JP2008263945A - 連続発酵による乳酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法による乳酸の製造方法を提供する。
【解決手段】
本発明は、乳酸を生産する能力を有する大腸菌の発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物である乳酸を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に保持または還流する連続発酵方法による乳酸の製造方法であって、分離膜に高い透過性と高い細胞阻止率を持ち閉塞しにくい特定の多孔性分離膜を用い、特定の低い膜間差圧で濾過処理することにより、安定に低コストで発酵による乳酸の生産効率を著しく向上させることが可能となる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、乳酸を生産する能力のある大腸菌の発酵培養液から、目詰まりが生じにくい多孔性膜を通して乳酸を含む液を効率よく濾過・回収すること、および未濾過液を前記の発酵培養液に戻すことにより発酵に関与する微生物濃度を向上させ、高い生産性を得ることができる連続発酵による乳酸の製造方法に関するものである。

微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）回分発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と、（２）連続発酵法とに分類することができる。

上記（１）の回分発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。しかしながら、時間経過とともに発酵培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性および収率が低下してくる。そのため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持することが困難である。一方、上記（２）の連続発酵法は、発酵反応槽内で目的物質が高濃度に蓄積されることを回避することによって、長時間にわたって高収率でかつ高生産性を維持することができるという利点がある。

次に、乳酸の製造方法に関する技術背景について説明する。乳酸は、主に、酸味料として従来のクエン酸や酒石酸の代替品として用いられており、酸性の洗浄剤としての用途にも用いられる。また、乳酸には、医薬品として局方品の酸薬や皮膚腐触薬などの用途がある。また、乳酸には、誘導体としてナトリウム塩（化粧品や食品などの保湿剤用途）やカルシウム塩（カルシウム剤や強壮剤用途）などの用途もある。その他、乳酸には、メチルエステルやエチルエステルなどのエステルとして、フロンやトリクロロエタンなどのオゾン層破壊性溶剤の代替品としての用途もある。最近では、ポリ乳酸樹脂の原料としての用途が大きく広がっている。ここで実用的なポリ乳酸樹脂の原料としては、乳酸の光学純度が高いことが必要であることが知られており、光学純度の高い乳酸を生産することが重要である。

現在、乳酸は、主に乳酸菌と呼ばれる原核微生物あるいはリゾパス属（Ｇｅｎｕｓ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）のカビによる回分発酵法で工業的に生産されているが、乳酸の対糖収率は、乳酸菌を用いる方が高いことが知られている（非特許文献１参照。）。しかしながら、乳酸菌による乳酸発酵から得られる乳酸の光学純度としては、実用的なポリ乳酸樹脂の原料として用いる光学純度を満足できない場合が多く、光学純度の高い乳酸を生産する微生物の昨出に関する検討もなされている（特許文献１参照。）。

一方、更に乳酸の生産性を向上させるため発酵プロセスに関する検討も行われている。連続的な乳酸発酵に関する検討が行われている。例えば、小林らは、セラミックス製フィルターを用いた乳酸菌による連続的な乳酸発酵の検討を行っているが、乳酸菌の濾過において、十分な透過性能を確保するためには、濾過圧力として、約９０ｋＰａの高い膜間差圧と逆洗浄が必要であることを報告している。また、膜表面の循環速度を早くすることにより透過性は向上するが、同時に膜表面での剪断力によって、微生物の活性低下や破裂などの不具合が生じることを開示している（非特許文献２参照。）。

同様に、セラミックス製フィルターを用いた連続的な乳酸発酵を行うための装置が開示されているが、この装置では、セラミックス製フィルターの逆洗浄のために、空気や窒素などの気体や、水や濾過膜透過水などの液体を培養液の中に加えることになるため、微生物や培養細胞の物質生産能力が変化し培養の状態を最適に維持することが難しいことに加えて、菌体分離のための濾過膜装置が複雑になるという課題があった（特許文献２参照。）。更に、濾過膜を用いた乳酸菌の培養法の技術も開示されているが、上記の装置と同様に逆洗浄操作に伴う不具合があり、また濾過時にポンプによる吸引が必要で、濾過膜装置の複雑化が課題であった（特許文献３参照。）。

すなわち、乳酸の連続発酵法において、微生物や細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や細胞を培養液に還流させ、培養液中の微生物や細胞濃度を向上させ、かつ、高く維持させることにより高い物質生産性を得ることは依然として困難であり、技術の革新が望まれていた。
財団法人バイオインダストリー協会 発酵と代謝研究会編、「発酵ハンドブック」、６４−６５、共立出版（２００１） 小林猛ら，ケミカル・エンジニア，１２，４９（１９８８） 特開２００５−１０２６２５号公報 特開昭６２−１３８１８４号公報 特開平２−１７４６７４号公報

そこで本発明の目的は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持することができる連続発酵法による乳酸の製造方法を提供することにある。

本発明者らは、鋭意研究の結果、微生物や細胞の分離膜内への侵入が少なく、微生物や細胞を膜間差圧が低い条件で発酵培養液を濾過した場合に、分離膜の目詰まりが著しく抑制されることを見出し、分離膜を用いた連続発酵を行うことにより、課題であった乳酸の発酵生産性能が飛躍的に向上することを発見し、本発明を完成するに至った。

本発明の乳酸の製造方法は、乳酸を生産する能力を有する大腸菌の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、その大腸菌の発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵により乳酸を製造する方法であって、前記の分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲にして濾過処理することを特徴とする連続発酵による乳酸の製造方法である。

具体的に本発明は、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、その濾液から所望の発酵生産物である乳酸を回収するとともに、その未濾過液を発酵培養液に保持または還流させる連続発酵方法による乳酸の製造方法であって、高い透過性と高い細胞阻止率を持ち閉塞しにくい上記特定の多孔性膜を利用すると共に上記特定の低い膜間差圧で濾過処理することにより、安定に低コストで、発酵生産効率を著しく向上させる乳酸の製造方法を提供するものである。

本発明の連続発酵による乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の純水透過係数は、２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上６×１０^−７ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以下である。

本発明の連続発酵による乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の平均細孔径は０.０１μｍ以上０.２μｍ未満であり、その平均細孔径の標準偏差は０.１μｍ以下であり、その膜表面粗さは０.１μｍ以下である。

本発明の連続発酵による乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜は多孔性樹脂層を含む多孔性膜であり、多孔性樹脂層は有機高分子膜からなるものである。

本発明の連続発酵による乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の素材にポリフッ化ビニリデン系樹脂が用いられることである。

本発明の連続発酵による乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の大腸菌の培養液および発酵原料は糖類を含むことである。

本発明の連続発酵による乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の乳酸はＬ−乳酸またはＤ−乳酸である。

本発明によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物である乳酸を低コストで安定に生産することが可能となる。本発明の連続発酵による乳酸の製造方法により得られた乳酸は、例えば、酸味料、洗浄剤および医薬品、更にはポリ乳酸樹脂の原料として有用である。

本発明は、乳酸を生産する能力のある大腸菌の発酵培養液を、分離膜で濾過して濾液と未濾過液に分離し濾液から生産物を回収すると共に未濾過液を前記培養液に保持または還流し、かつ、その大腸菌の発酵原料を前記の培養液に追加する連続発酵であって、前記の分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を０.１以上２０ｋＰａ未満にして濾過処理することを特徴とする連続発酵による乳酸の製造方法である。

本発明において分離膜として用いられる多孔性膜は、発酵に使用される大腸菌による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する性能を有するものであることが望ましい。そのため、本発明で使用される多孔性膜は、その平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満であることが重要である。

次に、本発明で分離膜として用いられる多孔性膜の構成について説明する。本発明における多孔性膜は、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものであり、阻止性能および透水性能や耐汚れ性という分離性能の点からは、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜としての多孔性膜に強度を与えるものである。

多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、中でも有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布であり、中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。

また、多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物からなるものであってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。中でも、多孔性膜を構成する多孔質樹脂層の素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。

ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられるが、その他、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。

本発明で用いられる多孔性膜の作成法の概要を説明する。まず、上述した多孔質基材の表面に、上述した樹脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成するとともに、その原液を多孔質基材に含浸させる。しかる後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。原液にさらに非溶媒を含ませることもできる。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、１５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。

ここで、上記の原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。

また、溶媒は、樹脂を溶解するものである。溶媒は、樹脂および開孔剤に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促す。このような溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。なかでも、樹脂の溶解性の高いＮＭＰ、ＤＭＡｃ、ＤＭＦおよびＤＭＳＯを好ましく用いられる。

さらに、上記の原液には、非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水やメタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。中でも、価格の点から水やメタノールが好ましい。非溶媒は、これらの混合物であってもよい。

本発明で用いられる多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。多孔性膜が平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択されるが、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。

上述のように、本発明で分離膜として用いられる多孔性膜は、多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されている多孔性膜であることが望ましい。その際、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下の範囲で選択される。また、多孔性分離膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、膜厚は好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸膜の内部に含んでいても良い。

本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。多孔性膜を有する分離膜エレメントの形態は特に限定されないが、支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に、本発明で用いられる多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明で用いられる多孔性膜を有する分離膜エレメントの好適な形態の一つである。この形態で、膜面積を大きくすることが困難な場合には、透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することも好ましい態様である。

分離膜としての多孔性膜の平均細孔径が上記のように０．０１μｍ以上１μｍ未満の範囲内にあると、菌体がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、さらに目詰まりをしにくく、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。大腸菌として細菌類を用いた場合、多孔性膜の平均細孔径は好ましくは０.４μｍ以下であり、平均細孔径は０.２μｍ未満であればなお好適に実施することが可能である。平均細孔径は、小さすぎると透水量が低下することがあるので、本発明では、平均細孔径は０.０１μｍ以上であり、好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。

ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。

また、本発明では上記の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。更に、平均細孔径の標準偏差が小さい、すなわち細孔径の大きさが揃っている方が均一な透過液を得ることができ、発酵運転管理が容易になることから、平均細孔径の標準偏差は小さければ小さい方が望ましい。

平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。

本発明で用いられる多孔性膜においては、発酵培養液の透過性が重要点の一つであり、透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましい。純水透過係数が２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上６×１０^−７ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。より好ましい純水透過係数は、２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上１×１０^−７ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以下である。

本発明で用いられる多孔性膜の膜表面粗さは、分離膜の目詰まりに影響を与える因子である。好ましくは膜表面粗さが０.１μｍ以下のときに分離膜の剥離係数や膜抵抗を好適に低下させることができ、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能である。従って、目詰まりを抑えることにより安定した連続発酵が可能になることから、表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。

また、多孔性分離膜の膜表面粗さを低くすることにより、大腸菌の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、大腸菌の破壊が抑制され、多孔性分離膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。

ここで、膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の装置と条件で測定することができる。
・装置：原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件：探針 ＳｉＮカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
：走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
：走査範囲 １０μm、２５μm 四方（気中測定）
５μm、１０μm 四方（水中測定）
：走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製 測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、濾過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いて濾過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。

また、膜表面粗さｄ_{ｒｏｕｇｈ}は、上記ＡＦＭにより各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出する。

本発明において、大腸菌を分離膜で濾過処理する際の膜間差圧は、大腸菌および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよいが、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲にして濾過処理することが重要である。膜間差圧は好ましくは０.１ｋＰａ以上１０ｋＰａ以下の範囲であり、さらに好ましくは０.１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下の範囲である。上記の膜間差圧０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲を外れた場合、大腸菌および培地成分の目詰まりが急速に発生し、透過水量の低下を招き、連続発酵運転に不具合を生じることがある。

濾過の駆動力としては、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホンにより多孔性膜に膜間差圧を発生させることが可能である。また、濾過の駆動力として多孔性膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよいし、多孔性膜の発酵培養液側に加圧ポンプを設置することも可能である。膜間差圧は、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を変化させることにより制御することができる、また、膜間差圧を発生させるためにポンプを使用する場合には、吸引圧力により膜間差圧を制御することができ、更に発酵培養液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によっても膜間差圧を制御することができる。これら圧力制御を行う場合には、発酵培養液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。

また、本発明において使用される多孔性膜は、濾過処理する膜間差圧として、０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲で濾過処理することができる性能を有するものであることが好ましい。また、本発明で使用される多孔性膜は、上述のように、使用前の純水透過係数が、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上の範囲であることが好ましく、更に２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上６×１０^−７ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以下の範囲にあることが好ましく、更に好ましくは２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上１×１０^−７ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以下の範囲にある
本発明で使用される大腸菌の発酵原料は、発酵培養する大腸菌の生育を促し、目的とする発酵生産物である乳酸を良好に生産させ得るものであれば良い。発酵原料としては、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、およびビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する液体培地等が好ましく用いられる。

上記の炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、サトウキビ搾汁、更には酢酸、フマル酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、およびグリセリン等が使用される。ここで糖類とは、多価アルコールの最初の酸化生成物であり、アルデヒド基またはケトン基をひとつ持ち、アルデヒド基を持つ糖をアルドース、ケトン基を持つ糖をケトースと分類される炭水化物のことを指す。

また、上記の窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。

また、上記の無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。

本発明で使用される大腸菌が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて添加使用することができる。

本発明において、発酵培養液とは、発酵原料と大腸菌を接触させることで増殖した結果得られる液のことを言う。追加する発酵原料の組成は、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。発酵原料組成から追加する発酵原料の組成に変更する場合、目的とする乳酸の生産性が高くなるような変更が好ましい。例えば、上記炭素源に対する窒素源、無機塩類、アミノ酸およびビタミンなどの有機微量栄養素の重量比率を低下させることにより、乳酸の生産コストの低減、すなわち広義で乳酸の生産性の向上が実現できる場合もある。一方、上記炭素源に対する窒素源、無機塩類、アミノ酸およびビタミンなどの有機微量栄養素の重量比率を増加させることにより、乳酸の生産性を向上させることができる場合もある。

本発明では、発酵培養液中の糖類など発酵原料の濃度は、５ｇ／ｌ以下に保持されるようにすることが好ましい。その理由は、発酵培養液の引き抜きによる発酵原料の流失を最小限にするためである。そのため発酵原料の濃度は、可能な限り小さいことが望ましい。

微生物の発酵培養は、通常、ｐＨが４〜８で温度が２０〜４０℃の範囲で行われることが多い。発酵培養液のｐＨは、無機の酸または有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節される。

大腸菌の培養において、発酵培養液中の溶存酸素濃は乳酸の生産性を高くできるように制御することができる。発酵培養液中の溶存酸素の制御には供給する気体の供給速度を変化させることによって行うことができる。また、発酵培養液中の溶存酸素の制御は供給する気体の成分比率を変更することでも行うことができる。例えば、酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を例えば２１％以上に保つ、発酵培養液を加圧する、攪拌速度を上げる、あるいは通気量を上げるなどの手段を用いることができる。逆に、酸素の供給速度を下げる必要があれば、炭酸ガス、窒素およびアルゴンなど酸素を含まないガスを空気に混合して供給することが可能である。

本発明においては、培養初期に回分培養または流加培養を行って大腸菌濃度を高くした後に連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の大腸菌をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から、発酵原料液の供給および培養物の引き抜きを行うことが可能である。発酵原料液供給と培養物の引き抜きの開始時期は、必ずしも同じである必要はない。また、発酵原料液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。発酵原料液には、上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。

発酵培養液中の大腸菌の濃度は、効率よい生産性を得る上で、発酵培養液の環境が微生物の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが好ましい。一例として、濃度を乾燥重量として２ｇ／Ｌ以上に維持することにより、より良好な生産効率が得られる。また、連続発酵装置の運転上の不具合や生産効率の低下を招かなければ、大腸菌の濃度の上限値は特に限定されない。

発酵生産能力のあるフレッシュな大腸菌を増殖させつつ行う連続培養操作は、培養管理上、通常、単一の発酵反応槽で行うことが好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵反応槽の数は問わない。発酵反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵反応槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても、発酵生産物の高生産性は得られる。

本発明においては、別の培養槽で乳酸を生産する能力のある大腸菌を培養し、培養されたフレッシュな大腸菌を含む培養液を発酵反応槽に供給しながら連続発酵することができる。このように、発酵能力が高い状態の大腸菌を含む培養液を培養槽から発酵反応槽に供給することにより、常に高い乳酸の生産性能を維持させることができる。

また本発明においては、発酵反応槽から大腸菌を適宜抜き出しながら連続発酵することができる。このようにすることで、高い乳酸の生産性能を維持できる場合がある。例えば、発酵培養液中の大腸菌濃度が高くなると乳酸の生産性能が低下したり、ある一定の大腸菌濃度を維持することにより高い乳酸の生産性能を維持する場合に有効な方法である。

更に本発明においては、大腸菌を発酵反応槽に維持したままで、発酵反応槽からの発酵培養液の連続的かつ効率的な抜き出しが可能となることから、大腸菌を連続的に培養し、十分な増殖を確保した後に発酵原料液組成を変更し、目的とする化学品を効率よく製造することも可能である。

本発明で使用される大腸菌は、乳酸を生産する能力を持つ大腸菌である。使用される大腸菌は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。

本発明で使用される大腸菌は、乳酸の生産能力が高いものが好ましい。元来乳酸の生産能力が高いものを自然界から分離してもよいし、人為的に生産能力を高めた大腸菌であってもよい。具体的には、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。

ここで、大腸菌の一部性質の改変に関して説明する。乳酸を効率よく生産するためには、乳酸を生合成して蓄積し、生体外に放出する必要がある。そのため、乳酸の生合成系路に関与する酵素の増強、乳酸の分解路に関与する酵素活性低下、また乳酸を生体外放出に関わるタンパク質、あるいは生体膜組成等の改変など、大腸菌の性質を変えることによって効率的に乳酸を生産する大腸菌を作出し、用いることができる。

また、乳酸以外の化学品（不純物）の生産能力が低い大腸菌を好ましく用いることができる。具体的な不純物としては、ピルビン酸、酢酸、蟻酸、コハク酸、リンゴ酸およびエタノール等が挙げられる。不純物が少ないと、発酵培養液からの乳酸の精製が容易になる。元来乳酸以外の化学品の生産能力の低い大腸菌を自然界から分離してもよいし、人為的に生産能力を高めた大腸菌であってもよい。具体的には、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。

更に、本発明で用いられる大腸菌としては、光学純度の高い乳酸を生産する能力の高い大腸菌も好ましく用いることができる。ポリ乳酸樹脂の原料として光学純度の高い乳酸を用いることが好ましいことから、ポリ乳酸樹脂の原料として乳酸を製造する場合、光学純度の高い乳酸を生産する能力の高い大腸菌を用いることが好ましい。例えば、元来大腸菌は、ピルビン酸をＤ−乳酸に変換するＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有している。本発明において、乳酸としてＤ−乳酸を製造する場合、元来大腸菌が有するＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に代わって、更に効率的にピルビン酸からＤ−乳酸に変換できるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した大腸菌を用いることができる。一方、Ｌ−乳酸を製造する場合には、元来大腸菌が有するＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を突然変異や、該遺伝子を欠失させることでＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を消滅せしめた上で、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入した大腸菌を用いることができる。例えば、Ｄ−乳酸を製造する場合には、特開２００５−１０２６２５号公報で開示されているように遺伝子工学的方法を用いてＤ−乳酸生産大腸菌を作出し、その大腸菌を用いることができる。また、Ｌ−乳酸を製造する場合にはディエンらの報告（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：２５９−２６４、２００１参照）で開示されているように遺伝子工学的方法を用いてＬ―乳酸生産大腸菌を作出し、その大腸菌を用いることが出来る。本発明では、これら大腸菌を選択して、本発明の連続発酵による乳酸の製造方法に用いることができる。

本発明の連続発酵による乳酸の製造方法により製造された濾過・分離発酵液に含まれる乳酸の分離・精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。例えば、濾過・分離発酵液のｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙げられる。好ましくは、濾過・分離発酵液の水分を蒸発させた濃縮Ｄ−乳酸溶液を蒸留操作にかけることができる。ここで、蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留することが好ましい。乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製乳酸を得ることができる。留出液としてエタノールや酢酸等の低沸点成分を含む乳酸水溶液を得た場合は、低沸点成分を乳酸濃縮過程で除去することが好ましい態様である。蒸留操作後、留出液について必要に応じて、イオン交換樹脂、活性炭およびクロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度の乳酸を得ることもできる。

本発明の連続発酵による乳酸の製造方法は、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性分離膜を使用し、濾過圧力である膜間差圧が０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理することを特徴としている。そのため、特別に発酵反応槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、濾過分離装置と発酵反応槽間で発酵培養液を循環させる動力手段が不要となる。多孔性分離膜を備えた分離膜エレメントは、発酵反応槽の外側に設置しても良いし、発酵反応槽内部に設置して発酵装置をコンパクト化することもできる。

本発明の連続発酵による乳酸の製造方法で用いられる膜分離型の連続発酵装置のうち、分離膜エレメントが、発酵反応槽の外部に設置された代表的な一例を図１の概要図に示す。図１は、本発明で用いられる連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。

図１において、連続発酵装置は、大腸菌を発酵培養させるための発酵反応槽１と、その発酵反応槽１に発酵培養液循環ポンプ１１を介して接続され内部に分離膜エレメント２を備えた膜分離槽１２と、発酵反応槽１の内の発酵培養液の量を制御するための水頭差制御装置３で基本的に構成されている。ここで、分離膜エレメント２には、多孔性分離膜が組み込まれている。この多孔性分離膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜、および分離膜エレメントを使用することが好適である。

図１において、培地供給ポンプ７によって培地を発酵反応槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で供給することができる。また、必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびよびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵培養液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。さらに、装置内の発酵培養液は、発酵培養液循環ポンプ１１によって発酵反応槽１と膜分離槽１２の間を循環する。発酵生産物を含む発酵培養液は、分離膜エレメント２によって大腸菌と発酵生産物に濾過・分離され、装置系から取り出すことができる。

また、濾過・分離された大腸菌は、装置系内に留まることにより装置系内の大腸菌濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は膜分離槽１２の水面との水頭差圧によって行なうことができ、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度および装置系内の発酵培養液量を適当に調節することができる。また、必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を膜分離槽１２内に供給することができる。

上記のように、本発明で用いられる連続発酵装置では、分離膜エレメント２による濾過・分離は水頭差圧によって行うことができるが、必要に応じて、ポンプや、液体や気体等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより濾過・分離することもできる。このような手段により、膜間差圧を調整制御することができる。

次に、本発明の連続発酵による乳酸の製造方法で用いられる連続発酵装置のうち、分離膜エレメントが発酵反応槽の内部に設置された代表的な一例を図２に示す。図２は、本発明で用いられる他の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。

図２において、連続発酵装置は、大腸菌を発酵培養させるための発酵反応槽１と、その発酵反応槽１の内の発酵培養液の量を制御するための水頭差制御装置３で基本的に構成されている。発酵反応槽１内には分離膜エレメント２が配設されており、その分離膜エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜、および分離膜エレメントを使用することができる。分離膜エレメントに関しては、追って詳述する。

次に、図１の膜分離型連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。培地供給ポンプ７によって、培地を発酵反応槽１に連続的もしくは断続的に投入する。培地については、発酵反応槽１に投入する前に、必要に応じて加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。発酵生産時には、必要に応じて、発酵反応槽１内の攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を発酵反応槽１内に供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４によって供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵反応槽１内の発酵液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵反応槽１内の発酵培養液の温度を調節することにより生産性の高い発酵生産を行うことができる。

ここでは、計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度の調節を例示したが、必要に応じて、発酵培養液の溶存酸素や酸化還元電位（ＯＲＰ）の制御を行うことができ、更にはオンラインケミカルセンサーなどの分析装置により発酵培養液中の乳酸の濃度を測定し、それを指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入の形態に関しては、特に限定されるものではないが、上記計装装置による発酵培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。

発酵培養液は、発酵反応槽１内に設置された分離膜エレメント２によって、大腸菌と発酵生産物に濾過・分離され装置系から取り出される。また、濾過・分離された大腸菌は装置系内に留まることにより装置系内の大腸菌濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は発酵反応槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度およびよび発酵反応槽１内の発酵液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメント２による濾過・分離は水頭差圧によって行うことができるが、必要に応じて、ポンプや、液体や気体等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。

本発明で用いられる分離膜エレメントの形態は特に、好適な形態の例である国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを、以下に図面を用いてその概略を説明する。図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。

分離膜エレメントは、図３に示すように、剛性を有する支持板１３の両面に、流路材１４と前記の分離膜１５をこの順序で配し構成されている。支持板１３は、両面に凹部１６を有している。分離膜１５は、発酵培養液をろ過する。流路材１４は、分離膜１５で濾過された透過水を効率よく支持板１３に流すためのものである。支持板１３に流れた透過水は、支持板１３の凹部１６を通り、排出手段である集水パイプ１７を介して連続発酵装置外部に取り出される。

図４は、本発明で用いられる別の分離膜エレメントの他の実施の形態を説明するための概略斜視図である。分離膜エレメントは、図４に示すように、中空糸膜（多孔性膜）で構成された分離膜束１８と上部樹脂封止層１９と下部樹脂封止層２０によって主に構成されている。分離膜束１８は、上部樹脂封止層１９および下部樹脂封止層２０よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層２０による接着・固定化は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の中空部を封止しており、培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層１９は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の内孔を封止しておらず、集水パイプ２２に濾液が流れる構造となっている。この分離膜エレメントは、支持フレーム２１を介して連続発酵装置内に設置することが可能である。分離膜束１８によって濾過された発酵生産物を含む濾液は、中空糸膜の中空部を通り、集水パイプ２２を介して連続発酵装置外部に取り出される。濾液を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。

本発明の乳酸の製造方法で用いられる連続発酵装置の分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材であることが好ましい。連続発酵装置内が滅菌可能であれば、連続発酵時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避することができ、より安定した連続発酵が可能となる。分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である、１２１℃で１５分間に耐性であることが好ましい。分離膜エレメント部材には、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定することができる。

本発明の乳酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、分離膜エレメントは、図１のように発酵反応槽内に設置しても良いし、図２のように発酵反応槽外に設置しても良い。分離膜エレメントを発酵反応槽外に設置する場合には、別途、膜分離槽を設けてその内部に分離膜エレメントを設置することができ、発酵反応槽と膜分離槽の間を培養液を循環させながら、分離膜エレメントにより培養液を連続的に濾過することができる。

本発明の乳酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、膜分離槽は、高圧蒸気滅菌可能であることが望ましい。膜分離槽が高圧蒸気滅菌可能であると、雑菌による汚染回避が容易である。

本発明の連続発酵による乳酸の製造方法に従って連続発酵を行った場合、従来の回分式の発酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここで、連続培養における発酵生産速度は、次の（式３）で計算される。
・発酵生産速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝抜き取り液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×発酵培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ） ・・・・（式３）
また、回分式培養による発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の発酵培養液量（Ｌ）で除して求められる。

本発明の連続発酵による乳酸の製造方法で得られる乳酸は、主に、酸味料として従来のクエン酸や酒石酸の代替品として用いられており、酸性の洗浄剤としての用途にも用いられる。また、乳酸には、医薬品として、局方品の酸薬や皮膚腐触薬などの用途がある。また、乳酸には、誘導体として、ナトリウム塩（化粧品や食品などの保湿剤用途）や、カルシウム塩（カルシウム剤や強壮剤用途）などの用途もある。乳酸には、その他、メチルエステルやエチルエステルなどのエステルとして、フロンやトリクロロエタンなどのオゾン層破壊性溶剤の代替品としての用途もある。最近では、乳酸は、ポリ乳酸樹脂の原料としての用途が大きく広がっている。本発明の連続発酵による乳酸の製造方法を用いることにより、これら幅広い用途のある乳酸を効率的に製造することができることから、より安価に乳酸を提供することが可能となる。

以下、本発明の連続発酵による乳酸の製造方法をさらに詳細に説明するために、図１および図２に示す連続発酵装置を用いることによる、連続的な乳酸の発酵生産について、実施例を挙げて説明する。本発明はこれらの実施例に限定されない。

下記の乳酸の製造方法に関する実施例においては、乳酸の例としてＬ―乳酸およびＤ−乳酸を用い、糖類の例としてグルコースを用いて乳酸の製造を行った。

下記の実施例において、培地、発酵培養液および透過液に含まれる発酵原料であるグルコースとＬ―乳酸およびＤ−乳酸の濃度は、下記のようにして測定した。グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。Ｌ−乳酸およびＤ−乳酸は、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することにより確認した。
・カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ（島津社製）
・移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、および０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・温度：４５℃。

また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は、次の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
・カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｅｎａｎｔｉｏ Ｌ１（東ソー社製）
・移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
・流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ
・温度 ：３０℃
また、Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算される。
・光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
（ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。）。

次に本発明の連続発酵による乳酸の製造方法に用いる乳酸を生産する能力を有する大腸菌、ならびに分離膜は、発明を実施するための最良の形態に記載の公知技術を参考して下記参考例のごとく作成した。

（参考例１： Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターの作製）
ラクトバチラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）のＬ−ｌｄｈ遺伝子（Accession No. X70926）をクローニングし大腸菌での発現ベクターを作製した。Ｌ−ｌｄｈ遺伝子は、全てＰＣＲ法によりクローニングを行い、同様の方法で発現ベクターに導入している。ＰＣＲの鋳型とするＤＮＡの調製方法を、以下に示す。

ラクトバチラス・プランタラムを培養し遠心回収後、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（MO BIO社製）を用いてゲノムＤＮＡの抽出を行った。詳細な操作方法は、付属のプロトコールに従った。得られたゲノムＤＮＡを続くＰＣＲの鋳型とした。

ＰＣＲ増幅反応には、Taq DNA Polymeraseの５０倍の正確性を持つとされるKOD-Plus polymerase（東洋紡社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。上記のＤＮＡの調整方法で得られたゲノムＤＮＡ、ファージミドＤＮＡ、およびｃＤＮＡをそれぞれ５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、およびKOD-Plus polymeraseを１ユニット／サンプルになるように５０μlの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、５５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：１分を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。Ｌ−ｌｄｈ遺伝子増幅用プライマー（配列番号１，２）には、５末端側にはＥｃｏＲＩ認識配列、3末端側にはＢａｍＨＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。

各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１９ベクター（制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いて行った。大腸菌DH５αに形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することによりＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクター得られた。この発現ベクターをpLLDHとした。

（参考例２：バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の染色体ＤＮＡの調製）
バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３をＧＹＰ培地（特開２００３−０８８３９２号公報）１００ｍｌに接種し、温度３０℃で２４時間培養し、培養物を得た。この培養物を３０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離処理し湿潤菌体０．５ｇを得た後、該菌体から斎藤、三浦の方法（Biochem．Biophys．Acta.，72，619（1963））により染色体ＤＮＡを得た。次いで、この染色体ＤＮＡ６０μｇ及び制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ、３ユニットを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄および１ｍＭ ジチオスレイトール含有（ｐＨ ７．４））におのおの混合し、温度３７℃の温度で３０分間反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してＳａｕ３ＡＩで消化されたバシラス・ラエボラクティカスＪＣＭ２５１３の染色体ＤＮＡ断片５０μｇを得た。

（参考例３：プラスミドベクターＤＮＡを利用したバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の遺伝子ライブラリーの作製）
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で自律複製可能なプラスミドベクターＤＮＡ（ｐＵＣ１９）２０μｇおよび制限酵素ＢａｍＨＩ２００ユニットを５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ硫酸マグネシウム含有（ｐＨ７．４））に混合し、温度３７℃の温度で２時間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理した。

この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡフラグメントが再結合することを防止するためバクテリアルアルカリホスファターゼ処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理を行った。

このＢａｍＨＩで消化されたｐＵＣ１９を１μｇ、参考例２で得られたＳａｕ３ＡＩで消化されたバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の染色体ＤＮＡ断片を１μｇ、および２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）を、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭＡＴＰを含有する６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、温度１６℃で１６時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９を形質転換し、これを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地上にまき、約２０，０００個のコロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。約２０，０００個のコロニーより、組換えＤＮＡの回収を行なった。回収の方法は上記に示した斎藤、三浦の方法に従った。

（参考例４：Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング用宿主の作製）
バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３株のＤ−ＬＤＨ遺伝子のスクリーニングを機能相補によって行った。その原理の詳細は（DOMINIQUE, G., Appl Environ Microbiol, United States (1995) 61 266-272）に記載されている。すなわち、エッシェリシア・コリのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性およびピルビン酸ギ酸リアーゼ酵素活性を欠失した株を作製する必要がある。

キリルらの方法（Kirill, A., PNAS, United States (2000) 97 6640-6645）によってエッシェリシア・コリのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ）およびピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子（ｐｆｌＢおよびｐｆｌＤ）を破壊欠失した株を作製した。この作製した株をエシェリヒア・コリ ＴＭ３３株（Ｅ．ｃｏｌｉ ΔｌｄｈＡ ΔｐｆｌＢ：：Ｋｍ^ｒ ΔｐｆｌＤ：：Ｃｍ ^ｒ ）と命名し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング用宿主とした。

（参考例５：Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング）
エシェリヒア・コリ ＴＭ３３株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシン硫酸塩および１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、温度３７℃の温度で２４時間培養し、培養物を得た。この培養物を３，０００r.p.m.で１５分間、遠心分離処理し湿潤菌体０．８ｇを得た。この湿潤菌体を１０％グリセロール溶液１０ｍｌで３度洗浄した後、１０％グリセロール溶液０．１ｍｌにけん濁しコンピテントセルとした。このコンピテントセルに参考例３で得たバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３株の遺伝子ライブラリーを１μｌ加え、電気穿孔法の常法に従い導入した株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＭ９ＧＰ寒天培地（Ｍ９培地＋０．４％グルコース＋０．２％ペプトン）上にまき、嫌気条件下で生育可能であった株を数株得た。

（参考例６：Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡの塩基配列の解析）
上記で得られた組換えＤＮＡを含有するエシェリヒア・コリ ＴＭ３３／ｐＢＬ２から常法に従いプラスミドを調製し、得られた組換えＤＮＡを用い塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用いSangerの方法に従って行った。得られたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列は２，９９５塩基対あった。この配列についてGenetyx（ソフトウェア開発株式会社製）を用いてオープン・リーディング・フレーム検索を行い、本発明のＤＮＡ配列（配列番号３）を決定した。

（参考例７： Ｄ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターの作製）
上記の参考例６で決定したバシラス・ラエボラクティカスのD−ｌｄｈ遺伝子をクローニングし大腸菌での発現ベクターを作製した。D−ｌｄｈ遺伝子は、全てＰＣＲ法によりクローニングを行い、同様の方法で発現ベクターに導入している。ＰＣＲの鋳型とするＤＮＡの調製方法を、次に示す。

バシラス・ラエボラクティカスを培養し遠心回収後、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（MO BIO社製）を用いてゲノムＤＮＡの抽出を行った。詳細な操作方法は、付属のプロトコールに従った。得られたゲノムＤＮＡを続くＰＣＲの鋳型とした。

ＰＣＲ増幅反応には、Taq DNA Polymeraseの５０倍の正確性を持つとされるKOD-Plus polymerase（東洋紡社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。上記のＤＮＡの調整方法で得られたゲノムＤＮＡ、ファージミドＤＮＡ、およびｃＤＮＡをそれぞれ５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、およびKOD-Plus polymeraseを１ユニット／サンプルになるように５０μlの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、５５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：１分を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。D−ｌｄｈ遺伝子増幅用プライマー（配列番号４，５）には、５末端側にはＢａｍＨＩ認識配列、3末端側にはＳｐｈＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。

各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１９ベクター（制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで切断したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いて行った。大腸菌DH５αに形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することによりＤ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターが得られた。この発現ベクターをpDLDHとした。

（参考例８）Ｌ−乳酸生産大腸菌およびＤ−乳酸生産大腸菌の作製
上記の参考例１および７で得られたｌｄｈ発現ベクターを、上記の参考例４で得られたＴＭ３３株に導入した。こうして得られたＬ−乳酸生産大腸菌（ＴＭ３３／ｐＬＬＤＨ）をＴＭ１００株と命名し、Ｄ−乳酸生産大腸菌（ＴＭ３３／ｐＤＬＤＨ）をＴＭ２００株と命名し、本発明に用いる乳酸の生産能力のある大腸菌とした。

（参考例９）多孔性膜の作製
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％
次に、上記の原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ³で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性分離膜を得た。
・水 ：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％
この多孔性分離膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水透過係数を評価したところ、５０×１０^-9ｍ³／ｍ²／ｓ／Ｐａであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。

（参考例１０）多孔性膜の作製（その２）
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し、原液を作製した。この原液を、γ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。

次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社製、商品名“イオネットＴ−２０Ｃ”（登録商標））を５重量％、および水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して、原液を調整した。この原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させて本発明で用いる中空糸膜（多孔性膜）を製作した。得られた中空糸膜（分離膜）の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０５μｍであった。次に、上記の分離膜である中空糸膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０^-9ｍ³／ｍ²・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。

（実施例１）大腸菌を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その１）
図１の連続発酵装置と表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、Ｌ−乳酸の製造を行った。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には上記の参考例９で作製した多孔性膜を用いた。実施例１における運転条件は、特に断らない限り次のとおりである。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：６０平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜分離槽通気量：０．３（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整
・乳酸発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・発酵培養液循環装置による循環液量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１００時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）。

微生物に上記の参考例８で造成したＬ−乳酸生産大腸菌ＴＭ１００株を用い、培地に表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、生産物である乳酸の濃度および光学純度の評価には前記ＨＰＬＣ方法を用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。

まず、ＴＭ１００株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度の調整、ｐＨの調整を行い、発酵培養液循環ポンプ１０を稼働させることなく、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、発酵培養液循環ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、乳酸発酵培地の連続供給を行い、膜分離型の連続発酵装置の発酵培養液量が２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、濾液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。

３００時間の連続発酵試験を行った結果を表２に示す。また、前記ＨＰＬＣ方法を用い、光学純度を測定した結果、Ｌ−乳酸の光学純度は９８．５％e.e.であった。図１に示す連続発酵装置を用いた本発明の乳酸の製造方法により、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。

（実施例２）大腸菌を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その２）
Ｌ−乳酸生産大腸菌ＴＭ１００株を用い、分離膜として参考例１０で作成した多孔性膜を用い、その他は実施例１と同じ条件、評価法によりＬ―乳酸の連続発酵試験を行った。

（実施例３）大腸菌を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その３）
図２の連続発酵装置と表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、Ｌ−乳酸の製造を行った。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、上記の参考例９で作製した多孔性膜を用いた。この実施例３における運転条件は、特に断らない限り以下のとおりである。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・乳酸発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。

微生物に上記の参考例８で造成したＬ−乳酸生産大腸菌ＴＭ１００株を用い、培地に表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、生産物である乳酸の濃度および光学純度の評価には前記ＨＰＬＣ方法を用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。

まず、ＴＭ１００株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示した膜分離型の連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって４００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度の調整、ｐＨの調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、膜分離型の連続発酵装置の発酵培養液量が１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ―乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、濾液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該Ｌ−乳酸、及びグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたＬ−乳酸対糖収率、Ｌ−乳酸生産速度を表２に示した。また、前記ＨＰＬＣ方法を用い、光学純度を測定した結果、Ｌ−乳酸の光学純度は９８．５％e.e.であった。

図２に示す連続発酵装置を用いた本発明の乳酸の製造方法により、安定したエタノールの連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。

（実施例４）大腸菌を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その４）
Ｌ−乳酸生産大腸菌ＴＭ１００株を用い、分離膜として参考例１０で作成した多孔性分離膜を用い、その他は実施例３と同じ条件、評価法によりＬ―乳酸の連続発酵試験を行った。

（比較例１）回分発酵によるＬ−乳酸の製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を行い、そのＬ−乳酸生産性を評価した。表１に示す乳酸発酵培地を用い、図１の膜分離型連続発酵装置の発酵反応槽１のみを用いた回分発酵試験を行った。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。比較例１においても、上記の参考例８で造成したＬ−乳酸生産大腸菌ＴＭ１００株を用い、生産物である乳酸の濃度および光学純度の評価には、前記ＨＰＬＣ方法を用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。比較例１の運転条件を次に示す。
・発酵反応槽容量（乳酸発酵培地量）：１（Ｌ）
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整。

まず、ＴＭ１００株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を膜分離型連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５により１００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１を通気した。温度の調整とｐＨの調整を行い、発酵培養液循環ポンプ１０を稼働させることなく、回分発酵培養を行った。このときの菌体増殖量は、６００ｎｍでの吸光度で１４であった。回分発酵の結果を表２に示す。

図１および図２に示す連続発酵装置を用いた本発明の乳酸の製造方法により、Ｌ―乳酸の生産速度が大幅に向上した。

（実施例５）大腸菌を用いた連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その１）
図１の連続発酵装置と表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、Ｄ−乳酸の製造を行った。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には上記の参考例９で作製した多孔性膜を用いた。実施例５における運転条件は、特に断らない限り次のとおりである。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：６０平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜分離槽通気量：０．３（Ｌ／ｍｉｎ）
・反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整
・乳酸発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・発酵培養液循環装置による循環液量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１００時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）。

微生物に上記の参考例８で造成したＤ−乳酸生産大腸菌ＴＭ２００株を用い、培地に表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、生産物である乳酸の濃度および光学純度の評価には前記ＨＰＬＣ方法を用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。

まず、ＴＭ２００株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度の調整、ｐＨの調整を行い、発酵培養液循環ポンプ１０を稼働させることなく、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、発酵培養液循環ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、乳酸発酵培地の連続供給を行い、膜分離型の連続発酵装置の発酵培養液量が２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＤ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、濾液中の生産されたＤ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。

３００時間の連続発酵試験を行った結果を、表３に示す。また、前記のＨＰＬＣ方法を用い、光学純度を測定した結果、Ｄ−乳酸の光学純度は９９．５％e.e.であった。図１に示す連続発酵装置を用いた本発明の乳酸の製造方法により、安定したＤ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。

（実施例６）大腸菌を用いた連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その２）
Ｄ−乳酸生産大腸菌ＴＭ２００株を用い、分離膜として参考例１０で作成した多孔性膜を用い、その他は実施例５と同じ条件、評価法によりＤ―乳酸の連続発酵試験を行った。

（実施例７）大腸菌を用いた連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その３）
図２の連続発酵装置と表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、Ｄ−乳酸の製造を行った。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には上記の参考例９で作製した多孔性膜を用いた。この実施例７における運転条件は、特に断らない限り次のとおりである。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・乳酸発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）。
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎの
オートクレーブにより高圧蒸気滅菌。

微生物に上記の参考例８で造成したＤ−乳酸生産大腸菌ＴＭ２００株を用い、培地に表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、生産物である乳酸の濃度および光学純度の評価には前記ＨＰＬＣ方法を用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。

まず、ＴＭ２００株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示した膜分離型の連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって４００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度の調整、ｐＨの調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、膜分離型の連続発酵装置の発酵培養液量が１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＤ―乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、濾液中の生産されたＤ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、Ｄ−乳酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたＤ−乳酸対糖収率とＤ−乳酸生産速度を表３に示した。また、前記ＨＰＬＣ方法を用い、光学純度を測定した結果、Ｄ−乳酸の光学純度は９９．５％e.e.であった。

図２に示す連続発酵装置を用いた本発明の乳酸の製造方法により、安定したエタノールの連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。

（実施例８）大腸菌を用いた連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その４）
Ｄ−乳酸生産大腸菌ＴＭ２００株を用い、分離膜として参考例１０で作成した多孔性膜を用い、その他は実施例７と同じ条件、評価法によりＤ―乳酸の連続発酵試験を行った。

（比較例２）回分発酵によるＤ−乳酸の製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を行い、そのＤ−乳酸生産性を評価した。表１に示す乳酸発酵培地を用い、図１の連続発酵装置の反応槽１のみを用いた回分発酵試験を行った。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。この比較例２でも、上記の参考例８で造成したＤ−乳酸生産大腸菌ＴＭ２００株を用い、生産物である乳酸の濃度および光学純度の評価には前記ＨＰＬＣ方法を用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。比較例２の運転条件を次に示す。
・発酵反応槽容量（乳酸発酵培地量）：１（Ｌ）
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整。

まず、ＴＭ２００株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を膜分離型の連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５により１００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１を通気した。温度の調整とｐＨの調整を行い、発酵培養液循環ポンプ１０を稼働させることなく、回分発酵培養を行った。この時の菌体増殖量は、６００ｎｍでの吸光度で１３であった。回分発酵の結果を表３に示す。

図１および図２に示す連続発酵装置を用いた本発明の乳酸の製造方法により、Ｄ―乳酸の生産速度が大幅に向上した。

図１は、本発明で用いられる連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。 図２は、本発明で用いられる他の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。 図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。 図４は、本発明で用いられる他の分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。

符号の説明

１ 発酵反応槽
２ 分離膜エレメント
３ 水頭差制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 発酵培養液循環ポンプ
１２ 膜分離槽
１３ 支持板
１４ 流路材
１５ 分離膜
１６ 凹部
１７ 集水パイプ
１８ 分離膜束
１９ 上部樹脂封止層
２０ 下部樹脂封止層
２１ 支持フレーム
２２ 集水パイプ

Claims (8)

1. 乳酸を生産する能力を有する大腸菌の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、その大腸菌の発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵により乳酸を製造する方法であって、前記の分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲にして濾過処理することを特徴とする連続発酵による乳酸の製造方法。
2. 多孔性分離膜の純水透過係数が、２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上６×１０^−７ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以下である請求項１記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
3. 多孔性膜の平均細孔径が０.０１μｍ以上０.２μｍ未満であり、かつ、該平均細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下である請求項１または２記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
4. 多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下である請求項１から３のいずれかに記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
5. 多孔性膜が多孔性樹脂層を含む多孔性膜である請求項１から４のいずれかに記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
6. 多孔性膜の膜素材がポリフッ化ビニリデン系樹脂である請求項１から５のいずれかに記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
7. 大腸菌の発酵原料が糖類を含む請求項１から６のいずれかに記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
8. 乳酸がＬ−乳酸またはＤ−乳酸である請求項１から７のいずれかに記載の連続発酵による乳酸の製造方法。

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