KR20220065793A - 마이크로바이옴을 특성화하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

마이크로바이옴을 특성화하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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조티 아마라나트 고빈단
엘람파리티 자야마니
프리티 에이치. 채터
무케쉬 채터
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마블바이옴 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 복수의 C. elegans 배양물을 포함하며, 각 배양물은 포유동물의 질환 또는 병증을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 시스템을 제공한다. 또한, 예를 들어 포유동물 마이크로바이옴의 미생물 균주를 특성화하고 해당 미생물 균주가 포유동물의 질환 또는 장애에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위한 시스템을 사용하는 방법을 제공한다.

Description

마이크로바이옴을 특성화하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 미국 가특허출원 No. 62/899,718(2019년 9월 12일 출원) 및 미국 가특허출원 제62/988,132호(2020년 3월 11일 출원)에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원은 본원에 원용되어 있다.
Caenorhabditis elegans는 길이가 약 1mm이고 온대 토양 환경에 사는 박테리오보러스 선충이다.
본 개시는 C. elegans로 미생물 제제(예를 들어, 마이크로바이옴 샘플)의 특성을 평가하는 시스템을 제공할 수 있다는 사실을 기초로 한다. 본 개시는 특히 마이크로바이옴 샘플을 평가하여 특정 질환 또는 병증에 마이크로바이옴 샘플의 미생물 균주가 미치는 영향 또는 조절을 확인하거나 특성화할 수 있는 기술에 관한다. 일부 실시형태에서, 해당 기술은 특정 환자 또는 환자군에서 균주의 수준 차이 식별에 유용할 수 있다. 그에 따라 본 개시는 환자별 샘플에서 미생물 균주의 특성을 평가하는 기술을 제공하고, 또한 개별 환자의 마이크로바이옴이 건강 상태에 차등적으로 영향을 미치는 방식에 관한 환자별 정보를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원이 제공하는 기술은 환자별 샘플에서 미생물 균주의 특성에 기초하여 환자에게 감수성이 있을 가능성이 높은 질환 또는 병증을 확인할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원이 제공하는 기술은, 예를 들어 특정 질환 또는 병증으로부터 환자를 보호하거나 그에 내성을 부여하는 환자의 미생물 균주를 확인할 수 있다. 따라서, 본 명세서가 제공하는 기술은 질병 조절제(예: 질환 또는 병증에 영향을 미치는 미생물 균주)에 대한 미생물군유전체 샘플(예: 인간 마이크로바이옴 샘플)을 스크리닝하기 위한 진단 도구로 유용하게 쓰일 수 있다.
특정 실시형태에서는 신경퇴행성 질환 또는 병증(예: 알츠하이머병)의 발병 및/또는 발달을 조절하거나 영향을 미칠 수 있는 마이크로바이옴 균주(예: 인간 마이크로바이옴에 존재)를 확인하거나 스크리닝하기 위한 형질전환 C. Elegans 전동물 모델 시스템의 용도를 제공한다. 당업자는 본원에 기재된 기술이 예시된 알츠하이머병 등의 신경퇴행성 질환은 물론, 마이크로바이옴과 연관이 있는 각종 기타 질환 또는 병증, 이를테면 파킨슨병, 헌팅턴병 및 근위축성 측삭 경화증, 제2형 당뇨병, 비만, 고혈당증, 포도당 불내성, 인슐린 저항성(고인슐린혈증, 대사 증후군, 증후군 X), 고콜레스테롤혈증, 고혈압, 고지단백질혈증, 고지혈증(예: 이상지질혈증), 고중성지방혈증, 심혈관 질환, 동맥경화증, 말초혈관 질환, 신장질환, 케톤산증, 혈전성질환, 신장병, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 노인성 황반변성, 녹내장, 성기능장애, 녹내장, 피부병, 소화불량, 암저혈당, 대사증후군 또는 부종 등의 병에 관련된 용도에 적용 가능하다는 사실을 이해할 것이다.
본원의 일부 양태에서는 복수의 C. elegans 배양물을 포함하는 시스템을 제공하며, 각 배양물은 질환 또는 병증(예: 포유동물의 질환 또는 병증)을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 C. elegans 배양물은 적어도 5개 이상(예 : 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상)의 C. elegans 배양물을 포함해도 좋다.
일부 실시형태에서, 시스템의 C. elegans 배양물 중 하나 이상은 표적 대상체에 존재하는 질환 또는 병증을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시스템의 C. elegans 배양물 중 하나 이상은 포유동물 질환 또는 병증(예 : 인간 질환 또는 병증)을 모델링하는 형질전환 C. elegans균주를 포함해도 좋다. C. elegans 균주가 모델링하는 인간 질환 또는 병증의 예시로는 신경퇴행성 질병 또는 장애(예: 알츠하이머병)를 들 수 있다. 일부 실시형태에서, C. elegans 균주가 모델링하는 질환 또는 병증(예: 인간 질환 또는 병증)은 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있는 질환 또는 병증을 포함해도 좋다(예: 세포 스트레스 반응을 포함). 일부 실시형태에서, 예를 들어, C. elegans가 모델링하는 질환 또는 병증은 안구 신생혈관 질환 또는 장애(예: 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 노인성 황반변성 또는 녹내장)여도 좋다. 일부 실시형태에서, 시스템의 C. elegans 배양물 중 하나 이상은 비인간 포유동물 질환 또는 병증, 예 를 들어 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 또는 돼지의 질환 또는 병증을 모델링하는 형질전환 C. elegans를 포함해도 좋다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템에서 제공하는 형질전환 C. elegans 균주는 표적 질환 또는 병증(예: 포유동물 질환 또는 병증)와 관련된 특징적 서열 요소를 가지는 형질전환 유전자를 포함해도 좋다. 질환 또는 병증(예: 포유동물 질환 또는 병증)과 연관이 있는 특징적 서열 요소는 외래 유전자(예: 포유동물 유전자), DNA 조절요소(예: 포유동물 DNA 조절요소) 및/또는 포유동물 RNA 조절요소이거나 이를 포함해도 좋다. 당업계에는 각종 DNA 및 RNA 조절요소가 공지되어 있다. 따라서 당업자는 일부 실시형태에서 질환 또는 병증(예: 포유동물의 질환 또는 병증)과 연관이 있는 DNA 조절 요소가 인핸서, 프로모터, 사일런서, 절연인자, 유전자좌 조절부위, 또는 이들의 조합이거나 이들을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병증(예: 포유동물 질환 또는 병증)과 연관이 있는 RNA 조절요소, 예를 들어 비번역 부위, 인트론, 스플라이스 부위 및 이들의 조합을 본 개시에 따라 사용해도 좋다.
추가적으로 또는 대안적으로, 해당 시스템의 형질전환 C. elegans 균주는 리포터 유전자를 가지는 형질전환 유전자를 포함해도 좋다. 상기 리포터 유전자로는 형광성, 인광성 및/또는 생물발광성 단백질을 들 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
C. elegans 배양물을 포함하는 일부 실시형태에서, 해당 배양물 중 적어도 2개 이상은 각각 동일한 질환 또는 병증(예: 포유동물 질환 또는 병증)을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함해도 좋다. 일부 실시형태에서, 해당 배양물 중 적어도 2개 이상은 각각 동일한 질환 또는 병증(예: 포유동물 질환 또는 병증)과 연견이 있는 상이한 생화학적 또는 분자적 경로를 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함해도 좋다. C. elegans 배양물을 포함하는 일부 실시형태에서, 해당 배양물은 모두 각각 동일한 질환 또는 병증(예: 포유동물 질환 또는 병증)을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함해도 좋다.
C. elegans 배양물을 포함하는 일부 실시형태에서, 해당 배양물 중 적어도 2개 이상은 각각 상이한 질환 또는 병증(예: 포유동물 질환 또는 병증)을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함해도 좋다.
본원의 시스템은 표적 대상의 특정 질환 또는 병증과 미생물 제제(예:마이크로바이옴 샘플)의 관계 및/또는 효과를 특성화하는 데 쓰일 수 있다. 따라서 일부 실시형태에서, 상기 시스템의 하나 이상의 C. elegans 배양물은 포유동물 마이크로바이옴(예: 인간 마이크로바이옴)의 미생물을 포함한다. 일부 실시형태에서, C. elegans 배양물은 각각 포유동물 바이크로바이옴(예: 인간 마이크로바이옴)의 미생물을 포함해도 좋다. 일부 실시형태에서, 상기 시스템의 하나 이상의 C. elegans 배양물은 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소 또는 돼지 마이크로바이옴의 미생물을 포함해도 좋다. 본 개시에 따라 쓰이는 바이크로바이옴은 포유동물 대상체의 표적 해부 위치에서 얻거나 그에서 유래해도 좋다. 마이크로바이옴의 예로는 피부 마이크로바이옴, 구강 마이크로바이옴, 비강 마이크로바이옴, 위장 마이크로바이옴, 뇌 마이크로바이옴, 폐 마이크로바이옴 및/또는 비뇨생식기 마이크로바이옴을 들 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 각 C. elegans 배양물의 미생물은 하나 이상의 미생물 균주를 포함해도 좋다. 일부 실시형태에서, 각 배양물의 미생물은 단일 미생물 균주를 포함해도 좋다.
일부 실시형태에서, C. elegans 배양물 중 하나 이상은 치료제 또는 영양제를 포함해도 좋다.
본원은 또한 복수의 C. elegans 배양물을 사용하여 마이크로바이옴을 특성화하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 해당 방법은 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합이 포유동물 질환 또는 장애에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위해 개체(예: 포유동물, 특히 인간)의 마이크로바이옴을 스크리닝하는 것을 목적으로 한다. 일부 실시형태에서, 해당 방법은 개체의 마이크로바이옴에 있는 하나 이상의 미생물 균주에 근거하여 개체(예: 포유동물, 특히 인간)를 진단하는 것을 목적으로 한다. 일부 실시형태에서, 해당 방법은 개체의 마이크로바이옴에 있는 하나 이상의 미생물 균주에 근거하여 개체(예: 포유동물, 특히 인간)의 질병 또는 병증 진행 상태를 모니터링하는 것을 목적으로 한다.
본원에 기재된 일부 실시형태에서 제공하는 방법은, 포유동물 마이크로바이옴에서 얻은 미생물을 본원에 기재된 시스템의 C. elegans 배양물 각각에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 각 C. elegans 배양물의 미생물은 하나 이상의 미생물 균주를 포함해도 좋다. 일부 실시형태에서, 각 배양물의 미생물은 단일 미생물 균주를 포함해도 좋다. 본원에 기재된 방법에서 쓰이는 바이크로바이옴은 포유동물 대상체의 표적 해부 위치에서 얻거나 그에서 유래해도 좋다. 마이크로바이옴의 예로는 피부 마이크로바이옴, 구강 마이크로바이옴, 비강 마이크로바이옴, 위장 마이크로바이옴, 뇌 마이크로바이옴, 폐 마이크로바이옴 및/또는 비뇨생식기 마이크로바이옴을 들 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 해당 방법은 포유동물 마이크로바이옴의 복수의 미생물 균주를 복수의 C. elegans 배양물에 첨가하는 단계를 포함해도 좋다. 이 경우 상이한 미생물 균주를 각각의 C. elegans 배양물에 첨가하고, 각각의 배양물은 동일한 형질전환 C. elegans 균주를 포함하며, 형질전환 C. elegans 균주는 포유동물의 질환 또는 병증을 모델링한다.
일부 실시형태에서, C. elegans 배양물 중 하나 이상은 치료제 또는 영양제를 포함해도 좋다. 따라서 일부 실시형태에서, 상기 방법은 C. elegans 배양물 중 하나 이상에 치료제 또는 영양제를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 각각의 C. elegans 배양물에서 형질전환 C. elegans 균주의 하나 이상의 매개변수 값을 결정하는 단계를 추가로 포함해도 좋다. 일부 실시형태에서, 형질전환 C. elegans의 해당 매개변수는 형질전환 C. elegans 균주가 모델링하는 포유동물의 질환 또는 병증과 연관이 있다. 형질전환 C. elegans 의 해당 매개변수의 예로는, 포유동물 질환 또는 병증과 연관이 있는 분자(예: 소분자, 단백질, 폴리펩타이드 또는 전사체)의 생물학적 기능 또는 표현형 및/또는 수치 및/또는 활성을 들 수 있다.
일부 실시형태에서, 해당 방법은, (a) C. elegans 배양물에 미생물 균주를 첨가하기에 앞서, 배양물에서의 형질전환 C. elegans 균주의 하나 이상의 매개변수 값을 판정하는 단계와, (b) C. elegans 배양물에 미생물 균주를 첨가한 후, 배양물에서의 형질전환 C. elegans 균주의 동일한 하나 이상의 매개변수 값을 판정하는 단계와, (c) 미생물 균주를 첨가하기 전에 결정한 하나 이상의 매개변수 값을 미생물 균주를 추가한 후에 판정한 하나 이상의 매개변수 값과 비교하는 단계를 추가로 포함해도 좋다.　
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 기술을 사용하여 인간 질환 또는 병증과 연관이 있는 인간 바이옴의 미생물 균주를 특성화할 수 있다. 따라서 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 시스템 및 방법에 관여하는 형질전환 C. elegans 균주는 인간 질환 또는 병증을 모델링한다. 형질전환 C. elegans 균주가 모델링하는 인간 질환 또는 병증의 예로는 알츠하이머를 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 형질전환 C. elegans 균주가 모델링하는 질환 또는 병증(예: 인간 질환 또는 병증)은 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있는 질환 또는 병증을 포함해도 좋다(예: 세포 스트레스 반응을 포함). 일부 실시형태에서, 예를 들어, 형질전환 C. elegans가 모델링하는 질환 또는 병증은 안구 신생혈관 질환 또는 장애(예: 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 노인성 황반변성 또는 녹내장)여도 좋다. 일부 실시형태에서, 형질전환 C. elegans 균주가 모델링하는 질환 또는 병증은 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 노인성 황반 변성, 또는 녹내장이다.
따라서, 본원에 기재된 특정한 양태는 인간 바이옴의 미생물 균주를 특성화하기 위한 기술에 관한다. 예를 들어, 일 양태는 (a) 알츠하이머병을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 C. elegans 배양물에 미생물 균주를 첨가하는 단계와, (b) 미생물 균주가 하나 이상의 매개변수에 영향을 미치는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 여기서 형질전환 C. elegans 균주의 매개변수 하나 이상이 알츠하이머병과 관련이 있다. 일부 실시형태에서, 형질전환 C. elegans 균주는 인간 ssApoE4 단백질, 인간 Aβ1-42 폴리펩티드, 또는 인간 슈도인산화 타우 단백질을 인코딩하는 형질전환 유전자를 포함해도 좋다.
일부 실시형태에서, 해당 방법은, (a) C. elegans 배양물에 미생물 균주를 첨가하기에 앞서, 배양물에서의 형질전환 C. elegans 균주의 하나 이상의 매개변수 값을 판정하는 단계와, (b) C. elegans 배양물에 미생물 균주를 첨가한 후, 배양물에서의 형질전환 C. elegans 균주의 동일한 하나 이상의 매개변수 값을 판정하는 단계와, (c) 미생물 균주를 첨가하기 전에 결정한 하나 이상의 매개변수 값을 미생물 균주를 추가한 후에 판정한 하나 이상의 매개변수 값과 비교하는 단계를 추가로 포함한다.하나 이상의 매개변수의 예로는 (i) C. elegans 마비도, (ii) 아밀로이드 플라크 수치, (iii) 타우 필라멘트 수치, (iv) 신경염증도, (v) 프로테아좀 기능도, 및/또는 (vi) 이들의 조합을 들 수 있다.
또다른 양태에 있어서, 본 개시는 인간 바이옴의 미생물 균주를 특성화하는 방법에 있어서, (a) 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있는 질환 또는 병증을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 C. elegans 배양물에미생물 균주를 첨가하는 단계와, (b) 미생물 균주가 형질전환 C. elegans 균주의 매개변수 하나 이상에 영향을 미치는지의 여부를 판정하는 단계를 포함하고, 하나 이상의 매개변수는 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 형질전환 C. elegans 균주는 인간 프롤릴 히드록실라아제 EGLN, 인간 HIF 전사인자 또는 인간 HIFα 단백질을 인코딩하는 형질전환 유전자를 포함해도 좋다.
일부 실시형태에서, 해당 방법은, (a) C. elegans 배양물에 미생물 균주를 첨가하기에 앞서, 배양물에서의 형질전환 C. elegans 균주의 하나 이상의 매개변수 값을 판정하는 단계와, (b) C. elegans 배양물에미생물 균주를 첨가한 후, 배양물에서의 형질전환 C. elegans 균주의 동일한 하나 이상의 매개변수 값을 판정하는 단계와, (c) 미생물 균주를 첨가하기 전에 결정한 하나 이상의 매개변수 값을 미생물 균주를 추가한 후에 판정한 하나 이상의 매개변수 값과 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
하나 이상의 매개변수의 예로는 (i) 신경염증도, (ii) 프로테아좀 기능도, (iii) C. elegans 의 산란율, 및/또는 (vi) 이들의 조합을 들 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
(i) 인간 ssApoE4, (ii) 인간 Aβ, (iii) 인간 유사인산화 타우, (iv) UbV-GFP 프로테아좀 마커 중 둘 이상을 발현하는 형질전환 C. elegans 균주 역시 본 개시의 청구범위에 속한다.
본 개시는 또한, 특히 포유동물 질환 또는 병증에 영향을 미치는 미생물 균주에 대해 포유동물 마이크로바이옴을 스크리닝하는 것을 목적으로 하는 형질전환 C. elegans 균주, 시스템 및/또는 방법의 용도를 기재하고 있다. 아울러 본 개시는 포유동물 마이크로바이옴 미생물 균주가 포유동물 질환 또는 병증에 미치는 영향을 특성화하는 것을 목적으로 하는 C. elegans, 시스템 및/또는 방법의 용도를 포함한다. 예를 들어, 인간 마이크로바이옴은 본 개시에 따라 본원에서 제공하는 기술을 사용하여 스크리닝/특성화할 수 있다.
본 개시는 하나 이상의 미생물 균주를 포함하는 조성물에 관한다. 일부 실시형태에서, 본원이 제공하는 조성물은 포유동물 마이크로바이옴에서 얻은 하나 이상의 미생물 균주, 그 추출물, 및/또는 그 성분을 포함하며, 그에 대한 평가, 확인, 특성화 또는 분석에는 본원에 기재된 형질전환 C. elegans 또는 방법을 사용하였다. 일부 실시형태에서, 본원이 제공하는 조성물은 포유동물 마이크로바이옴 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 미생물 균주, 아울러 그 추출물, 및/또는 그 성분을 포함하며, 그에 대한 평가, 확인, 특성화 또는 분석에서 본원에 기술된 바와 같은 형질전환 C. elegans 또는 방법을 사용하였다.
일부 실시형태에서, 본원이 제공하는 조성물은 하기 표 8에서 열거하는 미생물 균주 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본원이 제공하는 조성물은, Gluconacetobacter hansenii, Terrisporobacter glycolicus, Coprococcus sp., L. plantarum, Clostridium butyricum, Paenibacillus sp., Veillonella sp., Bifidobacterium sp., Bacillus subtilis, Acidaminococcus sp., 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 본원이 제공하는 조성물은, Gluconacetobacter hansenii, Terrisporobacter glycolicus, Coprococcus sp., L. plantarum, Clostridium butyricum, Paenibacillus sp., Veillonella sp., Bifidobacterium sp., Bacillus subtilis, Acidaminococcus sp. 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 전부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 해당 조성물은 의약 조성물이다. 일부 실시형태에서, 해당 조성물은 섭취 가능한 품목이다.
또한 본 개시는 본원에 기재된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한다.
일부 실시형태에서, 대상체의 질환 또는 병증을 치료하는 방법은 본원에 기재된 조성물을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병증은 신경퇴행성 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병증은 알츠하이머병이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병증은 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있어도 좋다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병증은 안구 신생혈관 질환 또는 장애여도 좋다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병증은 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 노인성 황반 변성, 또는 녹내장이다. 본 개시는 또한 본원에 기재된 조성물의 용도에 관한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물의 용도는 대상체의 질환 또는 병증의 치료이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병증은 신경퇴행성 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병증은 종양이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병증은 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있어도 좋다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병증은 안구 신생혈관 질환 또는 장애여도 좋다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병증은 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 노인성 황반 변성, 또는 녹내장이다.
본 개시에 포함되는 상기 및 그 외 양태는 하기와 청구범위에서 보다 상세하게 설명할 것이다.
정의
본 발명의 범위는 하기의 청구범위에 의해 정의되며 본원에 기재된 특정한 실시형태에 한정되지 않는다. 당업자는 본원에서 제시한 실시형태와 동등하거나 청구범위에 속하는 수정 또는 개량에 착안할 수 있을 것이다. 본원에서 쓰인 용어는 별도로 명시하지 않는 한 당업계에서 이해하는 의미를 따른다. 특정 용어는 하기에 명시적으로 정의하였다. 본 명세서 전반에 걸쳐 당업자는 용어의 의미를 명확하게 이해할 수 있을 것이다.
청구항에서 청구요소를 명시할 때 사용하는 "첫 번째", "두 번째", "세 번째" 등의 서수는 어느 청구요소가 또다른 청구요소에 대하여 우선순위가 높거나 실행하는 순서가 앞선다는 것을 의미하지 않는다. 이는 특정 이름을 가진 하나의 청구항 요소를 동일한 이름을 가진 다른 요소와 구별하기 위한 라벨에 지나지 않는다.
관사 "a" 및 "an"은 별도로 명시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 그룹의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는(or)"을 포함하는 청구항 또는 설명은, 별도로 명시하지 않는 한, 그룹 구성원 중 하나, 하나 이상 또는 모두가 해당 제품 또는 프로세스에 존재하거나, 이용되거나, 또는 이들과 관련이 있는 것으로 간주해야 한다. 일부 실시형태에서는 그룹의 구성원 하나가 해당 제품 또는 프로세스에 존재하거나, 이용되거나, 또는 그와 관련이 있다. 일부 실시형태에서는 그룹 구성원의 하나 이상이 해당 제품 또는 프로세스에 존재하거나, 이용되거나, 또는 그와 관련이 있다. 해당 발명은, 청구항 중 하나 이상에서의 제한사항, 요소, 조항, 설명 등 하나 이상을 동일한 기본청구항에 속하는 청구항에 도입한 수정, 조합 및 순열을 모두 포함하되, 별도로 명시하거나 모순 또는 불일치가 발생할 가능성이 높다는 것이 당업자에게 명백한 경우는 예외로 한다. 요소를 목록(예:Markush 그룹 또는 유사한 형식)으로 표시하는 경우, 요소의 각 하위 그룹 또한 공개하는 것으로 간주해야 하며, 임의의 요소는 그룹에서 제외할 수 있음을 이해해야 한다. 일반적으로 실시형태 또는 양태가 특정 요소, 특징 등을 "포함하는(comprise)" 것으로 규정되는 경우 특정 실시형태 또는 양태는 해당 요소, 특징 등으로 "구성(consist)"되거나 "본질적으로 구성(consist essentially)"되는 것이다. 복잡해지는 것을 피하기 위해 본원에서는 실시형태의 설명을 단순화했다. 본원에서의 인용 여부에 상관없이, 임의의 실시형태 또는 양태는 청구범위에서 명시적으로 배제될 수 있다.
투여: 본원의 "투여(administration)"는 일반적으로 대상 또는 시스템에 제제를 전달하기 위해 해당 대상 또는 시스템에 조성물을 투여하는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 제제는 조성물이거나 이에 포함된다. 일부 실시형태에서, 제제는 조성물 또는 조성물의 성분 하나 이상의 대사를 통해 생성된다. 당업자는 적절한 상황에서 대상체, 예를 들어 인간에게 투여하기 위해 활용할 수 있는 각종 경로를 인지할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 안구, 경구, 비경구, 국소 투여 등을 적용해도 좋다. 일부 실시형태에서, 기관지(예: 기관지 점적), 협측, 진피(예: 진피, 피내, 피내, 경피 등에 국소 투여), 장, 동맥내, 피내, 위내, 골수내, 근육내, 비강내, 복강내, 척추강내, 정맥내, 뇌실내, 특정 기관 내(예: 간내), 점막, 비강, 경구, 직장, 피하, 설하, 국소, 기관(예: 기관내 점적), 질, 유리체 투여를 적용해도 좋다. 일부 실시형태에서, 단일 용량의 투여만이 가능해도 좋다. 일부 실시형태에서, 일정한 횟수의 용량을 투여해도 좋다. 일부 실시형태에서, 투여는 간헐적 ( 예: 시간상 분리된 복수의 용량) 및/또는 주기적 (: 공통의 기간으로 분리되어 있는개별 용량) 투약을 포함해도 좋다. 일부 실시형태에서, 투여는 적어도 선택된 시간 동안의 연속 투여(예: 관류)와 관련이 되어도 좋다. 세포의 투여는 전달한 세포 또는 세포의 구성요소의 적어도 일부가 생존 가능한 상태로 유지되는 대상체의 희망 위치로 세포를 전달하는 임의의 적절한 경로에 실시해도 좋다. 대상체에게 투여한 후 세포의 생존 기간은 짧게는 몇 시간, 이를테면 24시간에서 며칠, 길게는 몇 년일 수 있다. 이 경우 장기 생착이라고 한다. 일부 실시형태에서, 투여는 하나 이상의 박테리아 대사산물 및/또는 부산물을 포함하되 완전 생존이 가능한 박테리아 세포는 없는 박테리아 추출물 또는 제제의 전달을 포함한다.
유사체: 본원의 "유사체"는 기준 물질과 하나 이상의 특정한 구조적 특징, 요소, 구성요소 또는 부분을 공유하는 물질을 의미한다. 일반적으로 "유사체"는 핵심 또는 합의 구조를 공유하는 등 기준 물질과 상당한 구조적 유사성을 보이되 특정한 개별 방식에서 상이한 물질이다. 일부 실시형태에서, 유사체는, 예를 들자면 기준 물질을 화학적으로 조작하여 기준 물질로부터 생성할 수 있는 물질이다. 일부 실시양태에서, 유사체는 기준 물질을 생성하는 것과 실질적으로 유사한(예: 복수의 단계를 공유) 합성 프로세스로 생성할 수 있는 물질을 말한다. 일부 실시형태에서, 유사체는 기준 물질 생성 시 사용한 것과는 다른 합성 프로세스로 생성하기도 한다.
대략: 하나 이상의 해당 값에 적용하는 것으로 명시한 기준 값과 유사한 값을 포함한다. 특정 실시형태에서, "대략"또는"약"은, 별도로 명시하지 않는 한, 기재된 기준 ±값을 중심으로 10% 내(초과와 미만을 모두 포함)에 해당하는 값을 말한다(해당 수치가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 예외로 한다).
유사한(comparable): 본원의 "유사한"은 동일하지는 않되 허용 범위 내에서 충분히 유사한 둘 이상의 제제, 개체, 상황, 조건 집합, 주제 등을 가리키며, 당업자는 관찰한 상이점 또는 유사점에 근거하여 결론을 합리적으로 도출하였음을 이해한다. 일부 실시형태에서, 조건, 상황, 개체 또는 집단의 유사한 집합은 실질적으로 동일한 특징 여러 개와 하나 또는 소수의 다양한 특징을 특성화한 것이다. 당업자는 문맥에서, 유사한 것으로 간주하기 위해서 임의의 환경 하에 상기 작용제, 실체, 환경, 조건 등 2가지 이상이 얼마나 동일해야 하는지를 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 당업자는 다양한 상황, 개체, 또는 집단의 집합 하에 또는 이를 사용하여 얻은 결과 또는 관측한 현상 간의 차이가 변화하는 특성의 변이로 인해 발생하거나 또는 변이를 나타낸다는 합리적인 결론을 보장하기에 충분한 숫자와 유형에서의 실질적으로 동일한 특성을 특징으로 하는 경우 상황, 개체, 또는 집단의 집합은 서로 유사하다고 할 수 있음을 이해할 것이다.
보존성: 본원에서 쓰이는 바와 같이, '보존성'이란 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 가지는 측쇄 R 기를 포함하는 또 다른 아미노산 잔기로 아미노산 잔기를 치환하는 것을 포함하는 보존성 아미노산 치환을 지칭하는 것이다. 일반적으로, 보존성 아미노산 치환은 단백질의 필요한 기능적 성질, 예를 들어 리간드에 결합하는 수용체의 능력을 실제적으로 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 가지는 아미노산기의 예로는 글리신(Gly, G), 알라닌(Ala, A), 발린(Val, V), 류신(Leu, L) 등의 지방족 측쇄, 이소류신(Ile, I); 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T)과 같은 지방족-히드록실 측쇄, 아스파라긴(Asn, N) 및 글루타민(Gln, Q) 등의 아미드 함유 측쇄, 페닐알라닌(Phe, F), 티로신(Tyr, Y), 트립토판(Trp, W) 등의 방향족 측쇄, 라이신(Lys, K), 아르기닌(Arg, R), 히스티딘(His, H) 등의 염기성 측쇄, 아스파르트산(Asp, D) 및 글루탐산(Glu, E) 등의 산성 측쇄, 스테인(Cys, C) 및 메티오닌(Met, M) 등의 황 함유 측쇄를 들 수 있다. 보존성 아미노산 치환기의 예로는, 발린/류신/이소류신(Val/Leu/Ile, V/L/I), 페닐알라닌/티로신(Phe/Tyr, F/Y), 라이신/아르기닌(Lys/Arg, K/R), 알라닌/발린(Ala/Val, A/V), 글루타메이트/아스파테이트(Glu/Asp, E/D), 아스파라긴/글루타민(Asn/Gln, N/Q)을 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 보존성 아미노산 치환은, 예를 들어 단백질 내 임의의 천연 잔기를 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 쓰이는 것과 같은 알라닌으로 치환하는 것이어도 좋다. 일부 실시형태에서는, 본원에 원용되어 있는 Gonnet, GH et al., 1992, Science 256:1443-1445에서 개시하는 PAM250 로그 우도 매트릭스에서 양의 값을 가지는 보존성 치환을 실시한다. 일부 실시형태에서, 치환은 PAM250 로그 우도 매트릭스에서 치환이 음이 아닌 값을 가지는 중도적인 보존성 치환이다.
Figure pct00001
대조군: 본원에서 "대조군"이란 당업계에서 통용되는 바와 같이 결과를 비교하기 위한 기준을 말한다. 일반적으로 대조군은 변수에 대한 결론을 내리기 위해 변수를 분리하여 실험의 무결성을 높일 때 쓰인다. 일부 실시형태에서, 대조군은 대조약(comparator)를 제공하기 위해 시험 반응 또는 분석과 동시에 수행하는 반응 또는 분석을 말한다. "대조군"에는 "대조군 동물"도 포함된다. "대조군 동물"은 본원에 기재한 바와 같이 변형이 있거나, 본원에 기재한 것과 다른 변형이 있거나, 변형이 없어도 좋다(야생동물). 첫 번재 실험에서는 "테스트"(즉, 테스트 중인 변수)를 적용한다. 두 번째 실험에서는 "대조군"으로 실험한다. 즉, 테스트 중인 변수를 적용하지 않는다. 일부 실시형태에서, 대조군은 과거 대조군(이전에 이행한 시험 또는 분석, 또는 이전에 알려진 양 또는 결과)이다. 일부 실시양태에서, 대조군은 인쇄 기록 또는 다른 방식으로 저장한 기록이거나 이를 포함한다. 대조군은 양성 대조군 또는 음성 대조군이어도 좋다.
판정, 결정, 측정, 평가, 검정, 분석: 판정, 결정, 측정, 평가, 검정, 분석은 모든 형태의 측정을 지칭하며, 각자의 표현을 대체하여 사용할 수 있다. 임의의 요소의 유무를 판정하는 것을 포함한다. 상기 용어는 정량 및/또는 정성 판정을 모두 포함한다. 분석은 상대적이거나 절대적일 수 있다. "유무의 검정"은 존재하는 것의 양을 판정하거나 존재 여부를 판정하는 것을 말한다.
투여 형태: 당업자는 용어 "투여 형태"가 대상체에 투여하기 위한 제제(예: 치료제)의 물리적으로 별개의 단위를 지칭할 수 있음을 이해할 것이다. 일반적으로 각 단위는 미리 결정된 양의 제제를 포함한다. 일부 실시형태에서는, 해당 관련 집단에 투여할 때 희망하거나 유익한 결과와 상관 관계가 있는 것으로 결정된 투여 요법(즉, 치료적 투여 요법)의 투여에 적합한 단위 투여량(또는 이의 전체 분획)을 가리킨다. 당업자는 특정 대상체에게 투여되는 치료 조성물 또는 제제의 총량은 한 명 이상의 주치의가 결정하며 다중 투여 형태의 투여를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
투여 요법: 당업자는 "투여 요법"은 일반적으로 시간 간격을 두고 구분하며, 대상체에게 개별적으로 투여하는 단위 용량 세트(대개 하나 이상)을 가리킨다는 사실을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 임의의 제제에는 권장 투여 요법이 있으며, 이는 1회 이상의 용량을 수반한다. 일부 실시형태에서, 투여 요법은 시간 간격으로 각각 구분되어 있는 복수의 용량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 개별 용량은 동일한 길이의 기간으로 서로 분리된다. 일부 실시형태에서, 투여 요법은 복수의 용량 및 개별 용량을 분리하는 적어도 2개의 상이한 기간을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여 요법 내의 투여는 모두 동일한 단위 투여량을 가진다. 일부 실시형태에서, 투여 요법 내의 투여는 투여량이 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여 요법은 제1 투여량의 제1 투여에 이어 제1 투여량과 상이한 제2 투여량을 가지는 추가 투여 1회 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여 요법은 제1 투여의 제1 투여에 이어 제1 투여량과 동일한 제2 투여량을 가지는 추가 투여 1회 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여 요법은 관련 집단에 투여했을 시 희망하거나 유익한 결과와 상관관계를 가진다.
조작: 일반적으로 조작(engineered)은 사람의 손으로 조작하는 것을 말한다. 예를 들어, 세포 또는 유기체를 조작하여 유전 정보를 변경한 경우(예: 이전에 존재하지 않았던 새로운 유전 물질을 형질전환, 교배, 체세포 혼성화, 형질감염, 형질도입 또는 기타 기전으로 도입하거나, 또는 이전에 존재하는 유전 물질을 치환 또는 결실 돌연변이, 또는 교배 프로토콜로 변경 또는 제거하는경우) "조작(engineered)"한 것으로 간주할 수 있다. 당업자가 이해하는 일반적인 관행에 따라, 조작 폴리뉴클레오티드 또는 세포의 자손은, 실제 조작을 실시한 것은 전 단계의 개체였다 해도 일반적으로 여전히 "조작"한 것으로 볼 수 있다.
부형제: 본 명세서에서는, 희망하는 일관성 또는 안정화 효과를 부여하거나 이에 기여하기 위해 의약 조성물에 포함시킬 수 있는 불활성(예: 비치료적) 제제를 가리킨다. 일부 실시형태에서, 적합한 약제학적 부형제의 예로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 들 수 있다.
관능성: 본 명세서에 있어 "관능성" 생물학적 분자는 해당 분자를 특성화하는 특성 및/또는 활성을 나타내는 형태의 생물학적 분자를 가리킨다. 생물학적 분자는 관능이 두 가지일 수도 있고(이관능성), 그보다 더 많을 수도 있다(다관능성).
유전자: 본 명세서에서는 생성물(예: RNA 생성물 및/또는 폴리펩타이드 생성물)을 코딩하는 염색체 내의 DNA 서열을 가리킨다. 일부 실시형태에서, 유전자는 코딩 서열(특정 생성물을 코딩하는 서열)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자는 비코딩 서열을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 유전자는 코딩(예: 엑손) 서열과 비코딩(예: 인트론) 서열을 모두 포함해도 좋다. 일부 실시형태에서, 유전자는 유전자 발현의 하나 이상의 측면(예: 세포 유형 특이적 발현, 유도 발현 등)을 제어하거나 영향을 미칠 수 있는 조절 서열(예: 프로모터, 인핸서 등) 및/또는 인트론 서열을 포함할 수 있다. 본 개시에서 쓰이는 “유전자”는 일반적으로 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 핵산의 일부를 지칭하며, 조절 서열을 임의로 포함할 수 있다. 당업자는 조절 서열의 포함 여부를 문맥상 쉽게 파악할 수 있을 것이다. 이는 “유전자”를 비단백질 코딩 발현 단위에 적용하는 것을 배제하기 위한 것이 아니며, 본 문서에서는 대부분의 경우 폴리펩티드 코딩 핵산을 지칭한다는 것을 명확히 하기 위한 것이다.
개선, 증가, 향상, 억제 또는 감소: 본 명세서에 있어서, “개선”, “증가”, “향상”, “억제”, “감소” 또는 그 동의어는 베이스라인(기준선) 또는 그 외 기준 측정값에 대한 값을 가리키는 말이다. 일부 실시형태에서, 임의의 값은 베이스라인 또는 그 외 기준 측정값과 통계적으로 유의한 차이가 있다. 일부 실시형태에서, 적절한 기준 측정값은 특정 작용제 또는 치료가 존재하거나 존재하지 않는(예: 작용제 또는 치료 적용 전후) 유사한 조건 하에, 혹은 적절하고 유사한 참조제제가 존재하는 유사한 조건 하에 특정 시스템에서 얻은 측정값이거나 그를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적절한 기준 측정값은 관련 작용제 또는 치료의 존재 하에 특정 방식으로 반응할 것으로 알려져 있거나 예상되는 유사한 시스템에서의 측정값이거나 그를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적절한 기준값은 음의 기준값이다. 일부 실시양태에서, 적절한 기준값은 양의 기준값이다.
단리: 본 명세서에서는, (1) 처음 생산했을 때 (자연 및/또는 실험 환경에서) 관련 구성요소의 적어도 일부에서 단리하거나, (2) 사람 손으로 설계, 생산, 준비, 제조한 물질 및/또는 독립체를 가리킨다. 일부 실시형태에서, 단리 물질 또는 독립체를 농축해도 좋다. 일부 실시형태에서, 단리 물질 또는 독립체가 순수해도 좋다. 일부 실시형태에서, 단리 물질 및/또는 독립체는 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99%를 넘는 그 외 구성요소에서 단리한 것이다. 일부 실시형태에서, 단리 제제의 순도는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99%를 넘는다. 본 명세서에서 물질에 실질적으로 다른 성분이 없는 경우 그 물질은 "순수"하다. 일부 실시형태에서, 당업자가 이해하는 바와 같이, 물질은 1종 이상의 담체 또는 부형제(예: 완충액, 용매, 물) 등 그 외의 특정 구성요소와 결합한 후에도 “농축”, “단리” 또는 “순수”할 수 있다. 일부 실시형태에서, 물질의 단리율 또는 순도는 담체 또는 부형제를 제외하고 산출한다. 당업자는 물질 또는 제제를 단리(예: 농축 또는 정제)하는 다양한 기술(예: 분별, 추출, 침전 또는 기타 분리 중 하나 이상을 적용)을 숙지하고 있다.
의약 조성물: 본 명세서의 "의약 조성물"은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된 활성제를 포함하는 조성물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 활성제는 관련 집단에 투여할 때 소정의 치료 효과를 달성할 통계적으로 유의한 확률을 나타내는 치료 또는 투여 요법으로 투여하기에 적합한 단위 용량으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 의약 조성물은 경구 투여에 적합한 고체 또는 액체 투여형으로 특별히 제제화할 수 있으며, 예로는 드렌치(수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액), 정제(예: 협측, 설하 및 전신 흡수), 볼루스, 분말, 과립, 혀에 바르는 페이스트, 캡슐, 분말 등을 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성제는 세포 또는 세포 집단(예: 배양물, 이를테면 EES 미생물)의 추출물 또는 구성요소이거나 그를 포함해도 좋다. 일부 실시형태에서, 활성제는 단리, 정제, 또는 순수 화합물이거나 이를 포함해도 좋다. 일부 실시형태에서, 활성제는 시험관 내에서 합성해도 좋다(예: 화학적 및/또는 효소적 합성). 일부 실시형태에서, 활성제는 천연 생성물이거나 이를 포함해도 좋다. 해당 천연 생성물은 천연 공급원에서 유래한 것이어도 좋고, 시험관 내에서 합성한 것이어도 좋다.
약학적으로 허용되는: 본 명세서에 있어서 "약학적으로 허용되는"이란 표현은 본원이 개시하는 의약 조성물을 제형화하는 데 사용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 관련하여 쓰일 수 있는 표현이다. 이 경우 해당 담체, 희석제 또는 부형제는 조성물의 그 외 성분과 상용성이고 수용자에게 해를 끼치지 않는다.
약학적으로 허용 가능한 담체 본 명세서에 있어서 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 또는 용매 캡슐화 물질과 같은 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 의미하며, 하나의 기관 또는 신체의 일부로부터, 다른 기관 또는 신체의 일부로 대상 화합물을 운반 (carry) 또는 운송 (transport)하는 것에 관여한다. 각 담체는 "허용"된다는 것은 제형의 다른 성분과 상용이 가능하고 환자에게 해를 끼치지 않음을 의미한다. 약학적으로 허용 가능한 담체로 작용할 수 있는 물질의 예시로는, 락토스, 글루코스, 수크로스 등의 당; 옥수수 전분 및 감자 전분 등의 전분; 나트륨 카복시 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트 등의 셀룰로오스 및 그 유도께; 분말 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터 및 좌약 왁스 등의 부형제; 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유, 대두유 등의 오일; 프로필렌 글리콜 등의 글리콜; 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜 등의 폴리올; 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트 등의 에스테르; 한천; 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄 등의 완충제; 알긴산; 발열원이 없는 물; 식염수; 링거 용액; 에틸 알코올; pH 완충 용액; 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 폴리 무수물; 제약 제형에 쓰이는 기타 무독성 양립성 물질을 들 수 있다.
예방: 본 명세서에 있어서 "예방"은 특정 질환, 장애 또는 병증의 하나 이상의 증상 발병을 지연하거나, 빈도 및/또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 예방은 집단 기반으로 평가하며, 질환, 장애 또는 병증의 증상 하나 이상의 발달, 빈도 및/또는 강도의 통계적으로 유의한 감소를 해당 질환, 장애 또는 병증에 취약한 집단에서 관측한 경우, 특정 질환, 장애 또는 병증을 “예방하는” 것으로 간주한다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병증의 발병이 사전에 정한 기간 동안 지연된 경우 완전히 예방한 것으로 간주할 수 있다.
기준: 본 명세서에서는 비교를 실시하는 기준 또는 대조군을 가리키는 말이다. 예를 들어 일부 실시형태에서, 관심 대상인 제제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 기준 또는 대조군의 제제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값과 비교한다. 일부 실시형태에서, 관심 대상인 시험 또는 판정과 실질적으로 동시에 기준 또는 대조군에 대한 실험 및/또는 판정을 실시한다. 일부 실시형태에서, 기준 또는 대조군은 과거의(historical) 기준 또는 대조군이며, 필요에 따라 유형 매체(tangible medium)로 구현할 수 있다. 일반적으로 기준 또는 대조군은 평가 대상과 유사한 조건 또는 상황 하에서 판정 또는 특성화를 실시한다. 당업자는 충분한 유사성이 존재하는 경우 기준 또는 대조군에 대한 의존 및/또는 비교를 정당화할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 기준은 음성 대조군 기준이다. 일부 실시형태에서, 기준은 양성 대조군 기준이다.
위험도: 문맥에 따라, 질환, 장애 및/또는 병증의 "위험도"는 특정 개인에게서 해당 질환, 장애 및/또는 병증이 발병할 가능성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 위험도는 백분율로 표현한다. 일부 실시형태에서, 위험도는 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 최대 100%이다. 일부 실시형태에서 위험도는 기준 샘플 또는 기준 샘플 그룹과 관련한 위험에 대한 위험도로 나타낸다. 일부 실시형태에서 기준 샘플 또는 기준 샘플 그룹은 질환, 장애, 병증 및/또는 사례에 대하여 주지의 위험도를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 기준 샘플 또는 기준 샘플 그룹은 특정 개인과 유사한 개인에게서 유래한다. 일부 실시형태에서, 상대적 위험도는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다.
샘플: 본 명세서에서 “샘플”은 일반적으로 관심 대상 공급원에게서 취득하거나 파생한 물질의 분취량을 가리킨다. 일부 실시형태에서, 관심 대상 공급원은 생물학적 또는 환경적 공급원이다. 일부 실시형태에서, 관심 대상 공급원은 미생물, 식물 또는 동물(예: 인간) 등의 세포 또는 유기체이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심 대상 공급원은 생물학적 조직 또는 유체이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 조직 또는 유체는 양수, 방수, 복수, 담즙, 골수, 혈액, 모유, 뇌척수액, 귀지, 유미, 사정액, 내림프, 삼출물, 대변, 위산, 위액, 림프, 점액, 심낭액, 외림프, 복막액, 흉막액, 고름, 류머티즘, 타액, 피지, 정액, 혈청, 귀두지, 가래, 활액, 땀, 눈물, 소변, 질 분비물, 유리체액, 구토물, 및/또는 이들의 조합 또는 그 성분이거나 이를 포함해도 좋다. 일부 실시형태에서, 생물학적 유체는 세포내 유체, 세포외 유체, 혈관내 유체(혈장), 간질 유체, 림프액, 및/또는 경세포 유체이거나 이를 포함해도 좋다. 일부 실시형태에서, 생물학적 유체는 식물 삼출물이거나 이를 포함해도 좋다. 일부 실시형태에서, 생물학적 조직 또는 샘플은 흡인, 생검(예: 가는 바늘 또는 조직 생검), 면봉(예: 구강, 비강, 피부 또는 질을 면봉으로 닦음), 긁기, 수술, 세척 또는 세정(예: 기관지폐포, 도관, 비강, 안구, 구강, 자궁, 질, 혹은 그 외의 세척 또는 제정)으로 얻어도 좋다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 개체에서 취득한 세포이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 임의의 적절한 수단으로 관심 대상 공급원에게서 직접 얻은 "일차 샘플"이다. 일부 실시형태에서, 문맥상 명백한 경우, "샘플"은 일차 샘플을 가공함으로써 (예를 들어 일차샘플의 하나 이상 의 구성요소를 제거하거나 일차 샘플에 1종 이상의 약제를 첨가함으로써) 수득하는 제제를 가리킨다. 예를 들어, 반투과성 막을 사용한 여과를 들 수 있다. 해당 "가공 샘플"은 예를 들어 샘플에서 추출되거나 핵산의 증폭 또는 역전사, 특정 구성요소의 단리 및/또는 정제와 같은 하나 이상의 기술을 1차 샘플에 적용하여 얻은 핵산 또는 단백질을 포함할 수 있다.
소분자: 본 명세서에서 "소분자"는 분자량이 약 3,000달톤 미만인 작은 유기 또는 무기 분자를 의미한다. 일반적으로 소분자는 3,000달톤(Da) 미만의 분자량을 가져도 좋다. 소분자는, 예를 들어, 적어도 약 100Da~약 3,000Da(예: 약 100Da~3,000 Da, 약 100Da~약 2500Da, 약 100Da~약 2,000Da, 약 100Da~약 1,750Da, 약 100Da~약 1,500Da, 약 100Da~약 1,250Da, 약 100Da~약 1,000Da, 약 100Da~약 750Da, 약 100Da~약 500Da, 약 200Da~약 1500Da, 약 500Da~약 1000Da, 약 300Da~약 1000Da, 또는 약 100Da~약 250Da)여도 좋다.
대상체: 본 명세서에 있어서 "대상체"는 치료를 받는 개체를 의미한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 본원에 기재된 질환, 장애 또는 병증을 경험하거나 이에 취약한 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 동물은 척추동물, 예를 들어 포유동물, 개중에서도 비인간 영장류(특히 고등 영장류), 양, 개, 설치류(예: 마우스 또는 래트), 기니아피그, 염소, 돼지, 고양이, 토끼 또는 소이다. 일부 실시형태에서, 동물은 닭, 양서류, 파충류, 또는 무척추동물 모델 C. elegans 등의 비포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 환자는 본원에 기재된 질환, 장애 또는 병증을 하나 이상 앓고 있거나 이에 취약하다. 일부 실시형태에서, 환자는 본원에 기재된 하나 이상의 질환, 장애 또는 병증의 증상을 하나 이상 나타낸다. 일부 실시형태에서, 환자는 본원에 기재된 하나 이상의 질환, 장애 또는 병증으로 진단받았다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병증을 진단 및/또는 치료하기 위해 특정 요법을 받고 있거나 받은 적이 있다. 또다른 실시형태에서, 대상체는 실험 동물 또는 질병 모델로서의 동물 대체물이다.
실질적으로(substantially): 여기에서 사용된 바와 같이, 관심 있는 특성 또는 속성의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 조건을 나타낸다. 생물학 분야의 당업자는 생물학적 및 화학적 현상이 설령 발생하는 경우에도 완전히 종료하거나 완전하게 진행하는 일이 드물며, 절대적인 결과를 달성하거나 회피한다는 사실을 이해할 것이다. 때문에 “실질적으로”는, 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재하는 완전함의 잠재적 결여를 나타내기 위하여 쓰인다.
치료 요법: 본 명세서에서 "치료 요법"은 관련 집단에 대한 투여 시 희망하거나 유익한 치료 결과와 연관을 보이는 투여 요법을 지칭한다.
치료 유효량: 본 명세서에 있어서 투여 시 목적하는 효과를 생성하는 양을 의미한다. 일부 실시형태에서, 해당 용어는 치료적 투여 요법에 따라 질환, 장애 및/또는 병증을 앓거나 이에 취약한 집단에게 투여하는 경우 질병, 장애 및/또는 병증의 치료에 충분한 양을 가리킨다. 일부 실시형태에서, 치료 유효량은 질환, 장애 및/또는 병증의 하나 이상의 증상의 발생 및/또는 중증도를 저하시키키거나 발병을 지연시키는 양이다. 당업자는 "치료 유효량"이 실제로 특정 개인에게서 치료를 성공시켰다는 사례를 필요로 하지 않음을 이해할 것이다. 치료 유효량은 해당 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 때 상당한 수의 대상체에서 특정한 원하는 약리학적 반응을 제공하는 양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량은 하나 이상의 특정 조직(예: 질환, 장애 또는 병증에 영향을 받는 조직) 또는 체액(예: 혈액, 타액, 혈청, 땀, 눈물, 소변 등)에서 측정한 양에 해당한다. 당업자는 일부 실시형태에서 치료 유효량의 특정 약제 또는 요법이 단일 용량으로 제형화 및/또는 투여할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 약제는 예를 들어 투약 양생법의 일부로서 복수의 용량으로 제형화 및/또는 투여할 수 있다.
치료: 본 명세서의 "치료"는 특정 질환, 장애 및/또는 병증의 증상에 대하여, 부분적으로 또는 완전히 완화, 개선, 억제, 발병 지연, 중증도 감소, 특징 및/또는 원인 중 하나 이상의 제거를 시행하는 것을 말한다. 일부 실시형태에서, 해당 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병증의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질환, 장애 및/또는 병증의 초기 징후만을 나타내는 대상체를 위한 것이어도 좋다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 해당 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병증의 확립된 징후를 하나 이상 나타내는 대상에 대한 것이어도 좋다. 일부 실시형태에서, 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병증을 앓는 것으로 진단을 받은 대상체의 치료여도 좋다. 일부 실시형태에서, 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병증의 증가한 발병 위험과 통계학적으로 관련이 있는 하나 이상의 민감성 인자를 가지는 것으로 알려져 있는 대상체의 치료여도 좋다.
도 1은 APOE4 단백질이 C. elegans에서 Aβ유도 마비 표현형을 향상시킨다는 사실을 입증하는 데이터를 도시한다.지정 유전자형을 가지는 C. elegans 동물에게 E. coli OP50 표준 실험실 균주를 투여하였다. 성체가 된 첫째 날부터 동물이 모두 마비 증상을 일으킬 때까지 격일로 모니터링하였다. 각 분석마다 최소한 20마리의 동물을 대상으로 하여 기록을 남겼다. 독립적 실험 3회에서 얻은 데이터를 플롯으로 표시하였다. 각 데이터 포인트에 대하여 ±평균±오차범위를 그래프에 표시한다.
도 2는 녹색 형광 단백질(GFP) 및 인간 ssAPOE4에 접합된 Aβ3-42의 발현이 응집체의 수를 유의하게 증가시켰음을 입증하는 데이터를 도시한다.지정 유전자형을 가지는 C. elegans 동물에게 E. coli OP50 표준 실험실 균주를 투여하였다. 동물의 전방(anterior) 영역의 GFP 응집체는 동물이 성체에 도달했을 때 계수하였다. 각 분석마다 최소한 17마리의 동물을 대상으로 하여 기록을 남겼다. 각 데이터 포인트에 대하여 평균±오차범위를 바 그래프에 표시한다. 스튜던트 t-검정(P<0.0001)을 적용하여 분석한 결과, Aβ3-42를 발현한 동물에 비해 Aβ3-42 및 ssApoE4를 발현한 동물에서 GFP 응집체가 유의하게 증가하였다.
도 3은 UbV-GFP가 인간 ssAPOE4 및 인간 tau352(PHP)를 모두 발현하는 동물에서 안정화되었음을 입증하는 데이터를 나타낸다.지정 유전자형을 가지는 C. elegans 동물에게 E. coli OP50 표준 실험실 균주를 투여하였다. 장에서 GFP를 발현하는 동물의 수를 동물이 성체에 도달했을 때 계수하였다. 각 분석마다 최소한 30마리의 동물을 대상으로 하여 기록을 남겼다. 독립적 실험 3회에서 얻은 데이터를 바 그래프로 표시하였다. 각 데이터 포인트에 대하여 ±평균±오차범위를 그래프에 표시한다. 스튜던트 t-검정(P<0.0001)을 적용하여 분석한 결과, tau352(PHP)를 발현한 동물에 비해 ssAPOE4 및 tau352(PHP)를 발현한 동물에서 UbV-GFP 응집체가 유의하게 증가하였다.
도 4는 마이크로바이옴의 특정 미생물 균주가 Aβ매개 마비를 증가시킨다는 것을 입증하는 데이터를 포함한다. 지정 유전자형을 가지는 C. elegans 동물에게 E. coli OP50 표준 실험실 균주 또는 개별 마이크로바이옴 균주를 투여하였다. 마비된 동물의 수를 성체 4일째에 기록하였다. 독립적 실험 3회에서 얻은 데이터를 바 그래프로 표시하였다. 각 데이터 포인트에 대하여 ±평균±오차범위를 그래프에 표시한다. 표 1은 각 조건에 대해 분석한 동물의 수와 함께 원시 데이터를 포함한다.
도 5는 Aβ3-42::GEP 응집을 조절하는 마이크로바이옴의 특정 미생물 균주를 입증하는 데이터를 포함한다.지정 유전자형을 가지는 C. elegans 동물에게 E. coli OP50 표준 실험실 균주 또는 개별 마이크로바이옴 균주를 투여하였다. 동물의 전방(anterior) 영역의 GFP 응집체 수는 동물이 성체에 도달했을 때 계수하였다. 동물 3마리에서 조건별로 GFP 응집체를 계수하였다. 각 데이터 포인트에 대하여 평균±오차범위를 그래프에 표시한다.
도 6은 특정 미생물 균주가 ATP 생산을 변경했음을 보여주는 데이터를 포함한다. Neuro2A 세포에 각 박테리아의 108 CFU 또는 모든 박테리아의 조합(CT10)으로 16시간 동안 모의 처리 또는 처리를 가했다. 미처리 웰을 제외한 모든 웰 에 2μM의 Human Amyloid β1-42 를 첨가했다. 세포를 24시간 동안 배양하고 ATP 수준을 측정하고 정규화하였다. ATP율은 다음 공식에 따라 계산하였다: %ATP = [(샘플 정규화 발광값/대조군 정규화 발광값) *100].
도 7은 예시적인 HIF 경로의 개략도를 도시한다.
본원에서는 포유동물의 질환 또는 병증과 연관이 있는 표현형에 영향을 미치는(예: 향상 또는 최소화) 포유동물 마이크로바이옴으로부터 얻은 하나 이상의 미생물 균주를 신속하게 식별, 평가 또는 특성화하기 위해 형질전환 C. elegans 질환 모델 및 C. elegans 질환 모델을 사용하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 식별, 평가 또는 특성화는 화학적 실체 및/또는 생물학적 제제(예: 항체)의 존재 유무에 상관없이 발생할 수 있다.
C. elegans는 실험실에서 E. coli를 먹이로 섭취 하는 박테리오보루스 선충이다. C. elegans 는 노화, 당뇨병, 신경퇴행성 장애, 대사 질환 및 암과 같은 다양한 인간 질환 및 병증을 포함하는 여러 포유동물 질환 및 병증에 대하여 신뢰성이 높고 효과적이며 효율적인 유전형 및 표현형 모델을 제공할 수 있다. 본 개시는 포유동물 질환 및 병증의 C. elegans 모델이 해당 질환 및 병증에 영향을 미치는 미생물 균주에 대하여 인간 마이크로바이옴을 신속하게 스크리닝하는 데 사용할 수 있음을 통찰하고 있다. 표준 포유류 세포 배양 분석 또는 동물 모델에서는 해당 연구가 불가능하다.다. 예를 들어, 수백만 개의 미생물 종 및/또는 균주를 개별적으로, 혹은 인간 질환 및 병증의 마우스 모델을 사용하여 조합하여 스크리닝하는 것은 경제적으로도 실행이 불가능하고 시간과 노력이 많이 든다. C. elegans가 포유류 시스템의 복잡성 중 일부를 포함하지 않을 수는 있지만 C. elegans 모델은 포유류 시스템과 기능을 공유하고 응답 시간이 빠르며 포유류 모델 시스템보다 생산 및 유지 관리 비용이 저렴하다. 따라서 포유동물 질환 및 병증의 C. elegans 모델은 포유동물 바이옴의 미생물 균주가 포유동물의 질환 및 병증에 미치는 영향을 조사하는데 적합한 한편, 특정한 영향을 미치는 주요 미생물 균주와 취약한 보존적 치료 표적의 우선순위를 지정하는 유용한 도구를 제공한다.
본원은 질병 조절자에 대해 인간 마이크로바이옴을 신속하게 스크리닝하기 위한 도구로서 C. elegans를 사용하는 방법을 제공한다. 건상자 또는 질환 또는 병증이 있는 환자에게서 채취한 샘플의 미생물 균주는 표준 미생물 기술을 사용하여 배양할 수 있다. 이들 미생물 균주를 포유동물(예: 인간)의 질병 마커, 포유동물(예: 인간)의 질병 유전자 돌연변이, 또는 이들의 조합을 보유하는 형질전환 C. elegans 균주에 공급할 수 있다. 미생물 균주는 개별적으로 또는 조합하여 형질전환 C. elegans 균주에 공급해도 좋다. 일부 경우에, 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합은 포유동물(예: 인간)의 질병 마커, 포유동물(예: 인간)의 질병 유전자 돌연변이, 또는 이들의 조합을 보유하는 형질전환 C. elegans 균주, 또는 화학 물질(예: 소분자, 예: 약물) 또는 생물학적 제제(예: 단일클론 항체)와 조합한 이들의 조합에 공급해도 좋다.
본 개시는 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합은 포유동물(예: 인간)의 질병 마커, 포유동물(예: 인간)의 질병 유전자 돌연변이, 또는 이들의 조합을 보유하는 형질전환 C. elegans 균주, 또는 화학 물질(예: 소분자, 예: 약물) 또는 생물학적 제제(예: 단일클론 항체)와 조합한 이들의 조합에 공급하는 것으로 다양한 결과를 얻을 수 있음을 인식한다. 첫 번째 시나리오에서는 여기에서 설명한 방법을 사용하여 C. elegans에서 포유동물 질환 또는 병증 표현형의 중증도를 증가시키는 개별 미생물 균주 또는 포유동물 마이크로바옴의 미생물 균주 조합을 식별, 정의, 평가 및/또는 탐지할 수 있다. 두 번째 시나리오에서는 여기에서 설명한 방법을 사용하여 C. elegans에서 포유동물 질환 또는 병증 표현형의 중증도를 감소시키는 개별 미생물 균주 또는 포유동물 마이크로바옴의 미생물 균주 조합을 식별, 정의, 평가 및/또는 탐지할 수 있다. 세 번째 시나리오에서는 여기에서 설명한 방법을 사용하여 C. elegans에서 포유동물 질환 또는 병증 표현형에 일절 영향을 미치지 않는 개별 미생물 균주 또는 포유동물 마이크로바옴의 미생물 균주 조합을 식별, 정의, 평가 및/또는 탐지할 수 있다. 상기의 각 결과에서 귀중한 정보를 얻을 수 있다.
예를 들어, C. elegan 에서 포유동물 질환 또는 병증 표현형의 중증도를 증가시키는 포유동물 마이크로마이옴의 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합은 포유동물 질환 또는 병증에 대한 조기 진단 바이오마커일 가능성이 있다. 일부 실시형태에서, 상기 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합은 포유동물(예: 인간)에서 질환 또는 병증의 높은 발생률 또는 중증도 증가와 상관관계를 가진다. 상관관계를 아직 발견하지 못한 경우, 본원이 기술하는 형질전환 C. elegans와 형질전환 C. elegans를 사용하는 방법으로, 유전자 스크리닝 또는 화학적 추출, 혹은 게놈 데이터 마이닝법을 이용하여 질병 중증도 또는 발병률 증가와 관련된 잠재적 "독성" 대사산물 또는 마이크로바이옴 구성요소를 식별할 수 있다. 이와 같이 식별한 미생물 균주 및/또는 포유동물 마이크로바이옴의 구성요소는 진단법 개발에도 도움이 된다. “독성” 미생물 균주 또는 마이크로바이옴 구성요소의 식별 및/또는 특성화는 미생물 균주, 마이크로바이옴 구성요소 또는 이를 생성하는 생합성 경로를 표적으로 하는 조절제 또는 치료제 개발에도 쓰일 수 있다.
또한 본 개시는 C. elegans에서 포유동물 질환 또는 병증 표현형의 중증도를 감소시키는 포유동물 마이크로바이옴의 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합이 인간 환자의 질환 중증도와 연관성을 가질 수 있음을 시사한다. 일부 실시형태에서, 상기 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합은 포유동물(예: 인간)에서 질환 또는 병증의 낮은 발생률 또는 중증도 감소와 상관관계를 가진다. 상관관계를 아직 발견하지 못한 경우, 본원이 기술하는 형질전환 C. elegans와 형질전환 C. elegans를 사용하는 방법으로, 유전자 스크리닝 또는 화학적 추출, 혹은 게놈 데이터 마이닝법을 이용하여 질병 중증도 또는 발병률 감소와 관련된 잠재적 "유익한" 미생물 균주, 마이크로바이옴 구성요소 또는 대사산물을 식별할 수 있다. 이와 같이 식별한 미생물 균주 및/또는 포유동물 마이크로바이옴의 구성요소는 진단법 개발에도 도움이 된다. 또한, "유익한" 미생물 균주 또는 마이크로바이옴 구성요소의 식별 및/또는 특성화는 질병의 조절제 또는 치료제에도 적용할 수 있다.
일부 경우에, 포유동물 마이크로바이옴의 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주 조합을 화학적 실체(예: 소분자, 약물) 또는 생물학적 제제(예: 단일클론항체), 또는 이들의 조합과 함께 형질전환 C. elegans 균주에 공급하여 잠재적인 생물학적, 신호전달 또는 세포 표적 유전자 또는 경로를 식별하기도 한다. 생물학적, 신호 전달 또는 세포 표적 유전자 또는 경로는 염증, 인슐린 수용체, 세포 사멸, 미토콘드리아, 소포체, 프로테아좀, 지방 생성, 해독을 포함할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
일부 경우에, 포유동물 마이크로바이옴의 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주 조합을 화학적 실체(예: 소분자, 약물) 또는 생물학적 제제(예: 단일클론항체), 또는 이들의 조합과 함께 형질전환 C. elegans 균주에 공급하여 특정 질환과 관련된 특정 세포 내 소기관의 기능을 조절하거나 최적화할 수 있는 신호전달 또는 세포 표적 유전자 또는 경로의 집합(예: 포괄적 집합)을 식별하기도 한다. 예를 들어, 알츠하이머병(AD)을 비롯한 각종 신경퇴행성 질환에 연관성이 있는 중요 표적인 최적화 미토콘드리아 기능을 달성하려면 조절할 수 있는 경로 또는 표적으로는 여러 가지가 있다. 미토콘드리아 기능을 개선하기 위한 생물학적 표적은 생합성, 생체 에너지, 호메시스 및/또는 수선을 포함한다. 본원에 기재된 형질전환 C. elegans 질환 모델 및/또는 C. elegans 질환 모델을 사용하는 방법으로, 미토콘드리아 생합성, 생물 에너지, 호메시스 또는 수선, 혹은 이들의 조합을 변형 또는 개선하거나 변경할 수 있는 개별 또는 조합 마이크로바이옴 종 및/또는 화학 물질(예: 소분자, 약물) 또는 생물학적 제제(예: 단일클론 항체), 혹은 이들의 조합을 식별할 수 있다. 따라서, 이를 테면 최적화 미토콘드리아 기능 달성을 목적으로 복수의 경로를 표적화할 수 있는 포유동물 마이크로바이옴의 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주 조합 및/또는 화학적 실체(예: 소분자, 약물) 또는 생물학적 제제(예: 단일클론항체), 또는 이들의 조합을, 식별하고 조합하는 것이 가능해진다.
C. elegans
자유생활 선충 C. elegans 는 모델 시스템으로 광범위하게 쓰이고 있다. C. elegans는 배양비가 저렴하고 물리적으로 조작하기 쉬우며 연구에 사용 가능한 유전 및 분자 도구가 많다. C. elegans 는 단순한 다세포 유기체이다. 성체는 약 1,000개의 체세포를 포함하지만 근육, 신경 및 장 세포와 같은 다양한 조직 유형을 가지고 있다. C. elegans는 세대주기가 짧기 때문에 신속한 실험이 가능하다. C. elegans 는 일반적으로 실온 하에 3일 만에 알에서 유충, 수정이 가능한 성충으로 성장한다. 성체 C. elegans의 자손 수는 300 내지 1,000마리에 달하므로 상당 수의 동물을 사용한 후에도 비교적 짧은 시간에 빠르게 보충하는 것이 가능하다. 성적 이형성으로 인해 C. elegans는 유전학에 유용하다. 자가 수정 자웅동체는 교미할 필요 없이 동형 접합 돌연변이를 유지할 수 있으며, 수컷은 유전자 교배에 쓰일 수 있다. C. elegans는 생명주기의 모든 단계에서 투명하여 유기체 내부를 들여다 볼 수 있다. 이로써 세포 사상을 관측할 수 있다. 또한 인광, 발광 및 형광 리포터를 사용 가능하다. C. elegans에서 단백질 발현을 유전자 기능의 신속한 평가를 허용하는 RNA-매개 간섭(RNAi)을 사용하여 조작해도 좋다. C. elegans를 모델 시스템으로 사용하는 또 다른 이점은 동물을 동결 및 회수하여 장기 보관이 가능하다는 것이다.
C. elegans는 형질전환 C. elegans 균주를 생성하는 각종 기술로 유전적으로 변형할 수 있다. C. elegans의 성적 이형성 때문에 주지의 절차에 따라 비교적 쉽게 유전자 조작을 할 수 있다. 예를 들어, 균주를 전파해야 하는 경우 단일 자웅동체로 자가 수정하고 자손 개체군을 생성할 수 있다. 돌연변이로 인해 동물이 짝짓기를 할 수 없더라도 자웅동체가 자손을 낳는 것은 여전히 가능하기 때문이다. C. elegans는 번식에 있어서 수컷과 자웅동체가 교배할 수 있기 때문에 매우 효과적인 유전 도구가 될 수 있다. 예를 들어, 짝짓기 실험을 통해 돌연변이 매핑을 용이하게 하기 위해 미지의 돌연변이와 함께 가시적 표현형을 유발하는 돌연변이 등의 유전적 마커를 단일 유기체에 함께 배치할 수 있다. 자웅동체는 제한적인 수의 정자만을 만들고 일반적으로 자손을 약 300마리까지 가진다. 짝짓기는 수컷이 생산한 정자의 추가로 인해 단일 자웅동체에서 생산되는 자손의 수를 약 1,000마리로 늘린다. C. elegans의 짧은 수명과 비교적 많은 수의 자손 에 힘입어 신속하고 저렴하게 분석을 할 수 있다.
번식을 통한 유전적 변형 외에도 C. elegans는 이식유전자의 주입을 통해 유전적으로 변형할 수 있다. 미세주입은 형질전환 동물을 만들고 다양한 유형의 분자를 세포에 직접 도입하는 효과적인 방법이다. DNA 변형의 경우 C. elegans 생식선의 말단 팔에 DNA를 주입하는 방법이 있다. C. elegans 의 말단 생식선에는 많은 생식 세포핵이 공유하는 세포질의 중심 코어가 존재한다. 따라서 C. elegans 생식선의 말단 팔에 DNA를 주입하면 여러 자손에게 전달이 가능하다. 난모세포 핵에 직접 미세주입하면 이식유전자의 염색체 통합을 유도할 수 있지만 이 기술은 상대적으로 까다롭다. C. elegans는 또한 공급을 받는 유전 물질을 통합할 수 있다.
C. elegans는 배양이 비교적 간단하다. C. elegans는 액체 배양 또는 박테리아가 있는 NGM(선충 성장 배지) 한천 플레이트에서 배양할 수 있다. 박테리아를 첨가하지 않고 화학적으로 정의한 배지에서 동물을 성장시키는 것이 가능하며, 배지의 성분은 동물의 영양소 또는 기타 화학적 요구 사항을 연구하는 경우 변경할 수 있다. 일부 실시형태에서, C. elegans는 한천 플레이트에서 성장한다. C. elegans 는 NGM(선충 성장 배지) 한천 플레이트에서도 성장할 수 있다. 동물의 사료 공급원으로 NGM 플레이트에 박테리아를 산포해도 좋다. 예를 들어, 누출 E. coli 우라실 영양공급원인 OP50을 사용한다. OP50은 천천히 성장하며, 동물을 과도하게 살찌우지 않고 영양분을 제공한다. 동물이 플레이트에 있는 모든 사료를 소비한 후에는 한천에 구멍을 뚫고 15℃의 인큐베이터에서 몇 주 동안 "무사료(starved)" 접시에서 버틸 수 있다. 마이크로피펫 팁과 같은 멸균 도구로 무사료 플레이트에서 작은 한천 블록을 잘라내거나, 멸균 플레이트 표면에서 증류수로 선충을 씻어내거나, 하나 이상의 개체를 선택하여 C. elegans 가 다시 나타날 수 있도록 새로운 접시에 올려놓는 방식으로 신선한 박테리아가 있는 한천 플레이트에 동물을 옮길 수 있다. C. elegans 는 언제든지 극저온으로 보존할 수 있다. C. elegans 는 15℃~25℃ 사이의 온도에서 성장하는 것이 바람직하지만, 온도는 C. elegans 의 변형과 테스트 중인 조건에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, C. elegans 배양물은 적어도 5℃, 적어도 10℃, 적어도 15℃, 적어도 20℃, 적어도 25℃, 적어도 30℃, 적어도 35℃ 또는 적어도 40℃의 온도에서 배양할 수 있다. 일부 실시형태에서, C. elegans 배양물은 최대 65℃, 최대 60℃, 최대 55℃, 최대 50℃, 최대 55℃, 최대 40℃, 최대 35℃, 최대 30℃, 최대 25℃, 또는 최대 20℃의 온도에서 배양할 수 있다. C. elegans 조작 및 배양에 대한 표준 프로토콜은 예를 들어 Stiernagle T. Maintenance of C. elegans. Wormbook, ed. The C. elegans Research Community, WormBook을 참조할 수 있다(2006년 2월 11일). 해당 서적은 본원에 원용하였다.
미생물 제제 및/또는 구성요소
본 개시는 마이크로바이옴의 하나 이상의 미생물 균주를 평가, 특성화 및 식별하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 해당 시스템 및 방법은 인간, 가축 및/또는 애완동물의 건강에 영향을 미치는 하나 이상의 미생물 균주를 평가, 특성화 및 식별하는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 뱀, 도마뱀, 물고기, 또는 새의 마이크로바이옴에서 얻은 하나 이상의 미생물 균주를 평가, 특성화 및 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 포유동물 마이크로바이옴에서 얻은 하나 이상의 미생물 균주를 평가, 특성화 및 확인하는 단계를 포함한다. 포유동물 마이크로바이옴은 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소 또는 돼지의 마이크로바이옴이어도 좋다. 일반적으로, 본원에 기술된 시스템 또는 방법에 쓰이는 마이크로바이옴은 시스템 또는 방법에 사용되는 형질전환 C. elegans로 모델링한 질환 또는 병증에 대응한다. 예를 들어, 형질전환 C. elegans 가 인간 질환을 모델링하는 경우 인간 마이크로바이옴의 평가, 특성화 또는 식별을 실시하게 된다.
마이크로바이옴은 미생물 성장을 지원하는 유기체의 모든 시스템이나 조직에서 분리가 가능하다. 예를 들어, 마이크로바이옴은 피부 마이크로바이옴, 구강 마이크로바이옴, 비강 마이크로바이옴, 위장 마이크로바이옴, 뇌 마이크로바이옴, 폐 마이크로바이옴, 또는 비뇨생식기 마이크로바이옴이어도 좋다. 위장 마이크로바이옴에서 발견되는 미생물 균주의 사례를 표 8에 정리하였다. 당업자는 마이크로바이옴 샘플이 당업계 주지의 다양한 방식으로 얻을 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 피부, 구강, 비강, 폐 또는 비뇨생식기의 마이크로바이옴 샘플은 면봉 또는 조직 스크래퍼로 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 위장 마이크로바이옴을 대변에서 채취할 수 있다. 피부 마이크로바이옴, 구강 마이크로바이옴, 비강 마이크로바이옴, 위장 마이크로바이옴, 뇌 마이크로바이옴, 폐 마이크로바이옴, 마이크로바이옴, 또는 비뇨생식기 마이크로바이옴은 생검으로 얻을 수 있다.
일부 실시형태에서, 마이크로바이옴은 건상자 또는 특정 질환 또는 장애를 앓지 않거나 발병할 위험이 없는 개체의 마이크로바이옴이다. 일부 실시형태에서, 마이크로바이옴은 특정 질환 또는 장애를 앓거나 발병할 위험이 있는 개체의 마이크로바이옴이다. 일부 실시형태에서, 마이크로바이옴은 특정 질환 또는 장애를 앓고 있는 것으로 알려진 개체의 마이크로바이옴이다. 일부 실시형태에서, 인간 마이크로바이옴은 하나 이상의 질환 또는 병증에 대한 위험도가 알려지지 않은 인간의 마이크로바이옴이다.
일부 실시형태에서, 마이크로바이옴은 기준 마이크로바이옴이다. 기준 마이크로바이옴은 건상자 또는 특정 질환 또는 장애를 앓지 않거나 발병할 위험이 없는 개체의 마이크로바이옴일 수 있다. 일부 경우에, 기준 마이크로바이옴은 평가 또는 특성화 대상인 마이크로바이옴과 동일한 개체에서 유래하되 상이한 시간대에 획득한 것이어도 좋다. 일부 경우에, 기준 마이크로바이옴은 평가 또는 특성화 대상인 마이크로바이옴과 동일한 개체에서 유래하되 상이한 시스템 또는 조직에서 획득한 것이어도 좋다.
일부 실시형태에서, 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합은 마이크로바이옴에서 발견되는 해당 균주와는 상이한 상대량으로 평가, 특성화 또는 확인할 수 있다. 예를 들어, 단일 균주는 그 밖의 미생물 균주와 함께 마이크로바이옴에 자연적으로 존재하더라도 형질전환 C. elegans 또는 본원에 기술된 형질전환 C. elegans를 사용하는 방법으로 평가, 특성화 또는 확인할 수 있다. 또 다른 예로, 2개의 미생물 균주가 추가 미생물 균주와 함께 마이크로바이옴에 자연적으로 존재 는 경우에도 형질전환 C. elegans 또는 본원에 기술된 형질전환 C. elegans를 사용하는 방법으로 2개의 균주를 평가, 특성화 또는 확인할 수 있다.
미생물 균주의 추출물, 성분 또는 화합물 또한 본원에 기재된 형질전환 C. elegans 또는 본원에 기술된 형질전환 C. elegans를 사용하는 방법으로 2개의 균주를 평가, 특성화 또는 확인할 수 있다. 일부 경우에, 질환 또는 병증의 형질전환 C. elegans 모델에 영향을 미치는 것으로 결정된 미생물 균주의 추출물, 성분 또는 화합을 평가, 특성화 또는 확인할 수 있습니다. 질환 또는 병증의 형질전환 C. elegans 모델에 영향을 미치는 미생물 균주의 추출물, 성분 또는 화합물을 평가, 특성화 또는 식별하는 것은 마이크로바이옴의 잠재적인 바이오마커, 표적 또는 보호제에 관한 추가 정보를 제공할 수 있다.
미생물 균주의 추출물을 제조하거나 그로부터 추출물, 성분 또는 화합물을 단리 또는 처리(예: 하나 이상의 성분 또는 화합물을 단리 및/또는 정제)할 수 있는 각종 기술은 당업계에서 이미 주지의 것이다. 하나 이상의 유기 추출, 진공 농축, 크로마토그래피 등을 예시로 들 수 있다.
생물학적 영향 평가
본 개시는 포유동물 질환 또는 병증을 모델링하는 C. elegans를 미생물 균주과 접촉시킴으로써(예: 미생물 균주를 공급 또는 투여) 포유동물 마이크로바이옴의 미생물 균주를 식별, 특성화, 확인에 C. elegans를 사용할 수 있음을 시사한다. 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합이 포유동물의 질환 또는 상태를 모델링하는 형질전환 C. elegans에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합과 접촉한 여러 샘플의 형질전환 C. elegans의 매개변수를 관찰, 측정 또는 평가할 수 있다. 형질전환 C. elegans의 다양한 매개변수를 관찰, 측정 또는 평가하여 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합이 포유동물의 질환 또는 병증을 모델링하는 형질전환 C. elegans에 영향을 미치는지 여부를 결정할 수 있다. 몇 가지 예로서, 형질전환 C. elegans 행동(예: 짝짓기, 섭식, 섭식 회피 또는 이동), 유전적 돌연변이(예: DNA의 SNP, 결실, 추가, 역전 또는 반복의 존재), 전사체 수준, 단백질 수준, 대사 산물 수준, 지질 수준, 탄수화물 수준, 단백질(예: 효소) 활성 수준을 관찰, 측정 또는 평가하여 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합이 포유동물의 질환 또는 병증을 모델링하는 형질전환 C. elegans에 영향을 미치는지의 여부를 결정한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 제1 샘플 및 제2 샘플을 활용한다. 일부 실시양태에서, 제1 샘플은 기준 샘플이다. 일부 실시형태에서, 기준 샘플은 예를 들어 OP50과 접촉(예: 투여 또는 공급)한 형질전환 C. elegans의 배양물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 기준 샘플은 건강한 개체의 마이크로바이옴에서 얻은 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합과 접촉(예: 투여 또는 공급)한 형질전환 C. elegans의 배양물이어도 좋다. 일부 실시형태에서, 기준 샘플은 제1 시점에서 수득한 개체의 마이크로바이옴에서 얻은 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합과 접촉한(예: 투여 또는 공급) 형질전환 C. elegans의 배양물이어도 좋다.
일부 실시형태에서, 제2 샘플은 시험 샘플일 수 있다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플은 포유동물 바이크로바이옴, 예를 들어 인간 마이크로바이옴에서 얻은 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합과 접촉(예: 투여 또는 공급)한 형질전환 C. elegans의 배양물일 수 있다. 일부 경우에, 인간 마이크로바이옴은 질환 또는 병증으로 고통받거나 위험에 처한 인간의 마이크로바이옴이다. 일부 경우에, 인간 마이크로바이옴은 하나 이상의 질환 또는 병증에 대한 위험도가 알려지지 않은 인간의 마이크로바이옴이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플은 제2 시점에서 수득한 개체의 마이크로바이옴에서 얻은 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합과 접촉(예: 투여 또는 공급)한 형질전환 C. elegans의 배양물일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 시험 샘플로부터 수득한 하나 이상의 매개변수를 기준 샘플로부터 수득한 하나 이상의 매개변수와 비교하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플로부터 수득한 하나 이상의 매개변수를 기준 샘플로부터 수득한 하나 이상의 매개변수와 비교함으로써, 마이크로바이옴으로부터 얻은 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합이 배양한 형질전환 C. elegans로 모델링한 질환 또는 병증 표현형의 중증도 또는 발병률을 증가시키는지의 여부를 확인할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플로부터 수득한 하나 이상의 매개변수를 기준 샘플로부터 수득한 하나 이상의 매개변수와 비교함으로써, 마이크로바이옴으로부터 얻은 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합이 배양한 형질전환 C. elegans로 모델링한 질환 또는 병증 표현형의 중증도 또는 발병률을 감소시키는지의 여부를 확인할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플로부터 수득한 하나 이상의 매개변수를 기준 샘플로부터 수득한 하나 이상의 매개변수와 비교함으로써, 마이크로바이옴으로부터 얻은 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합이 배양한 형질전환 C. elegans로 모델링한 질환 또는 병증 표현형의 중증도 또는 발병률에 일절 영향을 미치지 않는지의 여부를 확인할 수 있다.
본원에서 제공하는 형질전환 C. elegans 및 형질전환 C. elegans를 사용하는 방법은 포유동물의 질환 또는 병증에 영향을 미치는 마이크로바이옴의 미생물 균주를 평가, 특성화 또는 확인하는 데 유용할 수 있다. 본 개시는 또한 형질전환 C. elegans 및 형질전환 C. elegans를 사용하는 방법이 질환 또는 병증과 연관이 있는 미생물의 특징을 정의 및/또는 특성화할 때 사용할 수 있음을 시사한다. 본 개시는 또한 형질전환 C. elegans 및 형질전환 C. elegans를 사용하는 방법이 질환 또는 병증의 특징(예: 중증도, 치료에 대한 반응성 등) 하나 이상을 정의 및/또는 특성화할 때 사용할 수 있음을 시사한다. 예를 들어, 여러 미생물 균주가 질환 또는 장애의 중증도 증가와 관련이 있는 것으로 판정이 난 경우(예: 여러 개체를 대상으로 함) 미생물 균주 및 상대량은 질환 또는 장애의 중증도가 증가할 위험이 있는 개체를 식별하는 서명으로 사용할 수 있다. 또다른 예로서, 여러 미생물 균주가 예를 들어 단일 개체에서 특정 시간에(예: 치료 중단 후) 질병 또는 장애의 증가된 중증도와 연관이 있는 것으로 판정이 난 경우, 미생물 균주 및 상대량은 해당 개체에게서 질환 또는 장애의 중증도가 증가할 위험이 있는 시기를 식별하기 위한 서명으로 사용할 수 있다.
본 개시는 또한 형질전환 C. elegans 및 형질전환 C. elegans를 사용하는 방법이 질환 또는 병증이 있는 개체를 진단할 때 사용할 수 있음을 시사한다. 실제로, 본원에서 제공하는 형질전환 C. elegans 및 형질전환 C. elegans를 사용하는 방법을 적용하여 판정한 질환 또는 병증과 연관이 있는 미생물 특징으로, 개체를 조기에 진단하거나 위험에 처한 개체를 식별할 수 있다.
본 개시는 또한 본원에서 제공하는 형질전환 C. elegans 및 형질전환 C. elegans를 사용하는 방법을 적용하여 개체에서 질환 또는 병증의 진행을 모니터링할 수 있음을 시사한다. 예를 들어, 질환 또는 병증의 중증도를 증가시키는 것으로 판정이 난 미생물 균주가 마이크로바이옴 내에서 상대량이 감소하는 경우, 이는 질환 또는 병증이 이를테면 치료 또는 면역 반응에 의해 약화되고 있음을 나타내는 것일 수 있다.
본 개시는 또한 본원에서 제공하는 형질전환 C. elegans 및 형질전환 C. elegans를 사용하는 방법이 개별 환자에 대한 치료법(예: 기능식품 및/또는 프로바이오틱스)을 맞춤화하는 데 사용할 수 있음을 시사한다. 일부 실시형태에서, 본원 에서 제공하는 형질전환 C. elegans 및 형질전환 C . elegans를 사용하는 방법은 "맞춤형" 요법을 제공할 수 있다. 어떤 경우에는 개체 내의 미생물 균주를 평가, 특성화 또는 식별하여 질환 또는 장애에 영향을 미치는지 여부를 결정할 수 있다. 결과에 기초하여 개체를 마이크로바이옴에서 미생물 균주(및/또는 그 성분 또는 화합물)를 조정하기 위해 하나 이상의 미생물 균주로 치료할 수 있다. 어떤 경우에는 개체가 앓고 있거나 발병할 위험이 있는 질환 또는 병증에 영향을 미친다. 예를 들어, 개체가 질환 또는 병증의 중증도를 감소시키는 것으로 결정된 하나 이상의 미생물 균주를 비교적 소량 가지고 있는 것으로 판정이 난 경우, 질환 또는 병증의 중증도를 감소시키는 것으로 판정이 난 하나 이상의 미생물 균주(또는 그 추출물, 성분 또는 화합물)을 개인에게 투여하여 개인의 질환 또는 상태의 중증도를 완화할 수 있다.
의약 조성물
개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합을 포함하는 조성물을 본원에서 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원이 제공하는 조성물은 포유동물 마이크로바이옴에서 얻은 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합을 포함하며, 그에 대한 평가, 확인, 특성화 또는 분석에는 본원에 기재된 형질전환 C. elegans 또는 방법을 사용하였다. 일부 실시형태에서, 본원이 제공하는 조성물은 포유동물 마이크로바이옴 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 미생물 균주, 아울러 그 추출물, 및/또는 그 성분을 포함하며, 그에 대한 평가, 확인, 특성화 또는 분석에서 본원에 기술된 바와 같은 형질전환 C. elegans 또는 방법을 사용하였다.
일부 실시형태에서, 본원이 제공하는 조성물은 하기 표 8에서 열거하는 미생물 균주 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본원이 제공하는 조성물은, Gluconacetobacter hansenii, Terrisporobacter glycolicus, Coprococcus sp., L. plantarum, Clostridium butyricum, Paenibacillus sp., Veillonella sp., Bifidobacterium sp., Bacillus subtilis, Acidaminococcus sp., 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 본원이 제공하는 조성물은, Gluconacetobacter hansenii, Terrisporobacter glycolicus, Coprococcus sp., L. plantarum, Clostridium butyricum, Paenibacillus sp., Veillonella sp., Bifidobacterium sp., Bacillus subtilis, Acidaminococcus sp. 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 전부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 사멸한(예: 가열로 사멸) 포유동물 마이크로바이옴에서 얻은 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합을 포함한다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 포유동물 마이크로바이옴에서 얻은 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합은 생존 가능하거나 살아있는 세포를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 미생물 균주는 예를 들어 포유동물 마이크로바이옴으로부터의 생존 또는 살아 있는 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 미생물 균주는 본원에 기재된 바 같이, 하나 이상의 세포 배양물 및/또는 그 상청액 또는 펠릿, 또는 그에서 형성한 분말을 포함하거나 그로부터 제형화한, 예를 들어 포유동물 마이크로바이옴으로부터 얻은 생존 가능하거나 살아 있는 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시에 따라 사용하기 위한 조성물은, 예를 들어 포유동물(예: 인간)에 투여(예: 경구 투여)하기 위한 의약 조성물이다. 의약조성물은 전형적으로 활성제( 예: 포유동물 마이크로바이옴에서 얻은 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합, 그 추출물, 및/또는 성분) 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 약학적으로 허용되는 담체의 예로는 식염수, 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 들 수 있으며, 약학적 투여와 양립할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시에 따라 사용하기 위한 의약조성물은 1종 이상의 보조활성제를 포함하거나 그와 병용 투여해도 좋다. 특정 실시형태에서, 상기 보조활성제는 생강, 커큐민, 프로바이오틱스(예ㅣ 락토바실러스, 비피도박테리움, 사카로마이세스, 엔테로코커스, 스트렙토코커스, 페디오코커스 , 류코노스톡, 바실러스 및/또는 대장균 중 하나 이상 의 프로바이오틱 균주)(본원 에 원용 되어 있는 Fijan, Int J Environ Res Public Health. 2014 May; 11(5): 4745-4767을 참조), 프리바이오틱스(프로바이오틱 박테리아의 성장을 지원하는 소화 불가능한 식품 성분, 예: 프락토올리고당(FOS) 및 이눌린과 같은 프럭탄, 갈락토올리고당(GOS)과 같은 갈락탄, 저항성 전분, 펙틴, 베타-글루칸 및 자일로올리고당과 같은 식이 섬유)(본원에 원용되어 있는 Hutkins et al., Curr Opin Biotechnol. 2016 Feb; 37: 1-7을 참조), 이들의 조합을 포함할 수 있다.
의약 조성물은 의도한 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 예로는 경구 투여를 들 수 있다. 적합한 의약 조성물을 제형화하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Remington: Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005; Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY) 시리즈의 저서를 참조할 수 있다. 경구 조성물은 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 예를 들자면, 일부 실시형태에서, 경구 제형은 시럽, 액체, 정제, 트로키, 구미, 캡슐(예: 젤라틴 캡슐), 분말, 젤, 필름 등이거나 이를 포함해도 좋다.
일부 실시형태에서, 약학적으로 적합한 결합제 및/또는 보조제 물질은 경구 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 의약 조성물은 예를 들어 미세결정질 셀룰로오스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴 등의 결합제; 전분 또는 유당 등의 부형제; 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분 등의 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스 등의 윤활제; 콜로이드성 이산화규소 등의 활택제; 자당 또는 사카린 등의 감미료; 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료 등의 향미제와 같은 불활성 성분 중 임의의 하나 이상, 또는 그와 유사한 성질의 화합물을 포함해도 좋다. 일부 실시형태에서, 조성물은 그대로 섭취해도 좋고, 식품 또는 액체(예: 물) 상에 뿌리거나 혼합해도 좋다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같이 포유동물에게 투여할 수 있는 조성물은 포유동물 마이크로바이옴으로부터 얻은 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합, 그 추출물, 및/또는 그 성분을 포함하는(예: 보충) 섭취 가능한 물품(예: 식품 또는 음료)이거나 이를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 식품은 바, 사탕, 구운 식품, 시리얼, 짠 스낵, 파스타, 초콜릿, 및 기타 고형 식품, 그 밖에도 요구르트, 수프 및 스튜를 포함하는 액체 또는 반고체 식품, 스무디, 쉐이크, 주스 및 기타 탄산 또는 비 탄산 음료와 같은 음료 중 하나 이상이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물 마이크로바이옴에서 얻은 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합, 그 추출물, 및/또는 그 성분을 혼합함으로써 식품을 제조한다.
조성물은 투여 또는 본원에 기재된 방법에서의 사용을 위한 설명서와 함께 키트, 용기, 팩 또는 디스펜서에 수납할 수 있다.
당업자는 본 개시를 읽고, 일부 실시형태에서 본원에 개시된 조성물(예: 의약 조성물)이 관련 화합물을 생성하는 세포, 조직, 유기체(예: 식물 또는 미생물 세포, 조직 또는 유기체)이거나 이를 포함한다는 사실을 이해할 것이다.
당업자는, 일부 실시형태에서 조성물 및/또는 제제의 제조(특히 의약 조성물의 제조)를 위한 기술은, 예를 들어 품질 관리의 일부로서 화합물, 제제 또는 조성물을 평가하거나 특성화하는 하나 이상의 단계를 포함해도 좋음을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 분석 물질은 관련 평가에 관한 소정의 사양을 충족하지 못하면 폐기처분한다. 일부 실시형태에서, 해당 분석 물질이 소정의 사양을 충족하는 경우, 본원에 기재된 바와 같이 계속 처리한다.
일부 실시형태에서, 본원이 제공하는 의약 조성물은 포유동물 마이크로바이옴으로부터 얻은 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합의 집락화를 촉진하며, 상기 미생물 균주는 특히 포유동물의 질환 또는 병증을 앓고 있거나 발병할 위험이 있는 포유동물에서, 포유동물의 질환 또는 병증의 중증도 또는 발병률을 감소시키는 것이 식별, 특성화 또는 검증되어 있다. 일부 실시형태에서, 본원이 제공하는 의약 조성물은 포유동물 마이크로바이옴으로부터 얻은 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합의 집락화를 촉진하며, 상기 미생물 균주는 특히 포유동물의 질환 또는 병증을 앓고 있거나 발병할 위험이 있는 포유동물에서, 포유동물의 질환 또는 병증의 중증도 또는 발병률을 증가시키는 것이 식별, 특성화 또는 검증되어 있다. 일부 실시형태에서, 본원이 제공하는 의약 조성물은 포유동물 마이크로바이옴으로부터 얻은 개별 미생물 균주 또는 미생물 균주의 조합의 집락화를 촉진하며, 상기 미생물 균주는 특히 포유동물의 질환 또는 병증을 앓고 있거나 발병할 위험이 있는 포유동물에서, 포유동물의 질환 또는 병증의 중증도 또는 발병에 일절 영향을 끼치지 않는 것으로 식별, 특성화 또는 검증되어 있으나, 한편으로는 포유동물 질병 또는 상태의 중증도 또는 발병률을 증가시키는 것으로 식별, 특성화 또는 검증되어 있는 하나 이상의 미생물 균주를 압도할 수 있음이 식별, 특성화 또는 검증되어 있다.
일부 실시형태에서, 조성물 중 하나 이상의 미생물 균주 각각은 101~1012 CFU(콜로니 형성 단위)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물 중 하나 이상의 미생물 균주 각각은 106 ~1012 CFU를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물 중 하나 이상의 미생물 균주 각각은 CFU 수가 동일하다. 일부 실시형태에서, 조성물 중 하나 이상의 미생물 균주 각각은 CFU 수가 상이하다.
일부 실시형태에서, 조성물은 총 106~1012 CFU를 포함한다.
일부 실시형태에서, 의약 조성물은 포유동물(예: 인간)의 마이크로바이옴에 기초하여 특정 포유동물(예: 특정 인간 환자)에 맞춰 제조한다. 일부 실시형태에서, 의약 조성물은 개별 포유동물(예: 인간)의 마이크로바이옴에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 의약 조성물은 포유동물(예: 인간) 집단의 마이크로바이옴에 특이적이다. 포유동물의 개체군은, 가족, 동일한 지역 위치에 있는 포유동물(예: 이웃, 도시, 주 또는 국가), 동일한 질환 또는 병증을 가진 포유동물, 특정 연령 또는 연령대의 포유동물, 특정 식단(예: 음식, 식단, 또는 칼로리)를 섭취하는 포유동물을 포함할 수 있다.
치료법
본 개시는 본원에 기재된 조성물이 대상체의 치료에 유용할 수 있음을 시사한다. 본 개시가 제공하는 방법은 특정 질환, 장애 및 병증의 치료법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 관련 질환, 장애 및 병증은 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병증이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병증은 알츠하이머병일 수 있다. 일부 실시형태에서, 관련 질환, 장애 또는 병증은 안구 신생혈관 질환 또는 장애거나 이를 포함해도 좋다. 일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환 또는 병증은 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 노인성 황반 변성, 또는 녹내장이다.
일반적으로, 본 개시가 제공하는 치료법은 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 단독으로 또는 그 외의 조성물 및/또는 치료와 조합하여 이를 필요로 하거나 해당 치료가 필요한 것으로 여겨지는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 제공하는 치료법은 예방적이며, 예를 들어 유의미한 증상을 나타내기 전에 및/또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병증과 관련된 특정 유도에 노출되기 전에 대상체에게 투여해도 좋다. 일부 실시형태에서, 본원에서 제공하는 치료법은 치료적이며, 예를 들어 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병증과 관련된 유의한 증상이 일어난 후 대상체에게 투여해도 좋다.
일부 실시형태에서, 본원에서 제공하는 치료법은 포유동물인 대상체, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 질환, 장애 또는 병증을 경험하는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 또는 인간이 아닌 수의학의 대상체, 예를 들어 유인원, 고양이 개, 원숭이 또는 돼지이다.
일부 실시형태에서, 치료는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병증과 관련된 질환, 장애 또는 병증의 적어도 하나의 증상을 개선하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료법은 예방적일 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병증과 연관이 있을 것으로 여겨지는 치료의 투여 전, 투여 중(예: 병용), 또는 투여 후에 본원에 개시된 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료를 받는 대상체는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 질환, 장애 또는 병증(예: 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병증) 중 하나 이상의 증상 또는 특징의 치료를 의도한 치료(예: 약학적 치료/요법, 외과적 치료 등)를 받고 있거나 받았을 수 있다. 따라서 본원이 제공하는 조성물은 관련 질환, 장애 또는 병증을 치료하기 위해 상기 그 외의 요법(즉, 치료)과 조합하여 투여한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 형태로 투여해도 좋다. 적합한 담체는 이전에 설명한 바와 같으며, 조성물의 원하는 형태 및 투여 방식에 따라 다양하게 쓰일 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 담체는 희석제 또는 부형제, 예를 들어 충전제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 표면 활성제, 활택제 및 윤활제를 포함할 수 있다. 담체는 고체(분말 포함), 액체, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 각 담체는 바람직하게는 조성물의 다른 성분과 상용성이며, "허용 가능"하다는 것은 대상체에게 해를 끼치지 않는다는 의미이다. 담체는 생물학적으로 허용가능하고 불활성일 수 있다(이를테면 조성물이 적절한 부위에 전달될 때까지 생물학적 물질의 생존력을 유지하도록 허용한다).
정제, 알약, 캡슐, 트로키 등은 예를 들어 미세결정질 셀룰로오스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴 등의 결합제; 전분 또는 유당 등의 부형제; 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분 등의 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스 등의 윤활제; 콜로이드성 이산화규소 등의 활택제; 자당 또는 사카린 등의 감미료; 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료 등의 향미제와 같은 불활성 성분 중 임의의 하나 이상, 또는 그와 유사한 성질의 화합물을 포함해도 좋다. 이는 단지 예시를 위한 것이며 한정을 의도하지 않는다.
경구 조성물은 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 경구 치료 투여의 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 혼입해도 좋고, 정제, 로젠지, 알약, 트로키 또는 캡슐(예: 젤라틴 캡슐)의 형태로 사용해도 좋습니다. 경구 조성물은 또한 본 개시내용의 조성물을 식품과 조합함으로써 제조할 수 있다. 일부 실시형태에서, 미생물은 식품 품목에 제제화해도 좋다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에 쓰이는 식품 품목은 아이스캔디, 치즈, 크림, 초콜릿, 우유, 육류, 음료, 피클, 케피어, 미소, 자우어크라우트 등을 예로 들 수 있으나, 이제 한정되지는 않는다. 또다른 실시형태에서, 식품 품목은 주스, 탄산음료, 차 음료, 드링크, 젤리 음료, 기능성 음료; 맥주 등의 알코올 음료; 쌀 식품, 국수, 빵, 파스타 등의 탄수화물 함유 식품; 생선, 햄, 소시지, 해산물 페이스트 제품 등의 페이스트 제품; 카레, 전분 소스를 곁들인 음식, 중국 수프 등의 레토르트 파우치 제품; 수프; 우유, 유제품 음료, 아이스크림 및 요구르트와 같은 유제품; 된장, 발효음료, 장아찌 등의 발효물; 콩 제품; 비스킷, 쿠키 등의 제과류, 캔디류, 츄잉껌류, 구미류, 젤리류 등의 냉과자, 크림카라멜, 냉동과자류; 즉석 스프, 즉석 간장 스프 등의 인스턴트 식품을 포함해도 좋다. 미생물을 사멸시키는 것을 방지하기 위해 미생물 균주와 혼합한 후 식품 준비를 조리할 필요가 없는 것이 바람직하다. 한 실시형태에서, 투여에 사용하는 음식, 예를 들어 향미를 가한 얼음물을 냉각시킨다. 특정 실시형태에서, 식품 품목은 잠재적으로 알레르기를 유발하는 식품 품목이 아니다(예를 들어, 대두, 밀, 땅콩, 견과류, 유제품, 계란, 조개류 또는 생선이 아님). 약학적으로 상용성인 결합제 및/또는 보조제는 조성물의 일부로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물은 투여한 세포로 대상체의 마이크로바이옴을 달성하는 투여 요법에 따라 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 단일 투여량으로 대상체에게 투여한다. 일부 실시형태에서, 조성물을 복수의 투여량으로 대상체에게 투여한다. 일부 실시형태에서, 조성물의 투여량은 1일 2회, 매일, 매주 또는 매월 대상체에게 투여한다.
일부 실시형태에서, 투여량 중 하나 이상의 미생물 균주 각각은 101~1012 CFU(콜로니 형성 단위)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여량 중 하나 이상의 미생물 균주 각각은 106 ~1012 CFU를 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여량 중 하나 이상의 미생물 균주 각각은 CFU 수가 동일하다. 일부 실시형태에서, 투여량 중 하나 이상의 미생물 균주 각각은 CFU 수가 상이하다.
일부 실시형태에서, 투여량 중 하나 이상의 미생물 균주 각각은 106 ~1012 CFU를 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여량 중 하나 이상의 미생물 균주 각각은 107 ~1010 CFU를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 미생물 균주의 투여량은 50억~2000억 CFU를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 미생물 균주의 투여량은 50억~500억 CFU를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 미생물 균주의 투여량은 50억~200억 CFU를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 미생물 균주의 투여량은 500억~1000억 CFU를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 미생물 균주의 투여량은 1000억~2000억 CFU를 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 당업자에게 설명하기 위한 것으로, 본 개시의 범위를 한정하지 않는다.
실시예 1: 재료 및 방법
장내 프로모터(pvha-6::apoE4::tbb-2 UTR)의 제어 하에 인간 APOE4 이식유전자에 대한 상이한 구축물 2개를 유전자 합성으로 생성하였다. 구축물을 pUC57 플라스미드의 KpnI/SalI 제한 효소 부위에 클로닝하였다. 인간 APOE4 단백질 서열은 C. elegans에서 최적 발현을 위해 최적화한 코돈이다 . C. elegans에서의 유전자 침묵화와 최적 발현을 피하기 위해 양쪽 구축물 모두에서 apoE4서열 내에 3개의 합성 인트론을 포함시켰다. 인트론의 염기서열은 하기 표 1과 같다.
한 구축물에서, C. elegans FLP-1로부터의 분비를 위한 신호 서열을 apoE4 서열("Worm 2")에 포함시켰다. 다른 구축물에서는 apoE4 서열("Worm 1")에 신호 서열을 추가하지 않았다.
요소 서열
인트론 1 gtaagtttaaacatatatatactaactaaccctgattatttaaattttcag
인트론 2 gtaagtttaaacagttcggtactaactaaccatacatatttaaattttcag
인트론 3 gtaagtttaaacatgattttactaactaactaatctgatttaaattttcag
FLP-1 신호 서열 atgactctgctctaccaagtagggttattactccttgtggcagctacttataaggtgtcggca
발현 플라스미드 및 공동 주입 마커(pCFJ90의 경우 2ng/μl, pmyo-2::mCherry)를 Worm 1 또는 Worm 2에 주입하여 염색체 외 어레이 균주를 구성했다. Womr 1 및 Worm 2에 쓰인 서열을 표 2에 정리하였다. 코딩 서열은 대문자로, 비코딩 서열은 소문자로 표시하였다.
WORM 1
vha-6 프로모터:
actaactgacattaggtgtcacacaaaagaaatcacacactatacatcaaaatatacatcacaagtgagtcaatacaatccgggtgaagctcaagaatggatttcgcagacttcttctgctcattggctgcttcgaaaacctgaatagtttatattaaactagtgaaatcgaattcatacaaacctgtttcgattcactacttttcaatcgatggtcaaacgtagaatcaaaaacacgtgtcagaaacacttccaatcatcaaaatgatccatcaattccactcggagcaacaatttcgaagcctgggaatgtgtgtggtgagcacttttggctctggtagagcatgtacctttataggtgcgctctacgcaattcaccagctgaacaatggagttgagcctaatgtaactaaaaatttatttgaatgctttacaaaaatattatttcagatcttcgagatcatgaaaactatcaaacagcagcgccctggagcaatcgagtcgttcccacaatattcaggtgtatatgcaatcgttttagactacatttcggtaagttgctacttcagagataaactgtaattattttaaatttcagcgcaaacgcggaggaaagtctgatcctgttaacaaatacataaatcgtttcctcgctgatctcacggagatattgccagcatgctcaacgttgccagtgatgaatccaagcacagaactgcattaagtatactatttattactcgatacttttgttcacataggttttttaaatcatattttatgcatcatttatcatattcaatgcatcattcatatcatagtcaataaaaaggttgatttctcatgttctggtttcaaatgctgactttggtaaaaagaacgcgtgcctgcctattgcctatcttggcattttctcgataaattttaaaatgtaggttcgatcttatgagatttgtagtcaaaagagctcatatgtattcaggtaggtctggtagcgagaccaacttaatagcatgacaagcattttcaatttgccctggagcgcaattggttttttattcgaaaatcgcacatttctgtttccccataatataaaatttccaggacgatatatattacattcttcacaaaatattgcattacagacaccgacaaagaatctccacctgatatgaaaacaatgagccaacaatgttatctgtattgccaccacccacatttcctagtcattcagtatatattgtttcaattgaatcattgcaggtatatatcgaattgaacttgtaaggcttcatcttcatttctcaatacatcatccatcattccagagcagctccggccacacaaaaattggtggcggtctgatattgataatcgacttctttgacgtgcctgacggagcagcaaagcggagcactgataagacaatgaagaactaaaaaattgtcttcggttttcagtctttagttctgcagcactttattttttgtttctcctatttttccgcattttcctaactttctgatgtccatttcaaatgatttttgttataaaattgtttaatttcagggcgactaaaacctaccaaaacccataaaaa
인간 apoE4:atgAAGGTCCTTTGGGCCGCCCTTCTTGTCACCTTCCTTGCTGGATGCCAAGCTAAGGTTGAGCAAGCTGTTGAAACTGAGCCAGAGCCAGAGCTTCGTCAACAAACTGAGTGGCAATCTGGACAACGTTGGGAGCTTGCTCTTGGACGTTTCTGGGACTACCTTCGTTGGGTTCAAACCCTTTCCGAGCAAGTTCAAGAGGAGCTTCTTTCTTCCCAAGTTACCCAAGAGCTTCGTGCTCTTATGGATGAGACTATGAAGgtaagtttaaacatatatatactaactaaccctgattatttaaattttcagGAGCTTAAGGCTTACAAGTCTGAGCTTGAGGAGCAACTTACCCCAGTTGCTGAGGAGACCCGTGCTCGTCTTTCCAAGgtaagtttaaacagttcggtactaactaaccatacatatttaaattttcagGAGCTTCAAGCTGCTCAAGCTCGTCTTGGAGCTGATATGGAGGATGTTCGTGGACGTCTTGTTCAATACCGTGGAGAGGTTCAAGCTATGCTTGGACAATCTACCGAGGAGCTTCGTGTTCGTCTTGCCTCCCACCTTCGTAAGCTTCGTAAGCGTCTTCTTCGTGACGCTGACGACCTTCAAAAGCGTCTTGCTGTCTACCAAGCTGGAGCTCGTGAGGGAGCTGAGCGTGGACTTTCCGCTATCCGTGAGCGTCTTGGACCACTTGTTGAGCAAGGACGTGTTCGTGCTGCTACCGTCGGATCCCTTGCTGGACAACCACTTCAAGAGCGCGCTCAAGCTTGGGGAGAGCGTCTTCGTGCTCGCATGGAGGAGATGGGATCTCGCACCCGTGATCGTCTTGATGAGGTTAAGgtaagtttaaacatgattttactaactaactaatctgatttaaattttcagGAGCAAGTTGCTGAGGTCCGTGCTAAGCTTGAAGAGCAAGCTCAACAAATCCGTCTTCAAGCTGAGGCTTTCCAAGCTCGTCTTAAGTCTTGGTTCGAGCCACTTGTTGAGGATATGCAACGTCAATGGGCTGGACTTGTTGAGAAGGTCCAAGCCGCTGTCGGAACCTCCGCTGCTCCAGTTCCATCCGATAACCACTAA
tbb-2 3'UTR:
atgcaagatcctttcaagcattcccttcttctctatcactcttctttctttttgtcaaaaaattctctcgctaatttatttgcttttttaatgttattattttatgactttttatagtcactgaaaagtttgcatctgagtgaagtgaatgctatcaaaatgtgattctgtctgatgtactttcacaatctctcttcaattccattttgaagtgctttaaacccgaaaggttgagaaaaatgcgagcgctcaaatatttgtattgtgttcgttgagtgacccaacaaaaagaggaaa
WORM 2
vha-6 프로모터:
actaactgacattaggtgtcacacaaaagaaatcacacactatacatcaaaatatacatcacaagtgagtcaatacaatccgggtgaagctcaagaatggatttcgcagacttcttctgctcattggctgcttcgaaaacctgaatagtttatattaaactagtgaaatcgaattcatacaaacctgtttcgattcactacttttcaatcgatggtcaaacgtagaatcaaaaacacgtgtcagaaacacttccaatcatcaaaatgatccatcaattccactcggagcaacaatttcgaagcctgggaatgtgtgtggtgagcacttttggctctggtagagcatgtacctttataggtgcgctctacgcaattcaccagctgaacaatggagttgagcctaatgtaactaaaaatttatttgaatgctttacaaaaatattatttcagatcttcgagatcatgaaaactatcaaacagcagcgccctggagcaatcgagtcgttcccacaatattcaggtgtatatgcaatcgttttagactacatttcggtaagttgctacttcagagataaactgtaattattttaaatttcagcgcaaacgcggaggaaagtctgatcctgttaacaaatacataaatcgtttcctcgctgatctcacggagatattgccagcatgctcaacgttgccagtgatgaatccaagcacagaactgcattaagtatactatttattactcgatacttttgttcacataggttttttaaatcatattttatgcatcatttatcatattcaatgcatcattcatatcatagtcaataaaaaggttgatttctcatgttctggtttcaaatgctgactttggtaaaaagaacgcgtgcctgcctattgcctatcttggcattttctcgataaattttaaaatgtaggttcgatcttatgagatttgtagtcaaaagagctcatatgtattcaggtaggtctggtagcgagaccaacttaatagcatgacaagcattttcaatttgccctggagcgcaattggttttttattcgaaaatcgcacatttctgtttccccataatataaaatttccaggacgatatatattacattcttcacaaaatattgcattacagacaccgacaaagaatctccacctgatatgaaaacaatgagccaacaatgttatctgtattgccaccacccacatttcctagtcattcagtatatattgtttcaattgaatcattgcaggtatatatcgaattgaacttgtaaggcttcatcttcatttctcaatacatcatccatcattccagagcagctccggccacacaaaaattggtggcggtctgatattgataatcgacttctttgacgtgcctgacggagcagcaaagcggagcactgataagacaatgaagaactaaaaaattgtcttcggttttcagtctttagttctgcagcactttattttttgtttctcctatttttccgcattttcctaactttctgatgtccatttcaaatgatttttgttataaaattgtttaatttcagggcgactaaaacctaccaaaacccataaaaa
인간 ssapoE4:atgactctgctctaccaagtagggttattactccttgtggcagctacttataaggtgtcggcaAAGGTCCTTTGGGCCGCCCTTCTTGTCACCTTCCTTGCTGGATGCCAAGCTAAGGTTGAGCAAGCTGTTGAAACTGAGCCAGAGCCAGAGCTTCGTCAACAAACTGAGTGGCAATCTGGACAACGTTGGGAGCTTGCTCTTGGACGTTTCTGGGACTACCTTCGTTGGGTTCAAACCCTTTCCGAGCAAGTTCAAGAGGAGCTTCTTTCTTCCCAAGTTACCCAAGAGCTTCGTGCTCTTATGGATGAGACTATGAAGgtaagtttaaacatatatatactaactaaccctgattatttaaattttcagGAGCTTAAGGCTTACAAGTCTGAGCTTGAGGAGCAACTTACCCCAGTTGCTGAGGAGACCCGTGCTCGTCTTTCCAAGgtaagtttaaacagttcggtactaactaaccatacatatttaaattttcagGAGCTTCAAGCTGCTCAAGCTCGTCTTGGAGCTGATATGGAGGATGTTCGTGGACGTCTTGTTCAATACCGTGGAGAGGTTCAAGCTATGCTTGGACAATCTACCGAGGAGCTTCGTGTTCGTCTTGCCTCCCACCTTCGTAAGCTTCGTAAGCGTCTTCTTCGTGACGCTGACGACCTTCAAAAGCGTCTTGCTGTCTACCAAGCTGGAGCTCGTGAGGGAGCTGAGCGTGGACTTTCCGCTATCCGTGAGCGTCTTGGACCACTTGTTGAGCAAGGACGTGTTCGTGCTGCTACCGTCGGATCCCTTGCTGGACAACCACTTCAAGAGCGCGCTCAAGCTTGGGGAGAGCGTCTTCGTGCTCGCATGGAGGAGATGGGATCTCGCACCCGTGATCGTCTTGATGAGGTTAAGgtaagtttaaacatgattttactaactaactaatctgatttaaattttcagGAGCAAGTTGCTGAGGTCCGTGCTAAGCTTGAAGAGCAAGCTCAACAAATCCGTCTTCAAGCTGAGGCTTTCCAAGCTCGTCTTAAGTCTTGGTTCGAGCCACTTGTTGAGGATATGCAACGTCAATGGGCTGGACTTGTTGAGAAGGTCCAAGCCGCTGTCGGAACCTCCGCTGCTCCAGTTCCATCCGATAACCACTAA
tbb-2 3'UTR:
atgcaagatcctttcaagcattcccttcttctctatcactcttctttctttttgtcaaaaaattctctcgctaatttatttgcttttttaatgttattattttatgactttttatagtcactgaaaagtttgcatctgagtgaagtgaatgctatcaaaatgtgattctgtctgatgtactttcacaatctctcttcaattccattttgaagtgctttaaacccgaaaggttgagaaaaatgcgagcgctcaaatatttgtattgtgttcgttgagtgacccaacaaaaagaggaaa
균주 유전자형
PD1074 C. elegans 야생형
MB1 mbEx1(pvha-6::apoE4::tbb-2 UTR + pmyo-2:mCherry)
MB2 mbEx2(pvha-6::ssapoE4::tbb-2 UTR + pmyo-2:mCherry); SS는 신호 서열
MB3 mbEx1(pvha-6::apoE4::tbb-2 UTR + pmyo-2:mCherry); dvIs37 [myo-3p::GFP::Aβ(3-42) + rol-6(su1006)]
MB4 mbEx2(pvha-6::ssapoE4::tbb-2 UTR + pmyo-2:mCherry); dvIs37 [myo-3p::GFP::Aβ (3-42) + rol-6(su1006)]
CL2331 dvIs37 [myo-3p::GFP::Aβ (3-42) + rol-6(su1006)]
MB5 mbEx1(pvha-6::apoE4::tbb-2 UTR + pmyo-2:mCherry); dvIs2 [pCL12(unc-54/인간 Aβ펩티드 1-42 미니유전자) +pRF4]
MB6 mbEx2(pvha-6::ssapoE4::tbb-2 UTR + pmyo-2:mCherry); dvIs2 [pCL12(unc-54/인간 Aβ 펩티드 1-42 미니유전자) + pRF4]
CL2006 dvIs2 [pCL12(unc-54/인간 Aβ펩티드 1-42 미니유전자) +pRF4]
MB7 mbEx3 [unc-119(+);sur-5::UbV-GFP]
MB8 mbIs1[F25B3.3::tau352(PHP) + pha-1(+)]
MB9 mbEx3 [unc-119(+);sur-5::UbV-GFP]; mbIs1[F25B3.3::tau352(PHP) + pha-1(+)]
MB10 mbEx2(pvha-6::ssapoE4::tbb-2 UTR + pmyo-2:mCherry); mbIs1[F25B3.3::tau352(PHP) + pha-1(+)]
MB11 mbEx2(pvha-6:: ssapoE4::tbb-2 UTR + pmyo-2:mCherry); mbEx3 [unc-119(+); sur-5::UbV-GFP]
MB12 mbEx2(pvha-6::ssapoE4::tbb-2 UTR + pmyo-2:mCherry); mbEx3 [unc-119(+); sur-5::UbV-GFP]; mbIs1[F25B3.3::tau352(PHP) + pha-1(+)]
MB13 mbEx2(pvha-6::ssapoE4::tbb-2 UTR + pmyo-2:mCherry); mbEx3 [unc-119(+); sur-5::UbV-GFP]; mbIs1[F25B3.3::tau352(PHP) + pha-1(+)]; dvIs2 [pCL12(unc-54/인간 Aβ 펩티드 1-42 미니유전자) + pRF4]
실시예 2: 알츠하이머병과 관련된 매개변수에 영향을 미치는 미생물 균주를 특성화하기 위한 시스템의 예시
실시예 2.1: 알츠하이머병
알츠하이머병(AD)은 치매의 가장 흔한 원인 중 하나이다. 알츠하이머병은 기억, 언어 및 인지 능력을 포함한 인지 기능의 점진적인 감소를 특징으로 한다. 노인성 플라크 및 세포내 신경섬유 엉킴은 일반적으로 알츠하이머병 병리의 특징적인 특징으로 간주된다. 플라크는 40개 또는 42개 아미노산의 아밀로이드-β(Aβ) 펩티드 응집체로 구성할 수 있으며, 이는 프레세닐린(PSEN1 및 PSEN2)에 의한 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 비정상적 처리로 형성하는 것이 가능하다. 가용성 Aβ 올리고머는 또한 시냅스 기능 장애를 일으켜 신경변성 및 인지 장애를 유발할 수 있다 (Mucke, L., and Selkoe, D.J. (2012). Neurotoxicity of amyloid βsynaptic and network dysfunction. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, a006338, 본원에 원용됨). 알츠하이머병의 신경섬유 엉킴은 신경세포의 미세소관 관련 단백질인 과인산화 타우 단백질을 포함해도 좋다 (Iqbal, K., et al. (2010). Tau in Alzheimer Disease and Related Tauopathies. Curr. Alzheimer Res. 7, 656-664, 본원에 원용됨)-. AD에서 타우는 비정상적으로 과인산화되어 필라멘트 형태로 응집할 수 있다 (Grundke-Iqbal, I., et al. (1986). Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83, 4913-4917, 본원에 원용됨). 알츠하이머병에 Aβ가 관여한다는 강력한 증거가 있었으므로, 각종 단일클론 항체 기반 치료제가 개발되어아밀로이드 플라크를 표적으로 하는 테스트를 실시하였다 (van Dyck, CH(2018). Anti-Amyloid-βMonoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise. Biol. Psychiatry 83, 311-319, 전문이 본원에 원용됨). 표준 포유동물 동물 모델에 대한 연구에 따르면 동물 모델에서Aβ 축적을 효과적으로 예방하거나 제거하는 개입은 인간 임상 시험에서는 인지를 향상시키지 못했다.
알츠하이머병 사례의 약 5%는 유전적 원인이 있는 것으로 보이지만 나머지 사례의 95%는 병인을 알 수 없는 산발성 또는 후기 발병 알츠하이머병이다. AD 사례의 1% 미만은 APP, PSEN1 및 PSEN2를 포함한 유전자의 유전적 돌연변이로 인해 발생한다. 각종 유전자가 알츠하이머병과 관련되어 있지만 알츠하이머병의 가장 강력한 유전적 위험 요인 중 하나는 apoe로 꼽힌다 (Lambert, J.-C., et al.(2009). Genome-wide association study identifies variants at CLU and CR1 associated with Alzheimer's disease. Nat. Genet. 41, 1094-1099; Shen, L., and Jia, J. (2016). An Overview of Genome-Wide Association Studies in Alzheimer's Disease. Neurosci. Bull. 32, 183-190, 모두 본문에 원용됨). apoe는 지질/콜레스테롤 운반체 아포지단백 E(APOE)를 코딩한다. 인간의 경우 2개의 아미노산 잔기에만 서로 다른 APOE2, APOE3 및 APOE4라고 하는 3가지 주요 단백질 변이체가 있다. (Mahley, R.W. (2016). Apolipoprotein E: from cardiovascular disease to neurodegenerative disorders. J. Mol. Med. Berl. Ger. 94, 739-746, 본문에 원용됨). apoe에서 다형성, 특히 apoe4 대립유전자 보인자는 apoe2 또는 apoe3 대립유전자 보인자에 비해 알츠하이머병이 발병할 가능성이 훨씬 높으며, AD도 조기에 발병한다 (Roses, A.D. (1996). Apolipoprotein E alleles as risk factors in Alzheimer's disease. Annu. Rev. Med. 47, 387-400; Strittmatter, W.J., and Roses, A.D. (1996). Apolipoprotein E and Alzheimer's disease. Annu. Rev. Neurosci. 19, 53-77, 모두 본문에 원용됨). APOE2는 APOE의 보호 형태, APOE4는 "독성" 형태로 여겨진다. (Strittmatter and Roses, 1996, 본문에 원용됨). APOE4는 아밀로이드 침착도의 증가, 뇌 기능 장애 및 신경 퇴행을 포함하여 AD와 관련된 뇌 변화를 악화시킨다. (DiBattista, A.M., et al. (2016). Alzheimer's Disease Genetic Risk Factor APOE-ε4 Also Affects Normal Brain Function. Curr. Alzheimer Res. 13, 1200-1207, 본문에 원용됨). AD에서 APOE4의 중요성에도 불구하고, APOE4가 AD 발병을 촉진하는 방법의 분자 메커니즘을 여전히 제대로 파악하지 못하고 있다. (Kanekiyo, T., et al. (2014). ApoE and Aβin Alzheimer's disease: accidental encounters or partners? Neuron 81, 740-754, 전문이 본문에 원용됨). APOE4는 기능 상실 및 기능 획득 메커니즘을 통해 AD 발병에 기여하는 것으로 여겨진다. (DiBattista, 2016; Zepa, L., et al. (2011). ApoE4-Driven Accumulation of Intraneuronal Oligomerized Aβ42 following Activation of the Amyloid Cascade In Vivo Is Mediated by a Gain of Function. Int. J. Alzheimers Dis. 2011, 모두 본문에 원용됨).
이전의 연구에서는 APOE 동형이 Aβ에 결합하여 제거에 기여한다고 시사하였다 (Kim, J., et al. (2009). The role of apolipoprotein E in Alzheimer's disease. Neuron 63, 287-303, 본문에 원용됨). APOE2 및 APOE3에 비해 APOE4는 Aβ의 제거에서 효율성이 떨어지는 것으로 보였다(Kim, 2009, 본문에 원용됨). 그러나 최근 연구에 따르면 APOE는 apoE 수용체를 통한 흡수에서 Aβ와 경쟁한다 (Verghese, P.B., et al. (2013). APOE influences amyloid-β(Aβ) clearance despite minimal APOE/Aβassociation in physiological conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1807-1816; Yajima, R., et al. (2015). APOE-isoform-dependent cellular uptake of amyloid-βis mediated by lipoprotein receptor LR11/SorLA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456, 482-488, 모두 본문에 원용됨). 동형은 모두 APOE 수용체에 대한 결합에서 비슷한 결과를 보였지만, APOE4 발현 세포의 Aβ제거는 그다지 효율적이지 않았다 (Verghese, 2013, 본문에 원용됨).
Aβ뇌 병리학에서 APOE4의 역할에 관한 논문은 많지만, 타우 병리학에서 APOE4의 영향은 최근에야 연구 대상이 되었다. P301S 돌연변이를 포함하는 1N4R 인간 타우를 과발현하는 타우병증 모델을 사용한 결과, ApoE4가 Aβ병리와 무관하게 타우 유도 신경염증 및 신경변성 표현형을 악화시키는 것으로 나타났다. (Shi, Y., et al.(2017). ApoE4 markedly exacerbates tau-mediated neurodegeneration in a mouse model of tauopathy. Nature 549, 523-527, 본문에 원용됨). Tau P301S 돌연변이는 본디 전두측두엽 치매 및 변성을 가진 인간에게서 관측할 수 있었다 (Bugiani, O., et al. (1999). Frontotemporal Dementia and Corticobasal Degeneration in a Family with a P301S Mutation in Tau. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58, 667-677, 본문에 원용됨). 타우 P301S 돌연변이 단백질은 야생형 타우에 비해 인산화에 더 유리한 기질이다 (Alonso, A. del C., et al.(2004). Promotion of hyperphosphorylation by frontotemporal dementia tau mutations. J. Biol. Chem. 279, 34873-34881, 본문에 원용됨). 알츠하이머병에서 발견되는 신경섬유 엉킴은 주로 과인산화된 타우로 구성된다. (Iqbal, 2010, 본문에 원용됨). 또한 전측두엽 치매 환자에서 APOE4 대립유전자의 빈도는 상당히 높으며(Stevens, M., et al.(1997). Apolipoprotein E gene and sporadic frontal lobe dementia. Neurology 48, 1526-1529, 본문에 원용됨) APOE4 보인자 또한 질병 중증도가 증가하였다(Agosta, F., et al. (2009). Apolipoprotein Eε4 is associated with disease-specific effects on brain atrophy in Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2018-2022; Engelborghs, S., et al. (2006). Dose dependent effect of APOE epsilon4 on behavioral symptoms in frontal lobe dementia. Neurobiol. Aging 27, 285-292, 모두 본문에 원용됨). AD에서 APOE4의 중요성에도 불구하고 APOE4를 표적으로 하는 치료법은 아직 많지 않다 (Michaelson, D.M. (2014). APOEε4 The most prevalent yet understudied risk factor for Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. J. Alzheimers Assoc. 10, 861-868; Holtzman, D.M., et al. (2012). Apolipoprotein E and Apolipoprotein E Receptors: Normal Biology and Roles in Alzheimer Disease. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, 모두 본문에 원용됨). 모든 알츠하이머병 환자의 절반 이상에서 확인할 수 있었음에도 불구하고, ApoE4 보인자는 반응의 예측 불가능성 때문에 알츠하이머병에 대한 임상 시험에서 제외되는 경우가 많다 (Qiu, W.Q., et al. (2013). Angiotensin converting enzyme inhibitors and the reduced risk of Alzheimer's disease in the absence of apolipoprotein E4 allele. J. Alzheimers Dis. JAD 37, 421-428; Sperling, R., et al. (2012). Amyloid-related imaging abnormalities in patients with Alzheimer's disease treated with bapineuzumab: a retrospective analysis. Lancet Neurol. 11, 241-249; Farlow, M.R., et al. (1998). Treatment outcome of tacrine therapy depends on apolipoprotein genotype and gender of the subjects with Alzheimer's disease. Neurology 50, 669-677; Risner, M.E., et al. (2006). Efficacy of rosiglitazone in a genetically defined population with mild-to-moderate Alzheimer's disease. Pharmacogenomics J. 6, 246-254; 모두 본문에 원용됨).
APOE4는 뇌에서 발현되지만 APOE4의 말초 조직 발현율도 상당히 높다. 이것은 말초 APOE4가 알츠하이머병 발병에 기여할 가능성을 높인다. 뇌와는 별도로 APOE 단백질은 주로 간에서 합성되며 지질 수송과 콜레스테롤 항상성에 관여한다 (Safieh, M., et al.(2019). ApoE4: an emerging therapeutic target for Alzheimer's disease. BMC Med. 17, 본문에 원용됨). 간은 장간 순환을 통해 영양소뿐만 아니라 장내 미생물군유전체 유래의 소분자나 대사산물, 독소와도 접하는 주요 부위이다. 따라서 장내독소증은 간에 심각한 영향을 미친다. 한 가지 가능성은 알츠하이머병이 장에서 유래할 수 있다는 것이다. "마이크로바이옴 유래 물질"이 장간 순환계로 누출되어 간에 도달할 가능성이 있다. 간에서 APOE4는 "마이크로바이옴 유래 물질"을 뇌로 수송하여 아밀로이드 침착물을 심거나 신경염증을 증가시킬 수 있다. 최근 연구에서는 장내 마이크로바이옴이 알츠하이머병에서 중요한 역할을 할 가능성을 시사하였다. 대조군과 비교하여 인간 알츠하이머병 환자에서 마이크로바이옴의 상당한 변화가 관측할 수 있었다. 그러나 이러한 변화가 질병의 원인인지 결과인지는 알려져 있지 않다. 상당수의 마이크로바이옴 구성요소가 알츠하이머병의 감수성 또는 발병기전과 연관이 있으나, 상호작용의 분자 메커니즘은 아직 밝혀내지 못하고 있다.
실시예 2.2: Aβ유도된 마비 표현형을 향상시키는 APOE4
미생물이 AD 병인을 조절하는지 여부를 테스트하기 위해 인간 APOE4를 발현하는 형질전환 C. elegans 균주를 개발하였다. 해당 형질전환 C. elegans 균주는 인간 APOE4가 세포 밖으로 분비되도록 하는 신호 서열과 함께 장 프로모터의 제어 하에 C. elegans 의 장에서 인간 APOE4를 발현하였다[예:mbEx2(pvha-6 ::ssapoe4)]. 신호 서열이 없는 경우도 발현시켰다[예:mbEx1(pvha-6::apoe4)]. C. elegans는 간이 없고 간이 일반적으로 하는 모든 기능을 장이 대행한다. 동물에게 E. coli OP50 표준 실험실 균주를 투여했다 . 성체가 된 첫째 날부터 동물이 모두 마비 증상을 일으킬 때까지 격일로 모니터링하였다. 각 분석마다 최소한 20마리의 동물을 대상으로 하여 기록을 남겼다(표 4 참조). 독립적으로 시험을 3회 실시하여 데이터를 얻었다. 각 데이터 포인트에 대해 평균±오차범위를 도 1 의 그래프에 도시하였다. 신호 서열이 있거나 없는 인간 APOE4를 발현하는 형질전환 동물은 명백한 표현형을 일절 나타내지 않았다(도 1).
C. elegans 근육에서 인간 Aβ1-42를 발현시킨 결과 마비 표현형을 유도하는 것으로 보고되었다. (Link, C.D. (1995). Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 9368-9372, 본문에 원용). 인간 APOE4가 근육에서 인간 Aβ1-42에 의해 유도된 마비 표현형을 조절하는지의 여부를 결정하기 위해, 표 4의 동물을 분석하였다.
C. elegans 표현형
mbEx1(pvha-6::apoe4) 신호 서열이 없는 APOE4
mbEx2(pvha-6::ssapoe4) 신호 서열이 있는 APOE4
dvls2(punc-54::Abeta1-42) Aβ1-42
mbEx1(pvha-6::apoe4); dvls2(punc-54::Abeta1-42) 신호 서열이 없는 APOE4; Aβ1-42
mbEx2(pvha-6::ssapoe4); dvls2(punc-54::Abeta1-42) 신호 서열이 있는 APOE4; Aβ1-42
신호 서열을 가지는 APOE4의 발현은 Aβ유도 마비 표현형을 향상시켰다. Aβ를 발현하는 동물의 ~40%가 마비된 반면, 신호 서열과 함께 Aβ와 APOE4를 모두 발현하는 동물의 >90%는 성체 8일째에 마비되었다(도 1). 그러나 신호서열 없이 Aβ와 APOE4를 발현하는 동물의 마비 표현형은 Aβ를 단독으로 발현하는 동물과 유사하였다(도 1). 반대로 신호 서열의 유무에 관계없이 APOE4 자체를 발현하는 것은 Aβ발현의 부재 하에 마비 표현형 성년기를 유도하지 않았다(도 1).
본원에 기술된 연구의 나머지 부분에는 신호 서열 ssApoE4를 가지는 APOE4를 발현하는 균주를 분석하였다.
실시예 2.3: GFP 및 인간 ssAPOE4에 접합된 Aβ3-42가 유의하게 증가
C. elegans 근육에서 GFP와 접합시킨 인간 Aβ3-42을 발현시킨 결과 응집체 형성을 유발하는 것으로 보고되었다 (Link, C.D., Fonte, V., Roberts, C.M., Hiester, B., Silverman, M.A., and Stein, G.H. (2008). The beta amyloid peptide can act as a modular aggregation domain. Neurobiol. Dis. 32, 420-425, 본문에 원용됨). 인간 ssApoE4의 발현이 C. elegans에서 Aβ응집체 형성에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위해, GFP에 접합한 인간 Aβ3-42 와 함께 인간 ssApoE4를 발현하는 동물을 생성하였다. 표 5의 동물에게 E. coli OP50 표준 실험실 균주를 투여했다 .
C. elegans 표현형
GFP::A-Beta (3-42) Aβ3-42
ssApoE4::GFP::A-Beta (3-42) 신호 서열이 있는 APOE4; Aβ3-42
동물의 전방(anterior) 영역의 GFP 응집체는 동물이 성체에 도달했을 때 계수하였다. 각 분석마다 최소한 17마리의 동물을 대상으로 하여 기록을 남겼다. 각 데이터 포인트에 대해 평균±오차범위를 도 2에 도시하였다. 스튜던트 t-검정(P<0.0001)을 적용하여 분석한 결과, Aβ3-42를 발현한 동물에 비해 Aβ3-42 및 ssApoE4를 발현한 동물에서 GFP 응집체가 유의하게 증가하였다.
GFP에 결합된 인간 Aβ3-42를 발현하는 동물의 전방 영역의 응집체 수와 비하여, GFP에 결합한 Aβ3-42 및 인간 ssApoE4를 모두 발현하는 동물의 응집체 수가 유의하게 증가하였다(도 2). AD 환자의 Aβ침착은 비보인자와 비교하여 APOE4 보인자에서 더 높은 것으로 보고되었다 (Dorey, E., Chang, N., Liu, Q.Y., Yang, Z., and Zhang, W. (2014). Apolipoprotein E, amyloid-beta, and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Neurosci. Bull. 30, 317-330, 본문에 원용됨).
실시예 2.4: UbV-GFP는 인간 ssAPOE4 및 인간 tau352(PHP)을 모두 발현하는 동물에서 안정화
과인산화된 타우는 알츠하이머병과 관련이 있는 것으로 보고되었다. 또한 AD 관련 변형을 모방하는 유사과인산화 타우의 발현은 C. elegans에서 진행성 연령 의존적 운동 결함을 유도한다는 보고가 있었다 (Brandt, R., Gergou, A., Wacker, I., Fath, T., and Hutter, H. (2009). A Caenorhabditis elegans model of tau hyperphosphorylation: induction of developmental defects by transgenic overexpression of Alzheimer's disease-like modified tau. Neurobiol. Aging 30, 22-33, 본문에 원용됨).
ssAPOE4가 C. elegans에서 타우 유도 결함을 조절하는지의 여부를 분석하기 위해 유사과인산화 인간 타우 및 인간 ssAPOE4를 발현하는 형질전환 균주를 생성했다. 적절한 유전자형 의 동물에게 E. coli op50 표준 실험실 균주를 투여하였다. 유사과인산화 인간 타우 균주만을 발현한 균주와 비교하여 유사과인산화된 인간 타우를 발현하는 균주와 인간 ssAPOE4 사이에서 운동의 명백한 차이는 관찰되지 않았다(데이터 미도시).
적절한 프로테아좀 기능은 세포 기능에 중요하다. 기존 연구에 따르면 인간 알츠하이머병에서는 프로테아좀의 기능이 손상된다(Bonet-Costa, V., et al.(2016). The Proteasome and Oxidative Stress in Alzheimer's Disease. Antioxid. Redox Signal. 25, 886-901; Upadhya, S.C., and Hegde, A.N. (2007). Role of the ubiquitin proteasome system in Alzheimer's disease. BMC Biochem. 8, S12; Oddo, S. (2008). The ubiquitin-proteasome system in Alzheimer's disease. J. Cell. Mol. Med. 12, 363-373; Zheng, Q., et al. (2016). Dysregulation of Ubiquitin-Proteasome System in Neurodegenerative Diseases. Front. Aging Neurosci. 8, 모두 본문에 원용됨). ssApoE4 발현이 프로테아좀 기능에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위해, 인간 ssApoE4 및 손상된 프로테아좀 기능에 대한 마커를 보유하는 동물을 생성하였다(표 6). 프로테아좀 기능 장애 마커는 GFP(UbV-GFP)에 N 말단 융합된 절단 불가능한 유비퀴틴으로 구성된다.
C. elegans 표현형
UbV-GFP 유비퀴틴 N-말단 GFP에 융합
ssapoe4; UbV-GFP 신호 서열이 있는 APOE4; 유비퀴틴 N-말단 GFP에 융합
Tau352(PHP);UbV-GFP 유사과인산화 타우 단백질; 유비퀴틴 N-말단 GFP에 융합
ssapoe4; Tau352(PHP); UbV-GFP 신호 서열이 있는 APOE4; 유사과인산화 타우 단백질; 유비퀴틴 N-말단 GFP에 융합
장에서 GFP를 발현하는 동물의 수를 동물이 성체에 도달했을 때 계수하였다. 각 분석마다 최소한 30마리의 동물을 대상으로 하여 기록을 남겼다. 독립적 실험 3회에서 얻은 데이터를 플롯으로 도 3에 표시하였다. 각 데이터 포인트에 대하여 평균±오차범위를 그래프에 표시한다. 스튜던트 t-검정(P<0.0001)을 적용하여 분석한 결과, tau352(PHP)를 발현한 동물에 비해 ssAPOE4 및 tau352(PHP)를 발현한 동물에서 UbV-GFP 응집체가 유의하게 증가하였다.
일반적으로, UbV-GFP는 프로테아좀 의존적 분해를 겪는 반면, 손상된 프로테오스타시스는 GFP의 안정화를 야기한다(예: 도 3 참조). 인간 ssApoE4를 발현하는 동물에게서는 GFP 발현이 최소로 나타나거나 전혀 관찰되지 않았다. 그러나 UbV-GFP는 인간 ssApoE4 및 유사과인산화 인간 타우 둘 다를 발현하는 동물에게서 안정화하였다(도 3). 유사과인산화 인간 타우 발현 자체는 프로테아좀 스트레스를 유도하지 않았다(도 3). 이 결과는 인간 ssApoE4와 유사과인산화 인간 타우의 발현이 프로테아좀 스트레스를 유도함을 시사하였다.
과인산화 타우는 프로테아좀 분해에 내성이 있는 것으로 보고되어 있다(Poppek, D., Keck, S., Ermak, G., Jung, T., Stolzing, A., Ullrich, O., Davies, KJA 및 Grune, T.(2006). Phosphorylation inhibits turnover of the tau protein by the proteasome: influence of RCAN1 and oxidative stress. Biochem. J. 400, 511-520, 본문에 원용). 또한 타우 인산화는 프로테아좀 활성을 조절한다는 보고도 있다(Ren, Q.-G., Liao, X.-M., Chen, X.-Q., Liu, G.-P., and Wang, J.-Z. (2007). Effects of tau phosphorylation on proteasome activity. FEBS Lett. 581, 1521-1528; Johnson, G.V.W. (2006). Tau phosphorylation and proteolysis: insights and perspectives. J. Alzheimers Dis. JAD 9, 243-250, 본문에 원용됨). C. elegans 형질전환주에서는 유사과인산화 인간 타우가 뉴런에서 발현되는 반면 인간 ssApoE4는 신호 서열과 함께 장 프로모터의 제어하에 발현되어 세포 밖으로 분비되도록 하였다. UbV-GFP의 유도는 주로 동물의 장에서 관측되었다(미도시). 장은 그 외 조직에서 일어난 UbV -GFP의 유도를 상쇄할 수 있는 C. elegans에서 가장 큰 조직이다. 장에서 UbV-GFP의 유도는 프로테아좀 기능을 변형할 수 있는 개입을 쉽게 스크리닝할 수 있다.
실시예 2.5: Aβ마비에 영향을 미치는 미생물 균주
적절한 유전자형의 동물에게 E. coli OP50 표준 실험실 균주 또는 개별 마이크로바이옴 균주를 투여하였다. 마비된 동물의 수를 성체 4일째에 기록하였다. 독립적 실험 3회에서 얻은 데이터를 플롯으로 표시하였다. 각 데이터 포인트에 대하여 평균±오차범위를 그래프에 표시한다. 각 조건에 대해 분석한 동물의 수와 함께 원시 데이터를 포함하는 표 1을 참조할 것.
조절제에 대한 마이크로바이옴의 신속한 스크리닝을 용이하게 하기 위해 인간 ssApoE4, 인간 Aβ1-42, 인간 유사인산화 타우 및 UbV-GFP 프로테아좀 마커를 발현하는 새로운 형질전환 C. elegans 균주를 생성하였다. 이 형질전환 균주는 마비를 억제하는 개입과 프로테아좀 기능을 개선하는 약제 동정에도 사용할 수 있다. 마비에 영향을 미치는 생물학적 경로의 매개변수 또는 특징을 찾는 데도 유용하다. 매개변수 또는 특징은 소분자, 대사산물, 핵산, 단백질, 지질 또는 미생물군유전체 구성요소일 수 있다. 인간 마이크로바이옴의 약 1400개의 개별 미생물 균주를 인간 ssApoE4, 인간 Aβ인간 유사인산화 타우 및 UbV-GFP 프로테아좀 마커를 보유하는 동물에 투여하였다. 일정 수준의 마비가 관찰되었다. 미생물 집단의 그룹은 인간 ssApoE4, 인간 Aβ1-42, 인간 유사인산화 타우 및 UbV-GFP 프로테아좀 마커를 발현하는 동물의 마비 표현형을 향상시키는 것으로 밝혀졌다(표 7, 도 4). 인간 Aβ1-42, 인간 유사인산화 타우 및 UbV-GFP 프로테아좀 마커를 발현하는 동물에게 이들 박테리아 중 다수를 투여해도 마비 표현형이 향상되지 않았기 때문에 마비의 증진은 ssAPOE4의 존재 유무에 의존적이라 할 수 있다(표 7, 도 4).
미생물 단리 ssAPOE4, Tau352(PHP) 및 Aβ를 발현하는 균주에서 마비된 동물의 비율(%) Tau352(PHP) 및 Aβ를 발현하는 균주에서 마비된 동물의 비율(%)
E. coli OP50 40.6±1.8 (305) 5.5±2.1 (288)
E. coli 단리 2 91.6±1.1 (297) 6.3±3.7 (298)
E. coli 단리 6 85.6±2.1 (298) 5.6±2.9 (305)
E. coli 단리 7 83.9±7.1 (299) 5.0±1.7 (301)
E. coli 단리 3 51.2±1.1 (299) 5.4±1.6 (299)
E. coli 단리 5 52.9±1.1 (295) 5.3±1.5 (300)
E. coli 단리 12 71.9±1.8 (281) 5.1±2.1 (297)
E. coli 단리 15 71.1±2.4 (301) 5.7±2.2 (297)
E. coli 단리 8 63.6±1.0 (299) 6.0±1.0 (301)
E. coli 단리 21 68.2±2.7 (285) 6.0±1.9 (300)
E. coli 단리 13 50.7±0.3 (302) 5.2±1.6 (286)
E. coli 단리 11 51.7±1.8 (302) 5.5±1.4 (289)
Escherichia fergusonii 단리 2 68.3±2.4 (297) 5.2±0.2 (290)
Escherichia fergusonii 단리 4 76.0±4.2 (304) 5.8±2.0 (292)
Escherichia fergusonii 단리 5 82.7±4.4 (304) 5.4±0.7 (299)
Escherichia fergusonii 단리 8 63.5±1.8 (296) 6.3±0.6 (304)
Escherichia albertii 단리 5 57.1±6.1 (291) 5.6±2.1 (302)
Escherichia albertii 단리 3 56.0±8.1 (300) 5.5±0.5 (292)
Escherichia albertii 단리 8 57.7±10.0 (299) 5.5±1.4 (290)
Escherichia albertii 단리 4 67.6±5.3 (297) 5.5±0.8 (293)
Klebsiella oxytoca 단리 1 75.5±5.3 (295) 8.7±1.2 (299)
Klebsiella oxytoca 단리 8 55.6±4.3 (300) 8.1±0.6 (308)
Klebsiella oxytoca 단리 4 51.7±1.3 (302) 7.5±1.3 (305)
Klebsiella oxytoca 단리 5 86.7±1.2 (293) 7.6±2.8 (284)
Klebsiella pneumoniae 단리 1 70.8±8.6 (300) 9.4±1.6 (299)
Klebsiella pneumoniae 단리 3 58.4±3.4 (303) 12.2±0.5 (296)
Streptococcus downei 64.8±2.0 (301) 11.6±0.4 (301)
Streptococcus sanguinis 90.3±2.0 (299) 13.8±1.2 (297)
Streptococcus vestibularis 75.1±4.4 (297) 13.9±1.4 (297)
Streptococcus mitis 80.4±1.4 (305) 13.5±0.7 (303)
Streptococcus gallolyticus 60.5±5.4 (296) 14.7±0.5 (305)
Streptococcus anginosus 56.3±3.1 (297) 14.4±1.5 (300)
Streptococcus caprinus 77.5±2.9 (298) 12.9±2.2 (302)
Streptococcus intermedius 60.8±9.1 (303) 11.9±1.2 (302)
Staphylococcus aureus 70.3±4.0 (303) 13.0±0.3 (307)
Staphylococcus epidermis 79.0±1.6 (300) 13.0±0.3 (301)
Staphylococcus hominis 57.1±8.2 (305) 11.9±1.0 (287)
Paenisporosarcina sp. 69.8±0.4 (288) 12.5±0.6 (296)
Paenibacillus sp. 78.1±4.1 (309) 12.5±0.5 (305)
Sporosarcina sp. 66.8±0.8 (301) 11.7±1.4 (308)
Paenibacillus sp. 64.7±3.1 (287) 13.0±0.4 (293)
Alcaligenes faecalis 단리 1 74.7±9.9 (297) 7.5±3.2 (294)
Alcaligenes faecalis 단리 2 57.7±4.1 (297) 6.3±1.1 (285)
Enterococcus faecium 75.7±6.9 (296) 12.0±1.0 (300)
Enterococcus faecalis 73.3±5.6 (304) 13.3±0.5 (309)
Deinococcus grandis 52.9±0.9 (310) 12.5±1.2 (312)
Neisseria sp. 52.7±3.9 (302) 12.6±1.8 (302)
Rhodococcus erythropolis 44.6±1.3 (316) 13.3±1.2 (316)
Corynebacterium amycolatum 56.2±1.5 (301) 11.7±4.3 (292)
Actinomyces sp. 58.0±2.0 (300) 11.0±0.1 (301)
Rothia dentocariosa 92.3±1.1 (299) 11.0±3.7 (300)
Arcobacter butzlerei 58.3±2.1 (292) 13.5±0.7 (304)
Citrobacter freundii 58.2±3.9 (301) 11.9±1.5 (301)
Acinetobacter baumanni 68.7±1.4 (310) 8.5±2.1 (299)
Porphyromonas gingivalis 87.9±5.1 (297) 11.4±0.6 (298)
Fusobacterium nucleatum 84.4±4.6 (300) 10.9±5.2 (302)
Salmonella enterica 64.9±5.0 (291) 12.9±1.4 (295)
Shigella flexneri 64.5±6.7 (303) 9.8±4.4 (306)
Pseudomonas sp. 73.3±8.3 (292) 11.3±4.2 (292)
Cardiobacterium vulvarum 57.9±1.7 (302) 12.9±1.9 (302)
Achromabacter oxlosoxidans 61.5±3.0 (296) 12.2±1.1 (296)
실시예 2.6: Aβ3-42::GEP 응집을 조절하는 미생물 균주
인간 ssApoE4, 인간 Aβ1-42, 인간 유사인산화 타우 및 UbV-GFP 프로테아좀 마커를 발현하는 C. elegans동물에서 마비를 향상시키는 것으로 관찰된 미생물 집단에 포함된 것은 Porphyromonas gingivalis였다(표 1). P. gingivalis 는 AD 환자의 뇌에서 확인되었으며 신경독성 타우 및 아밀로이드 침착과 관련이 있다. (Dominy, SS, et al.(2019). Porphyromonas gingivalis in Alzheimer's disease brains: Evidence for disease causation and treatment with small-molecule inhibitors. Sci. Adv. 5. 본문에 원용됨). 또한, P. gingivalis는 유비퀴틴 부하를 증가시키는 것으로 보고되어 프로테아좀 기능의 붕괴를 시사한다(Dominy et al., 2019, 본문에 원용됨). P. gingivalis 의 경구 투여는 뇌 감염 및 Aβ침착의 유도를 충분히 유도한다는 보고가 있었다(Dominy et al., 2019, 본문에 원용됨).
동물에게 E. coli OP50 표준 실험실 균주 또는 개별 마이크로바이옴 균주를 투여하였다. 동물의 전방(anterior) 영역의 GFP 응집체는 동물이 성체에 도달했을 때 계수하였다. 동물 3마리에서 조건별로 GFP 응집체를 계수하였다. 각 데이터 포인트에 대하여 평균±오차범위를 그래프에 표시한다.
P. gingivalis 의 투여는 증가된 Aβ3-42::GFP 응집체를 유도했다. 그러나 Aβ3-42::GFP 응집체는 인간 ssApoE4 및 Aβ3-42::GFP를 함께 발현하는 동물에서 상당히 더 높게 증가하였다(도 5). 이 결과는 ssApoE4 유전자형이 알츠하이머병 관련 증상의 발병률을 높이는 데 해로운 영향을 미친다는 것을 시사한다. 따라서, 이전에 AD에 연관되었던 주지의 미생물 집단의 식별은 형질전환 인간 ssApoE4, 유사인산화 타우 및 Aβ발현 C. elegans 플랫폼 분석을 뒷받침한다. 결과는 발견된 그 외 미생물 집단이 인간의 알츠하이머병 위험에 영향을 미치는 요인일 수 있음을 확인시켜 준다.
마비 표현형을 증가시킬 뿐만 아니라 ssAPOE4에 의존적으로 증가한 Aβ3-42 ::GFP 응집체를 야기하는 몇몇 E. coli 분리주를 발견하였다(표 7; 도 4; 도 5). 적어도 C. elegans는 실험실에서 표준 비병원성 E. coli OP50 균주를 섭취했기 때문에 상당히 흥미로운 결과이다. 기존의 연구는 특히 E. coli 의 그람 음성 박테리아 분자가 알츠하이머병 신경병리와 연관이 있다고 보고하였다 (Zhan, X., Stamova, B., Jin, L.-W., DeCarli, C., Phinney, B., and Sharp, F.R. (2016). Gram-negative bacterial molecules associate with Alzheimer disease pathology. Neurology 87, 2324~2332. 본문에 원용됨). E. coli OP50 균주에서 이러한 인자가 발현되지 않거나 약하게 발현된다. 이는 균주별 차이를 시사할 수 있다. 시험 대상인 E. coli의 11개 균주는 마비(표 7, 도 4) 또는 Aβ3-42::GFP 응집체 표현형(도 5)에 대해 경증, 중등도 또는 중증 효과를 가지는 균주로 분류되었다. 해당 데이터는 미생물 개체군의 균주 특이적 차이가 AD의 발생 또는 중증도에 기여할 수 있음을 시사한다.
E. fergusonii와 E. albertii도 E. coli와 유사한 경향을 보였다 . E. fergusonii 및 E. albertii 의 일부 분리주는 마비 표현형을 증가시켰지만 다른 균주는 경미하거나 중간 정도의 효과를 나타냈다(표 7). 마비에 대한 이와 같은 효과는 Klebsiella oxytoca, Klebsiella pnuemoniae 및 Alcaligenes faecalis의 분리주에서도 관측할 수 있었다. 그 외의 미생물 집단에서도 일반적인 경향일 수 있으나, 분석 균주의 수가 제한적이면 이 특성을 놓칠 수 있다. 따라서, 본 개시는 특정 미생물의 개별 균주가 특히 질병 관련 표현형을 포함하는 생물학적 표현형에 차등 효과를 가질 수 있음을 교시한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 생물학적 표현형에 대한 특정 영향을 달성할 수 있는 특정 균주, 및/또는 이들의 성분 또는 조합을 확인 및/또는 특성화하기 위한 기술을 제공한다.
또한, 겉보기에 건강한 기증자의 마이크로바이옴 샘플을 분석하였다. 알츠하이머병 환자의 마이크로바이옴 샘플은 해로운 영향을 미칠 수 있는 균주를 식별하는 것에 더 유용할 수 있다. 그러나, 이 C. elegans 특성화 시스템을 사용하면 환자의 마이크로바이옴에 관하여 질병과 관련되거나 또는 질병에 영향을 미치는 미생물 균주의 존재 증가 또는 감소를 평가할 수 있다. 환자 집단의 메타게놈 시퀀싱은 특정 환자 또는 환자 집단에 존재하는 미생물 종의 다양성을 식별할 수 있지만, 이러한 방법은 건상자 집단과 비교했을 때 환자 샘플의 균주 수준 차이를 파악할 수 없다. 본 시스템은 환자 및/또는 환자 집단의 균주 수준 차이의 식별을 강화하며, 이는 알츠하이머병을 비롯한 여러 질환 또는 병증에 중요할 수 있습니다. 따라서 이 플랫폼은 잠재적인 조기 진단 질병 예측인자 역할을 할 수 있다. 따라서 본 개시는 특정 질환 상태와 연관성이 있는 미생물, 및/또는 구성요소 또는 이들의 조합(즉, 미생물 특징)을 정의, 평가 및/또는 검출하기 위한 기술을 제공한다. 일부 실시형태에서, 해당 미생물 특징은 환자 샘플에서 검출할 수 있으며, 예를 들어, 질환 상태를 진단하고, 해당 질환 상태에 대한 특정 요법의 영향을 모니터링하는 데 유용할 수 있다.
실시예 2.7: ATP 생산에 영향을 미치는 미생물 균주의 예
Neuro2A 세포주는 ATCC에서 구입하고 10% FBS 및 1% L-글루타민이 보충된 EMEM 배지에서 배양했다. 세포는 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 유지하였다. 모든 실험은 3-7 계대 세포만을 사용하여 실시하였다. Neuro2A 세포(1웰당 5 ×104 세포)를 96웰 흰색 벽 플레이트(Corning)에 플레이팅하고 37℃/5% CO2에서하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 10개의 박테리아 각각 또는 모든 박테리아의 조합(CT10)을 강화 클로스트리듐 브로스, 펩톤 효모 추출물 포도당 브로스, MRS 브로스 및 트립신 소이 브로스 배지에서 성장시켰다. 박테리아를 PBS에서 108 CFU로 재현탁하고 -80℃에서 보관했다. 108 CFU의 각 미생물(샘플함)을 6개의 웰에 첨가했다. 박테리아 전 조합(CT10)을 109 CFU(즉, 각 박테리아의 108 CFU)에서 6개의 웰에 첨가했다. 대조군 웰에는 세균이 없는 PBS를 첨가하였다. 37℃/5% CO2에서 16시간 인큐베이션한 후, 2μM의 인간 아밀로이드 β1-42를 미처리 대조군 웰을 제외한 모든 웰에 첨가했다. 세포를 37℃/5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션했다 . 세포를 PBS로 3회 세척하고 Promega CellTiter-Glo 0.05ml로 세척하고 플레이트를 빛을 차단한 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ATP 수준을 나타내는 마이크로플레이트 리더(Promega discoverer, Promega Corp)를 사용하여 발광을 측정하였다. ATP 수준은 Bradford 단백질 분석 키트(ThermoFisher Scientific)에 의해 측정된 단백질 함량으로 정규화하였다. 10μl의 샘플을 투명 96웰 플레이트에 있는 150μl의 Bradford 시약에 이중으로 첨가하고 암실에서 실온 하에 5분 동안 인큐베이션한 후 마이크로플레이트 리더(Promega Discoverer, Promega Corp.)로 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 정규화 발광도는 발광 값을 OD 단백질 흡광도 값으로 나누어 계산하였다. 각 조건에 대한 3중 웰의 평균을 계산하여 대조군 대비 %ATP를 산출하였다.
도 6에 도시한 바와 같이, Neuro2A 세포를 2μM의 인간 아밀로이드 β1-42 ("모의 처리")로 처리하면 ATP 생산이 크게 감소했다. Neuro2A 세포를 Gluconacetobacter hansenii, Terrisporobacter glycolicus, Coprococcus sp. 또는 Acidaminococcus sp. 모의 처리 세포와 비교한 결과, ATP 생산에 상당한 증가가 있었으며, 박테리아의 전 조합(CT-10)은 인간 아밀로이드 β1-42의 존재 하에 ATP 생산을 더욱 증가시켰다.
인간 장내 마이크로바이옴에서 발견한 미생물 균주의 예시
Bacteroides pectinophilus Exiguobacterium mexicanum
Acetobacter sp. Faecalibacterium prausnitzii
Acetobacterium tundrae Faecalitalea cylindroides
Achromobacter aegrifaciens Finegoldia magna
Achromobacter insuavis Flavonifractor plautii
Achromobacter piechaudii Flintibacter butyricus
Achromobacter xylosoxidans Fusicatenibacter saccharivorans
Acidaminococcus fermentans Fusobacterium gonidiaformans
Acidaminococcus intestini Fusobacterium mortiferum
Acinetobacter baumannii Fusobacterium nucleatum
Acinetobacter junii Fusobacterium ulcerans
Actinomyces sp. Fusobacterium varium
Agathobacter rectalis Gardnerella vaginalis
Agathobaculum butyriciproducens Gemella haemolysans
Aggregatibacter segnis Gemella sanguinis
Akkermansia muciniphila Gemmiger formicilis
Alistipes finegoldii Gluconacetobacter sp.
Alistipes indistinctus Gluconobacter sp.
Alistipes onderdonkii Gordonibacter pamelaeae
Alistipes putredinis Granulicatella adiacens
Alistipes shahii Grimontia hollisae
Allisonella histaminiformans Haemophilus parainfluenzae
Anaerobaculum hydrogeniformans Harryflintia acetispora
Anaerococcus hydrogenalis Helicobacter bilis
Anaerococcus octavius Helicobacter bizzozeronii
Anaerococcus prevotii Helicobacter canadensis
Anaerococcus tetradius Helicobacter cinaedi
Anaerococcus vaginalis Helicobacter pullorum
Anaerofilum agile Helicobacter pylori
Anaerofustis stercorihominis Helicobacter winghamensis
Anaerosporobacter mobilis Holdemanella biformis
Anaerostipes caccae Holdemania filiformis
Anaerostipes hadrus Holdemania massiliensis
Anaerostipes rhamnosivorans Hungatella effluvii
Anaerotruncus colihominis Hungatella hathewayi
Anaerovorax odorimutans Intestinimonas butyriciproducens
Arcobacter butzleri Kineothrix alysoides
Asaccharobacter celatus Kingella oralis
Atopobium parvulum Klebsiella pneumoniae
Atopobium vaginae Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae
Bacillus cereus Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae
Bacillus coagulans Klebsiella pneumoniae subsp. rhinoscleromatis
Bacillus licheniformis Klebsiella quasipneumoniae subsp. quasipneumoniae
Bacillus pseudomycoides Klebsiella singaporensis
Bacillus sonorensis Klebsiella variicola
Bacillus toyonensis Lachnobacterium bovis
Bacillus wiedmannii Lachnospira multipara
Bacteroides caccae Lachnospira pectinoschiza
Bacteroides cellulosilyticus Lactobacillus acidophilus
Bacteroides clarus Lactobacillus amylolyticus
Bacteroides coprocola Lactobacillus amylovorus
Bacteroides coprophilus Lactobacillus antri
Bacteroides dorei Lactobacillus brevis subsp. Gravesensis
Bacteroides eggerthii Lactobacillus buchneri
Bacteroides faecis Lactobacillus casei
Bacteroides finegoldii Lactobacillus coryniformis subsp. Coryniformis
Bacteroides fluxus Lactobacillus crispatus
Bacteroides fragilis Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus
Bacteroides intestinalis Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus
Bacteroides massiliensis Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis
Bacteroides nordii Lactobacillus fermentum
Bacteroides oleiciplenus Lactobacillus fructivorans
Bacteroides ovatus Lactobacillus gasseri
Bacteroides plebeius Lactobacillus helveticus
Bacteroides salanitronis Lactobacillus hilgardii
Bacteroides salyersiae Lactobacillus iners
Bacteroides stercoris Lactobacillus jensenii
Bacteroides thetaiotaomicron Lactobacillus johnsonii
Bacteroides uniformis Lactobacillus mucosae
Bacteroides vulgatus Lactobacillus oris
Bacteroides xylanisolvens Lactobacillus paracasei
Bacteroides xylanolyticus Lactobacillus paracasei subsp. tolerans
Barnesiella intestinihominis Lactobacillus pentosus
Bartonella clarridgeiae Lactobacillus plantarum subsp. plantarum
Bartonella quintana str. Toulouse Lactobacillus reuteri
Bifidobacterium adolescentis Lactobacillus rhamnosus
Bifidobacterium angulatum Lactobacillus rogosae
Bifidobacterium animalis Lactobacillus ruminis
Bifidobacterium bifidum Lactobacillus salivarius
Bifidobacterium breve Lactobacillus ultunensis
Bifidobacterium catenulatum Lactobacillus vaginalis
Bifidobacterium coryneforme Lactococcus formosensis
Bifidobacterium dentium Lactococcus garvieae
Bifidobacterium faecale Lactococcus lactis subsp. Cremoris
Bifidobacterium gallicum Lactococcus lactis subsp. lactis
Bifidobacterium longum Lactonifactor longoviformis
Bifidobacterium longum subsp. infantis Laribacter hongkongensis
Bifidobacterium longum subsp. longum Lautropia mirabilis
Bifidobacterium longum subsp. suis Leptotrichia buccalis
Bifidobacterium pseudocatenulatum Leptotrichia hofstadii
Bifidobacterium pseudolongum Leuconostoc lactis
Bifidobacterium stercoris Leuconostoc mesenteroides subsp. Cremoris
Bilophila wadsworthia Listeria grayi
Bittarella massiliensis Listeria monocytogenes
Blautia coccoides Longicatena caecimuris
Blautia faecis Marvinbryantia formatexigens
Blautia glucerasea Megamonas funiformis
Blautia hansenii Megamonas rupellensis
Blautia hydrogenotrophica Megasphaera elsdenii
Blautia luti Megasphaera indica
Blautia obeum Megasphaera micronuciformis
Blautia producta Megasphaera paucivorans
Blautia schinkii Methanobrevibacter smithii
Blautia stercoris Methanomassiliicoccus luminyensis
Blautia wexlerae Methanosphaera stadtmanae
Bradyrhizobium japonicum Methylobacterium radiotolerans
Burkholderia ambifaria Mitsuokella jalaludinii
Burkholderia cenocepacia Mitsuokella multacida
Burkholderia glumae Mobiluncus mulieris
Burkholderia multivorans Mogibacterium timidum
Burkholderia plantarii Mogibacterium vescum
Butyricicoccus faecihominis Moraxella catarrhalis
Butyricicoccus pullicaecorum Morganella morganii subsp. morganii
Butyricimonas faecihominis Murdochiella asaccharolytica
Butyricimonas paravirosa Mycobacterium abscessus
Butyricimonas virosa Mycobacterium tuberculosis
Butyrivibrio crossotus Mycoplasma hominis
Campylobacter coli Neisseria cinerea
Campylobacter concisus Neisseria flavescens
Campylobacter curvus Neisseria macacae
Campylobacter gracilis Neisseria mucosa
Campylobacter hominis Neisseria sicca
Campylobacter jejuni subsp. Jejuni Neisseria subflava
Campylobacter showae Nitrobacter hamburgensis
Campylobacter upsaliensis Nitrobacter winogradskyi
Candidatus Dorea massiliensis Odoribacter laneus
Candidatus Stoquefichus massiliensis Odoribacter splanchnicus
Capnocytophaga gingivalis Olsenella profusa
Capnocytophaga sputigena Olsenella scatoligenes
Cardiobacterium hominis Olsenella uli
Catenibacterium mitsuokai Oribacterium sinus
Catonella morbi Oscillibacter ruminantium
Cedecea lapagei Oscillibacter valericigenes
Citrobacter amalonaticus Oscillospira guilliermondii
Citrobacter freundii Oxalobacter formigenes
Citrobacter koseri Paenibacillus jamilae
Citrobacter youngae Paenibacillus kribbensis
Clostridium acetobutryicum Paenibacillus riograndensis
Clostridium aerotolerans Paeniclostridium sordellii
Clostridium aldenense Parabacteroides distasonis
Clostridium aminophilum Parabacteroides goldsteinii
Clostridium aminovalericum Parabacteroides gordonii
Clostridium amygdalinum Parabacteroides johnsonii
Clostridium asparagiforme Parabacteroides merdae
Clostridium baratii Paraprevotella clara
Clostridium bartlettii Paraprevotella xylaniphila
Clostridium beijerinckii Parasutterella excrementihominis
Clostridium bifermentans Parasutterella secunda
Clostridium bolteae Parvimonas micra
Clostridium butyricum Pediococcus acidilactici
Clostridium celerecrescens Pediococcus pentosaceus
Clostridium cf. saccharolyticum Peptoniphilus duerdenii
Clostridium citroniae Peptoniphilus grossensis
Clostridium clariflavum Peptoniphilus harei
Clostridium clostridioforme Peptoniphilus indolicus
Clostridium cocleatum Peptostreptococcus anaerobius
Clostridium colinum Phascolarctobacterium faecium
Clostridium difficile Phascolarctobacterium succinatutens
Clostridium glycyrrhizinilyticum Porphyromonas asaccharolytica
Clostridium hathewayi Porphyromonas endodontalis
Clostridium herbivorans Porphyromonas gingivalis
Clostridium hiranonis Prevotella bivia
Clostridium hylemonae Prevotella buccae
Clostridium innocuum Prevotella copri
Clostridium lactatifermentans Prevotella disiens
Clostridium lavalense Prevotella marshii
Clostridium leptum Prevotella melaninogenica
Clostridium methoxybenzovorans Prevotella nigrescens
Clostridium methylpentosum Prevotella pallens
Clostridium nexile Prevotella salivae
Clostridium orbiscindens Prevotella stercorea
Clostridium oroticum Prevotella tannerae
Clostridium perfringens Prevotella timonensis
Clostridium polysaccharolyticum Propionibacterium acnes
Clostridium propionicum Propionibacterium avidum
Clostridium ramosum Propionibacterium namnetense
Clostridium rectum Proteus mirabilis
Clostridium saccharogumia Proteus penneri
Clostridium saccharolyticum Providencia alcalifaciens
Clostridium sardiniense Providencia rettgeri
Clostridium saudii Providencia rustigianii
Clostridium scindens Providencia stuartii
Clostridium sordellii Pseudoflavonifractor capillosus
Clostridium sphenoides Ralstonia sp.
Clostridium spiroforme Robinsoniella peoriensis
Clostridium sporogenes Roseburia cecicola
Clostridium sticklandii Roseburia faecis
Clostridium straminisolvens Roseburia hominis
Clostridium symbiosum Roseburia intestinalis
Clostridium tertium Roseburia inulinivorans
Clostridium thermocellum Rothia dentocariosa
Clostridium xylanolyticum Ruminococcus albus
Clostridium xylanovorans Ruminococcus bromii
Collinsella aerofaciens Ruminococcus callidus
Collinsella intestinalis Ruminococcus faecis
Collinsella stercoris Ruminococcus gnavus
Collinsella tanakaei Ruminococcus lactaris
Coprobacillus cateniformis Ruminococcus obeum
Coprobacter fastidiosus Ruminococcus torques
Coprococcus catus Ruthenibacterium lactatiformans
Coprococcus comes Sarcina ventriculi
Coprococcus eutactus Sellimonas intestinalis
Corynebacterium ammoniagenes Senegalimassilia anaerobia
Corynebacterium matruchotii Shigella boydii
Corynebacterium pseudogenitalium Shigella dysenteriae
Corynebacterium tuberculostearicum Shigella flexneri
Deinococcus radiodurans Shigella sonnei
Dermabacter hominis Slackia faecicanis
Desulfotomaculum guttoideum Slackia isoflavoniconvertens
Desulfovibrio legallis Slackia piriformis
Desulfovibrio piger Solobacterium moorei
Dialister invisus Staphylococcus caprae
Dialister microaerophilus Staphylococcus epidermidis
Dialister succinatiphilus Staphylococcus hominis subsp. Hominis
Dielma fastidiosa Staphylococcus lugdunensis
Dorea formicigenerans Staphylococcus warneri
Dorea longicatena Streptococcus agalactiae
Dysgonomonas mossii Streptococcus anginosus
Edwardsiella tarda Streptococcus anginosus subsp. whileyi
Eggerthella lenta Streptococcus australis
Eggerthella sinensis Streptococcus bovis
Eikenella corrodens Streptococcus constellatus subsp. constellatus
Eisenbergiella tayi Streptococcus equinus
Enhydrobacter aerosaccus Streptococcus gallolyticus subsp. pasteuri
Enterobacter aerogenes Streptococcus gallolyticus subsp. pasteurianus
Enterobacter asburiae Streptococcus gordonii
Enterobacter cancerogenus Streptococcus gordonii str. Challis
Enterobacter cloacae Streptococcus infantarius
Enterobacter hormaechei Streptococcus infantarius subsp. coli
Enterobacter kobei Streptococcus infantarius subsp. Infantarius
Enterobacter ludwigii Streptococcus infantis
Enterobacter xiangfangensis Streptococcus lactarius
Enterococcus asini Streptococcus lutetiensis
Enterococcus avium Streptococcus mutans
Enterococcus casseliflavus Streptococcus parasanguinis
Enterococcus durans Streptococcus pasteurianus
Enterococcus faecalis Streptococcus pleomorphus
Enterococcus faecium Streptococcus rubneri
Enterococcus gallinarum Streptococcus salivarius
Enterococcus hirae Streptococcus salivarius subsp. salivarius
Enterococcus mundtii Streptococcus sanguinis
Enterococcus raffinosus Streptococcus thermophilus
Enterococcus raffinosus Streptococcus vestibularis
Erysipelotrichaceae bacterium Subdoligranulum variabile
Escherichia albertii Succinatimonas hippei
Escherichia coli Sutterella parvirubra
Escherichia fergusonii Sutterella stercoricanis
Eubacterium biforme Sutterella wadsworthensis
Eubacterium callanderi Terrisporobacter glycolicus
Eubacterium contortum Turicibacter sanguinis
Eubacterium cylindroides Ureaplasma parvum
Eubacterium desmolans Vagococcus penaei
Eubacterium dolichum Varibaculum cambriense
Eubacterium eligens Veillonella sp.
Eubacterium hadrum Veillonella dispar
Eubacterium hallii Veillonella parvula
Eubacterium infirmum Veillonella rogosae
Eubacterium limosum Veillonella tobetsuensis
Eubacterium oxidoreducens Vibrio cholerae
Eubacterium ramulus Vibrio furnissii
Eubacterium rectale Vibrio mimicus
Eubacterium ruminantium Victivallis vadensis
Eubacterium saburreum Weissella cibaria
Eubacterium siraeum Weissella confusa
Eubacterium sulci Weissella paramesenteroides
Eubacterium tortuosum Xenorhabdus nematophila
Eubacterium ventriosum Yersinia enterocolitica subsp. Palearctica
Eubacterium xylanophilum Yersinia pseudotuberculosis
Eubacterium yurii subsp. Margaretiae
실시예 3: HIF 경로에 영향을 미치는 미생물 균주를 특성화하기 위한 시스템의 예시
실시예 3.1: HIF 경로
저산소증 유도성 인자(HIF) 경로는 세포의 감소된 산소 수준에 대한 다양한 대사 및 생리학적 적응을 매개한다. HIF 경로의 활성화는 적혈구 생성 및 혈관신생을 촉진하여 세포의 산소 요구량을 감소시킨다. HIF 경로는 세포 스트레스 반응에 중요하지만, HIF-1의 구성적 활성화는 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 노인성 황반 변성 및 녹내장 등의 병증에서 신생혈관을 유도한다. 따라서, HIF 경로 조절제의 개발은 안구 신생혈관 질환의 치료에 필수적이다.
HIF-1 경로는 HIF 전사 인자와 음성 조절자인 프롤릴 수산화효소 EGLN으로 구성된다. EGLN은 산소 센서로 기능하며 산소가 있는 경우 HIF α-소단위체(HIFα)를 수산화한다. HIFα 분해를 촉진하는 요인이 여럿 있지만 개중에서도 HIFα의 하이드록실화가 von Hippel-Lindau(VHL) E3 유비퀴틴 리가제에 대한 결합을 유도한다(도 7 참조). 낮은 산소 조건에서 HIFα 단백질은 안정화하며, 낮은 산소 수준에 적응하는 데 필요한 유전자의 전사 활성화를 촉진한다.
실시예 3.2: 구성적 활성 HIF-1이 산란율을 저하시킴
C. elegans에서 egl-9 는 EGLN 상동체를 인코딩한다. egl-9 기능 상실(egl-9 lf) C. elegans 돌연변이의 경우, HIF1α의 상동체인 HIF-1에서 단백질 수준이 안정화된다. 따라서, HIF1 단백질은 HIF-1 전사 표적 유전자의 지속적인 활성을 유도하는 구성적 활성 단백질이다. HIF-1 경로를 조절하는 미생물을 확인하기 위해 egl-9 기능 상실(egl-9 lf) C. elegans 돌연변이를 분석했다. egl-9 lf 돌연변이 C. elegans 는 구성적 활성 HIF-1을 가지므로 제대로 산란하지 못한다. 따라서 성체가 되면 알과 함께 부풀어 오른다.
실시예 3.3: 미생물 균주가 HIF-1 유도 산란 결함에 영향을 미침
HIF-1 조절자는 egl-9 lf 돌연변이체의 산란 결함을 억제하는 능력에 대해 개별 박테리아 균주를 스크리닝하여 확인하였다. 야생형은 시간당 8±2(n=30)개의 알을 낳는 반면, egl-9 lf 돌연변이체는 시간당 2±1(n=30)개의 알을 낳는다. egl-9 lf C. elegans 돌연변이체를 각각의 개별 미생물에 투여하고 각각의 산란율을 측정하였다. 이 분석에서 Gluconacetobacter spp 와 Bifidobacterium spp 는 egl-9 lf C. elegans 돌연변이의 산란율을 각각 11±2(n=25) 및 8±2(n=29)로 유의하게 향상시켰다(표 9). 해당 실시예는 표 9의 미생물 균주가 HIF-1 및 HIF-1 경로를 조절할 수 있고 HIF-1 경로의 변경과 연관이 있는 병증 및 질환 개선에 쓰일 수 있음을 보여준다.
egl-9 lf C. elegans 에 투여 산란율 테스트 대상 동물의 수
E. coli OP50-1 2±1 30
Gluconacetobacter hansenii 11±2 25
Terrisporobacter glycolicus 3±1 32
Coprococcus sp. 1±1 28
L. plantarum 2±2 29
Clostridium butyricum 3±1 31
Paenibacillus barengoltzii 1±2 27
Veillonella atypica 1±1 30
Bifidobacterium 8±2 29
Bacillus subtilis 4±2 28
Acidaminococcus sp 3±2 31
그 외의 실시형태
당업자는 본 개시를 다양하게 변경, 수정 및 개선할 수 있으며, 변경, 수정 및 개선 또한 본 개시의 일부로 간주하고 본 발명의 범위에 속하는 것으로 본다. 전술한 설명 및 도면은 예시일 뿐이며, 본 개시에 기재된 임의의 발명은 모두 하기에 기재한 청구의 범위에 속한다.
당업자는 본원에 기재된 바와 같은 검정 또는 기타 공정에서 수득한 값에 편차 또는 표준오차범위가 있음을 이해한다. 본 발명의 배경을 설명하고 본 발명의 실시에 관한 추가 세부사항을 제공하기 위해 본원에서 인용한 간행물, 웹사이트 및 기타 참고 자료는 전문이 본원에 원용된 것으로 간주한다.
본 발명의 실시형태를 상세하게 설명하였으나, 이는 청구항이 정의하는 본 발명의 범위를 제한하지 않으며, 설명만을 목적으로 한다. 그 외의 양태, 이점, 및 변형은 하기의 청구 범위 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> MARVELBIOME, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR CHARACTERIZING A MICROBIOME <130> 2013404-0023 <140> PCT/US2020/050585 <141> 2020-09-11 <150> 62/988,132 <151> 2020-03-11 <150> 62/899,718 <151> 2019-09-12 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 gtaagtttaa acatatatat actaactaac cctgattatt taaattttca g 51 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 gtaagtttaa acagttcggt actaactaac catacatatt taaattttca g 51 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 gtaagtttaa acatgatttt actaactaac taatctgatt taaattttca g 51 <210> 4 <211> 63 <212> DNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 4 atgactctgc tctaccaagt agggttatta ctccttgtgg cagctactta taaggtgtcg 60 gca 63 <210> 5 <211> 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Claims (84)

  1. 시스템에 있어서,
    복수의 C. elegans 배양물을 포함하며, 각 배양물은 포유동물의 질환 또는 병증을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 복수의 C. elegans 배양물이
    (a) C. elegans 배양물 5개 이상,
    (b) C. elegans 배양물 10개 이상,
    (c) C. elegans 배양물 25개 이상, 또는
    (d) C. elegans 배양물 50개 이상을 포함하는 시스템.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 배양물이 인간 질환 또는 병증을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 배양물이 알츠하이머병을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 시스템.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 배양물이 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있는 질환 또는 병증을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있는 질환 또는 병증이 세포 스트레스 반응을 포함하는 시스템.
  7. 제5항에 있어서, 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있는 질환 또는 병증이 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 노인성 황반변성, 녹내장인 시스템.
  8. 제5항에 있어서, 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있는 질환 또는 병증이 안구 신생혈관 질환인 시스템.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 배양물이 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 또는 돼지 질병 또는 상태를 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 시스템.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 배양물이 리포터 유전자를 가지는 형질전환 유전자를 포함하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 시스템.
  11. 제10항에 있어서, 상기 리포터 유전자가 형광성, 인광성 또는 생물발광성 단백질을 인코딩하는 시스템.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 배양물이 포유동물의 질환 또는 병증과 연관이 있는 관련된 포유동물 유전자를 가지는 형질전환 유전자를 포함하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 시스템.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 배양물이 포유동물의 질환 또는 병증에 연관이 있는 포유동물 DNA 조절요소를 가지는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 시스템.
  14. 제13항에 있어서, 상기 포유동물 DNA 조절요소가 인핸서, 프로모터, 사일런서, 절연인자, 유전자좌 조절부위, 또는 이들의 조합이거나 이들을 포함하는 시스템.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 배양물이 포유동물의 질환 또는 병증을 인코딩하는 형질전환 유전자를 가지는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 시스템.
  16. 제15항에 있어서, 상기 포유동물 RNA 조절요소가 비번역 부위, 인트론, 스플라이스 부위, 또는 이들의 조합이거나 이들을 포함하는 시스템.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 배양물이 동일한 포유동물의 질환 또는 병증을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 시스템.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 전체 배양물이 동일한 포유동물의 질환 또는 병증을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 시스템.
  19. 제 1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 배양물이 동일한 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 시스템.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 배양물이 상이한 포유동물의 질환 또는 병증을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 시스템.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 배양물이 포유동물 마이크로바이옴의 미생물을 포함하는 시스템.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 각 배양물이 포유동물 마이크로바이옴의 미생물을 포함하는 시스템.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 배양물이 인간 마이크로바이옴의 미생물을 포함하는 시스템.
  24. 제23항에 있어서, 각 배양물이 인간 마이크로바이옴의 미생물을 포함하는 시스템.
  25. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 배양물이 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소 또는 돼지 마이크로바이옴의 미생물을 포함하는 시스템.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로바이옴이 피부 마이크로바이옴, 구강 마이크로바이옴, 비강 마이크로바이옴, 위장 마이크로바이옴, 뇌 마이크로바이옴, 폐 마이크로바이옴, 마이크로바이옴, 또는 비뇨생식기 마이크로바이옴인 시스템.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 각 배양물 내의 상기 미생물이 하나 이상의 미생물 균주를 포함하는 시스템.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 각 배양물 내의 상기 미생물이 단일 미생물 균주를 포함하는 시스템.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 배양물이 치료제 또는 영양제를 포함하는 시스템.
  30. 방법에 있어서,
    포유동물 마이크로바이옴으로부터 얻은 미생물을 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 시스템의 배양물 각각에 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 각 배양물에 첨가된 상기 미생물이 하나 이상의 미생물 균주를 포함하는 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 각 배양물 내의 상기 미생물이 단일 미생물 균주를 포함하는 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 마이크로바이옴이 피부 마이크로바이옴, 구강 마이크로바이옴, 비강 마이크로바이옴, 위장 마이크로바이옴, 뇌 마이크로바이옴, 폐 마이크로바이옴, 마이크로바이옴, 또는 비뇨생식기 마이크로바이옴인 시스템.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 배양물이 치료제 또는 영양제를 포함하는 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 각 배양물에서 형질전환 C. elegans 균주의 매개변수 하나 이상을 결정하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 매개변수는 상기 형질전환 C. elegans 균주가 모델링하는 포유동물의 질환 또는 병증과 연관이 있는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 하나 이상의 매개변수가 소분자, 단백질, 폴리펩티드 또는 전사체의 수치를 포함하는 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 하나 이상의 매개변수가 형질전환 C. elegans 균주의 활성도를 포함하는 방법.
  38. 방법에 있어서,
    포유동물 마이크로바이옴의 복수의 미생물 균주를 복수의 C. elegans 배양물에 첨가하는 단계를 포함하고,
    상기 단계에서 상이한 미생물 균주를 각 C. elegans 배양물에 첨가하며,
    각 배양물은 동일한 형질전환 C. elegans 균주를 포함하고, 상기 형질전환 C. elegans 균주는 포유동물의 질환 또는 병증을 모델링하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 복수의 미생물 균주가 각자 상기 형질전환 C. elegans 균주의 매개변수 하나 이상에 영향을 미치지는지의 여부를 판정하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 매개변수는 상기 형질전환 C. elegans 균주가 모델링하는 포유동물의 질환 또는 병증과 연관이 있는 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서,
    C. elegans 배양물에 미생물 균주를 첨가하기에 앞서, 상기 배양물에서의 상기 형질전환 C. elegans 균주의 하나 이상의 매개변수 값을 판정하는 단계와,
    상기 C. elegans 배양물에 상기 미생물 균주를 첨가한 후, 상기 배양물에서의 상기 형질전환 C. elegans 균주의 동일한 하나 이상의 매개변수 값을 판정하는 단계와,
    상기 미생물 균주를 첨가하기 전에 결정한 하나 이상의 매개변수 값을 상기 미생물 균주를 추가한 후에 판정한 하나 이상의 매개변수 값과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 하나 이상의 매개변수가 소분자, 단백질, 폴리펩티드 또는 전사체의 수치를 포함하는 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 매개변수가 형질전환 C. elegans 균주의 활성도를 포함하는 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 마이크로바이옴이 피부 마이크로바이옴, 구강 마이크로바이옴, 비강 마이크로바이옴, 위장 마이크로바이옴, 뇌 마이크로바이옴, 폐 마이크로바이옴, 마이크로바이옴, 또는 비뇨생식기 마이크로바이옴인 시스템.
  44. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 C. elegans 배양물이 치료제 또는 영양제를 포함하는 방법.
  45. 제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 C. elegans 균주가 인간 질환 또는 병증을 모델링하는 방법.
  46. 제 38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 C. elegans 균주가 알츠하이머병을 모델링하는 방법.
  47. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 배양물이 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있는 질환 또는 병증을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있는 질환 또는 병증이 세포 스트레스 반응을 포함하는 방법.
  49. 제47항에 있어서, 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있는 질환 또는 병증이 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 노인성 황반변성, 또는 녹내장인 방법.
  50. 제47항에 있어서, 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있는 질환 또는 병증이 안구 신생혈관 질환인 방법.
  51. 인간 바이옴의 미생물 균주를 특성화하는 방법에 있어서,
    알츠하이머병을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 C. elegans 배양물에 상기 미생물 균주를 첨가하는 단계와,
    상기 미생물 균주가 상기 형질전환 C. elegans 균주의 매개변수 하나 이상에 영향을 미치는지의 여부를 판정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 매개변수는 알츠하이머병과 연관이 있는 방법.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 C. elegans 배양물에 상기 미생물 균주를 첨가하기에 앞서, 상기 배양물에서의 상기 형질전환 C. elegans 균주의 하나 이상의 매개변수 값을 판정하는 단계와,
    상기 C. elegans 배양물에 상기 미생물 균주를 첨가한 후, 상기 배양물에서의 상기 형질전환 C. elegans 균주의 동일한 하나 이상의 매개변수 값을 판정하는 단계와,
    상기 미생물 균주를 첨가하기 전에 결정한 하나 이상의 매개변수 값을 상기 미생물 균주를 추가한 후에 판정한 하나 이상의 매개변수 값과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 형질전환 C. elegans 균주는 인간 ssApoE4 단백질, 인간 Aβ1-42 폴리펩티드, 또는 인간 슈도인산화 타우 단백질을 인코딩하는 형질전환 유전자를 포함하는 방법.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 매개변수는
    (i) C. elegans 마비도,
    (ii) 아밀로이드 플라크 수치,
    (iii) 타우 필라멘트 수치,
    (iv) 신경염증도,
    (v) 프로테아좀 기능도, 또는
    (vi) 이들의 조합을 포함하는 방법.
  55. 인간 바이옴의 미생물 균주를 특성화하는 방법에 있어서,
    변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있는 질환 또는 병증을 모델링하는 형질전환 C. elegans 균주를 포함하는 C. elegans 배양물에 상기 미생물 균주를 첨가하는 단계와,
    상기 미생물 균주가 상기 형질전환 C. elegans 균주의 매개변수 하나 이상에 영향을 미치는지의 여부를 판정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 매개변수는 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있는 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    상기 C. elegans 배양물에 상기 미생물 균주를 첨가하기에 앞서, 상기 배양물에서의 상기 형질전환 C. elegans 균주의 하나 이상의 매개변수 값을 판정하는 단계와,
    상기 C. elegans 배양물에 상기 미생물 균주를 첨가한 후, 상기 배양물에서의 상기 형질전환 C. elegans 균주의 동일한 하나 이상의 매개변수 값을 판정하는 단계와,
    상기 미생물 균주를 첨가하기 전에 결정한 하나 이상의 매개변수 값을 상기 미생물 균주를 추가한 후에 판정한 하나 이상의 매개변수 값과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 형질전환 C. elegans 균주는 인간 프롤릴 히드록실라아제 EGLN, 인간 HIF 전사인자 또는 인간 HIFα 단백질을 인코딩하는 형질전환 유전자를 포함하는 방법.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 매개변수는
    (i) 신경염증도,
    (ii) 프로테아좀 기능도,
    (iii) C. elegans 의 산란율, 또는
    (iv) 이들의 조합을 포함하는 방법.
  59. 포유동물의 질환 또는 병증에 영향을 미치는 미생물 균주에 대해 포유동물 마이크로바이옴을 스크리닝하는 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 시스템의 용도.
  60. 제59항에 있어서, 상기 포유동물 마이크로바이옴이 인간 마이크로바이옴인 용도.
  61. 포유동물 마이크로바이옴의 미생물 균주가 포유동물의 질환 또는 병증에 미치는 영향을 특성화하는 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 시스템의 용도.
  62. 형질전환 C. elegans 균주에 있어서, (i) 인간 ssApoE4, (ii) 인간 Aβ(iii) 인간 슈도인산화 타우, (iv) UbV-GFP 프로테아좀 마커 중 둘 이상을 발현하는 균주.
  63. 표 8에 열거한 미생물 균주 중 하나 이상을 포함하는 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 표 8에 열거한 미생물 균주 중 둘 이상을 포함하는 조성물.
  65. 제63항에 있어서, 표 8에 열거한 미생물 균주 중 다섯 이상을 포함하는 조성물.
  66. 제63항에 있어서, 표 8에 열거한 미생물 균주 중 10개 이상을 포함하는 조성물.
  67. 조성물에 있어서, Gluconacetobacter hansenii, Terrisporobacter glycolicus, Coprococcus sp., L. plantarum, Clostridium butyricum, Paenibacillus sp., Veillonella sp., Bifidobacterium sp., Bacillus subtilis, Acidaminococcus sp., 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
  68. 제67항에 있어서, Gluconacetobacter hansenii, Terrisporobacter glycolicus, Coprococcus sp., L. plantarum, Clostridium butyricum, Paenibacillus sp., Veillonella sp., Bifidobacterium, Bacillus subtilis, Acidaminococcus sp.로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 미생물 균주를 포함하는 조성물.
  69. 제67항에 이어서, Gluconacetobacter hansenii, Terrisporobacter glycolicus, Coprococcus sp., L. plantarum, Clostridium butyricum, Paenibacillus sp., Veillonella sp., Bifidobacterium, Bacillus subtilis, Acidaminococcus sp.로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 5개의 미생물 균주를 포함하는 조성물.
  70. 제67항에 있어서, Gluconacetobacter hansenii, Terrisporobacter glycolicus, Coprococcus sp., L. plantarum, Clostridium butyricum, Paenibacillus sp., Veillonella sp., Bifidobacterium, Bacillus subtilis, Acidaminococcus sp.를 포함하는 조성물.
  71. 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 의약 조성물인 조성물.
  72. 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 섭취 가능한 품목인 조성물.
  73. 대상체의 질환 또는 병증을 치료하는 방법에 있어서, 제63항 내지 제72항 중 어느 한 항의 조성물을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 질환 또는 병증이 신경퇴행성 질환 또는 장애인 방법.
  75. 제73항에 있어서, 상기 질환 또는 병증이 알츠하이머병인 방법.
  76. 제73항에 있어서, 상기 질환 또는 병증이 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있는 방법.
  77. 제73항에 있어서, 상기 질환 또는 병증이 안구 신생혈관 질환 또는 장애인 방법.
  78. 제73항에 있어서, 상기 질환 또는 병증이 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 노인성 황반변성, 또는 녹내장인 방법.
  79. 대상체의 질환 또는 병증에 있어서의 제63항 내지 제72항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  80. 제79항에 있어서, 상기 질환 또는 병증이 신경퇴행성 질환 또는 장애인 용도.
  81. 제79항에 있어서, 상기 질환 또는 병증이 알츠하이머병인 용도.
  82. 제79항에 있어서, 상기 질환 또는 병증이 변경되거나 결함이 있는 HIF-1 경로와 연관이 있는 용도.
  83. 제79항에 있어서, 상기 질환 또는 병증이 안구 신생혈관 질환 또는 장애인 용도.
  84. 제79항에 있어서, 상기 질환 또는 병증이 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 노인성 황반변성, 또는 녹내장인 용도.
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