KR20220043918A - 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 및 이를 이용한 5-하이드록시발레르산 생산방법 - Google Patents

5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 및 이를 이용한 5-하이드록시발레르산 생산방법 Download PDF

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류미희
강경희
박시재
손유정
주정찬
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이화여자대학교 산학협력단
가톨릭대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 및 이를 이용한 5-하이드록시발레르산 생산방법에 관한 것이다.

Description

5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 및 이를 이용한 5-하이드록시발레르산 생산방법 {Recombinant Corynebacterium glutamicum strain for producing 5-hydroxyvaleric acid and a method of producing glutaric acid using the same}
본 발명은 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 대사 조작을 통한 5-하이드록시발레르산 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT), 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB), 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA) 및 알데하이드 리덕테아제의 활성이 강화되고, 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제의 활성이 감소 또는 불활성화된, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 및 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양하는 단계를 포함하는 5-하이드록시발레르산 생산방법에 관한 것이다.
전 세계적인 석유수급 불안과 석유자원 고갈, 지구 온난화에 대한 위기의식으로 최근 산업 바이오 기술을 이용하여 바이오매스에서 유래한 대체 생산 방법이나 대체 화합물을 생산하기 위한 전 인류적인 노력이 바이오 에너지, 바이오 플라스틱, 바이오 화합물 등의 다양한 분야에서 가시화되고 있다.
이와 같은 지속 가능한 산업 구축에 대한 사회적 요구를 반영하기 위한 전략 중 하나로, 수많은 미생물들의 신진대사를 통해, 재생 가능한 자원으로부터의 다양한 생산물의 탄소 중립적 생산이 연구되고 있다. 그러한 연구의 결과로, 다양한 아미노산, 바이오 기반 플랫폼 화학물질, 바이오 폴리머 및 폴리하이드록시알카노에이트 등의 생분해성 고분자들이 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 혹은 대장균(Escherichia coli)과 같은 재조합 박테리아를 이용하여 성공적으로 개발되고 있다.
특히, 카다베린(cadaverine), 5-아미노발레르산(5-AVA), 글루타르산(glutaric acid)과 같은 여러 C5 플랫폼 화학 물질의 바이오 기반 생산은 여러 화학 물질의 추가적인 합성을 위해 중요한 중간 화학체의 역할 및 고분자 단량체의 역할을 수행하여 광범위한 산업 분야에서 적용가능하기 때문에 활발히 연구되고 있다. 종래 연구들을 통해, L-라이신을 통한 대사 경로는 미생물 발효에서 C5 플랫폼 화학 물질을 생성하는 데 선호되는 경로로 알려진 바 있다. 따라서, GRAS(Generally Recognized as Safe) 상태의 L-라이신의 산업적 생산에 널리 사용되는 코리네박테리움 글루타미쿰의 대사 공학은 L-라이신 유래 제품의 생산을 위한 유용한 전략을 제공할 수 있을 것이다.
한편, 5-히드록시발레르산(5-HV: 5-hydroxyvaleric acid)은 그의 이중-기능적 특성으로 인해 1,5-판탄디올,δ-발레로락톤 또는 테트라히드로피렌과 같은 다양한 화학 물질의 추가 합성에 사용할 수 있는 중요한 C5 부산물 중 하나로 여겨진다. 일 예로, 5-HV 단량체를 포함하는 PHA의 생산은 생분해성과 더불어 우수한 재료 성능으로 인해 관심이 높아지고 있다.
그러나, 여러 C5 플랫폼 화학물질들의 미생물 발효 생산에 성공하였음에도 불구하고, 현재까지 5-HV 생산을 위한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 대사 공학에 대한 연구는 활발하게 이루어지지 않고 있는 실정이다. 종래 연구에서 L-라이신을 주요 전구체로 사용하여 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰에서 Pseudomonas putida davB 및 davA 유전자에 의해 암호화된 L-라이신 이화 경로를 구성함으로써 글루타르산 및 5-AVA가 성공적으로 생성되었음이 보고된 바 있다(Rohles et al. , 2016; Shin et al., 2016). 또한 5-aminovalerate transaminase와 glutarate semialdehyde dehydrogenase를 코딩하는 P. putida davT 및 davD 유전자의 추가적인 발현은 글루타르산의 효율적인 생산을 가능하게 함이 보고된 바 있다(Rohles et al., 2018; Kim et al., 2019). 다만, 5-AVA 및/또는 글루타르산을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 배양 중에는 5-HV와 같은 추정상의 부산물의 생성은 여전히 보고된 바가 없다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 인공 5-HV 생합성 경로는 글루타레이트 세미알데히드의 세포내 환원을 매개하는 적절한 알데히드 환원효소의 추가 도입과 함께 L-라이신 이화작용 경로를 조작함으로써 설계될 수 있을 것이라는 가설을 수립하였다.
그에 따라 본 발명자들은 설계된 경로를 도입한 후 부산물 경로를 제거하여 5-HV 생산을 위한 Corynebacterium glutamicum의 대사 공학을 완성하였다(도 1). 본 발명자들은 글루타레이트 세미알데히드를 5-HV로 전환할 수 있는 다양한 알데히드 환원효소 중에서 대장균의 YihU, YahK 및 YqhD를 포함한 잠재적 알데히드 환원효소 후보를 조사하였으며, 추가적으로 Corynebacterium glutamicum에서 gabD 유전자의 염색체 결실에 의해 부산물인 글루타르산 형성을 담당하는 고유 경로를 제거하였다. 그 결과, 재조합된 Corynebacterium glutamicum 균주에서의 현저히 향상된 5-HV 생산 및 감소된 글루타르산 축적을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
Rohles, C.M., Gießelmann, G., Kohlstedt, M., Wittmann, C., Becker, J., 2016. Systems metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for the production of the carbon-5 platform chemicals 5-aminovalerate and glutarate.　Microb. Cell Fact. 15(1), 154. Shin, J.H., Park, S.H., Oh, Y.H., Choi, J.W., Lee, M.H., Cho, J.S., Jeong, K.J., Joo, J.C., Yu, J., Park, S.J., Lee, S.Y., 2016. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for enhanced production of 5-aminovaleric acid.　Microb. Cell Fact. 15(1), 1-13. Rohles, C.M., Glδser, L., Kohlstedt, M., Gießelmann, G., Pearson, S., del Campo, A., Becker, J., Wittmann, C., 2018. A bio-based route to the carbon-5 chemical glutaric acid and to bionylon-6, 5 using metabolically engineered Corynebacterium glutamicum.　Green Chem. 20(20), 4662-4674. Kim, J.W., Ko, Y.S., Chae, T.U., Lee, S.Y., 2020. High-level production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol as a sole carbon source using metabolically engineered Escherichia coli.　Biotechnol. Bioeng. https://doi.org/10.1002/bit.27344
본 발명의 주된 목적은 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT), 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB), 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA) 및 알데하이드 리덕테아제의 활성이 강화된, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT)를 코딩하는 DavT 유전자, 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB)를 코딩하는 DavB 유전자, 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA)를 코딩하는 DavA 유전자 및 알데하이드 리덕테아제를 코딩하는 유전자가 도입된, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT), 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB) 및 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA)를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1벡터; 및 알데하이드 리덕테아제를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 제2벡터로 형질전환된 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로서, 내생의 gabD 유전자가 결손된, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 배양하는 단계를 포함하는 5-하이드록시발레르산 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태로 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT), 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB), 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA) 및 알데하이드 리덕테아제의 활성이 강화된, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제공한다.
본 발명에서 용어 "5-하이드륵시발레르산(5-HV: 5-hydroxyvaleric acid)"은 5-히드록시발레르산이라고도 불리며, 화학식 C5H10O3, 분자량 118의 탄소화합물이다. 불안정하고 락톤화되기 쉽다는 특징이 있으며, 다양한 화합물의 합성에 이용되어 그 활용도가 높다.
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 C.글루타미쿰 또는 C.glutamicum으로 명명될 수 있다. 상기 코리네박테리움 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 1857 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 PKC일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 PKC일 수 있다.
본 발명에서 용어 "5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT)"는 5-아미노발레르산의 글루타레이트 세미알데하이드(glutarate semialdehyde)로의 전환을 매개하는 효소이다. 상기 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제는 구체적으로, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.
본 발명에서 용어 "라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB)"는 L-라이신(L-lysine)의 5-아미노발레르아미드(5-aminovaleramide)로의 전환을 매개하는 효소이다. 상기 라이신-2-모노옥시게나아제는 구체적으로, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.
본 발명에서 용어 "델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA)" 5-아미노발레르아미드의 5-아미노발레르산(5-aminovaleric acid, 5-AVA)로의 전환을 매개하는 효소이다. 상기 델타-아미노발레르아미다아제는 구체적으로, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.
본 발명에서 용어 알데하이드 리덕테아제(aldehyde reductase)는 알데하이드 탈수소효소라고도 불리며, 알데하이드의 산화를 촉매하는 효소군이다.
상기 알데하이드 리덕테아제(aldehyde reductase)는 E. coli의 알데하이드 리덕테아제 YihU, 알데하이드 리덕테아제 YahK, 및 알데하이드 리덕테아제 YqhD로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 상기 알데하이드 리덕테아제는 알데하이드 리덕테아제 YahK일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 알데하이드 리덕테아제 YihU는 구체적으로 서열번호 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있고, 상기 알데하이드 리덕테아제 YahK는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으며, 상기 알데하이드 리덕테아제 YqhD는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "단백질 활성의 강화"는 상기 미생물이 내재적 또는 변형 전에 나타내는 단백질의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 내재적 활성에 비하여 증가 또는 향상된 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 강화는 단백질이 미생물 내에 도입되거나, 미생물 내에서 발현되도록 변형된 상태를 의미하는 것일 수 있고, 상기 단백질이 미생물 내 존재하는 유전자 또는 단백질인 경우 내재적 또는 변형 전에 비하여 그 활성이 증가된 상태를 의미한다. 이 때 상기 "단백질의 도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성을 나타나게 되는 것 또는 해당 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타나게 되는 것을 의미한다. 예를 들면, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전의 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 의미한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 단백질의 활성 강화는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법; 상기 단백질의 활성이 강화되도록 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 변이를 추가적으로 도입시키는 방법; 및 미생물에 단백질을 도입하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 단백질 활성을 강화시키는 방법이라면 어떠한 것이라도 적용될 수 있음은 당업자에게 자명하다.
상기에서 유전자의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입되는 것일 수 있다. 또는, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포의 염색체 내에 도입되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다.
다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
이와 같은 단백질 활성의 도입 및 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형 혹은 조작되지 않은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서의 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로, 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT), 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB), 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA) 및 알데하이드 리덕테아제의 활성이 강화되고, 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제의 활성이 감소 또는 불활성화된, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주가 제공된다.
본 발명에서 용어 "숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제 (SSD: Succinate Semialdehyde Dehydrogenase)"은 숙시네이트 세미알데하이드를 숙시네이트로 전환하는데 관여하는 효소로, 글루타레이트 세미알데하이드의 글루타르산으로의 전환을 매개할 수 있는 것으로도 알려져 있다. 상기 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제는 NAD- 또는 NADP- 의존적 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제일 수 있다. 상기 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 davT,B,A 단백질 서열정보 및 상기 알데하이드 리덕테아제 단백질의 서열정보는 미국생물공학정보센터(NCBI) 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 또한 본 발명에서 '특정 서열번호의 아미노산 서열을 포함하는 단백질'이라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다.
본 발명에서 용어, "단백질 활성의 감소 또는 불활성화"는 상기 코리네박테리움 글루타미쿰이 내재적 또는 변형 전에 나타내는 단백질의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되거나, 감소되거나, 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 감소 또는 불활성화는 단백질의 활성이 약화되도록 변이된 것일 수 있고, 상기 변이는 비자연적으로 발생된 것일 수 있고, 유전적 변이를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적상, 상기 단백질은 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 단백질 활성의 감소 또는 불활성화는 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 단백질의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 단백질 활성을 감소 또는 불활성화시키는 방법이라면 어떠한 것이라도 적용될 수 있음은 당업자에게 자명하다.
본 발명의 다른 일 양태로 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT)를 코딩하는 DavT 유전자, 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB)를 코딩하는 DavB 유전자, 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA)를 코딩하는 DavA 유전자 및 알데하이드 리덕테아제(aldehyde reductase)를 코딩하는 유전자가 도입된, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제공한다.
본 발명에서의 용어, 유전자의 "도입"은 벡터 상에 자가 프로모터 또는 강화된 별개의 프로모터와 함께 상기 유전자들을 클로닝하여 코리네박테리움 글루타미쿰에 형질전환시키거나 상기 유전자가 염색체상에 삽입되도록 함으로써 수행되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 DavT 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davT)은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 DavB 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davB)은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 DavA 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davA)은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 알데하이드 리덕테아제(aldehyde reductase)는 E. coli의 알데하이드 리덕테아제 YihU, 알데하이드 리덕테아제 YahK, 및 알데하이드 리덕테아제 YqhD 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 알데하이드 리덕테아제 YihU를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(YihU)은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 알데하이드 리덕테아제 YahK를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(YahK)은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 알데하이드 리덕테아제 YqhD를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(YqhD)은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 davT,B,A 유전자의 서열정보 및 상기 알데하이드 리덕테아제 유전자의 서열정보는 미국생물공학정보센터(NCBI) 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 또한 본 발명에서 '특정 서열번호의 뉴클레오티드 서열'이라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 뉴클레오티드로 이루어진 유전자와 동일 혹은 상응하는 기능 및 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 치환, 변형 또는 부가된 염기 서열을 갖는 유전자도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다.
즉, 본 발명에서 '특정 서열번호의 아미노산 서열을 포함하는 단백질', '특정 서열번호의 뉴클레오티드 서열'이라고 기재되어 있다 하더라도, 각각 해당 서열번호의 아미노산 서열 혹은 뉴클레오티드로 이루어진 단백질 혹은 유전자와 동일 혹은 상응하는 기능 및 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 서열을 갖는 단백질 혹은 유전자도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들면, '서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질'은, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질'에 속할 수 있음은 자명하다.
본 발명에서 용어 '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어, 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들면, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들면, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들면, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 양태에서, 상기 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT)를 코딩하는 DavT 유전자, 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB)를 코딩하는 DavB 유전자, 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA)를 코딩하는 DavA 유전자 및 알데하이드 리덕테아제(aldehyde reductase)를 코딩하는 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 도입하여 형질전환시키는 것은 하나 이상의 발현벡터를 이용하여 이루어지는 것일 수 있다.
상기 용어 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물(상기 폴리뉴클레오티드)이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 발현벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 삽입된 외래 DNA가 발현될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다.
상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
상기 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 형질전환에 사용될 수 있는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포 모두를 포함할 수 있으며, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 사용될 수 있다. 예를 들어, 에스케리키아, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10 등의 동물 세포 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
형질전환은 폴리뉴클레오티드를 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아-매개 형질전환, PEG(polyethylene glycol), 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 입자 충격법(particle bombardment) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
상기 발현벡터는 히스티딘-태그(polyhistidine-tag, His-tag)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 히스티딘-태그는 6개 이상의 히스티딘(histidine) 잔기(residue)로 구성된 아미노산 모티프로, 본 발명에서는 6개의 히스티딘-태그를 사용한다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 히스티딘-태그는 DavB를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davB)의 N-말단에 위치할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 발현벡터에 포함된 프로모터는 전사를 시작하는데 필요한 서열로, pL프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터, 합성 프로모터 등을 사용하는 것이 일반적이나, 최적의 발현세기를 나타내기 위해 구체적으로 합성 프로모터인 H30 프로모터를 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태로 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT)를 코딩하는 DavT 유전자, 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB)를 코딩하는 DavB 유전자, 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA)를 코딩하는 DavA 유전자 및 알데하이드 리덕테아제(aldehyde reductase)를 코딩하는 유전자가 도입되고, 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 내생의 유전자 gabD가 결손 또는 약화된, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제공한다.
본 발명에서의 용어, 유전자의 "결손"은, 예를 들어 유전체 상에서 상기 유전자 부위를 결실시키거나 특정 유전자 서열을 삽입하여 단백질 서열을 변형시켜 수행되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 특정 유전자 서열의 삽입은 당업계에서 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합에 의하여 이루어질 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명에서의 용어, 유전자의 "약화"는 예를 들어, 상기 유전자의 프로모터 부위 및 5'-UTR 부위의 염기서열을 변형시킴으로써 단백질의 발현을 약화시키거나 또는 해당 유전자의 코딩 영역(open reading frame) 부위에 변이를 도입하여 효소의 활성을 약화시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다
상기 내생의 gabD 유전자란 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자로, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주가 천연적으로 가지고 있는　gabD　유전자를 의미한다.
본 발명에서의 일 구현예로, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 gabD　유전자의 서열정보는 미국생물공학정보센터(NCBI) 등의 공지된 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 본원의 구체적인 실시예에서는, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 내생의gabD　유전자를 결손시켜 이용하였다. 이 때 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 내생의 gabD 유전자의 염기서열은 서열번호 7에 나타내었다.
본 발명의 비제한적인 구체적 일 양태로, 상기 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT), 상기 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB) 및 상기 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA)를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1벡터; 및 상기 알데하이드 리덕테아제를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 제2벡터로 형질전환된 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 내생의 gabD 유전자가 결손된, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제공한다.
본 발명의 비제한적인 구체적 또 다른 일 양태로, davT, davB 및 davA 를 포함하는 pCES208 발현벡터; 및 YahK가 포함된 pBL712 발현벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 내생의 gabD 유전자가 결손된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태로, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 이용하여, 5-하이드록시발레르산을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 5-하이드록시발레르산 생산방법은 구체적으로 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양하여 배양물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서 상기 방법은 상기 수득한 배양물로부터 5-하이드록시발레르산을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 전술한 바와 동일하게 이해될 수 있다. 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, davT, davB 및 davA 를 포함하는 pCES208 발현벡터; 및 YahK가 포함된 pBL712 발현벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 내생의 gabD 유전자가 결손된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미하며 플라스크배양(flask culture), 회분식 배양(batch culture), 유가식 배양(fed-batch culture)등이 포함될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 배양은 유가식 배양 일수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로 미생물의 발효 개시 전에 질소원이 포함된 배지를 첨가하는 것은 회분식 배양(batch culture)으로 균체증식 또는 물질생산에 필요한 모든 영양소를 함유한 배지를 접종하여 미생물 배양을 하는 것으로, 배양 중에는 새로운 배지의 첨가가 어렵다.
또한, 미생물의 발효시에 질소원이 포함된 배지를 첨가하는 것은 유가식 배양(fed-batch culture)으로 하나 이상의 영양소가 포함된 배지를 발효 개시 직후 또는 배양물이 어떤 단계에 도달한 후에, 또는 공급된 영양소가 배양물로부터 고갈되는 경우, 배양물에 연속적으로 공급하는 방식의 배양을 의미한다. 유가식 배양에서는 일반적으로 단일 영양소, 탄소원이 성장의 제한인자가 된다. 다른 종류의 영양소 제한을 이용할 수도 있는데, 예를 들면 질소원에 의한 제한, 산소에 의한 제한, 황에 의한 제한 및 인에 의한 제한 등이 있다. 본 발명의 목적상 재조합 벡터가 포함된 미생물의 발효시 질소원이 포함된 배지를 연속적으로 공급하는 것을 포함할 수 있다.
배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 탄산 칼슘을 사용하여 적정 pH 를 유지할 수 있고, 쉐이킹 속도를 조절하여 호기성 조건을 유지할 수 있다.
본 발명의 목적상 배지는 세포를 배양하는데 사용되는 배지, 목적하는 물질의 생산을 극대화하는데 사용되는 배지 등을 모두 포함한다.
구체적으로 "세포 배양 배지" 또는 "배양 배지" 는 다세포 유기체 또는 조직의 외측인 인공적인 시험관 내 환경에서 세포의 유지, 성장, 증식 또는 팽창을 위한 영양소 용액을 의미한다. 세포 배양 배지는 특정 세포 배양용으로 최적화될 수 있으며, 그 예로는 세포 성장의 지지를 위해 조제된 기본 배양 배지, 또는 목적 물질의 생산을 촉진하도록 조제된 세포 배양 생산 배지, 영양소들을 고농도로 농축시켜 만든 농축 배지일 수 있다. 영양소, 배지 성분이란 용어들은 배지를 구성하는 구성성분을 의미하는 것으로, 본 명세서에서 호환 사용되고 있다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 코리네박테리움 글루타미컴 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당 원으로는 글루코스, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인의 원료로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다.
구체적으로, "기본 배양 배지" 또는 "기본 배지"란 용어는 최소한의 세포의 성장을 지지할 수 있는 배지를 의미한다. 기본 배지는 탄소원, 질소원 이외에 비타민, 무기염류를 공급하는 배지를 의미한다.
또한 구체적으로, "세포 배양 생산 배지" 또는 "생산 배지"란 용어는 생물반응기에서 목적 물질의 발현을 극대화할 목적으로 사용되는 배지를 말한다. 생산배지는 기본배지와 동일하거나 달라질 수 있고, 만약 달라질 경우 기본배지 자체를 농축하거나 기본배지에 특정 성분들을 추가하는 방법으로 제작할 수 있다.
또한, "피딩(feeding) 배지" 및 "추가 배양배지"는 특정 영양소 또는 복수의 영양소로 구성된 배지로서 전부 기본배지의 농축 산물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자가 배양하는 세포에 따라 피딩 배지의 구성성분과 농도를 다양하게 제작할 수 있다.
본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰의 대사경로 엔지니어링을 통해, 기존에는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 L-라이신 이화경로로부터 거의 생성되지 않던 추정상의 부산물인, 5-HV을 생산하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 및 이를 이용한 5-HV의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 사용할 경우 5-HV의 경쟁적 산물인 글루타르산의 축적이 감소하며 5-HV 생산량이 현저히 증가되어 효율적인 5-HV의 생산이 가능하다. 아울러, 본 발명에서 제공하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 사용하여 유가식 발효를 수행할 경우, 5-HV 생산이 현저히 증가됨을 확인하여, 보다 효율적인 5-HV의 생산을 가능케 한다.
도 1은 C. 글루타미쿰에서의 5-HV 생산을 위한 엔지니어링 전략의 개략도를 모식화한 도면이다. 이 때, 표시된 약어의 의미는 다음과 같다: GLU, glucose; OAA, oxaloacetate; L-LYS, L-lysine; 5-AVAM, 5-aminovaleramide; 5-AVA, 5-aminovaleric acid; GSA, glutarate semialdehyde; GTA, glutaric acid; 5-HV, 5-hydroxyvaleric acid; AR, aldehyde reductase.
도 2는 플라스크 배양에서의 재조합 C. 글루타미쿰 균주에 의한 L-라이신, 5-AVA, 글루타르산 및 5-HV의 생산을 나타낸 도면이다.
도 3은 재조합 C.글루타미쿰 균주에 의한 L-라이신, 5-AVA, 글루타르산 및 5-HV 생산량, glucose 농도, 및 세포 성장(OD600)의 시간에 따른 변화를 나타낸다. 구체적으로, 도 3a는 C. glutamicum 5HV-1, 도 3b는 C. glutamicum 5HV-2, 도 3c는 C. glutamicum 5HV-3 균주를 이용한 경우를 나타낸다.
도 4는 플라스크 배양에서의 재조합 C. 글루타미쿰 ΔgabD 균주에 의한 L-라이신, 5-AVA, 글루타르산 및 5-HV의 생산을 나타낸 도면이다.
도 5는 회분식 발효에서의 재조합 C. 글루타미쿰 ΔgabD 균주에 의한 L-라이신, 5-AVA, 글루타르산 및 5-HV 생산량, glucose 농도, 및 세포 성장(OD600)의 시간에 따른 변화를 나타낸다. 구체적으로 도 5a는 C. glutamicum 5HV-4 균주를, 도 5b는 C. glutamicum 5HV-5 균주를 이용한 경우를 나타낸다.
도 6은 유가식 발효에서의 재조합 글루타미쿰 5HV-4에 의한 L-라이신, 5-AVA, 글루타르산 및 5-HV 생산량, glucose 농도, 및 세포 성장(OD600)의 시간에 따른 변화를 나타낸다.
도 7은 C. glutamicum KCTC 1857 및 C. glutamicum PKC 균주 각각의 L-라이신, 5-AVA, 글루타르산 및 5-HV 생산량을 나타낸다.
도 8은 pCES208H30eGFP 및 pBL712H30mCherry를 포함하는 C. 글루타미쿰 PKC의 FACS 분석결과를 나타낸다. 이 때, 균주의 형광 강도는 24시간 배양 후 측정되었다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1-1. 플라스미드 및 박테리아 균주의 준비
본 연구에 사용된 모든 화학물질은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 사용된 모든 박테리아 균주 및 플라스미드는 하기 표 1에 나타내었다.
Strains and plasmids Relevant characteristics Reference or source
Strains
E. coli XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [FA1proAB lacI q Z△M15 Tn10 (TetR)] Stratagene
C. glutamicum PKC An expired industrial l-lysine-producing strain Kim et al. 2018
C. glutamicum KCTC 1857 An expired industrial l-lysine-producing strain KCTC; Kim et al. 2019
C. glutamicum 5HV-1 C. glutamicum PKC harboring pCES208H30DavTBHisA and pBL712H30YihU This study
C. glutamicum 5HV-2 C. glutamicum PKC harboring pCES208H30DavTBHisA and pBL712H30YahK This study
C. glutamicum 5HV-3 C. glutamicum PKC harboring pCES208H30DavTBHisA and pBL712H30YqhD This study
C. glutamicum △gabD C. glutamicum PKC △gabD This study
C. glutamicum 5HV-4 C. glutamicum PKC △gabD harboring pCES208H30DavTBHisA and pBL712H30YahK This study
C. glutamicum 5HV-5 C. glutamicum PKC △gabD harboring pCES208H30DavTBHisA and pBL712H30YqhD This study
Plasmids
pCES208H30DavTBHisA pCES208 derivative; PH30, P. putida KT2440 davTB His A; Kmr This study
pCES208H30eGFP pCES208 derivative; PH30, eGFP; Kmr This study
pBL712H30-MCS Expression vector; PH30, Ralstonia eutropha PHA biosynthesis genes transcription terminator; Spr This study
pBL712H30mCherry pBL712 derivative; PH30, mCherry; Spr This study
pBL712H30YihU pBL712 derivative; PH30, E. coli yihU; Spr This study
pBL712H30YahK pBL712 derivative; PH30, E. coli yahK; Spr This study
pBL712H30YqhD pBL712 derivative; PH30, E. coli yqhD; Spr This study
pK19mobSacBGabD pK19mobSacB derivative; gabD deletion vector; designed to delete 500 nt in-frame This study
E. coli XL1-Blue(Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 유전자 클로닝 작업에 사용하였으며 모든 DNA의 조작은 표준 절차(Sambrook 및 Russell, 2001)를 준수하여 수행하였다. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. 5-HV 생산을 위한 숙주 균주로는 expired 산업용 L-라이신 생산 C. glutamicum PKC 균주(Kim et al., 2018) 및 그의 변이체를 이용하였다.
또한, 사용된 프라이머는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
서열번호 Primer Sequence (5'-3') Purpose
15 DavBhis-F GGATCCATGCACCATCATCACCATCACATGAACAAGAAGAACCGCCACCC DavBHis
16 DavBhis-R GCGGCCGCTTAATCTGCCAGGGCGATCGGG
17 DavA-F GCGGCCGCAGGAGATATACATATGCGCATCGCACTGTACCAAG DavA
18 DavA-R GCGGCCGCTTAGCCTTTACGCAGGTGCAG
19 DavT-F GGATCCAGGAGATATACATATGAGCAAAACCAACGAATCCTTG DavT
20 DavT-R AGATCTATGTATATCTCCTTTAGGCGATTTCAGCGAAGCAC
21 H30-F GCGCTCGAGAAAGTAACTTTTCGGTTAAGGTAGC H30 promoter
22 H30-R GCGGAATTCCAATATACTCCTGCCCAACCAAC
23 pBL1-F GACGTCATTCGGGGTCGTTCACTGG pBL1 origin
24 pBL1-R CTCGAGCAACAACAAGACCCATCATAGTTTG
25 Sp-F GACGTCGGTTTTTTGCTGAAACCTCAGGC Spectinomycin resistant gene
26 Sp-R ACTAGTCTCACGCCCGGAGCGTAGCGAC
27 eGFP-F GGATCCAGGAGATATACATATGGTGAGCAAGGGCGAGG eGFP
28 eGFP-R GCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG
29 mCherry-F GAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGG mCherry
30 mCherry-R GGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC
31 YihU-F GAATTCATGGCAGCGATAGCATTCATTGGTCTTG YihU
32 YihU-R GGTACCTTACATTTTTACCTTTGCGGTCATTCCAGC
33 YahK-F GGATCCAGGAGATATACATATGAAGATCAAAGCTGTTGGTGC YahK
34 YahK-R AGATCTATGTATATCTCCTTCAGTCTGTTAGTGTGCGATTATC
35 YqhD-F GGATCCAGGAGATATACATATGAACAACTTTAATCTGCACACCC YqhD
36 YqhD-R AGATCTATGTATATCTCCTTTAGCGGGCGGCTTCGTATATAC
37 GabD1-F CGATCTCCGTGATCGAATCC 500-bp of upstream region of gabD gene
38 GabD1-R GCTCATGTGTTCTAGATTTTAGCCCACCTTCTGGTG
39 GabD2-F TGGGCTAAAATCTAGA ACACATGAGCTGTCCGGTGA 500-bp of downstream region of gabD gene
40 GabD2-R CGGGGTGGCAGGGTTAACTC
41 GabD-F CCTGCAGGCGATCTCCGTGATCGAATCC 1000-bp DNA fragment of upstream and downstream of gabD gene
42 GabD-R GAATTCCGGGGTGGCAGGGTTAACTC
모든 프라이머는 바이오니아(대전, 한국)에서 합성하였다. 글루타레이트 세미알데하이드(glutarate semialdehyde) 생성에 관여하는 유전자는 플라스미드 pCES208H30DavTDBHisA에서 증폭하였다(Kim et al., 2019). 먼저, DavB의 N-말단 영역에 His6-tag를 포함하는 davBHis 유전자를 프라이머 DavBhis-F 및 DavB-R을 사용하여 PCR로 증폭하였다. PCR 산물을 BamHI 및 NotI로 분해하고 BamHI-NotI로 분해된 pCES208H30 플라스미드와 연결하여 pCES208H30DavBHis를 제조하였다. 다음으로, 프라이머 DavA-F 및 DavA-R을 사용하여 PCR에 의해 davA 유전자를 증폭시켰다. 증폭된 단편을 pCES208H30DavBHis의 NotI 부위에 삽입하였다. 유사하게, 프라이머 DavT-F 및 DavT-R을 사용하여 PCR에 의해 증폭된 davT 유전자를 BamHI 및 BglII로 분해하고 BamHI 부위에서 pCES208H30DavBHisA로 클로닝하여 pCES208H30DavTBHisA를 제조하였다.
발현 벡터, pKE112-MCS(Park et al., 2013)를 H30 프로모터, pBL1 원점 및 스펙티노마이신(spectinomycin) 내성 유전자를 갖도록 변형하였다. 먼저, pKE112-MCS의 tac 프로모터를 XhoI/EcoRI 사이트에서 프라이머 H30-F 및 H30-R을 사용하여 pCES208H30에서 증폭된, H30 프로모터로 교체하여 pKE112H30-MCS를 제조하였다. 다음으로, 프라이머 pBL1-F 및 pBL1-R을 사용하여 PCR에 의해 증폭된 pBL1 원점을 AatII 및 XhoI로 분해하고 pKE112H30-MCS의 동일한 제한 효소 부위에 클로닝하여 pBL112H30-MCS를 제조하였다. 합성된 스펙티노마이신 내성 유전자를 AatII 및 SpeI로 분해하고 AatII/SpeI로 분해된 pBL112H30-MCS에 클로닝하여 pBL712H30-MCS를 제조하였다.
하기FACS(fluorescence-activated cell sorting) 분석을 위해, 형광 단백질의 발현을 위한 벡터를 구축하기 위해 플라스미드 pCES208V:eGFP(Baritugo et al., 2018b) 및 플라스미드 pFA-Frm-GESS(Lee et al., 2019)로부터 각각 eGFP-F, eGFP-R 및 mCherry-F, mCherry-R 프라이머를 사용하여 PCR로 egfp 유전자와 mcherry 유전자를 증폭하였다. 그런 다음, 각 PCR 산물을 pCES208H30과 pBL712H30-MCS에 각각 클로닝하여 pCES208H30eGFP와 pBL712H30mCherry를 제조하였다.
또한, E. coli의 3가지 aldehyde reductase 인코딩 유전자인 yihU, yahK 및 yqhD를 E. coli XL1-Blue의 염색체 DNA에서 상응하는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 각 PCR 산물을 pBL712H30-MCS에 클로닝하여 pBL712H30YihU, pBL712H30YahK 및 pBL712H30YqhD를 각각 제조하였다.
다음으로, C. glutamicum PKC 염색체에서의 gabD 유전자 결손을 위해, 플라스미드 pK19mobSacBGabD를 제조하였다. 먼저, GabD1-F 및 GabD1-R 프라이머를 사용하여 C. glutamicum PKC 염색체의 DNA로부터 gabD 유전자의 업스트림 영역 500bp를 PCR로 증폭하였다. 다음으로, 프라이머 GabD2-F 및 GabD2-R을 사용하여 C. glutamicum PKC 염색체의 DNA로부터 gabD 유전자의 다운스트림 영역 500-bp을 증폭하였다. 그런 다음, gabD 유전자 업스트림 및 다운스트림의 완전한 1000-bp DNA 단편을, 프라이머 GabD-F 및 GabD-R를 사용하여 2개의 500-bp 단편을 주형으로 중첩 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 생성물을 SbfI 및 EcoRI로 분해하고 SbfI-EcoRI로 분해된 pK19mobSacB와 결찰시켜 pK19mobSacBGabD를 제조하였다. 플라스미드 pK19mobSacBGabD를 사용하여 염색체에서 gabD 유전자를 결실시켜 상동 재조합을 통해 C. 글루타미쿰 △gabD 균주를 구축하였다.
실시예1-2. 배양 조건
DNA 조작을 위해 kanamycin(Km, 30μg/ mL) 및 스펙티노마이신(Sp, 40㎍/mL)이 플라스미드의 내성 마커에 따라 첨가된, Luria-Bertani(LB) 배지(리터당 10g 트립톤, 5g 효모 추출물 및 10g NaCl 함유)를 배양에 사용하였다.
플라스크에서 재조합 C. glutamicum 균주를 배양하여 5-HV를 생산하기 위해 CG50 배지를 사용하였다(Kim et al., 2018). CG50 배지는 리터당: 포도당 50g, 효모 추출물 30g, 30 g (NH4)2SO4·7H2O, 0.5 g KH2PO4, 0.5 g MgSO4·7H2O, 0.01 g MnSO4·H2O, 0.01 g FeSO4·7H2O, 0.5 mg biotin, 0.3 mg thiamine-HCl, 및 15 g/L CaCO3을 함유한다. 종자 배양물은 RG(Recovery Growth) 배지가 함유된 14mL 둥근 바닥 튜브에서 250rpm의 회전식 진탕기로 오버나이트(overnight)로 30°C에서 준비되었다(Baritugo et al., 2018b). 다음으로, 2mL의 오버나이트로 배양한 배양물을 250rpm의 회전식 진탕기에서 30°C의 CG50 배지 20mL를 포함하는 250mL 진탕 플라스크로 옮겼다. 재조합 C. glutamicum 균주에 대해 각각 20㎍/mL 및 200㎍/mL의 Km 및 Sp를 배양 배지에 첨가하였다. 모든 플라스크 배양은 삼중으로 수행하였다.
회분식 발효는 30°C 및 600rpm에서 500mL의 CG100 배지를 포함하는 2.5L jar 발효기(BioCNS, Korea)에서 수행되었다. CG100 배지는 리터당: 효모 추출물 30g, (NH4)2SO430g, 포도당 100g, 0.5 g KH2PO4, 0.5 g MgSO4·7H2O, 0.01 g FeSO4·7H2O, 0.01 g MnSO4·1H2O, 0.5 mg biotin, 및 0.3 mg thiamine-HCl을 함유한다. 배양 pH는 28%(v/v) 암모니아 용액에 의해 6.9로 조절되었다. 회분식 배양 동안 Antifoam 289를 첨가하여 거품 형성을 억제하였다. 250 rpm 및 30 ℃에서 12시간 동안 50 mL의 CG50 배지를 함유하는 500 mL 진탕 플라스크에 2 mL의 오버나이트로 배양한 배양물을 접종하여 종자 배양물을 제조하였다.
유가식 발효는 30 °C 및 1000 rpm에서 1 L의 CG100 배지를 포함하는 5 L jar 발효기(Satorius, USA)에서 수행되었다. 배양 pH는 28%(v/v) 암모니아 용액에 의해 6.9로 조절되었다. 유가식 발효 동안 Antifoam 289를 첨가하여 거품 형성을 억제하였다. 유가식 발효는 10-20g/L를 유지하기 위해 포도당 수준에 따라 공급 용액을 첨가하는 연속식 공급에 의해 수행되었다. 포도당 농도를 10-20g/L로 유지하기 위해 공급 용액을 첨가하였다. 공급 용액에는 리터당: 850g 포도당, 270 g (NH4)2SO4·7H2O, 및 500 mg MgSO4·7H2O 이 포함하였다
실시예1-3. FACS(fluorescence-activated cell sorting) 분석
FACS 분석이 C. glutamicum에서 구성된 이중 벡터 시스템의 기능과 적용 가능성을 조사하는 데 사용되었다. pCES208H30eGFP 및 pBL712H30mCherry 플라스미드를 모두 포함하는 재조합 C. glutamicum PKC를 CG50 배지에서 각각 30°C 및 250rpm에서 배양하였다. 다음으로, 세포를 24시간 후에 수확하고 인산완충식염수(PBS) 완충액을 사용하여 희석하였다. FACS 분석(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)은 아르곤 이온 레이저(blue, 488nm)와 대역 통과 필터(green, FITC, 530 nm ± 15 nm; red, PE, 585 nm ± 42 nm)를 사용하여 각 샘플의 100,000개 클론에 대해 수행하였다.
실시예1-4. 분석 절차
UV-1700 분광광도계(Shimadzu, Japan)를 사용하여 600 nm(OD600)에서 흡광도를 측정하여 세포 성장을 모니터링하였다. 포도당, 5-HV 및 글루타르산의 농도는 굴절률 검출기(RID) 및 Bio-RAD Aminex HPX-87H컬럼이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피[HPLC, Infinity 1260(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)]로 분석되었다. 용출(elution)은 5mM의 H2SO4에서 50°C, 0.8mL/min의 유속으로 수행되었다. 5-AVA와 L-라이신의 농도는 VWD(Variable Wavelength Detector)와 C18 column(RStech, DaeJeon, Korea)이 장착된 HPLC로 DEEMM 방법(Kim et al., 2015)에 따라 분석하였다. 이동상 A(아세토니트릴) 및 이동상 B(25mM 아세트산나트륨 완충액, pH 4.8)를 사용하여 용출을 수행하였다. 유속은 1mL/min이었고 분석물은 284nm에서 다음과 같은 농도구배 프로그램으로 검출되었다: 0-2분, 20-25% A; 2-32분, 25-60% A; 32-40분, 60-20%.
실시예 2-1. 각 C. 글루타미쿰 균주에서의 5-HV 생합성 능력의 조사
5-HV는 Clostridium aminovalericum에 의해 5-AVA가 아세테이트(acetate), 프로피오네이트(propionate), 발레레이트(valerate) 및 암모니아로 분해되는 대사 경로에서 발견되는 중간체이며, 여기서 5-AVA는 글루타레이트 세미알데히드로 전환된 다음 5-HV로 환원된다(Barker et al., 1987). C. aminovalericum의 5-AVA 분해 경로와 P. putida의 L-lysine 이화 경로가 5-AVA 및 glutarate semialdehyde와 같은 특정 대사산물을 공유한다는 점을 감안할 때, 5-HV 생산을 위한 인공적 경로는 적절한 알데히드 환원효소를 추가로 도입하여 L-라이신 이화작용 경로를 재구성함으로써 L-라이신으로부터 합리적으로 설계될 수 있다. 본 발명자들의 이전 연구에서, 5-AVA및 글루타르산의 생산을 위한 이종성 P. putida L-lysine 이화 경로는 C. glutamicum에서 각각 davBA 유전자 및 davTDBA 유전자를 발현시킴으로써 성공적으로 설계되었다(Joo et al., 2017; Kim et al., 2019; Shin et al., 2016). L-라이신 이화 경로의 중간체인 글루타레이트 세미알데하이드는 글루타르산과 5-HV 모두로 전환될 수 있으나, davTDBA를 발현하는 C. 글루타미쿰 KCTC 1857의 배양 동안에는 글루타르산의 고수준 생산을 위해 5-HV는 생성되지 않았다(Kim et al., 2019). 따라서 플라스미드에서 davD 유전자의 발현이 글루타르산에 대한 더 높은 대사 플럭스를 지원하여 검출 가능한 수준의 5-HV 없이 글루타르산의 생산을 초래하는 것으로 가정하였다. 그리하여, 본 발명자들은 먼저 davD 유전자 없이 davTBA 유전자만을 발현하는 C. 글루타미쿰에 의해 5-HV가 생성될 수 있는지 여부를 실험하였다.
C. glutamicum KCTC 1857 및 PKC 두 균주는 모두 L-lysine을 주요 전구체로 사용하여 글루타르산 및 카다베린(cadaverine) 생산에 성공적으로 사용되었기 때문에 5-HV 생산을 위한 숙주 균주로 평가되었다(Kim et al., 2019, 2020). 또한 davB의 N-말단 영역에 His6-태그를 도입하면 재조합 C. 글루타미쿰 균주에서 글루타르산의 생산 증가를 지원하는 것으로 보고된 바 있다(Kim et al., 2019). 따라서, L-라이신을 글루타레이트 세미알데히드로 전환시키기 위해 N-말단에 His6-tag가 융합된 davB와 함께 davTA 유전자를 발현하는 pCES208H30DavTBHisA를 제작하였고, C. 글루타미쿰 KCTC 1857 및 PKC 두 균주에 형질 전환시켰다. 두 균주 각각 0.21 ± 0.05 g/L 및 0.29 ± 0.12 g/L농도의 5-HV를 생성할 수 있으며, 이는 이러한 재조합 C. 글루타미쿰 균주에서 알려지지 않은 내인성 알데히드 환원효소에 의해 글루타레이트 세미알데히드가 5HV로 환원될 수 있음을 시사한다. 5-HV가 L-라이신 이화작용 경로를 통해 생산될 수 있음이 확인되었으나, 재조합 C. 글루타미쿰 KCTC 1857 및 PKC 균주에 의해 각각 0.79 ± 0.31 g/L 및 0.88 ± 0.16 g/L의 더 높은 농도의 글루타르산이 수득되었다. 이러한 결과는 글루타레이트 세미알데하이드의 글루타르산으로의 전환을 매개하는 내인성 숙신산(succinate) 세미알데하이드 디하이드로게나제 (gabD에 의해 암호화됨; Shin et al., 2016; Kim et al., 2019) 의 존재로 인해 davD 유전자의 발현 없이도 글루타르산으로의 대사 플럭스가 5-HV으로의 플럭스보다 여전히 선호됨을 시사한다. 두 균주 모두 5-HV 생산 및 글루타르산 형성에 대한 비슷한 능력을 보여주었기 때문에, L-라이신 이화 경로에 대한 더 높은 흐름을 갖는 균주를 확인하기 위해 davTBhisA 유전자를 도입하여 생성된 다른 대사산물을 모니터링 하였다. 그 결과 C. glutamicum PKC는 C. glutamicum KCTC 1857(L-lysine, 2.99 ± 0.42g/L, 5-AVA, 0.44 ± 0.11g/L)보다 L-라이신 및 5-AVA의 더 높은 생산을 나타내었다(6.98 ± 1.47 g/L). 따라서, C. 글루타미쿰 PKC 균주를 사용하여 하기와 같은 추가적 조작을 수행하였다.
실시예2-2. C. 글루타미쿰에서 구성된 듀얼 벡터 시스템의 기능 검증
제어된 방식에서의 다중 유전자의 동시 발현은 외래 대사 산물을 생산하는 대사 경로의 효율적인 작동에 있어 중요하다. 그러나, 단일 폴리시스트론 벡터를 기반으로 하는 이종 대사 경로를 코딩하는 다중 유전자의 발현 시스템은 종종 플라스미드 상의 다운스트림 유전자의 낮은 전사 효율을 초래한다. 목적 유전자의 안정적인 발현을 위해 다양한 선택 마커 및 호환 가능한 레플리콘을 보유하는 다중 플라스미드 기반의 발현 시스템이 사용되었다(Akiba 및 Tsumoto, 2016; Sørensen 및 Mortensen, 2005). 최근,C. 글루타미쿰에 대한 호환 가능하고 이중 유도성의 셔틀 발현 벡터가 여러 유전자의 동시 발현을 엄격하게 조절하는 것으로 입증된 바 있다(Gauttam et al., 2019). C. 글루타미쿰에서 5-HV 생합성 경로에 관여하는 다중 표적 유전자의 공동 발현을 위한 대사 공학적 접근을 확장하기 위해, 본 발명자들은 pHM1519/p15a 및 pBL1/ColE1 레플리콘을 수반하는 pCES208H30 및 pBL712H30-MCS를 포함하는 듀얼 벡터 시스템을 구축하였다
C. glutamicum PKC에서의 듀얼 벡터 시스템의 기능성과 적용 가능성은 두 형광 단백질 eGFP 및 mCherry를 발현시키고, FACS를 통해 형광 수준을 측정하여 검증하였다. C. 글루타미쿰 PKC에서 egfp 및 mcherry 유전자를 발현시키기 위해, 각각 eGFP 및 mCherry를 함유하는 플라스미드 pCES208H30eGFP 및 pBL712H30mCherry를 구축하고 두 플라스미드를 동시에 C. 글루타미쿰 PKC에 도입하였다. 도 8에서 볼 수 있듯이 pCES208H30eGFP와 pBL712H30mCherry를 포함하는 C. glutamicum PKC는 두 형광 단백질을 안정적으로 동시 발현하고 발현 수준을 유지할 수 있었다. C. glutamicum에서 듀얼 벡터 시스템이 잘 작동함을 확인하여, 따라서, 개발된 듀얼 벡터 시스템을 기반으로 5-HV 생합성 경로를 구축하였다.
실시예2-3. C. 글루타미쿰의 5-HV 생합성 경로 설계 및 5-HV 생산의 검증
5-HV는 pCES208H30DavTBHisA를 포함하는 재조합 C. 글루타미쿰 균주에 의해 생산될 수 있지만, 그 생산 수준은 다소 낮았고 훨씬 더 많은 글루타르산이 부산물로 축적되었다. 알데히드 환원효소는 5-HV 생합성에서 중요한 반응 단계를 촉매하기 때문에 우리는 5-HV 생산을 위한 보다 효율적인 효소를 찾기 위해 대장균에서 YihU, YahK 및 YqhD와 같은 세 가지 알데히드 환원효소를 조사하였다(Saito et al., 2009 ; Pick et al., 2012). 글루타레이트 세미알데하이드를 5-HV로 전환시키는 알데히드 환원효소 유전자의 발현을 위해, 각각 yihU, yahK 및 yqhD 유전자를 발현하는 3개의 상이한 플라스미드를 pBL712H30-MCS를 기반으로 제작하였다. 이어서, 생성된 각각의 플라스미드 및 pCES208H30DavTBHisA를 C. 글루타미쿰 PKC 균주에 동시에 형질전환시켰다. 5-HV 생합성을 위한 세 가지 재조합 C. 글루타미쿰 PKC 균주를 개발하였으며, 다음과 같이 명명하였다: C. 글루타미쿰 5HV-1(pCES208H30DavTBHisA 및 pBL712H30YihU를 보유하는 C. glutamicum PKC), C. glutamicum 5HV-2 (pCES208H30DavTBHisA 및 pBL712H30YahK를 보유하는 C. glutamicum PKC), 및 C. glutamicum 5HV-3 (pCES208H30DavTBHisA 및 pBL712H30YqhD를 보유하는 C. glutamicum PKC).
다음으로, 본 발명자들은 상기 세 가지 재조합 C. 글루타미쿰 5HV-1, 5HV-2 및 5HV-3의 50g/L의 포도당으로부터 5-HV를 생산하는 능력을 플라스크 배양 하에서 조사하였다. 5-HV 생산 역가가 davTBhisA 유전자를 발현하는 C. 글루타미쿰 PKC에 의해 얻어진 것과 비교하여 증가되었음에도 불구하고, 여전히 모든 균주에서 부산물로 축적되는 상대적으로 높은 농도의 글루타르산이 관찰되었다(도 2). 이들 균주의 120시간 배양 후, 5-HV의 농도는 각각 0.44 ± 0.12(C. glutamicum 5HV-1), 0.78 ± 0.38 g/L(C. glutamicum 5HV-2) 및 1.30 ± 0.63 g/L(C. glutamicum 5HV-3) 로 나타났으며, 글루타르산의 농도는 각각 1.72 ± 0.25 g/L(C. glutamicum 5HV-1), 0.62 ± 0.16 g/L(C. glutamicum 5HV-2) 및 0.62 ± 0.06 g/L(C. glutamicum 5HV-3)로 나타났다.
pH, 용존산소량 등의 발효조건을 철저하게 관리하여 C. glutamicum의 5-HV 생산능력을 극대화하기 위해 각 균주에 대해 2.5L 회분식(batch) 발효를 수행하였다(도 3). C. glutamicum 5HV-1, 5HV-2 및 5HV-3 균주의 회분식 발효시의 시간에 따른 5-HV 생산량은 각각 도 3a, 도 3b, 및 도 3c에 나타내었다. 발효 말기의 5-HV 농도는 각각 8.38g/L(C. glutamicum 5HV-1), 15.45g/L(C. glutamicum 5HV-2), 14.57g/L(C. glutamicum 5HV-3)이었다. 주요 부산물인 글루타르산은 최종 농도 7.42g/L(C. glutamicum 5HV-1), 3.92g/L(C. glutamicum 5HV-2) 및 3.89g/L(C. glutamicum, 5HV-3)로 축적되었다. 플라스크 배양 결과, C. glutamicum 5HV-2 및 5HV-3 균주가 C. glutamicum 5HV-1보다 5-HV 생산에서 더 우수한 성능을 보였다. C. 글루타미쿰 5HV-3가 가장 높은 5-HV 생산을 기록하였던 플라스크 배양에서의 결과와는 달리, 회분식 발효에서는C. 글루타미쿰 5HV-2에 의해 5-HV의 높은 생산율이 달성되었다. 본 연구에서의 플라스크 배양 및 회분식 발효에서 생산되는 표적 생화학물질의 농도 차이는 이전 연구에서도 관찰되었던 바 있다(Kim et al., 2019). C. glutamicum 5HV-2 및 C. glutamicum 5HV-3 균주는 비교적 높은 농도로 유사한 수준의 5-HV 생산을 나타내므로, 본 발명자들은 두 균주 모두를 5-HV 생산을 향상시키기 위한 추가적인 대사 조작의 균주로 선택하였다.
실시예2-4. 5-HV의 생산 증진을 위해 부산물 경로를 제거한 재조합 C. 글루타미쿰 균주의 구축
gabD 유전자에 의해 암호화된 내인성 C. 글루타미쿰 숙시네이트 세미알데하이드 탈수소효소는 글루타레이트 세미알데하이드에 대해서도 활성인 것으로 알려졌다(Rohles et al., 2016; Shin et al., 2016). 5-HV 생합성 경로는 동일한 중간체인 글루타레이트 세미알데하이드에 대해 글루타르산 생합성 경로와 경쟁하기 때문에, 결과적으로 배양 배지에서 상당한 양의 글루타르산 부산물이 발생하여 5-HV의 생산을 감소시켰다.
따라서, 재조합 C. 글루타미쿰 PKC 균주에서 5-HV의 생산과정 동안 글루타르산 생합성을 감소시키기 위해, C. 글루타미쿰의 염색체에서 내생의 gabD 유전자를 제거하였다. 이를 위해 C. glutamicum PKC의 염색체에 있는 gabD 유전자를 녹아웃시킨 균주를 제작하였으며 이를 C. glutamicum △gabD 균주로 명명한다. 이 때, 5-HV 생합성을 위한 다음의 두 가지 다른 재조합 C. 글루타미쿰 균주를 개발하였으며, 다음과 같이 명명하였다: C. 글루타미쿰 5HV-4(pCES208H30DavTBHisA 및 pBL712HH30YahK를 보유하는 C. 글루타미쿰 △gabD) 및 C. glutamicum 5HV-5 (pCES208H30DavTBHisA 및 pBL712H30YqhD 를 보유하는 C. glutamicum △gabD).
그런 다음, 120시간 플라스크 배양에 의해 이 두 C. glutamicum 균주를 통해 5-HV 생산에 대한 부산물 경로 제거의 효과를 검증하였다(도 4). 120시간 배양 후의 5-HV의 농도는 0.97 ± 0.38 g/L(C. glutamicum 5HV-4), 1.16 ± 0.64 g/L(C. glutamicum 5HV-5)로 나타났으며, 이는 gabD 유전자 결손이 없는 재조합 C. 글루타미쿰 5HV-1, -2 및 -3 균주와 비교하여 개선된 5-HV의 생산을 나타낸다. 글루타르산의 축적 또한 0.54±0.21g/L(C. glutamicum 5HV-4), 0.47±0.10g/L(C. glutamicum 5HV-5) 수준으로 크게 감소하였다.
다음으로, 5-HV 생산 향상을 위해 C. 글루타미쿰 5HV-4 및 5HV-5 균주의 회분식 발효를 수행하였다. C. 글루타미쿰 5HV-4 및 5HV-5 균주의 회분식 발효의 시간에 따른 경과는 각각 도 5a 및 도 5b에 개시하였다. C. 글루타미쿰 5HV-4는 114.1의 최종 OD600으로 20.1g/L의 5-HV를 생산한 반면, C. 글루타미쿰 5HV-5는 113.7의 최종 OD600으로 16.1g/L의 5-HV를 생산하였다. 이러한 역가는 C. 글루타미쿰 5HV-2 및 5HV-3 균주에 의해 달성된 것보다 각각 약 30% 및 약 10% 더 높았다. 발효 완료시의 글루타르산 농도 또한 두 균주에서 각각 1.9g/L 및 2.1g/L로 감소하였다. 내인성 gabD 유전자를 포함하는 5-HV 생산 균주의 5-HV 생산은 상기 도 4에서의 발효 결과와 같이, yqhD 유전자보다 yahK 유전자의 과발현에 의해 더 높게 달성되었다. 상기 회분식 발효의 결과에 기반하여, 부산물 축적이 훨씬 감소되면서 가장 높은 5-HV 생산을 나타낸 C. 글루타미쿰 5HV-4 균주(yahK 유전자 발현)를 추가적 유가식 발효를 위해 선택하였다.
실시예2-5. 5-HV 생산을 위해 조작된 C. 글루타미쿰 균주의 유가식 발효
포도당 농도를 10-20g/L 부근으로 유지하여 높은 수준의 5-HV를 생산하기 위해 C. glutamicum 5HV-4 균주의 유가식 발효가 수행되었다. C. 글루타미쿰 5HV-4 균주의 유가식 발효의 시간에 따른 경과는 도 6에 나타내었다. 유가식 발효 81시간 후 C. 글루타미쿰 5HV-4 균주는 포도당에 대해 0.33g의 수율 및 0.64g·L-1·h-1의 생산율로 52.1g/L의 5-HV를 생산하였으며, 부산물인 글루타르산의 농도는 7.8g/L로, 비교적 적은 양으로 축적되었다. 57시간의 유가식 발효 후에128.4의 최대 OD600에 도달하였으며, 21시간 동안 유지되었다. 발효 말기 배양 배지에서의L-라이신 및 5-AVA와 같은 미전환 중간체의 농도는 각각 15.2g/L 및 1.35g/L로 관찰되었으며, 최종 5-AVA 농도 또한 현저히 감소하였음을 확인하였다.
위와 같은 실시예들을 통해, P. putida davTBA 유전자에 의해 암호화된 L-라이신 이화 경로를 통해 L-라이신에서 글루타레이트 세미알데하이드의 생성으로부터 시작되는 C. 글루타미쿰에서의 인공 5-HV 생합성 경로를 성공적으로 확립하였다. 5-HV 생합성 경로의 다운스트림을 완성하기 위해 글루타레이트 세미알데하이드의 5-HV로의 세포내 환원을 담당할 수 있는 다양한 알데하이드 환원효소를 조사하였다. 뿐만 아니라 조작된 C. 글루타미쿰 균주는 주요 부산물인 글루타르산 생산을 주로 담당하는 숙시네이트 세미알데히드 탈수소효소를 암호화하는 gabD 유전자를 염색체에서 제거하도록 추가적으로 개발되었으며, 궁극적으로 글루타르산 축적이 훨씬 감소하면서 5-HV 생산이 향상되었다. 더 나아가, 염색체에서 gabD 결실과 함께 P. putida davTBA 유전자 및 E. coli yahK 유전자를 발현하는 최종 조작된 C. 글루타미쿰 PKC 균주를 사용한 유가식 발효는 52.1g/L의 현저히 향상된 5-HV 생산을 나타냄을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY Ewha University - Industry Collaboration Foundation THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Recombinant Corynebacterium glutamicum strain for producing 5-hydroxyvaleric acid and a method of producing glutaric acid using the same <130> KPA201225-KR <150> KR 10-2020-0126927 <151> 2020-09-29 <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1278 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <220> <221> gene <222> (1)..(1278) <223> recombinant davT <400> 1 atgagcaaaa ccaacgaatc cttgatgcaa cgtcgtgtag ctgccgtccc acgtggcgtc 60 ggccagatcc acccgatctt cgtcgacacc gcgaagaact cgaccgtgat cgacgttgaa 120 ggccgcgaac tgatcgactt cgccggcggc atcgcagtac tgaacaccgg ccacctgcac 180 ccgaaagtag ttgcagccgt gcaagagcag ctgaccaagg tcagccacac ctgcttccag 240 gtgctggctt acgagcccta tgtagagctg tgcgaaaaga tcaacaagct ggtcccaggc 300 gacttcgaca agaagaccct gctggtcacc accggctccg aagccgttga aaacgccgtc 360 aagatcgccc gtgctgccac tggccgcgct ggcgtcatcg 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315 320 Val Leu Gly Asn Gly Leu Asp Glu Gly Val Thr Val Gly Pro Leu Val 325 330 335 Glu Glu Lys Ala Arg Asn Ser Val Ala Ser Leu Val Asp Ala Ala Val 340 345 350 Ser Glu Gly Ala Thr Val Leu Thr Gly Gly Lys Ala Gly Thr Gly Ala 355 360 365 Gly Tyr Phe Tyr Glu Pro Thr Val Leu Thr Gly Val Ser Thr Asp Ala 370 375 380 Ala Ile Leu Asn Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Ala Pro Ile Val Thr 385 390 395 400 Phe Ser Asp Glu Ala Glu Ala Leu Arg Leu Ala Asn Ser Thr Glu Tyr 405 410 415 Gly Leu Ala Ser Tyr Val Phe Thr Gln Asp Thr Ser Arg Ile Phe Arg 420 425 430 Val Ser Asp Gly Leu Glu Phe Gly Leu Val Gly Val Asn Ser Gly Val 435 440 445 Ile Ser Asn Ala Ala Ala Pro Phe Gly Gly Val Lys Gln Ser Gly Met 450 455 460 Gly Arg Glu Gly Gly Leu Glu Gly Ile Glu Glu Tyr Thr Ser Val Gln 465 470 475 480 Tyr Ile Gly Ile Arg Asp Pro Tyr Ala Gly 485 490 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer - DavBhis-F <400> 15 ggatccatgc accatcatca ccatcacatg aacaagaaga accgccaccc 50 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer - DavBhis-R <400> 16 gcggccgctt aatctgccag ggcgatcggg 30 <210> 17 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer - DavA-F <400> 17 gcggccgcag gagatataca tatgcgcatc gcactgtacc aag 43 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer - DavA-R <400> 18 gcggccgctt agcctttacg caggtgcag 29 <210> 19 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer - DavT-F <400> 19 ggatccagga gatatacata tgagcaaaac caacgaatcc ttg 43 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer - DavT-R <400> 20 agatctatgt atatctcctt taggcgattt cagcgaagca c 41 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer - H30-F <400> 21 gcgctcgaga aagtaacttt tcggttaagg tagc 34 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer - H30-R <400> 22 gcggaattcc aatatactcc tgcccaacca ac 32 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer - pBL1-F <400> 23 gacgtcattc ggggtcgttc actgg 25 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer - pBL1-R <400> 24 ctcgagcaac aacaagaccc atcatagttt g 31 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -Sp-F <400> 25 gacgtcggtt ttttgctgaa acctcaggc 29 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -Sp-R <400> 26 actagtctca cgcccggagc gtagcgac 28 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -eGFP-F <400> 27 ggatccagga gatatacata tggtgagcaa gggcgagg 38 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -eGFP-R <400> 28 gcggccgctt acttgtacag ctcgtccatg 30 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -mCherry-F <400> 29 gaattcatgg tgagcaaggg cgagg 25 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -mCherry-R <400> 30 ggtaccttac ttgtacagct cgtccatgc 29 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -YihU-F <400> 31 gaattcatgg cagcgatagc attcattggt cttg 34 <210> 32 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -YihU-R <400> 32 ggtaccttac atttttacct ttgcggtcat tccagc 36 <210> 33 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -YahK-F <400> 33 ggatccagga gatatacata tgaagatcaa agctgttggt gc 42 <210> 34 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -YahK-R <400> 34 agatctatgt atatctcctt cagtctgtta gtgtgcgatt atc 43 <210> 35 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -YqhD-F <400> 35 ggatccagga gatatacata tgaacaactt taatctgcac accc 44 <210> 36 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -YqhD-R <400> 36 agatctatgt atatctcctt tagcgggcgg cttcgtatat ac 42 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -GabD1-F <400> 37 cgatctccgt gatcgaatcc 20 <210> 38 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -GabD1-R <400> 38 gctcatgtgt tctagatttt agcccacctt ctggtg 36 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -GabD2-F <400> 39 tgggctaaaa tctagaacac atgagctgtc cggtga 36 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -GabD2-R <400> 40 cggggtggca gggttaactc 20 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -GabD-F <400> 41 cctgcaggcg atctccgtga tcgaatcc 28 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer -GabD-R <400> 42 gaattccggg gtggcagggt taactc 26

Claims (19)

  1. 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT)를 코딩하는 DavT 유전자, 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB)를 코딩하는 DavB 유전자, 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA)를 코딩하는 DavA 유전자 및 알데하이드 리덕테아제를 코딩하는 유전자가 도입된, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제를 코딩하는 내생의 유전자 gabD가 결손 또는 약화된, 하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
  3. 제2항에 있어서, 상기 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT), 상기 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB) 및 상기 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA)를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1벡터; 및 상기 알데하이드 리덕테아제를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 제2벡터로 형질전환된 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로서,
    상기 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 내생의 gabD 유전자가 결손 또는 약화된, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 알데하이드 리덕테아제는 알데하이드 리덕테아제 YihU, 알데하이드 리덕테아제 YahK, 및 알데하이드 리덕테아제 YqhD로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
  5. 제3항에 있어서, 상기 발현벡터는 히스티딘-태그(polyhistidine-tag, His-tag)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
  6. 제5항에 있어서, 상기 히스티딘-태그는 DavB를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davB)의 N-말단에 위치하는 것인, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
  7. 제1항에 있어서, 상기 davT 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
  8. 제1항에 있어서, 상기 davB를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
  9. 제1항에 있어서, 상기 davA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
  10. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 PKC인 것인, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
  11. 제1항에 있어서, 상기 알데하이드 리덕테아제는 알데하이드 리덕테아제 YihU이고, 상기 알데하이드 리덕테아제 YihU를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
  12. 제1항에 있어서, 상기 알데하이드 리덕테아제는 알데하이드 리덕테아제 YahK이고, 상기 알데하이드 리덕테아제 YahK 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
  13. 제1항에 있어서, 상기 알데하이드 리덕테아제는 알데하이드 리덕테아제 YqhD이고, 상기 알데하이드 리덕테아제 YqhD를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
  14. 제3항에 있어서, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 davT, davB 및 davA 를 포함하는 pCES208 발현벡터; 및 YahK가 포함된 pBL712 발현벡터로 형질전환된 것인, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
  15. 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT), 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB), 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA) 및 알데하이드 리덕테아제의 활성이 강화된, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
  16. 제15항에 있어서, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제의 활성이 감소 또는 불활성화된, 5-하이드록시발레르산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양하여 배양물을 수득하는 단계를 포함하는, 5-하이드록시발레르산 생산방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 수득한 배양물로부터 5-하이드록시발레르산을 회수하는 단계를 더 포함하는, 5-하이드록시발레르산 생산방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 배양은 유가식 배양인, 5-하이드록시발레르산 생산방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kim, J.W., Ko, Y.S., Chae, T.U., Lee, S.Y., 2020. High-level production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol as a sole carbon source using metabolically engineered Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. https://doi.org/10.1002/bit.27344
Rohles, C.M., Gießelmann, G., Kohlstedt, M., Wittmann, C., Becker, J., 2016. Systems metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for the production of the carbon-5 platform chemicals 5-aminovalerate and glutarate. Microb. Cell Fact. 15(1), 154.
Rohles, C.M., Glδser, L., Kohlstedt, M., Gießelmann, G., Pearson, S., del Campo, A., Becker, J., Wittmann, C., 2018. A bio-based route to the carbon-5 chemical glutaric acid and to bionylon-6, 5 using metabolically engineered Corynebacterium glutamicum. Green Chem. 20(20), 4662-4674.
Shin, J.H., Park, S.H., Oh, Y.H., Choi, J.W., Lee, M.H., Cho, J.S., Jeong, K.J., Joo, J.C., Yu, J., Park, S.J., Lee, S.Y., 2016. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for enhanced production of 5-aminovaleric acid. Microb. Cell Fact. 15(1), 1-13.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116904384A (zh) * 2023-09-12 2023-10-20 清华大学 一种重组微生物及其在生产聚羟基脂肪酸酯中的应用

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