを用いて核酸増幅の標準曲線を作成した:dsDNAを、2つのssDNA(80nt)をアニーリングすることから調製し、2%アガロースゲルで同定し、ゲルから抽出した。ゲルから抽出されたdsDNAの濃度をQubit(登録商標)3.0(Thermo fisher scientific Co.Ltd,America)によって測定した(この方法は正確度と精度において紫外分光光度計よりも優れている);得られた既知濃度のdsDNAを10倍濃度勾配の10倍に希釈し、次いで標準的な相関を得るためにQ−PCR(Premix SYBR−Takara Co.Ltd,Japan)を用いてdsDNA濃度のct値の標準曲線を作成した(図11〜12に示すように、Ct値は各濃度勾配下で良好な再現性を有し、R2=0.99+である)。従って、この標準的な相関は、その後のssDNA転位実験の計算の基礎として使用することができる。
3’−TTT TTT TTT AAA AAA TTT TTT GGG GGG TTT TTT CCC CCC TTT TTT TTT−5’。
5’−AGC TCC ACC CCT CCT GGT AAC CAG TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT−3’(配列番号17)。
5’−TTT TTT TTT TTT TTT TT CTG GTT ACC AGG AGG GGT GGA GCT−3’(配列番号18)。
5’−CTG GTT ACC AGG AGG GGT GGA GCT−3’。
5’−CCTACGCCACCAGCTCCGTAGG−3’(5’−Cy5、3’−BHQ2)(配列番号20)。
5’−CCTACGGAGCTGGTGGCGTAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT−3’(配列番号21)。
5’−TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT−3’(配列番号22)。
5’−AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA−3’(配列番号23)。
5’−CAG GCA GAG GAC AGA TAT TTG TAC TTG CAT AGT CGG GTG CAA ACC TTT CGC TTT GAG CAG CCA TGC ACA GAT GAA TCG GGT TTT TTT TTT TTT TTTT(配列番号24)。
5’−CCC GAT TCA TCT GTG CAT GGC TGC TCA AAG CGA AAG GTT TGC ACC CGA CTA TGC AAG TAC AAA TAT CTG TCC TCT GCC TG(配列番号25)。
5’−CAG GCA GAG GAC AGA TAT TT(配列番号26)。
5’−CCC GAT TCA TCT GTG CAT GG(配列番号27)。
本発明は、インビトロでタンパク質六量体のdsDNAのらせん活性を検証するためにE1(306〜577)を使用する。
インビトロでE1のヘリカーゼ活性を検証した後、人工脂質膜上での巻き戻し実験を計画する:E1がBLMに挿入された後、二本鎖DNAの直径がE1タンパク質細孔の直径よりも大きいため(上記のように)、dsDNAは、ATP及びMg2+の不在下では、室温(21℃)でE1タンパク質を通して転位することができなかった。
更に、本発明は、人工脂質膜上での異なる長さを有するdsDNAの巻き戻し現象を検討する。
他方で、本発明は、温度が異なることを除いて同じ条件下で膜上のdsDNAの巻き戻し現象を観察することを試みた。上記の24bpの核酸鎖の実験を、それぞれ室温(21℃)、35℃未満、35℃〜37℃、及び37℃超の勾配温度で実施した。
本発明はまた、異なる膜貫通電圧でE1−2が同じdsDNA基質を巻き戻すのに必要な時間を決定し、実験工程は上記と同じである。
本発明はまた、dsDNAの一本鎖中に3つのdスペーサ(塩基なし)を有する別の特別な核酸基質を設計し、これは単腕を有し、A及びTからなる。この特別な核酸基質を用いて巻き戻し実験を実施した。
膜上のE1−2の巻き戻しを検証するために、Mg2+とキレート化した過剰のEDTAを適用してヘリカーゼを不活性化した。実験工程は上記と同じである。巻き戻しの工程で、過剰のEDTAキレート剤を反応系に添加した。
Claims (68)
- (1)単離されたウシパピローマウイルス二本鎖DNAヘリカーゼの306〜577位のアミノ酸からなり、およびその配列が配列番号3に示されている;又は
(2)(1)で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも1つのアミノ酸の置換及び/若しくは欠失及び/若しくは挿入によって得られる変異体であることを特徴とする、タンパク質。 - (1)で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の1〜20個のアミノ酸を置換及び/又は欠失及び/又は挿入することによって得られる変異体である、請求項1に記載のタンパク質。
- (1)で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の1〜3個のアミノ酸の置換及び/又は欠失及び/又は挿入によって得られる変異体である、請求項1に記載のタンパク質。
- (1)で定義された配列番号3の配列と75%を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である、請求項1に記載のタンパク質。
- (1)で定義された配列番号3の配列と90%を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である、請求項1に記載のタンパク質。
- (1)で定義された配列番号3の配列と99%を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である、請求項1に記載のタンパク質。
- 配列番号3に示されるアミノ酸配列の変異体を含み、前記変異体が以下の突然変異:
(a)479位のアミノ酸が、ヒスチジン(H)、リジン(K)、セリン(S)、アスパラギン(N)、トレオニン(T)である;
(b)489位のアミノ酸が、ヒスチジン(H)、リジン(K)、アスパラギン(N)、トレオニン(T)およびセリン(S)である;
(c)530位のアミノ酸が、ヒスチジン(H)、リジン(K)、セリン(S)、アスパラギン(N)、トレオニン(T)である;
(d)529位のアミノ酸が、グルタミン(Q)およびリジン(K)である;
(e)525位のアミノ酸が、ヒスチジン(H)、リジン(K)、セリン(S)、ロイシン(L)、トレオニン(T)である;
(f)504位のアミノ酸が、アスパラギン(N)、リジン(K)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、フェニルアラニン(f)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)である;
(g)328位のアミノ酸が、グルタミン(Q)、リジン(K)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)である;
(h)360位のアミノ酸が、アスパラギン(N)、リジン(K)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)である;
(i)322位のアミノ酸が、アスパラギン(N)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)である;
(j)372位のアミノ酸が、グルタミン(Q)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、プロリン(P)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アスパラギン(N)である;
(k)342位のアミノ酸が、アスパラギン(N)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)である;
(l)334位のアミノ酸が、アスパラギン(N)、ロイシン(l)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)である;
(m)392位のアミノ酸が、アスパラギン(N)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)である;
(n)408位のアミノ酸が、アスパラギン(N)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)である;
(o)396位のアミノ酸が、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)およびトリプトファン(W)、アラニン(A)およびグリシン(G)である;
(p)570位のアミノ酸が、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)である;
(q)574位のアミノ酸が、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)およびフェニルアラニン(F)である;
(r)417位のアミノ酸が、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)およびグリシン(G)である;
(s)421位のアミノ酸が、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)、ロイシン(L)およびイソロイシン(I)である;
(t)383位のアミノ酸が、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)である;
(u)387位のアミノ酸が、ヒスチジン(H)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)である;
(v)323位のアミノ酸が、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(v)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)である;
(w)324位のアミノ酸が、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、プロリン(P)およびバリン(V)である;
(x)565位のアミノ酸が、トレオニン(T)、セリン(S)およびチロシン(Y)である;
(y)426位のアミノ酸が、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)である
の少なくとも1つを含み、
前記各突然変異位置の数は、前記ウシパピローマウイルス二本鎖DNAヘリカーゼの完全長の最初の位置から数え始め、
前記ウシパピローマウイルス二本鎖DNAヘリカーゼの完全長アミノ酸配列が配列番号5に示されている、
請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質。 - 前記変異体が、配列番号3のアミノ酸配列のタンパク質と同じ又は類似の機能を有し、前記類似の機能が、多量体タンパク質細孔を形成することができる単量体であり得ることであり、前記同じ機能が、細孔を形成することができる単量体であり得ること及び形成された多量体タンパク質細孔もまたヘリカーゼ活性を有することである、請求項1〜7のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 化学的に修飾されている、請求項1〜8のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質が、分子を1以上のシステインに連結すること、分子を1以上のリジンに連結すること、及び分子を1以上の非天然アミノ酸に連結すること、エピトープの酵素修飾又は末端修飾によって化学的に修飾されている、請求項9に記載のタンパク質。
- 前記1以上のシステイン又は前記1以上の非天然アミノ酸が置換によって前記タンパク質に導入されている、請求項10に記載のタンパク質。
- 前記分子が、
(a)導電性チャネルを含むタンパク質若しくは膜を含むナノポアと、標的被検体、標的ヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドとの間の相互作用を促進することができる分子アプタマー;又は
(b)ポリヌクレオチド結合タンパク質;
である、請求項10又は11に記載のタンパク質。 - 前記連結がリンカーによって達成される、請求項10〜12のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 前記分子が前記変異体の1以上の部位に連結されている、請求項10〜13のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の2以上のタンパク質のサブユニットを含む、多量体タンパク質。
- 前記多量体タンパク質を構成するサブユニットの数が4〜8である、請求項15に記載の多量体タンパク質。
- 前記多量体タンパク質を構成するサブユニットの数が6である、請求項16に記載の多量体タンパク質。
- 前記多量体タンパク質がホモ多量体又はヘテロ多量体である、請求項15〜17のいずれか1項に記載の多量体タンパク質。
- (1)単離されたウシパピローマウイルス二本鎖DNAヘリカーゼの306〜605位のアミノ酸からなり、その配列が配列番号1に示されている;又は
(2)(1)で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも1つのアミノ酸の置換及び/若しくは欠失及び/若しくは挿入によって得られる変異体である;
ことを特徴とする、タンパク質。 - (1)で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の1〜20個のアミノ酸を置換及び/又は欠失及び/又は挿入することによって得られる変異体である、請求項19に記載のタンパク質。
- (1)で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の1〜3個のアミノ基の置換及び/又は欠失及び/又は挿入によって得られる変異体である、請求項19に記載のタンパク質。
- (1)で定義された配列番号1の配列と75%を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である、請求項19に記載のタンパク質。
- (1)で定義された配列番号1の配列と90%を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である、請求項19に記載のタンパク質。
- (1)で定義された配列番号1の配列と99%を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である、請求項19に記載のタンパク質。
- 配列番号1に示されるアミノ酸配列の変異体を含み、前記変異体が以下の突然変異:
(z)479位のアミノ酸が、ヒスチジン(H)、リジン(K)、セリン(S)、アスパラギン(N)、トレオニン(T)である;
(aa)489位のアミノ酸が、ヒスチジン(H)、リジン(K)、アスパラギン(N)、トレオニン(T)およびセリン(S)である;
(bb)530位のアミノ酸が、ヒスチジン(H)、リジン(K)、セリン(S)、アスパラギン(N)、トレオニン(T)である;
(cc)529位のアミノ酸が、グルタミン(Q)およびリジン(K)である;
(dd)525位のアミノ酸が、ヒスチジン(H)、リジン(K)、セリン(S)、ロイシン(L)、トレオニン(T)である;
(ee)504位のアミノ酸が、アスパラギン(N)、リジン(K)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、フェニルアラニン(f)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)である;
(ff)328位のアミノ酸が、グルタミン(Q)、リジン(K)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)である;
(gg)360位のアミノ酸が、アスパラギン(N)、リジン(K)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)である;
(hh)322位のアミノ酸が、アスパラギン(N)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)である;
(ii)372位のアミノ酸が、グルタミン(Q)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、プロリン(P)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アスパラギン(N)である;
(jj)342位のアミノ酸が、アスパラギン(N)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)である;
(kk)334位のアミノ酸が、アスパラギン(N)、ロイシン(l)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)である;
(ll)392位のアミノ酸が、アスパラギン(N)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)である;
(mm)408位のアミノ酸が、アスパラギン(N)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)である;
(nn)396位のアミノ酸が、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)およびトリプトファン(W)、アラニン(A)およびグリシン(G)である;
(oo)570位のアミノ酸が、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)である;
(pp)574位のアミノ酸が、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)およびフェニルアラニン(F)である;
(qq)417位のアミノ酸が、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)およびグリシン(G)である;
(rr)421位のアミノ酸が、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)、ロイシン(L)およびイソロイシン(I)である;
(ss)383位のアミノ酸が、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)である;
(tt)387位のアミノ酸が、ヒスチジン(H)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)である;
(uu)323位のアミノ酸が、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(v)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)である;
(vv)324位のアミノ酸が、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、プロリン(P)およびバリン(V)である;
(ww)565位のアミノ酸が、トレオニン(T)、セリン(S)およびチロシン(Y)である;
(xx)426位のアミノ酸が、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、アラニン(A)、グリシン(G)である
の少なくとも1つを含み、
前記各突然変異位置の数は、前記ウシパピローマウイルス二本鎖DNAヘリカーゼの完全長の最初の位置から数え始め、
前記ウシパピローマウイルス二本鎖DNAヘリカーゼの完全長アミノ酸配列が配列番号5に示されている、請求項19〜24のいずれか1項に記載のタンパク質。 - 前記変異体が、配列番号3のアミノ酸配列のタンパク質と同じ又は類似の機能を有し、前記類似の機能が、多量体タンパク質細孔を形成することができる単量体であり得ることであり、前記同じ機能が、細孔を形成することができる単量体であり得ること及び形成された多量体タンパク質細孔もまたヘリカーゼ活性を有することである、請求項19〜25のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質変異体が、配列番号1に示されているアミノ酸配列の421位をKからLに、又は323位をHからWに変異させることによって得られる、請求項19〜26のいずれかに記載のタンパク質。
- 前記タンパク質変異体のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号6及び配列番号7に示されている、請求項27に記載のタンパク質。
- 化学的に修飾されている、請求項19〜28のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質が、分子を1以上のシステインに連結すること、分子を1以上のリジンに連結すること、及び分子を1つ以上の非天然アミノ酸に連結すること、エピトープの酵素修飾又は末端修飾によって化学的に修飾されている、請求項29に記載のタンパク質。
- 前記1以上のシステイン又は前記1以上の非天然アミノ酸が置換によって前記タンパク質に導入されている、請求項30に記載のタンパク質。
- 前記分子が、
(a)導電性チャネルを含むタンパク質若しくは膜を含むナノポアと、標的被検体、標的ヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドとの間の相互作用を促進することができる分子アプタマー;又は
(b)ポリヌクレオチド結合タンパク質;
である、請求項30又は31に記載のタンパク質。 - 前記連結がリンカーによって達成される、請求項30〜32のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 前記分子が前記変異体の1以上の部位に連結されている、請求項30〜32のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 請求項19〜34のいずれか1項に記載の2以上のタンパク質のサブユニットを含む、多量体タンパク質。
- 前記多量体タンパク質を構成するサブユニットの数が4〜8である、請求項35に記載の多量体タンパク質。
- 前記多量体タンパク質を構成するサブユニットの数が6である、請求項35に記載の多量体タンパク質。
- 前記多量体タンパク質が、ホモ多量体又はヘテロ多量体である、請求項35〜37のいずれか1項に記載の多量体タンパク質。
- 請求項1〜14、19〜34、15〜18、及び35〜38のいずれか1項に記載のタンパク質又は多量体タンパク質の、導電性チャネルを含むナノポア又は膜の調製のための使用。
- (1)膜層;及び
(2)前記多量体タンパク質が前記膜層に埋め込まれてチャネルを形成し、膜貫通電位が印加されたとき、前記チャネルを通して電気的に伝導され得る、請求項15〜18又は請求項35〜38のいずれか1項に記載の分離された多量体タンパク質
を含む、導電性チャネルを含む膜。 - 前記膜層が、脂質層又は両親媒性ポリマーで形成される単層又は二重層の膜を含む、請求項40に記載の導電性チャネル含有膜。
- 前記脂質層が両親媒性脂質を含む、請求項40又は41に記載の導電性チャネル含有膜。
- 前記脂質層が平面脂質膜層又はリポソームから選択され、及び前記膜の単層がPMOXA−PDMS−PMOXAから形成され、PMOXAがジメチルジアゾリンを表し、PDMSがポリジメチルシロキサンを表す、請求項40〜42のいずれか1項に記載の導電性チャネル含有膜。
- 電位が印加されたときに前記チャネルを通してDNA又はRNAを転位させることができる、請求項40〜43のいずれか1項に記載の導電性チャネル含有膜。
- 以下の工程:
(a)乾燥両親媒性脂質を調製する工程;及び
(b)前記乾燥両親媒性脂質を、水性溶媒、浸透剤、及び請求項1〜11又は請求項16〜28のいずれか1項に記載のいくつかの分離されたタンパク質を含む溶液に再懸濁する工程であって、サブユニットとしての前記タンパク質が六量体タンパク質に自己組織化することができ、これを、特定の条件下で、導電性チャネルを含む膜を形成するのに十分な時間、脂質二重層膜に挿入することができる工程;
を含む、導電性チャネルを含む膜を作製する方法。 - 前記両親媒性脂質がリン脂質である、請求項45に記載の方法。
- 前記リン脂質が、以下に列挙される1以上のリン脂質:ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、1,2−ジアスカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、および1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリンから選択される、請求項46に記載の方法。
- 標的試料を特徴付けるための単分子センサ又はキットを調製するための、請求項40〜44のいずれか1項に記載の導電性チャネル含有膜の使用。
- 前記標的試料が、無機小分子、有機小分子、ポリペプチド、アミノ酸、金属イオン、ポリヌクレオチド、一本鎖核酸、又は二本鎖核酸の少なくとも1つである、請求項48に記載の使用。
- 医薬担体の調製における、請求項40〜44のいずれか1項に記載の導電性チャネル含有膜の使用。
- 請求項1〜14、19〜34のいずれか1項に記載のタンパク質、又は請求項15〜18、35〜38のいずれか1項に記載の多量体タンパク質、又は請求項40〜44のいずれか1項に記載の導電性チャネル含有膜を含む、単分子センサ又はキット。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載のタンパク質又は請求項19〜34のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする、遺伝子。
- 前記遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号2又は配列番号4に示されている、請求項52に記載の遺伝子。
- 請求項52又は53に記載の遺伝子を含む、ベクター。
- 請求項54に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 導電性チャネルを含むナノポア又は膜の調製におけるウシパピローマウイルス二本鎖DNAヘリカーゼタンパク質又はその相同タンパク質の使用であって、前記ウシパピローマウイルス二本鎖DNAヘリカーゼタンパク質のアミノ酸配列が配列番号5に示されている、使用。
- 前記ウシパピローマウイルス二本鎖DNAヘリカーゼタンパク質の相同タンパク質が、以下の表に示されるタンパク質から選択される、請求項56に記載の使用。
- (1)膜層;及び
(2)多量体タンパク質が前記膜層に埋め込まれてチャネルを形成し、バイアス電圧が印加されたとき電気的に伝導され得る、分離されたウシパピローマウイルス二本鎖DNAヘリカーゼタンパク質又はその相同タンパク質;
を含む、導電性チャネルを含む膜。 - 前記ウシパピローマウイルス二本鎖DNAヘリカーゼタンパク質のアミノ酸配列が配列番号5に示されている、請求項58に記載の導電性チャネル含有膜。
- 前記ウシパピローマウイルス二本鎖DNAヘリカーゼの相同タンパク質が以下の表から選択される、請求項58に記載の導電性チャネル含有膜。
- 前記膜層が、脂質又は両親媒性ポリマーで形成される単層または二重層の膜を含む、請求項58〜60のいずれか1項に記載の導電性チャネル含有膜。
- 前記脂質層が両親媒性脂質を含む、請求項58〜61のいずれか1項に記載の導電性チャネル含有膜。
- 前記脂質層が平面脂質膜層又はリポソームから選択される、請求項58〜62のいずれか1項に記載の導電性チャネル含有膜。
- 電位が印加されたときに前記チャネルを通してDNA又はRNAを転位させることができる、請求項58〜63のいずれか1項に記載の導電性チャネル含有膜。
- 標的試料を特徴付けるための単分子センサ又はキットの調製における、請求項58〜64のいずれか1項に記載の導電性チャネル含有膜の使用。
- 前記標的試料が、無機小分子、有機小分子、ポリペプチド、アミノ酸、金属イオン、ポリヌクレオチド、一本鎖核酸、又は二本鎖核酸の少なくとも1つである、請求項65に記載の使用。
- 医薬担体の調製における、請求項58〜64のいずれか1項に記載の導電性チャネル含有膜の使用。
- 請求項58〜64のいずれか1項に記載の導電性チャネル含有膜を含む、単分子センサ又はキット。
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