CN112513260A - 用于改善线粒体功能的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了包含细菌或其代谢物的组合物和方法，所述组合物和方法用于增强线粒体和/或过氧化物酶体功能。

Description

用于改善线粒体功能的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年1月23日提交的美国临时申请No.62/620,641以及2018年8月23日提交的美国临时申请No.62/721,979在35U.S.C.§119(e)下的权益，以引用的方式将其各自的内容整体并入本文。
政府支持
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的基金号AG043181-16A的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本发明的领域涉及用于治疗与线粒体功能障碍相关的疾病的症状的细菌组合物或细菌提取物。
背景技术
线粒体在ATP生成、脂肪酸β-氧化、氨基酸的分解代谢、生酮作用、活性氧(ROS)的生成以及钙稳态中发挥关键作用。线粒体功能障碍与许多人类疾病(包括神经变性和肌肉变性、心血管紊乱、肥胖、糖尿病以及如衰老等的病症)相关。线粒体通过ATP生产下降、ROS生产提高以及激活凋亡途径来促进衰老。线粒体能量产生的下降与氧化应激增加相结合与多种神经退行性疾病(包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病和肌萎缩侧索硬化)有因果关系。此外，对于这些神经退行性疾病中的数种而言，衰老是目前最大的危险因素。无论是主要原因还是次要原因，线粒体功能障碍有望成为鉴别神经退行性疾病的治疗的靶标。随着全球平均预期寿命的增加，在不久的将来受线粒体功能中衰老相关减退影响的人数将大大增加。因此，对于不仅可用于减缓神经退行性疾病、还可作为用于保护或改善老年人群中线粒体功能的预防性措施的新治疗方法，有着急需满足的临床需求。
发明内容
本文所述的方法、组合物和治疗部分基于通过例如增加细胞内能量(例如，ATP)的产生使线粒体功能得到改善的细菌提取物或细菌组合物的发现。因此，本文提供了用于治疗与代谢紊乱、神经退行性紊乱(例如帕金森氏病等)和过氧化物酶体紊乱有关的线粒体功能障碍的细菌提取物和组合物。
本发明大体上涉及活的或灭活的醋杆菌科(Acetobacteriaceae)微生物的成员、微生物组合、提取物、活性级分或代谢物、或者它们的组合在促进、增强和/或恢复线粒体功能中的用途。此类组合物可用于治疗或预防与线粒体功能障碍有关的疾病、发育迟缓以及症状，例如衰老、代谢紊乱、肌肉紊乱和神经退行性疾病。
在一方面中，本文提供了组合物，所述组合物包含测定量的一种或多种细菌，所述细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II(ubiquinol oxidase subunit II)。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的一个实施方式中，所述细菌来自醋杆菌科。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述细菌为Gluconobacter spp.、Acetobacter spp.、Gluconoacaetobacter spp.、Acidomonas spp.、Ameyamaea spp.、Asaia spp.、Granulibacter spp.、Kozakia spp.、Neoasaia spp.、Neokomagataea spp.、Saccharibacter spp.、Swaminathania spp.或Tanticharoeniaspp.，或者这些细菌中两种以上的组合(例如这些细菌中3种以上、4种以上、5种以上、6种以上、7种以上、8种以上、9种以上、10种以上、11种以上或12种以上的组合)。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述细菌为Gluconobacter albidus、蜡状葡糖杆菌(Gluconobacter cerinus)、Gluconobacterfrateruii、日本葡糖杆菌(Gluconobacter japonicus)、Gluconobacter kondonii、Gluconobacter nephelii、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、Gluconoacetobacterdiazotrophicus、汉氏葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter hansenii)、Gluconoacetobactersaccharivorans、醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)或苹果酸醋杆菌(Acetobactermalorum)。在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，细菌为葡糖杆菌EBT405(Gluconobacter EBT 405)。在另一实施方式中，所述组合物包含这些细菌种类中的至少2种以上、至少3种以上、至少4种以上、至少5种以上、至少6种以上、至少7种以上、至少8种以上、至少9种以上、至少10种以上、至少11种以上、至少12种(或每种)。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述核酸序列中的一种或多种为外源性核酸序列。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述细菌包含并表达编码以下每种的核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述测定量的一种或多种细菌为冻干的细菌。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述测定量为当给予至有需要的受试者时有效诱导人细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(PGC)或线粒体转录因子A(TFAM)的表达和/或活性的量。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，有效诱导人细胞中TFAM或PGC的表达和/或活性的量为1×106个细菌。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述组合物进一步包含选自于由以下所组成的组中的一种或多种添加的细菌代谢物：葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述细菌是活的、减毒的或热灭活的。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，将所述组合物配制为食品、饮料、饲料组合物、益生菌、营养补充剂或药物组合物。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述组合物进一步包含益生元(prebiotic)。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述益生元包括低聚果糖、菊粉、低聚异麦芽糖、lactilol、lactosucrose、乳果糖(lactulose)、大豆寡糖、反式低聚半乳糖(transgalactooligosaccharide)或低聚木糖。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，将所述组合物配制用于口服给予。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述组合物为肠溶包衣制剂。
本文提供的另一方面涉及包含治疗有效量的提取物或级分的组合物，所述提取物或级分来源于至少一种细菌，所述细菌包含并表达编码选自于由以下所组成的组中的酶的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的一个实施方式中，所述至少一种细菌包含并表达以下酶中的每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述提取物或级分包含选自于葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸的一种或多种代谢物。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述提取物或级分来自培养基中培养的细菌细胞，所述培养基包含：(i)含有1％葡萄糖的标准溶原性肉汤(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化钠)；(ii)标准Hestrin-Schramm肉汤(D-葡萄糖2％、0.5％酵母提取物、0.5％蛋白胨、0.27％磷酸氢二钠、0.115％柠檬酸)；或者(iii)含有8％葡萄糖、0.5％酵母提取物、0.2％甘露醇、0.05％硫酸镁和10％碳酸钙的CaCO3培养基。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述提取物或级分包含代谢物或细菌副产物，所述代谢物或细菌副产物促进给予所述组合物的宿主哺乳动物的至少一种细胞类型中的ATP生产。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述提取物或级分不包含活的细菌细胞。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述提取物或级分缺乏可检测的细菌。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述提取物或级分进一步包含减毒的或热灭活的细菌。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述细菌来自醋杆菌科。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述细菌为Gluconobacter spp.、Acetobacter spp.、Gluconoacaetobacter spp.、Acidomonas spp.、Ameyamaea spp.、Asaia spp.、Granulibacter spp.、Kozakia spp.、Neoasaia spp.、Neokomagataea spp.、Saccharibacter spp.、Swaminathania spp.或Tanticharoeniaspp.，或这些细菌中两种以上的组合(例如这些细菌中3种以上、4种以上、5种以上、6种以上、7种以上、8种以上、9种以上、10种以上、11种以上或12种以上的组合)。
在本文所述的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述细菌为Gluconobacter albidus、蜡状葡糖杆菌、Gluconobacter frateruii、日本葡糖杆菌、Gluconobacter kondonii、Gluconobacter nephelii、氧化葡糖杆菌、Gluconoacetobacterdiazotrophicus、汉氏葡糖醋杆菌、Gluconoacetobacter saccharivorans、醋化醋杆菌或苹果酸醋杆菌。在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述细菌为葡糖杆菌EBT 405。在另一实施方式中，所述组合物包含这些细菌种类中的至少2种以上、至少3种以上、至少4种以上、至少5种以上、至少6种以上、至少7种以上、至少8种以上、至少9种以上、至少10种以上、至少11种以上、至少12种(或每种)。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述核酸序列中的一种或多种为外源性核酸序列。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，将所述组合物配制为食品、饮料、饲料组合物、营养补充剂或药物组合物。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，将所述组合物配制用于口服给予。
在另一方面，本文还提供了用于增加有需要的受试者的至少一种细胞类型中的细胞ATP生产的方法，所述方法包括向所述受试者给予组合物，所述组合物包含有效增加所述至少一种细胞类型中的细胞ATP生产的量的至少一种细菌或其提取物或级分，所述细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的一个实施方式中，所述至少一种细菌表达以下每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述核酸序列中的一个或多个对所述细菌而言是外源性的。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述一种或多种细胞类型中的线粒体电子传递链的复合物I和/或复合物II的活性增加。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述给予使线粒体膜电位增加。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述受试者为人。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，线粒体转录因子A(TFAM)和/或过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子l-α(PGC-lα)的表达增加。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，AMP激活的蛋白激酶(AMPK)磷酸化水平、核呼吸因子-2(nuclear respiratory factor-2，Nrf2)蛋白水平、PGCαmRNA水平、TFAM mRNA水平和/或线粒体DNA复制得到增加。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，使线粒体DNA拷贝数(mtDNA)增加。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述方法使携带线粒体呼吸复合物I NADH:泛醌还原酶的突变的受试者的发育生长速度增加。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，使至少一种线粒体β-氧化的酶的表达增加。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种线粒体β-氧化的酶为B0303.3、cpt-2、cpt-1、ech-1.2或acdh-7。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，使受试者的寿命增加。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，维持或增加线粒体生物发生(biogenesis)。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，与给予所述组合物前的细胞ATP生产相比，细胞ATP生产增加至少10％。
本文提供的另一方面涉及用于制造细菌提取物的方法，所述方法包括在培养基中对至少一种细菌进行培养，所述至少一种细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II，所述培养基包含：(i)含有1％葡萄糖的标准溶原性肉汤(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化钠)；(ii)标准Hestrin-Schramm肉汤(D-葡萄糖2％、0.5％酵母提取物、0.5％蛋白胨、0.27％磷酸氢二钠、0.115％柠檬酸)；或(iii)含有8％葡萄糖、0.5％酵母提取物、0.2％甘露醇、0.05％硫酸镁和10％碳酸钙的CaCO3培养基。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的一个实施方式中，所述至少一种细菌包含和表达编码以下每种的核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
在另一方面，本文还提供了组合物，所述组合物包含有效增加给予所述组合物的宿主哺乳动物的至少一种细胞类型中的细胞ATP生产的量的葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
本文提供的另一方面涉及组合物，所述组合物包含有效增加给予所述组合物的人受试者的至少一种细胞类型中的过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(PGC)或线粒体转录因子A(TFAM)的表达和/或活性的量的葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的一个实施方式中，所述组合物包含细菌提取物或其活性级分。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，将所述组合物配制为食品、饮料、饲料组合物、营养补充剂或药物组合物。
在另一方面，本文提供了治疗帕金森氏病的方法，所述方法包括向患有帕金森氏病的受试者给予含有治疗有效量的至少一种细菌或其提取物或级分的组合物，从而减轻帕金森氏病的至少一种症状，所述细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的一个实施方式中，所述至少一种细菌表达以下每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种症状选自于由以下所组成的组：震颤、睡眠障碍、活动能力损害、不自主运动、肌强直、节律性肌肉收缩、身体运动缓慢、缓慢的曳行步态、疲劳、头晕、平衡受损、躁动、遗忘、精神混乱、痴呆、认知损害、言语受损、焦虑、情感淡漠、嗅觉失真或丧失、尿失禁、面部表情减少、重量减轻以及便秘。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述细菌为葡糖杆菌EBT 405。
本文提供的另一方面涉及治疗线粒体电子传递链紊乱的方法，所述方法包括向具有线粒体电子传递链紊乱的受试者给予含有治疗有效量的至少一种细菌或其提取物或级分的组合物，从而减轻线粒体电子传递链紊乱的至少一种症状，所述细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的一个实施方式中，所述线粒体电子传递链紊乱包括复合物I和/或复合物II的紊乱或活性受损。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述线粒体电子传递链紊乱为NADH脱氢酶(NADH-CoQ还原酶)缺陷、琥珀酸脱氢酶缺陷、Leigh病、线粒体DNA耗竭或线粒体机能不全(insufficiency)。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种症状选自于由以下所组成的组：肌病、线粒体脑肌病、发育停滞(failure to thrive)、发育迟缓、张力减退、嗜睡、呼吸衰竭、共济失调、肌阵挛、乳酸酸中毒、癫痫发作(seizures)、疲劳、眼球震颤、反射不良、进食或吞咽困难、呼吸困难、共济失调、先天性肌病、婴儿肌病以及肝病。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种细菌表达以下每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
本文提供的另一方面涉及治疗过氧化物酶体紊乱的方法，所述方法包括向具有过氧化物酶体紊乱的受试者给予含有治疗有效量的至少一种细菌或其细菌提取物的组合物，从而减轻过氧化物酶体紊乱的至少一种症状，所述细菌包含一种或多种核酸序列从而使得该细菌表达以下酶：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述过氧化物酶体紊乱为Zellweger综合征谱系(PBD-ZSD)或肢近端型点状软骨发育不良1型(rhizomelicchondrodysplasia punctate type 1，RCDP1)
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述PBD-ZSD为婴儿Refsum病、新生儿肾上腺脑白质营养不良(neonatal adrenoleukodystrophy)或Zellweger综合征。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种症状选自于由以下所组成的组：骨骼和颅面畸形、肝功能障碍、进行性感觉神经性听力损失以及视网膜病变。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种细菌表达以下每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
在另一方面，本文还提供了用于增加细胞线粒体或过氧化物酶体的生物发生的方法，所述方法包括向受试者给予含有有效增加细胞线粒体或过氧化物酶体的生物发生的量的至少一种细菌或其级分或提取物的组合物，所述细菌包含并表达编码以下的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的一个实施方式中，使过氧化物酶体的尺寸和/或数量增加。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的一个实施方式中，使线粒体活性增加。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种细菌表达编码以下的每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
在另一方面，本文还提供了治疗阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括向患有阿尔茨海默氏病的受试者给予含有治疗有效量的至少一种细菌或其提取物或级分的组合物，从而减轻阿尔茨海默氏病的至少一种症状，所述细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的一个实施方式中，所述至少一种细菌表达以下每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述至少一种症状选自于由以下症状所组成的组：认知减退、精神混乱、妄想、定向障碍、健忘、难以集中精神、无法生成新的记忆、无法做简单的数学、无法识别常见物品、攻击性、烦躁、易怒、无意义地重复自己的话、人格改变、躁动、缺乏约束、神志恍惚、愤怒、情感淡漠、普遍的不满、孤独、情绪波动、抑郁、幻觉、偏执、食欲不振、无法组合肌肉运动以及言语混乱。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，所述细菌为葡糖杆菌EBT 405。
本文提供的另一方面涉及含有以下物质的组合物用于治疗帕金森氏病或阿尔茨海默氏病的用途：葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
本文提供的另一方面涉及本文所述的组合物在帕金森氏病或阿尔茨海默氏病的治疗中的用途。
本文提供的另一方面涉及含有以下物质的组合物用于提高细胞ATP生产的用途：葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
本文提供的另一方面涉及如本文所述的组合物用于提高细胞ATP生产的用途。
本文提供的另一方面涉及含有以下物质的组合物用于治疗线粒体电子传递链紊乱或过氧化物酶体紊乱的用途：葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
本文提供的另一方面涉及如本文所述的组合物用于治疗线粒体电子传递链紊乱或过氧化物酶体紊乱的用途。
本文提供的另一方面涉及含有以下物质的组合物用于提高线粒体或过氧化物酶体的细胞生物发生的用途：葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
本文提供的另一方面涉及如本文所述的组合物用于提高线粒体或过氧化物酶体的细胞生物发生的用途。
本文提供的另一方面涉及含有如下物质的组合物用于增加TFAM或过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(PGC-1)的表达和/或活性的用途：葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
本文提供的另一方面涉及如本文所述的组合物用于增加TFAM或过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(PGC-1)的表达和/或活性的用途。
本文提供的另一方面涉及含有测定量的一种或多种细菌的组合物用于治疗或预防阿尔茨海默氏病或帕金森氏病的用途，所述细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
在本文提供的这一方面和所有其它方面的一个实施方式中，所述一种或多种细菌包括葡糖杆菌EBT 405。
定义
术语“患者”、“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，并指为其提供处理(包括预防性处理)的动物，特别是人。本文所使用的术语“受试者”是指人和非人动物。术语“非人动物”和“非人哺乳动物”在本文中可互换使用，并包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，如非人灵长类(特别是高级灵长类)、绵羊、狗、啮齿动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛；以及非哺乳动物，如鸡、两栖动物、爬行动物等。在一个实施方式中，受试者为人。在另一实施方式中，受试者为作为疾病模型的实验动物或动物替代品。在另一实施方式中，受试者为家养动物，包括伴侣动物(例如狗、猫、大鼠、豚鼠、仓鼠等)。本文特别预期的是，受试者可处于任何发育年龄，包括但不限于胎儿、新生儿、婴儿、幼儿、儿童、青少年、成年、绝经后或老年受试者。
本文所使用的“益生元(prebiotic)”是指允许或促进胃肠微生物群的组成和/或活性二者中的特定变化的成分，其能(或不能)赋予宿主益处。在一些实施方式中，益生元可包括以下中的一种或多种：低聚果糖、低聚半乳糖、半纤维素(如阿拉伯木聚糖、木聚糖、木葡聚糖和葡甘露聚糖)、菊粉、几丁质、乳果糖、甘露寡糖、富含果寡糖的菊粉、树胶(如瓜尔胶、阿拉伯胶和角叉菜胶)、果寡糖、oligodextrose、塔格糖、抗性麦芽糊精(如抗性淀粉)、反式低聚半乳糖、果胶(如木糖半乳糖醛酸聚糖(xylogalactouronan)、柑橘果胶、苹果果胶和鼠李半乳糖醛酸聚糖-I)、膳食纤维(如大豆纤维、甜菜纤维、豌豆纤维、玉米麸质和燕麦纤维)和低聚木糖。
本文所使用的术语“给予/给药(administering)”、“引入”和“移植”在以下的上下文中可互换使用：通过使得引入的细胞至少部分定位在期望的部位(例如肠或其区域)的方法或途径将如本文所述的细胞(例如细菌组合物)置于受试者中，从而产生期望的效果(例如线粒体ATP生产增加)。可通过任何导致递送至受试者中的期望位置的合适途径给予细胞，在所述位置中至少所递送的细胞或该细胞的组分的部分保持活力。给予受试者后，细胞的存活期可短至数小时(例如6-24小时)、到数天、到长达数年(即长期植入)。在一些实施方式中，术语“给予/给药”是指包含一种或多种细菌代谢物和/或副产物但缺乏完全活的细菌细胞的细菌提取物或制剂的给予。
本文所使用的“预防(preventing/prevention)”是指由于该方法学的作用而未发生疾病状态的任何方法学(例如本文所述的组合物的给予)。一方面，可理解的是，预防还可意味着疾病的建立未达到未经处理的对照中发生的程度。例如，相对于未经处理的对照，在疾病建立频率方面可存在5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的减少。因此，疾病的预防涵盖相对于未经处理的受试者(例如未经如本文所述的组合物处理的受试者)，受试者将发展出疾病的可能性减少。
“协同作用”或“协同相互作用”是指两种以上微生物或代谢物的相互作用或协作以产生大于它们单独效果之和的组合效果。例如，在一个实施方式中，两种以上微生物之间的“协同作用”可由第一微生物分泌第二微生物用来为生长或其它过程提供养料的废产物或代谢物而产生。
术语“降低(decrease)”、“减少/减轻(reduced/reduction)”或“抑制(inhibit)”在本文都用于指性质、水平或其它参数降低或减小(lessening)统计学上显著的量。在一些实施方式中，“减少/减轻”、“降低”或“抑制”通常意为与参比水平(例如给定的处理不存在)相比降低至少10％，并且可包括例如降低至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％、或更多。本文所使用的“减少/减轻”或“抑制”不涵盖与参比水平相比完全抑制或减少。“完全抑制”是与参比水平相比100％的抑制。降低可优选下降至在无给定紊乱的个体的正常范围内接受的水平。
本文所使用的术语“增加/提高(increased/increase)”或“增强(enhance)”或“激活/活化(activate)”通常意味着性质、水平或其它参数增加统计学上显著的量；为避免任何疑问，术语“增加/提高”或“增强”或“激活/活化”意为与参比水平相比增加至少10％，例如与参比水平相比增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或上至并包括100％的增加、或10％-100％之间的任意增加，或与参比水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加，至少约20倍的增加，至少约50倍的增加，至少约100倍的增加，至少约1000倍的增加，或更多。
术语“药学上可接受的”可指可给予受试者(例如哺乳动物或人)而无过度毒性的化合物和组合物。
本文所使用的术语“药学上可接受的载体”可包括当与活性成分组合时允许该成分保留生物活性并且与受试者的免疫系统基本上是非反应性的(除非期望反应)的任何材料或物质。实例包括但不限于标准药学载体(例如磷酸盐缓冲盐溶液、乳剂(如油/水乳剂)以及多种类型的润湿剂)的任一种。术语“药学上可接受的载体”排除组织培养基和细菌培养基。
本文使用的术语“包含/包括/含有(comprising)”是指除存在的确定的要素外还可存在其它要素。“包含/包括/含有”的使用表示包含而非限制。
本文所使用的术语“基本上由……组成”是指对于给定的实施方式而言所需的那些要素。该术语允许存在实质上不影响本发明的该实施方式的基本以及新颖的或功能性的特性的额外要素。
术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法及其各自的组分，其排除在实施方式的描述中未列举的任何要素。
此外，除非上下文另有要求，单数形式应包括复数，并且复数术语应包括单数。
除在操作实例中或另外指示之处，本文使用的所有表达反应条件或成分的量的数字应被理解为在任何情况下均由术语“约”修饰。当与百分比连接使用时，术语“约”可表示±1％。
附图说明
此专利或申请文件含有至少一个彩色附图。根据必要费用的缴纳以及请求，本专利或专利申请公开的带有彩色附图的副本将由政府机关提供。
图1A-图1H。图1A，葡糖醋杆菌饲养阻抑spg-7(ad2249)、nduf-7(et7)和gas-1(fc21)突变体的发育迟缓表型。图1B，根据使用在所有体细胞中表达荧光素酶的品系进行评估，与用大肠杆菌OP50-1(E.coli OP50-1)饲养的蠕虫相比，葡糖醋杆菌饲养使野生型动物中的ATP含量增加。图1C，根据通过使用生化方法测量内源性ATP水平进行评估，与用大肠杆菌OP50-1饲养的蠕虫相比，葡糖醋杆菌饲养使野生型动物中的ATP含量增加。图1D，葡糖醋杆菌饲养将spg-7(ad2249)动物中的ATP含量恢复至野生型水平。图1E，葡糖醋杆菌饲养将nduf-7(et7)动物中的ATP含量恢复至野生型水平。图1F，根据使用MitoTracker RedCMXRos进行评估，与用大肠杆菌OP50-1饲养的相应突变蠕虫相比，葡糖醋杆菌饲养使spg-7(ad2249)、nduf-7(et7)和gas-1(fc21)突变动物中的线粒体膜电位增加。图1G，与用大肠杆菌OP50饲养并用百草枯处理的动物相比，用Gluconacetobacter spp饲养并用不同剂量的百草枯处理的动物具有显著较高的生物发光水平(ATP水平的替代)。图1H，与用大肠杆菌OP50饲养并用鱼藤酮处理的动物相比，用Gluconacetobacter spp饲养并用不同剂量的鱼藤酮处理的动物具有显著较高的生物发光水平(ATP水平的替代)。
图2A-图2K。图2A，用大肠杆菌OP50饲养并用MPP+或6-OHDA或百草枯处理的蠕虫诱导了线粒体应激报告子hsp-6::gfp表达，而用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫未能诱导GFP表达。图2B，用Gluconacetobacter spp饲养spg-7(ad2249)；tbb-6::gfp动物阻抑了tbb-6::gfp表达的激活。图2C，葡糖醋杆菌饲养阻抑hphd-1::gfp表达。图2D，葡糖醋杆菌饲养使B0303.3::gfp表达增加。图2E，葡糖醋杆菌饲养使prx-11::gfp表达增加。图2F，tcer-1(RNAi)阻抑用Gluconoacetobacter spp饲养的蠕虫中cpt-2::gfp的诱导。图2G，nhr-49(RNAi)阻抑用Gluconoacetobacter spp饲养的蠕虫中acox-1.2::gfp的诱导。图2H，tcer-1(RNAi)阻抑用Gluconoacetobacter spp饲养的蠕虫中ech-1.2::gfp的诱导。图2I，nhr-49(RNAi)阻抑用Gluconoacetobacter spp饲养的蠕虫中acdh-7::gfp的诱导。图2J，nhr-49(RNAi)阻抑用Gluconoacetobacter spp饲养的蠕虫中pmp-4::gfp的诱导。图2K，nhr-49(RNAi)阻制用Gluconoacetobacter spp饲养的蠕虫中prx-6::gfp的诱导。
图3A-图3H。图3A，与用Gluconacetobacter spp饲养的野生型蠕虫相比，用Gluconacetobacter spp饲养饲养的tcer-1(tm1452)和nhr-49(nr2041)动物生长较慢。图3B，tcer-1、nhr-49和prx-5的RNAi阻抑了生物发光表型方面Gluconacetobacter spp饲养诱导的增加。图3C，nhr-49(RNAi)阻抑了用Gluconacetobacter spp饲养的spg-7(ad2249)和nduf-7(et19)突变蠕虫的发育进程加速表型。图3D，prx-5(RNAi)阻抑了用Gluconacetobacter spp饲养的spg-7(ad2249)和nduf-7(et19)突变蠕虫的发育进程加速表型。图3E，根据使用Mito CMXRos进行评估，nhr-49(RNAi)加剧了spg-7(ad2249)突变体的线粒体膜电位降低。图3F，示出了与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比用Gluconacetobacterspp饲养的蠕虫的肌肉中的融合线粒体表型的代表性图，通过使用线粒体靶向的TOM20-RFP融合蛋白进行评估。图3G，示出了通过使用过氧化物酶体靶向的GFP-DAF-22融合蛋白进行评估，用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫的肠中的点状结构(punctate structures)增加的代表性图，表明过氧化物酶体的增加。图3H，根据使用表达HyPer传感器的转基因蠕虫进行评估，用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫具有略低的H2O2水平，表明Gluconacetobacter spp。
图4A-图4I。图4A，随着蠕虫变老，与用大肠杆菌OP50饲养的动物相比，用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫具有显著较高的生物发光水平(ATP水平的替代)。图4B，用大肠杆菌稀释Gluconacetobacter spp诱导显著较高的生物发光水平(ATP水平的替代)。图4C，与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，葡糖醋杆菌菌株(包括汉氏葡糖醋杆菌(MGH分离株)、标准汉氏葡糖醋杆菌ATCC 23769和汉氏葡糖醋杆菌(G.hanseni)ATCC 23769的非产纤维素突变体)诱导显著较高的生物发光水平(ATP水平的替代)。图4D，与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，醋杆菌科(Acetobacteraceae)成员诱导显著较高的生物发光水平(ATP水平的替代)。图4E，与用野生型氧化葡糖杆菌(G.oxydans)饲养的蠕虫相比，用膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶、细胞色素o泛醇氧化酶亚基II和泛醇细胞色素c还原酶铁硫亚基的突变体饲养的蠕虫具有较低的生物发光水平(ATP水平的替代)。图4F，与用野生型氧化葡糖杆菌饲养的蠕虫相比，用膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶、FAD依赖型膜结合脱氢酶和膜结合PQQ依赖型脱氢酶3的缺失突变饲养的蠕虫中的ATP生产降低。图4G，根据通过RT-PCR评估，与模拟(mock)处理的细胞相比，暴露至Gluconacetobacter spp的人原代真皮成纤维细胞中的PGC-1α基因表达增加。图4H，根据通过RT-PCR进行评估，与模拟处理的细胞相比，暴露至Gluconacetobacter spp的人原代真皮成纤维细胞中的TFAM基因表达增加。图4I，与模拟处理的细胞相比，暴露至Gluconacetobacter spp的人原代真皮成纤维细胞中的mtDNA拷贝数增加。
图5A-图5I。图5A，Gluconacetobacter spp、Acetobacter spp和Gluconobacterspp阻抑spg-7(ad2249)的发育迟缓表型。图5B，与用大肠杆菌OP50-1饲养的蠕虫相比，Gluconacetobacter spp、Acetobacter spp和Gluconobacter spp加速野生型动物的发育生长速度。图5C，示出了用Gluconacetobacter spp饲养的野生型蠕虫的发育生长加速的代表性图。图5D，与用大肠杆菌OP50-1饲养的蠕虫相比，用Gluconacetobacter spp饲养的野生型蠕虫稍长。Gluconacetobacter spp饲养减少动物从L1幼虫阶段到达产卵成年阶段所花费的时间。图5E，Gluconacetobacter spp饲养减少动物从L4幼虫阶段到达产卵成年阶段所花费的时间。图5F，开始饲养6小时内Gluconacetobacter spp诱导生物发光(ATP产生的替代)的增加，饲养18小时达最高水平；根据使用TMRE染料进行评估，与用大肠杆菌OP50饲养的动物相比，用Gluconacetobacter spp饲养的spg-7(ad2249)突变体具有显著增加的线粒体膜电位。图5G，与用大肠杆菌OP50饲养并用鱼藤酮或百草枯或叠氮钠处理的动物相比，用Gluconacetobacter spp饲养并用鱼藤酮或百草枯或叠氮钠处理的动物具有显著较高的生物发光水平(ATP水平的替代)。图5H，根据使用TMRE染料进行评估，与用大肠杆菌OP50饲养的动物相比，用Gluconacetobacter spp.饲养的spg-7(ad2249)突变体具有显著增加的线粒体膜电位。图5I，与用大肠杆菌OP50饲养并用鱼藤酮或百草枯或叠氮钠处理的动物相比，用Gluconacetobacter spp饲养并用鱼藤酮或百草枯或叠氮钠处理的动物具有显著较高的生物发光水平(ATP水平的替代)。
图6A-图6L。图6A，与用大肠杆菌OP50饲养的动物相比，用Gluconacetobacter spp饲养的动物对鱼藤酮或百草枯更耐受。图6B，用Gluconacetobacter spp饲养spg-7(ad2249)；tbb-6::gfp动物阻抑了tbb-6::gfp表达的激活。图6C-图6G，与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，葡糖醋杆菌饲养增加cpt-2::gfp(图6C)、acox-1.2::gfp(图6D)、pmp-4::gfp(图6E)、acdh-7::gfp(图6F)、ech-1.2::gfp(图6G)表达。图6H，示出了与用大肠杆菌OP50饲养相比，用葡糖醋杆菌饲养的蠕虫中的B0303.3::gfp表达增加的代表性图。图6I，示出了与用大肠杆菌OP50饲养相比，用葡糖醋杆菌饲养的蠕虫中的acdh-7::gfp表达增加的代表性图。图6J，示出了与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，用葡糖醋杆菌饲养的蠕虫中的acox-1.2::gfp表达增加的代表性图。图6K，示出了与用大肠杆菌OP50饲养相比，用葡糖醋杆菌饲养的蠕虫中的cpt-1::gfp表达增加的代表性图。图6L，示出了与用大肠杆菌OP50饲养相比，用葡糖醋杆菌饲养的蠕虫中的rpt-3::gfp表达无变化的代表性图。
图7A-图7H。图7A，示出了与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，用葡糖醋杆菌饲养的蠕虫中的icl-1::gfp表达增加的代表性图。图7B，葡糖醋杆菌饲养未影响fat-7::gfp的表达。图7C，示出了葡糖醋杆菌饲养未影响UbV-gfp表达，而用硼替佐米(Bortezomib)处理将使UbV-gfp稳定的代表性图。图7D，示出了葡糖醋杆菌饲养未诱导自噬而饥饿诱导自噬的代表性图，使用lgg-1::GFP品系进行评估。图7E，nhr-49的肠特异性过表达足以加速用Gluconacetobacter spp饲养的nhr-49(nr2041)突变体的生长速度。图7F，示出了在用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫中诱导了nhr-49基因表达的代表性图，使用nhr-49::GFP转录融合物进行评估。图7G，示出了与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，肠细胞核中的TCER-1::GFP表达增加的代表性图。图7H，示出了与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，葡糖醋杆菌饲养在蠕虫的皮下组织中诱导了线粒体融合的代表性图，用罗丹明6G染料(其对线粒体进行染色)进行评估。
图8A-图8H。图8A，示出了葡糖醋杆菌饲养未恢复prx-5(RNAi)处理的蠕虫中的过氧化物酶体靶向缺陷的代表性图。图8B，示出了葡糖醋杆菌饲养未影响高尔基体形态或分布的代表性图，通过将GFP靶向至高尔基体的转基因品系进行评估。图8C，示出了葡糖醋杆菌饲养未影响肠道溶酶体形态或分布的代表性图，通过将GFP靶向至溶酶体的转基因品系进行评估。图8D，示出了葡糖醋杆菌饲养未影响内质网(ER)形态或分布的代表性图，通过将GFP靶向至ER的转基因品系进行评估。图8E，根据使用Amplex red测定进行评估，与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，用Gluconacetobacter spp饲养并用H2O2处理的蠕虫具有较低的H2O2水平。图8F，与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，在用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫中谷胱甘肽细胞内浓度未受影响。图8G，示出了醋杆菌科不同成员在CaCO3培养基板中产生的菌落周围的晕圈(Halo)形成的代表性图。图8H，氧化葡糖杆菌转座子突变体无法阻抑秀丽隐杆线虫spg-7(ad2249)(C.elegans spg-7(ad2249))的发育生长缓慢表型。
图9A-图9E。图9A，示出了氧化葡糖杆菌转座子突变体无法阻抑野生型动物的发育生长缓慢表型的代表性图。图9B，膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶、细胞色素o泛醇氧化酶亚基II、泛醇细胞色素c还原酶铁硫亚基和碳氮水解酶的突变体未能在含有CaCO3的培养基板周围形成清晰的晕圈。图9C，多种脱氢酶的缺失等位基因，并发现与用野生型氧化葡糖杆菌饲养的蠕虫相比，用膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶、FAD依赖型膜结合脱氢酶和膜结合PQQ依赖型脱氢酶3的缺失突变饲养的spg-7(ad2249)突变蠕虫生长较慢。图9D，人原代真皮成纤维细胞暴露于大肠杆菌OP50导致ATP生产显著降低，而与模拟处理的细胞相比，Gluconacetobacter spp未影响ATP生产。图9E，即使在较高剂量的细菌下，Gluconacetobacter spp也未降低细胞ATP生产。
图10A-图10B。图10A，在多巴胺能神经元中表达人α-突触核蛋白和GFP的转基因蠕虫从第一幼虫阶段起用大肠杆菌OP50或EBT405饲养，并在L4幼虫阶段进行鱼藤酮处理。箭头示出了CEP神经元的轴突。在鱼藤酮处理的动物中，CEP神经元变性或丢失。图10B，CEP神经元丢失的定量。进行了3个独立试验，每个试验由20-30只动物组成。
图11人Aβ1-42的泛神经元(panneuronal)表达足以诱导肠中的UPRmt报告子phsp-6::gfp。用阴性对照细菌或葡糖醋杆菌EBT405细菌饲养的不表达人Aβ1-42的品系(左侧对照品系)或表达人Aβ1-42的品系(中图和右图)的代表性荧光显微图。所有品系含有phsp-6::gfp和phsp-4::mcherry报告子。尽管在对照品系中仅观测到基础水平的phsp-6::gfp表达(左图)，在携带人Aβ1-42的品系的肠道中GFP被激活(中图)；然而，在用葡糖醋杆菌EBT405细菌饲养的品系中，phsp-6::gfp表达降低。ER未折叠蛋白反应UPRER报告子phsp-4::mcherry仅在受精囊(白色箭头)中被微弱激活。左图的比例尺为200μM。
图12人聚集性tau突变体(aggregative tau mutant)的泛神经元表达足以诱导肠中的UPRmt应激报告子phsp-6::gfp。用阴性对照细菌或EBT405细菌饲养的不表达人tau突变体的品系(左侧对照品系)和表达人tau突变体的品系(中图和右图)的代表性荧光显微图。所有品系含有phsp-6::gfp、phsp-4::mcherry报告子和咽标志物(白色箭头记号)pmyo-2:mcherry。尽管在对照品系中仅观测到基础水平的phsp-6::gfp表达(左图)，在携带人tau突变体的品系的肠道中GFP被激活(中图)；然而，在用葡糖醋杆菌EBT405细菌饲养的品系中，phsp-6::gfp表达降低。此种降低是特异性的，因为咽标志物的表达未受影响。UPRER报告子phsp-4::mcherry仅在受精囊(白色箭头)中被弱激活。左图的比例尺为200μM。
图13示出了HTS策略的示意图。
图14示出了表明EBT 405饲养减少Aβ聚集体的数据。表达缀合有GFP的Aβ3-42肽的CL2331品系的代表性荧光显微图，用阴性对照细菌或EBT405进行饲养，并在L1阶段后60小时进行成像。箭头记号表明淀粉样沉积物。比例尺，200μM。
具体实施方式
本文提供了用于治疗或预防涉及线粒体功能障碍和/或过氧化物酶体功能障碍或者特征在于线粒体功能障碍和/或过氧化物酶体功能障碍的疾病和/或紊乱的方法和组合物。此类组合物包含来自醋杆菌科的一种或多种细菌种类或由其衍生而来的细菌提取物或组分。
线粒体功能/功能障碍以及细胞内ATP生产
线粒体是存在于多数真核细胞中的细胞内细胞器，其主要行使通过氧化磷酸化产生能量(以ATP形式)的功能以用于多种细胞过程。例如，将来源于葡萄糖或脂肪酸代谢的能量转化为ATP，然后将ATP用于驱动多种需要能量的生物合成反应和其它代谢活动。线粒体具有与核DNA分开的它们自己的基因组，在人细胞中包含具有约16,000个碱基对的环状双链DNA。每个线粒体可具有其基因组的多个拷贝，并且个体细胞可具有数百个线粒体。线粒体在三羧酸(TCA)循环、血红素合成、脂肪酸的β-氧化、氨基酸代谢等中发挥作用。此外，线粒体中存在用于维持钙稳态的功能、活性氧产生系统以及代谢物、离子、蛋白质等的转运系统。因此，线粒体在真核细胞的分解代谢和合成代谢反应中均发挥重要作用。
已证明线粒体功能障碍可导致多种疾病。一些线粒体疾病是由于线粒体基因组中的突变或缺失引起的。线粒体以比其宿主细胞更快的周转速率分裂和增殖，并且它们的复制受核基因组的控制。因此，如果细胞中线粒体的阈值比例是有缺陷的，并且如果组织内此类阈值比例的细胞具有有缺陷的线粒体，可导致组织或器官功能障碍的症状。实际上，任何组织都可受影响，并且可表现出多种症状，取决于不同组织涉及的程度。
线粒体疾病最常见于具有高能量需求的器官中，例如脑、心脏、肝、骨骼肌、肾以及内分泌和呼吸系统。甚至线粒体功能的轻度损害可反映为疾病症状。线粒体疾病的症状可包括运动控制丧失、肌肉无力和疼痛、癫痫发作、视觉/听觉问题、心脏疾病、肝疾病、胃肠道紊乱、吞咽困难等。线粒体疾病可为遗传性的，或者可归因于自发突变，其均可导致正常存在于线粒体中的蛋白质或RNA分子的功能改变。
重要的是要注意，本文所述的细菌组合物、提取物和/或组分将在保留至少一些线粒体活性(即使活性是受损的)的受试者的细胞、组织、器官等中具有最好的效果。尽管本文所述的细菌组合物、提取物和/或组分可诱导线粒体和过氧化物酶体生物发生(从而增强总的细胞代谢功能)，但本文所述的组合物的益处被认为是归因于通过电子传递链增强现有的线粒体功能。即，本文所述的组合物不提供用于修复线粒体功能障碍的外源性基因，而是将通过增加线粒体的数量和/增强或每个线粒体内电子传递链的功能来增强线粒体的现有功能。此种功能增强可能部分归因于本文所述的细菌所生成的代谢物。
与受损的线粒体功能相关的疾病还包括例如代谢紊乱、神经退行性紊乱、与衰老相关的紊乱以及慢性炎性紊乱。线粒体紊乱还可包括具有遗传性和/或获得性线粒体功能障碍的疾病，如Charcot-Marie-Tooth病2A2型、线粒体脑病、乳酸酸中毒和中风(MELAS)、Leigh综合征、Barth综合征、Leber氏视神经病变、脂肪酸氧化紊乱、耳聋和失明的遗传性形式、由暴露于有毒化学品和/或药物诱发的代谢异常(例如顺铂诱发的耳聋)。
重申一下，本文所述的方法和组合物并非旨在治愈疾病或紊乱以及受损的线粒体功能，而是可用于减轻与受损的线粒体功能相关的疾病的至少一种症状。即，尽管本文所述的组合物不能修正遗传性线粒体缺陷，它们可用于增强细胞中存在的线粒体功能，即使存在疾病。例如，这可通过增加线粒体数量或增加通过电子传递链(例如在复合物I和复合物III处)的流量来实现。因此在一个实施方式中，与未受影响的受试者相比，待用本文所述的组合物和方法处理的受试者保留至少10％的线粒体和/或过氧化物酶体功能(处理前)。在其它实施方式中，与未受影响的个体相比，该受试者保留至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的线粒体和/或过氧化物酶体功能(处理前)。
本文还考虑了可对保留正常线粒体和/或过氧化物酶体功能的个体进行处理以增强线粒体功能，从而增强表现(例如运动表现)。
在某些实施方式中，与此类处理前的线粒体和/或过氧化物酶体功能相比，本文所述的方法和组合物可使线粒体和/或过氧化物酶体功能增加至少10％(例如通过测量ATP生产进行评估)。在一些实施方式中，与此类处理前的线粒体和/或过氧化物酶体功能相比，线粒体和/或过氧化物酶体功能增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍、或更多。
电子传递链的缺陷：已发现许多疾病涉及线粒体缺陷(例如复合物I、复合物II、复合物III或复合物IV损害)或酶缺陷(例如丙酮酸脱氢酶损害)。复合物I、复合物II、复合物III和复合物IV是嵌于线粒体内膜的蛋白复合物。它们被称为呼吸链，并且通过偶联电子供体(例如NADH)和电子受体(例如O2)之间的电子传递与H+离子的传递而起作用。通过葡萄糖、丙酮酸和NADH(这些都产生于细胞的细胞胞浆中)的氧化，在内膜上产生的电化学质子梯度用来生成三磷酸腺苷(ATP)形式的化学能。该细胞呼吸过程也称为有氧呼吸，依赖于氧的存在。当氧有限时，糖酵解产物将通过厌氧发酵代谢，该过程不依赖于线粒体。与发酵相比，有氧呼吸过程中由葡萄糖生产的ATP高出约13倍。
复合物I-复合物IV沿4个系列的反应携带电子(被称为电子传递链)，引起能量产生。第5组(复合物V)是生成ATP的ATP合酶。电子传递链和ATP合酶一起形成呼吸链，并且整个过程称为氧化磷酸化或OXPHOS。
复合物I缺陷(Complex I deficiency)：复合物I是此链中的第一步，是线粒体异常的最常见部位，占呼吸链缺陷的多达三分之一。复合物I缺陷通常在出生时或儿童早期便表现出来，通常为进行性神经退行性紊乱，并且引起多种临床症状，尤其在需要高能量水平的器官和组织(例如脑、心脏、肝和骨骼肌)中。多种特定线粒体紊乱都与复合物I缺陷相关，包括：Leber氏遗传性视神经病变(LHON)、线粒体肌病、脑病、乳酸酸中毒和中风(MELAS)、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(myoclonic epilepsy with ragged red fibers，MERRF)和Leigh综合征(LS)。
迄今为止，已鉴别出3种主要形式的复合物I缺陷：i)致命婴儿多系统疾病-特征在于肌张力差、发育迟缓、心脏疾病、乳酸酸中毒和呼吸衰竭；ii)肌病(肌肉疾病)-开始于儿童期或成年期，特征在于虚弱或运动不耐受；以及iii)线粒体脑肌病(脑和肌肉疾病)-开始于儿童期或成年期，涉及可变症状的组合，其可包括：眼肌麻痹、色素性视网膜病(伴有视力丧失的视网膜颜色变化)、听觉丧失、感觉神经病变(涉及感觉器官的神经损伤)、癫痫发作、痴呆、共济失调(异常肌肉协调)以及不自主运动。这种形式的复合物I缺陷可能导致Leigh综合征和MELAS。复合物I缺陷的大多数情况是常染色体隐性遗传(来自母亲和父亲的有缺陷的核基因的组合)导致的。不常见的是该紊乱是母系遗传或散发，并且遗传缺陷存在于线粒体DNA中。
在一个实施方式中，与基本上相似的细胞或细胞群中细胞内ATP的水平相比，本文所述的组合物和方法使细胞内ATP水平增加至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少100倍、至少1000倍、或更高，不同之处在于该参比细胞不与本文所述的组合物或代谢物接触。在一个实施方式中，相对于未经此类组合物和方法处理的受试者(或受试者的组)，本文所述的组合物和方法使具有线粒体功能障碍的受试者中的细胞内ATP水平得以恢复。
代谢紊乱：代谢紊乱包括：例如，II型糖尿病、肥胖、高血糖、葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗(即高胰岛素血症、代谢综合征、X综合征)、高胆固醇血症、高血压、高脂蛋白血症、高脂血症(例如血脂异常)、高甘油三酯血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周血管疾病、肾疾病、酮症酸中毒、血栓性紊乱、肾病、糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变、性功能障碍、皮肤病、消化不良、低血糖、代谢综合征、癌症或水肿。尽管本文所述的方法和组合物可能无法解决此类疾病或紊乱的根本原因，由此类方法和组合物提供的对线粒体功能的促进可改善这些疾病或紊乱与线粒体功能障碍或机能不全有关的那些方面。
在本文提供的方法和组合物的一个实施方式中，受试者患有代谢紊乱或易于发展为代谢紊乱。通过本领域已知的方法鉴别患有代谢紊乱或处于发展为代谢紊乱的风险中的受试者。例如，可通过测量例如空腹血糖水平或胰岛素或者通过葡萄糖耐量测试来诊断糖尿病。正常成年人葡萄糖水平为60mg/dl-126mg/dl。正常胰岛素水平为7mU/mL±3mU。在75g口服葡萄糖耐量测试中，通过2小时葡萄糖水平在140mg每dL至199mg每dL(7.8mmol-11.0mmol)来诊断葡萄糖耐受不良。通过空腹血清胰岛素水平大于约60pmol/L来诊断胰岛素抵抗。可通过血糖水平低于2.8mmol/L-3.0mmol/L(50mg/dl-54mg/dl)来诊断低血糖。可通过血压始终处于或高于140/90来诊断高血压。可至少部分地通过测量胆固醇水平(例如LDL、HDL、VLDL等)来诊断心血管疾病。例如，LDL胆固醇高于137以上或总胆固醇高于200表明心血管疾病。通过血糖水平高于10mmol/l(180mg/dl)来诊断高血糖。例如通过体重指数诊断肥胖。另外，测量腰围(估计脂肪分布)、腰臀比(估计脂肪分布)、皮褶厚度(如果在数个部位进行测量，估计脂肪分布)或生物阻抗(基于瘦团块传导电流优于脂肪团块(即脂肪团块阻碍电流)的原理，估计脂肪％)。正常、超重或肥胖个体的参数如下：体重不足：BMI<18.5；正常：BMI18.5-24.9；超重：BMI＝25-29.9。超重个体的特征在于男性腰围>94cm或女性腰围>80cm，并且男性腰臀比≥0.95，女性腰臀比≥0.80。肥胖个体的特征在于BMI为30-34.9，比关于身高的“正常”体重高20％以上，女性体脂百分比>30％、男性>25％，并且男性腰围>102cm(40英寸)或女性腰围>88cm(35英寸)。具有严重或病态肥胖的个体的特征在于BMI≥35。
神经退行性疾病：神经退行性紊乱包括诸如痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿氏病的疾病。
在一个实施方式中，神经退行性紊乱为帕金森氏病。帕金森氏病(PD)为神经退行性运动障碍，其特征在于静止性震颤、僵硬、运动迟缓和姿势不稳。PD症状经典地归因于黑质致密部(SNc)中的多巴胺耗竭以及多巴胺能神经元变性。然而，额外的神经回路受到影响，并且经常表现出非运动性症状，提示系统性病理。存在令人信服的证据表明线粒体功能障碍是该疾病过程中的主要事件。据报道，与PD有关的突变与线粒体动力学具有相互作用的关系。与PD有关的突变可扰乱线粒体动力学，并且通过线粒体动力学可调控这些突变的后果。
在一个实施方式中，通过维持帕金森氏病的症状的恰当控制所需的药理学治疗(例如L-DOPA)的剂量减少来确定帕金森氏病的有效治疗。在另一实施方式中，使用本领域已知的帕金森氏病统一评分量表(UPDRS)来监测治疗的功效。
阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、亨廷顿氏病、弗里德里希氏共济失调、遗传性痉挛性截瘫、脑铁沉积的神经变性(NBIA)以及I型视神经萎缩也都与多种线粒体活性缺陷有关(例如，Lin等，Nature443：787-795(2006))。
炎性疾病：慢性炎性疾病包括如腹腔疾病、血管炎、狼疮、慢性阻塞性肺病(COPD)、肠易激疾病、动脉粥样硬化、关节炎和银屑病的疾病。尽管本文所述的方法和组合物可能无法解决此类疾病或紊乱的根本原因，由此类方法和组合物提供的对线粒体功能的促进可改善这些疾病或紊乱与线粒体功能障碍或机能不全有关的那些方面。
衰老：衰老是与逐渐增加的疾病易感性相关的代谢和生理变化的逐渐积累。在衰老的膜假说(MHA)中，衰老与继发于氧自由基损伤的细胞保护和修复机制的有效性逐渐降低有关。这产生逐渐累积的生化和代谢错误，导致细胞双衰老并最终死亡。因此，MHA认为活性氧(ROS)诱导的细胞膜结构损伤是细胞衰老的主要介体。
ROS是氧化磷酸化的正常副产物，也在缺血、灌注不足以及对环境污染物的响应下形成。ROS(或游离氧自由基)的许多有害活性之一是直接损伤线粒体DNA(mtDNA)。mtDNA损伤的逐渐累积使细胞不能够有效进行氧化磷酸化反应，从而导致生物能缺乏的细胞。线粒体DNA损伤随时间累积并导致细胞功能障碍，继而导致器官衰竭、衰老并最终死亡。另外，存在证据表明与衰老相关的防氧化酶超氧化物歧化酶和过氧化氢酶减少。因此，不仅ROS的有害作用增加，而且用于对抗ROS以及用于有效的线粒体功能所必需的酶和线粒体代谢物减少。
过氧化物酶体紊乱
在一些实施方式中，受试者患有过氧化物酶体紊乱，伴有或不伴有线粒体功能障碍。
过氧化物酶体是细胞内细胞器，其在除红细胞外的所有真核细胞中表达，并在细胞内代谢中发挥重要作用。过氧化物酶体是动态细胞器，其基于不同组织和细胞类型的特定代谢需要而改变形状和数量。过氧化物酶体能够将极长链脂肪酸(very long chainfatty acids)(VLCFA：碳链>22)代谢为可继而进入β-氧化循环的较短的脂肪酸。过氧化物酶体也在细胞内抗氧化活性中发挥作用。
过氧化物酶体也参与脂质(例如胆汁酸、二十二碳六烯酸、ω3脂肪酸和缩醛磷脂，一类特殊的膜磷脂)的合成。尽管单个细胞可在某些条件下在无过氧化物酶体的情况下能够生存，该细胞器对于组织和器官的恰当功能和活力至关重要。过氧化物酶体的重要性在功能性过氧化物酶体的缺乏导致的疾病(称为过氧化物酶体生物发生紊乱或“PBD”)的组中最为明显(Weller等，2003)。
在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物并非旨在治愈过氧化物酶体疾病或紊乱，而是用于减轻与受损的过氧化物酶体功能相关的疾病的至少一种症状。即，尽管本文所述的组合物不能够修正遗传性过氧化物酶体缺陷，它们可用于增强现有的过氧化物酶体功能。例如，这可通过增加过氧化物酶体数量或增加通过过氧化物酶体的代谢途径(例如极长链脂肪酸(VLCFA)的代谢)的流量来实现。因此，在一个实施方式中，与未受影响的受试者的过氧化物酶体功能相比，待用本文所述的组合物和方法处理的受试者保留至少10％的过氧化物酶体功能。在其它实施方式中，与未受影响的个体相比，受试者保留至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的过氧化物酶体功能。
过氧化物酶体生物发生紊乱是紊乱的连续，基于紊乱的严重程度分为3种表型。Zellweger综合征(ZS)为最严重的形式，其次是新生儿肾上腺脑白质营养不良(NALD)(中间形式)，婴儿Refsum病(IRD)为最不严重。具有ZS的儿童早在新生儿期表现出严重的张力减退、面部畸形、肝功能障碍、癫痫发作，并且很少活过其生命的第一年。在生化水平上，实验室测试显示严重的过氧化物酶体代谢缺陷，并且来自这些患者的细胞显示功能性细胞过氧化物酶体几乎不存在。NALD和IRD彼此较难区分，构成多数病例，并且患者可活过成年期。两者均可能在出生后不久存在，但后来通常由于发育迟缓、轻度肝功能障碍以及听觉和视觉损害(使得其被归类为聋盲儿童)而被诊断出。部分NALD-IRD儿童会发展为表现出正常髓磷脂被破坏的脑白质营养不良。他们还可能发展为肾上腺机能不全和骨质减少，后者引起病理骨折。与ZS患者相比，来自NALD-IRD患者的细胞含有更多功能性过氧化物酶体，并且实验室测试显示较强的残余的过氧化物酶代谢。临床特征由过氧化物酶体生成的产物缺乏以及累积的底物(例如极长链脂肪酸)的毒性导致。
这些常染色体隐性疾病来源于过氧化物酶体的功能障碍，并且目前的治疗主要集中在支持性护理、饮食管理、对症治疗以及涉及使用过氧化物酶体药理诱导的治疗策略。向患有过氧化物酶体缺陷的受试者给予如本文所述的细菌或者提取物或代谢物制剂可改善过氧化物酶体活性或功能，从而提供治疗益处。
工程化的细菌
在一些实施方式中，如本文所述的组合物或细菌提取物中的一种或多种包含工程化的微生物。例如，工程化的微生物包括怀有一种或多种引入的遗传改变的微生物，此类改变是细菌染色体或内源性质粒上所含的一个或多个核苷酸的插入、删除、易位或置换或它们的任意组合，其中，所述遗传改变可导致一种或多种蛋白编码基因、非蛋白编码基因、基因调节区或它们的任意组合的改变、破坏、去除或添加，并且其中，此类改变可为两个以上独立的基因组区的融合或者可由合成而来。工程化的微生物可使用包括但不限于以下的技术来生产：定点诱变、转座子诱变、敲除、敲入、聚合酶链式反应诱变、化学诱变、紫外线诱变、转化(以化学方法或通过电穿孔)、噬菌体转导或它们的任何组合。
在一个实施方式中，细菌来自革兰氏阴性细菌的醋杆菌科。醋杆菌科的成员通常根据其在发酵过程中将糖或乙醇氧化以产生醋酸的能力进行分组。在一个实施方式中，细菌为Acetobacter spp.，其不同于醋杆菌科的其它成员，包括Gluconobacter spp.和Gluconoacaetobacter spp.。
在另一实施方式中，细菌为Gluconobacter spp.。Gluconobacter spp.的非限制性实例包括Gluconobacter albidus、Gluconobacter asaii、Gluconobacter cerevisiae、蜡状葡糖杆菌、Gluconobacter frateruii、日本葡糖杆菌、Gluconobacterkanchanaburiensis、Gluconobacter kondonii、Gluconobacter nephelii、氧化葡糖杆菌、Gluconobacter sphaericus、泰国葡糖杆菌(Gluconobacter thailandicus)、Gluconobacter uchimurae、和Gluconobacter wancherniae。
在另一实施方式中，细菌为Gluconacetobacter spp.。Gluconacetobacter spp.的非限制性实例包括Gluconoacaetobacter aggeris、Gluconoacaetobacter asukensis、Gluconoacaetobacter azotocaptans、Gluconoacaetobacter diazotrophicus、Gluconoacaetobacter entanii、Gluconoacaetobacter europaeus、汉氏葡糖醋杆菌、Gluconoacaetobacter intermedius、Gluconoacaetobacter johannae、Gluconoacaetobacter kakiaceti、Gluconoacaetobacter kombuchae、Gluconoacaetobacter liquefaciens、Gluconoacaetobacter maltaceti、Gluconoacaetobacter medellinensis、Gluconoacaetobacter nataicola、Gluconoacaetobacter oboediens、Gluconoacaetobacter rhaeticus、Gluconoacaetobacter sacchari、Gluconoacaetobacter saccharivorans、Gluconoacaetobacter sucrofermentans、Gluconoacaetobacter swingsii、Gluconoacaetobacter takamatsuzukensis、Gluconoacaetobacter tumulicola、Gluconoacaetobacter tumulisoli和Gluconoacaetobacter xylinus。在本文提供的这一方面和所有其它方面的另一实施方式中，细菌为葡糖杆菌EBT 405。
在一些实施方式中，细菌为Gluconobacter albidus、蜡状葡糖杆菌、Gluconobacter frateruii、日本葡糖杆菌、Gluconobacter kondonii、Gluconobacternephelii、氧化葡糖杆菌、Gluconoacetobacter diazotrophicus、汉氏葡糖醋杆菌、Gluconoacetobacter saccharivorans、醋化醋杆菌或苹果酸醋杆菌。
在一些实施方式中，细菌不是醋杆菌科的成员，但其经基因修饰以产生相似的代谢物(例如葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸)。例如，在一些实施方式中，对如本文所述的细菌进行遗传修饰以表达例如以下中的一种或多种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。通过转化或转导将异源性遗传物质引入细菌细胞的方法众所周知，作为非限制性实例包括化学转化、粒子轰击和电穿孔。本领域普通技术人员已知最适合给定细菌的方法。
关于选定的代谢途径酶，提供了以下序列，其可在工程化的细菌中表达。
SEQ ID NO:1>mGDH核苷酸序列
Figure BDA0002694172010000331
SEQ ID NO:2>mGDH蛋白序列
Figure BDA0002694172010000341
SEQ ID NO:3>泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基核苷酸序列
Figure BDA0002694172010000342
SEQ ID NO:4>泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基蛋白序列
Figure BDA0002694172010000343
SEQ ID NO:5>TonB依赖型受体核苷酸序列
Figure BDA0002694172010000351
Figure BDA0002694172010000361
SEQ ID NO:6>TonB依赖型受体蛋白序列
Figure BDA0002694172010000371
SEQ ID NO:7>碳氮水解酶核苷酸序列
Figure BDA0002694172010000372
SEQ ID NO:8>碳氮水解酶蛋白序列
Figure BDA0002694172010000381
SEQ ID NO:9>泛醇氧化酶亚基II核苷酸序列
Figure BDA0002694172010000382
SEQ ID NO:10>泛醇氧化酶亚基II蛋白序列
Figure BDA0002694172010000383
为促进遗传物质(例如质粒、DNA等)转移至细菌，可通过使细菌暴露于特定条件下来诱导人工细胞感受态。例如，一种诱导细胞感受态的方法是通过将细菌在具有二价阳离子(例如氯化钙)的溶液中孵育以部分破坏膜，然后对宿主细胞进行热休克以诱使它们摄取例如质粒DNA。用于诱导细胞感受态的替代方法是电穿孔，其中细胞暴露于电场中，可在细胞膜上生成小孔，从而质粒DNA可进入细胞。
质粒供应的核酸(例如DNA)可稳定地整合至基因组中，或可游离地保持在例如质粒或其它游离载体上。在一些实施方式中，指导本文所述的一种或多种酶表达的序列可置于细胞中天然存在的调节元件的控制下。在其它实施方式中，用于表达膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶以及泛醇氧化酶亚基II中的至少一种的构建体通常将包含调节元件，包括指导编码序列表达的启动子、增强子等。处于一组调节元件的控制下的基因通常被称作与这些元件“可操作地连接”。通常，表达载体包含转录启动子、转基因编码序列和转录终止子。
如本文所述的表达载体或载体是如下核酸分子：其编码基因，当将该分子引入宿主细胞时该基因得以表达。通常，表达载体包含转录启动子、基因编码序列和转录终止子。表达载体中的基因表达通常置于启动子的控制下，并且称此类基因与启动子“可操作地连接”。类似地，如果调节元件调控核心启动子的活性，则该调节元件与该核心启动子可操作地连接。
在一些实施方式中，在转化的细胞中包含阳性标记(其允许对就质粒供应的核酸序列而言为阳性的细胞进行体外选择)可能是有用的。阳性选择标记可为被引入宿主细胞后表达显性表型以允许对携带基因的细胞进行阳性选择的基因。本领域中已知此类型的基因，包括例如抗生素抗性基因(例如对杀稻瘟菌素、霉酚酸、嘌呤霉素、博莱霉素(zeocin)、放线菌素、氨苄青霉素、卡那霉素、新霉素、多粘菌素B硫酸盐或链霉素的抗性)，或将底物转化为有色产物的酶(例如通过表达B-半乳糖苷酶的蓝/白筛选，B-半乳糖苷酶将X-gal转化为半乳糖和不溶性蓝色色素)等。其它选择工具可包括例如对转基因表达的蛋白质具有特异性的标记抗体以及放射性核酸探针。
益生元(Prebiotics)
益生元是不能被细菌宿主(例如人)消化，但可被宿主中的有益细菌发酵并选择性地促进其生长和/或活性的成分或组合物。允许胃肠微生物群的组成和/或活性二者发生特定变化的此类选择性发酵为宿主安康和健康赋予中性或积极的益处。益生元可包括对细菌组合物的存活、定植和持留有用的复合碳水化合物、氨基酸、肽或其它营养组分。
合适的益生元通常是植物来源的复合碳水化合物、寡糖或多糖。通常，益生元是人不可消化或消化不良的，而用作细菌的食物来源。可用于药物剂型以及本文提供的药物组合物和方法的益生元不受限地包括低聚半乳糖(GOS)、反式低聚半乳糖、低聚果糖或果寡糖(FOS)、菊粉、富含果寡糖的菊粉、乳果糖、阿拉伯木聚糖、低聚木糖(XOS)、低聚甘露糖、瓜尔胶、阿拉伯胶、塔格糖、直链淀粉、支链淀粉、木聚糖、果胶、以及它们的组合等。
在一些实施方式中，益生元包含一种或多种非消化性寡糖、非消化性多糖、游离单糖、非消化性糖类、淀粉或非淀粉多糖的混合物。合适的寡糖及其生产方法在Laere KJM，“Degradation of structurally different non-digestible oligosaccharides byintestinal bacteria:glycosylhydrolases of Bi.Adolescentis(2000)”，PhD论文，瓦格宁根农业大学，荷兰，瓦格宁根中有进一步描述。
细菌的培养和储存
关于库存，细菌组合物中包含的菌株可(1)直接分离自样本或从库存的原种中取得；(2)任选地在支持生长以生成可存活的生物质(biomass)的营养琼脂或肉汤中进行培养；以及(3)将所述生物质任选地以多个等分试样保存，以长期储存。
在使用培养步骤的实施方式中，琼脂或肉汤包含提供必需元素的营养物以及使得能够生长的特定因子。实例可为由以下组成的培养基：20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、10g/L大豆蛋白胨、2g/L柠檬酸、1.5g/L磷酸二氢钠、100mg/L柠檬酸铁铵、80mg/L硫酸镁、10mg/L氯化血红素、2mg/L氯化钙和1mg/L甲萘醌。多种微生物培养基及变化在本领域中众所周知(例如R.M.Atlas，Handbook of Microbiological Media(2010)CRC出版)。培养基可在开始时添加至培养中，可在培养过程中添加，或者可在培养整个过程中间歇/连续地流动。细菌组合物中的菌株可单独培养，可作为细菌组合物的亚群进行培养，或者可作为包含细菌组合物的不同物种或菌株的整个群进行培养。作为实例，可在混合的连续培养中将第一菌株与第二菌株以低于任一细胞的最大生长速度的稀释率一起培养，以防止培养出现培养耗竭(washing out of the cultivation)。
将接种的培养物在有利条件下孵育足以建立生物质的时间。对于供人使用的细菌组合物，这通常为在具有类似于正常人微环境(niche)的正常体温(37℃)、pH及其它参数下。可对环境进行主动控制、被动控制(例如经由缓冲液)，或者允许环境漂移。例如，对于厌氧细菌组合物(例如肠道微生物群)，可采用缺氧/还原环境。这可通过向肉汤添加还原剂/因子(如半胱氨酸)和/或除去其的氧气来实现。例如，细菌组合物的培养物可在上述培养基(用1g/L半胱氨酸·HCl预还原)中于37℃、pH 7下生长。
当培养物生成足够的生物质时，可将其保存以用于库存或储存。可将有机体置于防止冷冻(添加“冷冻保护剂(cryoprotectants)”)、干燥(“冻干保护剂(lyoprotectants)”)和/或渗透休克(“渗透保护剂(osmoprotectants)”)的化学环境中，分配至多个容器(任选为相同的)中以创建均一的库存，然后处理培养物以进行保存。容器通常是不可渗透的，并且具有确保与环境隔离的封闭件。冷冻保存处理通过将液体在超低温下(例如在-80℃或低于-80℃下)冷冻来完成。干燥保存通过蒸发(在喷雾干燥或“冷却干燥(cool drying)”的情况下)或者通过升华(例如用于冷冻干燥、喷雾冷冻干燥)从培养物中除去水。除去水改善了细菌组合物在提高至高于低温的温度下的长期储存稳定性。如果细菌组合物包含形成孢子的物种并导致孢子的产生，则可通过额外手段(例如密度梯度离心)对最终组合物进行纯化，并使用上述技术进行保存。可通过单独培养和保存菌株或者通过将菌株混合在一起以创建合并的库，来进行细菌组合物库存。作为冷冻保存的实例，细菌组合物培养物可通过以下收集：离心以使细胞从培养基中沉淀出来，倾倒上清液，并替换为含有15％甘油的新鲜培养肉汤。然后将培养物等分至1mL冻存管中，密封，并放置于-80℃以长期保持活力。该程序使得从冷冻存储中恢复后实现了可接受的活力。
有机体生产可使用与库存类似的培养步骤(包括培养基组成和培养条件)来进行。其可以以较大操作规模进行，尤其是用于临床开发或商业化生产。在较大规模上，在最终培养前可存在数次细菌组合物的亚培养。在培养结束时，收获培养物以使得能够进一步配制成用于给予的剂型。这可能涉及浓缩、不期望的培养基组分的去除和/或引入保存细菌组合物并使它对于经选定途径给予而言可接受的化学环境。例如，可将细菌组合物培养至1010CFU/mL的浓度，然后通过切向流微滤浓缩20倍；可通过渗滤将用过的培养基替换为由2％明胶、100mM海藻糖和10mM磷酸钠盐缓冲液组成的防腐介质。然后可将悬浮液冷冻干燥成粉末并滴定。
干燥后，可将粉末混合至适当的效价，并与其它培养物和/或填充剂(例如微晶纤维素)混合以保持一致性并且易于处理，并如本文所提供配制所述细菌组合物。
在一个实施方式中，将组合物中的细菌细胞的一个或多个群进行共培养。
在一些实施方式中，细菌不在包含0％-5％酵母提取物肉汤的培养基中生长。在其它实施方式中，细菌在含葡萄糖或者另一可代谢单糖(例如果糖)或二糖(例如蔗糖)的0％-5％酵母提取物肉汤中生长，以优化如本文所述的代谢物的生产。在一些实施方式中，葡萄糖或者可代谢的单糖或二糖的浓度为0.5％-5％。在一实施方式中，培养基包含3％酵母提取物肉汤。
在一些实施方式中，将玉米浆加入细菌培养基中以优化代谢物的生产(例如0.5％-5％的玉米浆)。玉米浆是湿玉米碾磨的副产品。它的组分为可溶性蛋白质、氨基酸、碳水化合物、有机酸(例如乳酸)、维生素和矿物质。有时将它与玉米蛋白质饲料(corngluten feed)中的其它成分组合，并广泛用于奶牛和肉牛、家禽、猪的完全饲料以及宠物食品中。一些玉米浆用于醋酸、食品酸的生产以及发酵过程。一些玉米浆在制药工业中用于静脉溶液和药物、最著名的是抗生素(青霉素)的生产。在某些实施方式中，玉米浆的浓度为0.5％-4％、0.5％-3％、0.5％-2％、0.5％-1％、2％-4％、3％、2％-5％、3％-5％、4％-5％、1％-4％或其间的任意范围。在一个实施方式中，玉米浆的浓度为3％。
剂量、给予和剂型
在一些实施例中，在如本文所述的含有细菌或细菌组群(collection)的组合物中可给予例如2×105-5×105个或更多个的范围内(例如1×106、1×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多个)的细胞。细菌的剂量范围取决于效价，并且包括足够大以产生所期望的效果(例如减轻经处理的受试者中与线粒体功能障碍相关的疾病的至少一种症状)的量。剂量不应过大以致引起不能接受的不良副作用。通常，剂量将随病的类型以及患者的年龄、病症和性别而变化。剂量可由本领域技术人员确定，并且在发生任何并发症的情况下也可由个人医师进行调整。
为用于本文所述的多种方面，如本文所述的组合物中的有效量的细胞包含至少1×105个细菌细胞、至少1×106个细菌细胞、至少1×107个细菌细胞、至少1×108个细菌细胞、至少1×109个细菌细胞、至少1×1010个细菌细胞、至少1×1011个细菌细胞、至少1×1012个细菌细胞、或更多个。在本文描述的方面的一些实施方式中，在给予有需要的受试者前，使细菌细胞(例如分离自腐烂的水果)在培养中扩增或维持。在一个实施方式中，由微生物库获得细菌菌株。在一些实施方式中，例如在单个掺合物中一起给予两种以上的细菌菌株。然而，本文特别预期的是两种以上的细菌菌株可作为分开的剂型或者菌株的亚混合物或亚组合进行给予。因此，对于例如3个成员的聚生体(consortium)，可例如以包含全部3个成员的单个制剂(以一个或多个剂量单位，例如一个或多个胶囊)或作为总共包含给定菌株的全部成员的两个以上单独制剂的形式给予聚生体。虽然优选作为单个掺合物给予，但使用例如每种菌株的个体单位的潜在优势是，可通过选择例如一起构成期望的聚生体的单一物种剂量单位的适当组合来定制给予至任意给定受试者的实际菌株(如果需要的话)。
在一些实施方式中，本文所述的组合物可以以含有一种或多种药学上可接受的载体的形式给予。合适的载体在本领域中众所周知，并随组合物的期望形式以及给予方式而变化。例如，药学上可接受的载体可包括稀释剂或赋形剂，例如填充剂、粘结剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、助流剂、润滑剂等。通常，载体可为固体(包括粉末)、液体或它们的组合。优选各载体为在与组合物中的其它成分相容并且对受试者无害的意义上“可接受的”。载体可为生物学上可接受的并且是非活性的(例如它允许组合物保持生物材料的活力，直至被递送至合适的部位)。
口服组合物可包含非活性稀释剂或可食用载体。为口服疗法给药的目的，可将活性化合物与赋形剂合并，并以片剂、糖锭剂(lozenges)、锭剂(pastilles)、含片剂(troches)或胶囊剂(例如明胶胶囊)的形式使用。口服组合物也可通过将本公开的组合物与食品进行组合来制备。在一些实施方式中，可将细菌配制在食品类中。与本文所述的方法和组合物一起使用的食品类的一些非限制性实例包括：冰棒(popsicles)、奶酪、奶油、巧克力、牛奶、肉、饮品、腌制蔬菜、开菲尔(kefir)、味噌(miso)、酸菜等。在其它实施方式中，食品类可为果汁、清爽饮料、茶饮料、饮品制剂、果冻饮料和功能性饮料；酒精饮料，例如啤酒；含碳水化合物的食品，例如大米食品产品、面条、面包和意大利面等；糊类产品，例如鱼类、火腿、香肠、海产品的糊类产品；蒸煮袋(retort pouch)产品，例如咖喱、用浓淀粉酱调味的食品和中式汤(Chinese soups)；汤；乳制品，例如牛奶、乳饮料、冰淇淋和酸奶；发酵产品，例如发酵大豆酱、发酵饮料和泡菜；豆制品；多种糖果产品，包括饼干、曲奇等，糖果，口香糖，软糖，冷甜点，包括果冻、奶油焦糖和冷冻甜点；方便食品，例如速食汤和速食大豆汤等。优选食品制剂在与细菌菌株混合后无需进行烹饪，以免杀灭微生物。
在一个实施方式中，用于给予的食品是冷却的，例如冰调味水。在某些实施方式中，食品类不是潜在的致敏食品类(例如不是大豆、小麦、花生、树坚果、乳制品、蛋类、贝类或鱼类)。药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可作为组合物的部分被包含在内。片剂、丸剂、胶囊剂、含片剂等可含有以下成分中的任一种或类似性质的化合物：粘结剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如褐藻酸(alginic acid)、primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或sterotes；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或者调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯、橙味调味品或其它合适的调味品。这些仅出于示例的目的，并不旨在进行限制。
适于口服给予的制剂可以如下进行提供：离散单元，例如片剂、胶囊剂、扁囊剂、糖浆剂、酏剂、制备好的食品类、微乳剂、溶液、悬浮液、糖锭剂或凝胶包覆的安瓿剂，各自含有预定量的活性化合物；粉剂或颗粒剂；处于水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或者水包油或油包水乳剂。
本文所述的组合物也可以以用于直肠递送的保留灌肠剂或栓剂(例如与常规栓剂基质(如可可脂和其它甘油酯)一起)的形式制备。适用于直肠给予的制剂包括凝胶剂、霜剂、洗剂、水性或油性悬浮液、可分散的粉剂或颗粒剂、乳剂、可溶性固体材料、灌洗剂等。制剂优选以单位剂量栓剂提供，所述栓剂包含处于形成栓剂基质(例如可可脂)的一种或多种固体载体中的活性成分。用于此类制剂的合适载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇类以及它们的组合。替代地，可配制具有本公开的快速再定殖展开剂(deployment agent)的结肠清洗剂以用于结肠或直肠给予。可将组合物用可保护细菌免于从机体快速消除的载体制备，例如控释制剂，包括植入物。可使用可生物降解并生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯(polyorthoesters)和聚乳酸。此类制剂可使用标准技术来制备。所述材料也可从例如Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.商购获得。脂质体悬浮剂也可用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法来制备。
在一些实施方式中，可将组合物封装入胶囊或封装入微胶囊(例如肠溶包衣制剂)。例如，当组合物待口服给予时，配制剂型以使组合物不暴露于小肠前的胃肠道中普遍存在的条件(例如胃中存在高酸度和消化酶)下。肠溶包衣可在低pH值下(例如在胃中)稳定，并可在较高pH值下(例如在小肠中)溶解。可用于肠溶包衣中的材料包括例如褐藻酸、邻苯二甲酸醋酸纤维素、塑料、蜡类、虫胶(shellac)和脂肪酸(例如硬脂酸、棕榈酸)。肠溶包衣例如在美国专利No.5,225,202、5,733,575、6,139,875、6,420,473、6,455,052和6,569,457中有所描述，以引用的方式将其全部以其整体并入本文。肠溶包衣可为水性肠溶包衣。可用于肠溶包衣中的聚合物的实例包括例如虫胶(商品名称EmCoat 120N，Marcoat 125)；邻苯二甲酸醋酸纤维素(商品名称AQUACOATTM、AQUACOAT ECDTM、SEPIFILMTM、KLUCELTM和ETOLOSETM)；聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(商品名称SURETERICTM)；和甲基丙烯酸(商品名称EUDRAGITTM)。用于治疗用途的组合物的封装在本领域中是已知的。封装可包括硬壳胶囊(其可用于干的粉状成分)或软壳胶囊。胶囊可由以下物质的水性溶液制成：胶凝剂，例如动物蛋白(例如明胶)；植物多糖或衍生物，如角叉菜胶、以及淀粉和纤维素的改性形式。可将其它成分添加至胶凝剂溶液中，例如增塑剂(如甘油和/或山梨醇)、着色剂、防腐剂、崩解剂、润滑剂和表面处理。
在一个实施方式中，将本文所述的肠溶包衣益生菌组合物给予受试者。在另一实施方式中，将肠溶包衣益生菌和益生元组合物给予受试者。
细菌组合物或细菌提取物的制剂可通过任何合适的方法制备，通常通过将细菌细胞与液体或精细分裂的固体载体或两者皆有按所需比例均匀且紧密地掺合，然后将得到的混合物成形为期望的形状(如果需要)。在一些实施方式中，在受试者的处理前，将如本文所述的细菌菌株与一种或多种额外的益生菌有机体进行组合。本文所使用的术语“益生菌(probiotic)”是指形成短暂或内源性菌群的至少一部分并由此对宿主有机体表现出有益的预防性和/或治疗性效果的微生物。益生菌在正常情况下是非致病性的，并且包括但不限于美国食品药品监督管理局指定的“公认安全的(GRAS)”那些菌。
包含如本文所述的细菌或细菌聚生体的营养补充剂可包含多种营养剂中的任一种，包括维生素、矿物质、必需氨基酸和非必需氨基酸、碳水化合物、脂质、食材、膳食补充剂、短链脂肪酸等。优选的组合物包含任意组合的维生素和/或矿物质。用于如本文所述的组合物中的维生素可包括维生素B、维生素C、维生素D、维生素E、叶酸、维生素K、烟酸和类似的维生素。在可能被认为对特定的应用有用时，组合物可含有任意或多种维生素，由此维生素含量不应被解释为限制。典型的维生素为例如推荐每日摄入的推荐日用量(RDA，尽管精确的量可能变化)的维生素。组合物可优选包含以下的复合物：RDA维生素、矿物质和微量矿物质、以及无确定的RDA但对健康的人或哺乳动物生理具有有益作用的营养物。优选的矿物质形式可包括例如更容易被乳酸菌代谢的葡萄糖酸盐/酯或柠檬酸盐/酯形式的矿物质形式。如果需要，可采用类似的考虑因素来支持其它类型的细菌。在有关的实施方式中，预期本文所述的组合物包含本文所述的一种或多种细菌或细菌聚生体以及活性乳酸菌和任意待吸收的物质的组合，以此期望确保将材料从胃肠道有效且健康地吸收至血液，所述待吸收的物质包括但不限于营养补充剂、食材、维生素、矿物质、药剂、治疗组合物、抗生素、激素、类固醇以及类似化合物。包含在组合物中的材料的量可根据材料及其吸收的预期目的而广泛地变化，使得该组合物不被认为是限制性的。
本文所述的组合物可以以每日或少于每日的计划表包含约100mg-约100g、或者约500mg-约50g、或者约1g-约40g的益生元。
在细菌组合物给予前，患者可任选地具有使用抗生素的预治疗方案以使胃肠道准备进行接收细菌组合物。在某些实施方式中，例如当患者具有高适应力(resilient)病原体的急性感染时，预治疗方案是可取的。在其它实施方式中，例如当患者不具有病原体感染时，或者例如当引起感染的病原体不具有适应力，或患者曾患有急性感染不过已被成功治疗，但医师担心感染可能再次发生时，预治疗方案是完全可选的。在这些情况下，预治疗方案可增强细菌组合物影响患者的微生物组和/或增强治疗结果的能力。在可选实施方式中，不用抗生素对受试者进行预治疗。
作为使患者准备进行治疗性微生物给药的一种方式，可给予至少一种抗生素以改变患者中的细菌。作为使患者准备进行给药的另一方式，可向患者给予标准结肠清洁制剂以基本上排空结肠的内容物，例如用于使患者准备进行结肠镜检查。“基本上排空结肠内容物”是指去除结肠内容物的通常体积的至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或约100％。抗生素治疗可先于结肠清洁方案。
如果患者已接受用于感染治疗的抗生素，或者如果患者已接受抗生素作为特定预治疗方案的部分，在一个实施方式中抗生素应停药足够的时间以使得在给予细菌组合物前抗生素在肠道中的浓度大幅降低。在一个实施方式中，可在细菌组合物给药前1天、2天或3天停用抗生素。在一个实施方式中，在细菌组合物给药前，抗生素可停用3个、4个、5个、6个或7个抗生素半衰期。如果预治疗方案是急性感染治疗的部分，则可对抗生素进行选择，以使得感染对抗生素敏感，但所给予的细菌组合物中的组成成分对该抗生素不敏感。
本文所述的任何制剂可在单个时间或多个时间给予一次，例如每日一次连续数日或者给药当日一日多于一次(包括每日两次、每日三次或多达每日五次)。或可按照设定的计划表间歇性地给予制剂，例如每周一次、每月一次或者当患者原来的病复发时。在另一实施方式中，可长期给予制剂以确保保护性或治疗性效果的维持。注意，尽管上文和本文其它地方的描述涉及用于细菌递送的制剂，包含由此类细菌生产的代谢物的制剂可以以类似的方式制备和给予。
排除的细菌：如本领域技术人员容易理解的，如本文所述的用于疾病治疗的组合物在理想情况下不包含一种或多种致病性细菌。在一个实施方式中，如本文所述的组合物(例如细菌提取物或益生菌组合物)不包含通常分类为致病性或机会性有机体的有机体。给定分类群的所有成员共有的功能可能对例如提供特定的代谢物有益，但由于其它原因，所述群中的一个或多个特定成员的整体效果并非是有益的，并且例如是致病性的。显然，本文所述的治疗性或预防性方法和组合物排除引起发病机理(例如急性胃肠道病理)的给定分类群的成员。
在一个实施方式中，细菌组合物不包含以下中的至少一种：肠氨基酸球菌(Acidaminococcus intestinalis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、Raoultella sp.和缓症链球菌(Streptococcus mitis)。在另一实施方式中，细菌组合物不包含这些菌中的任一种。
在另一实施方式中，细菌组合物不包含以下中的至少一种：Barnesiellaintestinihominis；罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)；Enterococcus hirae、屎肠球菌(Enterococus faecium)或耐久肠球菌(Enterococcus durans)；Anaerostipescaccae；Clostridium indolis；沃氏葡萄球菌(Staphylococcus wameri)或巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)；和Adlercreutzia equolifaciens。在另一实施方式中，细菌组合物不包含这些菌中的任一种。
在另一实施方式中，细菌组合物不包含以下中的至少一种：肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、尸毒梭菌(Clostridium cadaveris)、鸣疽梭状芽菌(Clostridium chauvoei)、梭状梭菌(Clostridium clostridioforme)、匙形梭菌(Clostridium cochlearium)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、溶血梭菌(Clostridium haemolyticum)、矛形梭菌(Clostridium hastiforme)、溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)、Clostridium indolis、不规则梭菌(Clostridiumirregulare)、泥渣梭菌(Clostridium limosum)、恶名梭菌(Clostridiummalenominatum)、诺维氏梭菌(Clostridium novyi)、乳清酸梭菌(Clostridiumoroticum)、类腐败梭菌(Clostridium paraputrificum)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、毛状梭菌(Clostridium piliforme)、腐化梭菌(Clostridiumputrefaciens)、腐败梭菌(Clostridium putrificum)、败毒梭菌(Clostridiumsepticum)、索氏梭菌(Clostridium sordellii)、楔形梭菌(Clostridium sphenoides)以及破伤风梭菌(Clostridium tetani)。在另一实施方式中，细菌组合物不包含这些菌中的任一种。
在另一实施方式中，细菌组合物不包含大肠杆菌(Escherichia coli)和约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)中的至少一种。在另一实施方式中，细菌组合物不包含这些菌中的任一种。
在另一实施方式中，细菌组合物不包含无害梭菌(Clostridium innocuum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)和Blautia producta(先前称为Peptostreptococcusproductus)中的至少一种。在另一实施方式中，细菌组合物不包含这些菌中的任一种。
在另一实施方式中，细菌组合物不包含真细菌界(Eubacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、丙酸杆菌属(Propionibacteria)、大肠杆菌和Gemmiger中的至少一种。
在另一实施方式中，本文所述的组合物不包含以下属中的致病性细菌：耶尔森氏菌属(Yersinia)、弧菌属(Vibrio)、密螺旋体属(Treponema)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、志贺氏杆菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)、立克次氏体属(Rickettsia)、东方体属(Orientia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、支原体属(Mycoplasma)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、李斯特氏菌属(Listeria)、钩端螺旋体属(Leptospira)、军团菌属(Legionella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、螺杆菌属(Helicobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、埃希氏菌属(Escherichia)、埃里希氏体属(Ehrlichia)、肠球菌属(Enterococcus)、柯克斯氏体属(Coxiella)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、衣原体属(Chlamydia)、嗜衣原体属(Chlamydophila)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、布鲁氏菌属(Brucella)、疏螺旋体属(Borrelia)、博德特氏菌属(Bordetella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、多药耐药细菌(multi-drug resistantbacteria)、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌属(extended spectrum beta-lactamresistant Enterococci，ESBL)、碳青霉烯耐药性肠杆菌科(Carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE)或万古霉素内药性肠球菌(vancomycin-resistantEnterococci，VRE)。
在其它实施方式中，本文所述的组合物不包含致病性物种或菌株，例如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肠聚集性大肠杆菌(enteroaggregative Escherichia coli)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli)、肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive Escherichia coli)、肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenicEscherichia coli，例如但不限于LT和/或ST)、大肠杆菌0157:H7、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellia pneumonia)、单核细胞增生李斯特氏菌(Lysteria monocytogenes)、类志贺邻单胞菌、Salmonella spp、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)Shigella spp.、Staphylococcus spp.、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、vancomycin-resistant enterococcus spp.、Vibrio spp.、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、或小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)。
在一个实施方式中，如本文所述的细菌组合物或制剂不包含肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)或沃氏嗜胆菌(Bilophila wadsworthia)。
功效测量
本文使用的术语“有效量”是指缓解与线粒体功能障碍相关的疾病的至少一种或多种症状所需的细菌细胞的群或者它们的组分或代谢物的量，并且涉及足以提供期望的效果的组合物的量。本文使用的有效量还包括足以预防或延缓疾病症状的发展、改变疾病症状的进程(例如但不限于减缓疾病(例如肌病)症状的进展)或将疾病症状逆转的量。可理解的是，对于任何给定的情况，适当的“有效量”可由本领域普通技术人员使用常规实验法来确定。考虑到机体的复杂性以及细胞建立的性质，不同患者之间的细胞的“有效量”可能有所不同，但事后可容易地确定给予的细胞的量是否确实为“有效量”。因此，可相应地修改进一步的治疗。注意，长期定植或建立(虽然通常期望如此)对于有效治疗不是必需的，因为定期给药也可实现有效治疗。
治疗的功效可由熟练的临床医生确定。然而，如果在用包含如本文所述的细菌细胞或细菌提取物的组合物治疗后，与线粒体功能障碍相关的疾病的任一种或所有症状或者其它临床上认可的症状或标志物减少例如至少10％，则该治疗被视为本文所使用的术语“有效治疗”。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文有所描述。
在一个实施方式中，通过维持对与线粒体功能障碍相关的疾病的症状的恰当控制所需的常规药理治疗的剂量减少来确定有效治疗。
在一些实施方式中，使用一种或多种额外的诊断程序对受试者进行进一步评价，例如通过医学成像、物理检查、实验室测试、临床病史、家族病史、基因测试等。医学成像是本领域众所周知的。因此，医学成像可选自任何已知的成像方法，包括但不限于超声波、计算机断层摄影扫描、正电子发射断层摄影、光子发射计算机断层摄影和磁共振成像。
本发明可如以下编号的段落中的任一项所述：
1.一种组合物，所述组合物包含测定量的一种或多种细菌，所述一种或多种细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
2.如段落1所述的组合物，其中，所述细菌来自醋杆菌科。
3.如段落2所述的组合物，其中，所述细菌为Gluconobacter spp(例如葡糖杆菌EBT 405)、Acetobacter spp.、Gluconoacaetobacter spp.、Acidomonas spp.、Ameyamaeaspp.、Asaia spp.、Granulibacter spp.、Kozakia spp.、Neoasaia spp.、Neokomagataeaspp.、Saccharibacter spp.、Swaminathania spp.或Tanticharoenia spp.。
4.如段落1-3中任一段所述的组合物，其中，所述核酸序列中的一种或多种为外源性核酸序列。
5.如段落1-4中任一段所述的组合物，其中，所述细菌包含并表达编码以下每种的核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
6.如段落1-5中任一段所述的组合物，其中，所述测定量的一种或多种细菌为冻干的细菌。
7.如段落1-6中任一段所述的组合物，其中，所述测定量为当给予有需要的受试者时有效诱导人细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(PGC)或线粒体转录因子A(TFAM)的表达和/或活性的量。
8.如段落7所述的组合物，其中，有效诱导人细胞中PGC或TFAM的表达和/或活性的量为至少1×106个细菌。
9.如段落1-8中任一段所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含选自于由以下所组成的组中的一种或多种添加的细菌代谢物：葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
10.如段落1-9中任一段所述的组合物，其中，所述细菌是活的、减毒的或热灭活的。
11.如段落1-10中任一段所述的组合物，其中，将所述组合物配制为食品、饮料、饲料组合物、益生菌、营养补充剂或药物组合物。
12.如段落1-11中任一段所述的组合物，所述组合物进一步包含益生元。
13.如段落12所述的组合物，其中，所述益生元包括低聚果糖、菊粉、低聚异麦芽糖、lactilol、lactosucrose、乳果糖、大豆寡糖、反式低聚半乳糖或低聚木糖。
14.如段落1-13中任一段所述的组合物，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
15.如段落1-14中任一段所述的组合物，其中，将所述组合物配制用于口服给予。
16.如段落15所述的组合物，其中，所述组合物为肠溶包衣制剂。
17.一种组合物，所述组合物包含治疗有效量的提取物或级分，所述提取物或级分来源于至少一种细菌，所述至少一种细菌包含并表达编码选自于由以下所组成的组中的酶的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
18.如段落17所述的组合物，其中，所述至少一种细菌包含并表达以下酶的每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
19.如段落17或18所述的组合物，其中，所述提取物或级分包含选自于葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸的一种或多种代谢物。
20.如段落17-19中任一段所述的组合物，其中，所述提取物或级分来自培养基中培养的细菌细胞，所述培养基包含：(i)含有1％葡萄糖的标准溶原性肉汤(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化钠)；
(ii)标准Hestrin-Schramm肉汤(2％D-葡萄糖、0.5％酵母提取物、0.5％蛋白胨、0.27％磷酸氢二钠、0.115％柠檬酸)；或
(iii)含有8％葡萄糖、0.5％酵母提取物、0.2％甘露醇、0.05％硫酸镁和10％碳酸钙的CaCO3培养基。
21.如段落17-20中任一段所述的组合物，其中，所述提取物或级分包含代谢物或细菌副产物，所述代谢物或细菌副产物促进给予所述组合物的宿主哺乳动物的至少一种细胞类型中的ATP生产。
22.如段落17-21中任一段所述的组合物，其中，所述提取物或级分不包含活的细菌细胞。
23.如段落17-22中任一段所述的组合物，其中，所述提取物或级分缺乏可检测的细菌。
24.如段落17-23中任一段所述的组合物，其中，所述提取物或级分进一步包含减毒的或热灭活的细菌。
25.如段落17-24中任一段所述的组合物，其中，所述细菌来自醋杆菌科。
26.如段落25所述的组合物，其中，所述细菌为Gluconobacter spp.(例如葡糖杆菌EBT 405)、Acetobacter spp.、Gluconoacaetobacter spp.、Acidomonas spp.、Ameyamaea spp.、Asaia spp.、Granulibacter spp.、Kozakia spp.、Neoasaia spp.、Neokomagataea spp.、Saccharibacter spp.、Swaminathania spp.或Tanticharoeniaspp.。
27.如段落17-26中任一段所述的组合物，其中，所述核酸序列中的一种或多种为外源性核酸序列。
28.如段落17-27中任一段所述的组合物，其中，将所述组合物配制为食品、饮料、饲料组合物、营养补充剂或药物组合物。
29.如段落17-28中任一段所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
30.如段落17-29中任一段所述的组合物，其中，将所述组合物配制用于口服给予。
31.用于增加有需要的受试者的至少一种细胞类型中的细胞ATP生产的方法，所述方法包括向所述受试者给予组合物，所述组合物包含有效增加至少一种细胞类型中的细胞ATP生产的量的至少一种非致病性细菌或其提取物或级分，所述非致病性细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
32.如段落31所述的方法，其中，所述至少一种细菌表达以下每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
33.如段落31-32中任一段所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
34.如段落31-33中任一段所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
35.如段落31-34中任一段所述的方法，其中，所述核酸序列中的一种或多种对所述细菌而言是外源性的。
36.如段落31-35中任一段所述的方法，其中，所述一种或多种细胞类型中的线粒体电子传递链的复合物I和/或复合物II的活性增加。
37.如段落31-36中任一段所述的方法，其中，所述给予使线粒体膜电位增加。
38.如段落31-37中任一段所述的方法，其中，所述受试者为人。
39.如段落31-38中任一段所述的方法，其中，过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子l-α(PGC-lα)和/或线粒体转录因子A(TFAM)的表达增加。
40.如段落31-39中任一段所述的方法，其中，AMP激活的蛋白激酶(AMPK)磷酸化水平、核呼吸因子-2(Nrf2)蛋白水平、PGCαmRNA水平、TFAM mRNA水平和/或线粒体DNA复制增加。
41.如段落31-40中任一段所述的方法，其中，使线粒体DNA拷贝数(mtDNA)增加。
42.如段落31-41中任一段所述的方法，其中，所述方法使携带线粒体呼吸复合物INADH:泛醌还原酶的突变的受试者的发育生长速度增加。
43.如段落31-42中任一段所述的方法，其中，使至少一种线粒体β-氧化的酶的表达增加。
44.如段落43所述的方法，其中，所述至少一种线粒体β-氧化的酶为B0303.3、cpt-2、cpt-1、ech-1.2或acdh-7。
45.如段落31-44中任一段所述的方法，其中，使所述受试者的寿命增加。
46.如段落31-45中任一段所述的方法，其中，维持或增加线粒体生物发生。
47.如段落31-46中任一段所述的方法，其中，与给予所述组合物前的细胞ATP生产相比，细胞ATP生产增加至少10％。
48.一种用于制造细菌提取物的方法，所述方法包括在培养基中对至少一种细菌进行培养，所述细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II，所述培养基包含：(i)含有1％葡萄糖的标准溶原性肉汤(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化钠)；(ii)标准Hestrin-Schramm肉汤(2％D-葡萄糖、0.5％酵母提取物、0.5％蛋白胨、0.27％磷酸氢二钠、0.115％柠檬酸)；或(iii)含有8％葡萄糖、0.5％酵母提取物、0.2％甘露醇、0.05％硫酸镁和10％碳酸钙的CaCO3培养基。
49.如段落48所述的方法，其中，所述至少一种细菌包含并表达编码以下每种的核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
50.如段落48或49的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
51.一种组合物，所述组合物包含有效增加给予所述组合物的宿主哺乳动物的至少一种细胞类型中的细胞ATP生产的量的葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
52.一种组合物，所述组合物包含有效增加给予所述组合物的人受试者的至少一种细胞类型中的线粒体转录因子A(TFAM)或过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(PGC)的表达和/或活性的量的葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
53.如段落51或52所述的组合物，其中，所述组合物包含细菌提取物或其活性级分。
54.如段落51、52或53所述的组合物，其中，将所述组合物配制为食品、饮料、饲料组合物、营养补充剂或药物组合物。
55.一种治疗帕金森氏病的方法，所述方法包括向患有帕金森氏病的受试者给予含有治疗有效量的至少一种细菌或其提取物或级分的组合物，从而减轻帕金森氏病的至少一种症状，所述细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
56.如段落55所述的方法，其中，所述至少一种细菌表达以下每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
58.如段落55或56所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
59.如段落55-58中任一段所述的方法，其中，(i)所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种，和/或(ii)所述细菌包括葡糖杆菌EBT 405。
60.如段落55-59中任一段所述的方法，其中，所述至少一种症状选自于由以下所组成的组：震颤、睡眠障碍、活动能力损害、不自主运动、肌强直、节律性肌肉收缩、身体运动缓慢、缓慢的曳行步态、疲劳、头晕、平衡受损、躁动、遗忘、精神混乱、痴呆、认知损害、言语受损、焦虑、情感淡漠、嗅觉失真或丧失、尿失禁、面部表情减少、重量减轻以及便秘。
61.一种治疗线粒体电子传递链紊乱的方法，所述方法包括向具有线粒体电子传递链紊乱的受试者给予含有治疗有效量的至少一种细菌或其提取物或级分的组合物，从而减轻所述线粒体电子传递链紊乱的至少一种症状，所述细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
62.如段落61所述的方法，其中，所述线粒体电子传递链紊乱包括复合物I和/或复合物II的活性受损或紊乱。
63.如段落61或62所述的方法，其中，所述线粒体电子传递链紊乱为NADH脱氢酶(NADH-CoQ还原酶)缺陷、琥珀酸脱氢酶缺陷、Leigh病、线粒体DNA耗竭或线粒体机能不全。
64.如段落61-63中任一段所述的方法，其中，所述至少一种症状选自于由以下所组成的组：肌病、线粒体脑肌病、发育停滞、发育迟缓、张力减退、嗜睡、呼吸衰竭、共济失调、肌阵挛、乳酸酸中毒、癫痫发作、疲劳、眼球震颤、反射不良、进食或吞咽困难、呼吸困难、共济失调、先天性肌病、婴儿肌病以及肝病。
65.如段落61-64中任一段所述的方法，其中，所述至少一种细菌表达以下每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
66.如段落61-65中任一段所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
67.如段落61-66中任一段所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
68.一种治疗过氧化物酶体紊乱的方法，所述方法包括向具有过氧化物酶体紊乱的受试者给予含有治疗有效量的至少一种细菌或其细菌提取物的组合物，从而减轻所述过氧化物酶体紊乱的至少一种症状，所述细菌包含一种或多种核酸序列以使得所述细菌表达以下酶：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
69.如段落68所述的方法，其中，所述过氧化物酶体紊乱为Zellweger综合征谱系(PBD-ZSD)或肢近端型点状软骨发育不良1型(RCDP1)
70.如段落68或69所述的方法，其中，所述PBD-ZSD为婴儿Refsum病、新生儿肾上腺脑白质营养不良或Zellweger综合征。
71.如段落68-70中任一段所述的方法，其中，所述至少一种症状选自于由以下所组成的组：骨骼和颅面畸形、肝功能障碍、进行性感觉神经性听力损失以及视网膜病变。
72.如段落68-71中任一段所述的方法，其中，所述至少一种细菌表达以下每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
73.如段落68-72中任一段所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
74.如段落68-73中任一段所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
75.一种用于增加细胞线粒体或过氧化物酶体的生物发生的方法，所述方法包括向受试者给予含有有效增加细胞线粒体或过氧化物酶体的生物发生的量的至少一种细菌或其级分或提取物的组合物，所述细菌包含并表达编码以下的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
76.如段落75所述的方法，其中，使过氧化物酶体的尺寸和/或数量增加。
77.如段落75或76所述的方法，其中，使线粒体活性增加。
78.如段落75、76或77所述的方法，其中，所述至少一种细菌表达以下每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
79.如段落75-78中任一段所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
80.如段落75-79中任一段所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
81.一种治疗阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括向患有阿尔茨海默氏病的受试者给予含有治疗有效量的至少一种细菌或其提取物或级分的组合物，从而减轻阿尔茨海默氏病的至少一种症状，所述细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
82.如段落81所述的方法，其中，所述至少一种细菌表达以下每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
83.如段落81或82所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
84.如段落81、82或83所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
85.如段落81-84中任一段所述的方法，其中，所述至少一种症状选自于由以下所组成的组：认知减退、精神混乱、妄想、定向障碍、健忘、难以集中精神、无法生成新的记忆、无法做简单的数学、无法识别常见物品、攻击性、烦躁、易怒、无意义地重复自己的话、人格改变、躁动、缺乏约束、神志恍惚、愤怒、情感淡漠、普遍的不满、孤独、情绪波动、抑郁、幻觉、偏执、食欲不振、无法组合肌肉运动以及言语混乱。
86.如段落81-85中任一段所述的方法，其中，所述细菌包括葡糖杆菌EBT 405。
实施例
以下提供了证明并支持如本文所述的技术的非限制性实例。
实施例1：结果
使用定性可视化屏幕鉴别了阻抑秀丽隐杆线虫(C.elegans)的3种线粒体突变体spg-7(ad2249)1、gas-1(fc21)2和nduf-7(et19)3的发育生长速度缓慢表型的6种微生物。spg-7编码AFG3L2的同系物，其为保守的m-AAA金属蛋白酶1。AFG3L2与另一m-AAA金属蛋白酶paraplegin一起参与从线粒体中去除异常蛋白质，从而维持线粒体蛋白质组。nduf-7编码NADH-泛醌氧化还原酶Fe-S，其是线粒体电子传递链中复合物I的组成部分3。gas-1编码NADH脱氢酶[泛醌]铁硫蛋白2，其是线粒体电子传递链中复合物I的组成部分2。gas-1(fc21)突变动物表现出线粒体质量和膜电位显著降低，从而表现出呼吸容量降低4,5,6。当用大肠杆菌OP50饲养时，spg-7(ad2249)、gas-1(fc21)和nduf-7(et19)突变体与野生型动物相比以显著较低的速度生长(图1A)。大肠杆菌OP50是标准微生物菌株，在实验室中秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)通常在其上生长。进行筛选以测试在野生环境中与秀丽隐杆线虫天然相关的微生物中的任一种是否可修改线粒体突变体的生长缓慢表型。在筛选中，分别以～200株野生微生物菌株饲养同步化L1阶段spg-7(ad2249)、gas-1(fc21)和nduf-7(et19)突变体。鉴别出以显著快于用大肠杆菌OP50饲养的动物的速度生长的突变动物(图5A)。在该筛选中，鉴别出部分阻抑制线粒体突变体的生长缓慢表型的6种微生物。该研究集中于这些微生物中的3种：Gluconacetobacter spp、Acetobacter spp和Gluconobacter spp(图5A)。这些微生物各自均属于变形菌门(Proteobacteria)的醋杆菌科，并且其特征在于在发酵过程中能够氧化糖或乙醇并产生醋酸7。它们天然存在于含糖和酸性小生境(例如水果)中8，并且尤其是发酵饮料，例如天然苹果酒醋9和康普茶(Kombucha)10中。有趣的是，发现这3种细菌(即葡糖杆菌、醋杆菌和葡糖醋杆菌)甚至能够加速野生型动物的发育生长速度(图5B-图5D)。在该3个种类中，Gluconacetobacter spp在加速发育生长速度方面相对较好(图5A-图5B)。为具体确定Gluconacetobacter spp如何提高发育生长速度，在每个幼虫阶段检查了发育加速速度。发现Gluconacetobacter spp饲养特别缩短了动物从L4-幼虫阶段到达产卵成年阶段所花费的时间(图5E-图5F)。
为测试发育生长速度的提高是否对所有线粒体突变体是普遍的，测试了其它线粒体呼吸链中的突变，即mev-1(kn1)和isp-1(qm150)。mev-1编码线粒体电子传递链复合物II中的琥珀酸辅酶Q氧化还原酶的亚基11。isp-1是细胞色素bc1复合物(复合物III)的铁硫蛋白(isp-1)12。Gluconacetobacter spp饲养无法阻抑mev-1(kn1)和isp-1(qm150)突变体的缓慢发育生长速度，表明复合物I和/或复合物II活性的增强是可能的作用方式。据推测，Gluconacetobacter spp饲养可能通过增加线粒体ATP生产来提高野生型和线粒体突变体的发育生长速度。为了验证这一假设，将表达转基因萤火虫荧光素酶的秀丽隐杆线虫品系13用于ATP水平的体内快速评估。与用大肠杆菌OP50饲养的动物相比，用Gluconacetobacterspp饲养的表达转基因荧光素酶的品系具有较高的生物发光，表明ATP含量增加(图1B)。使用体外ATP测定分析证实了这一结果(图1C)。在开始用Gluconacetobacter spp饲养的6小时内即观测到生物发光增加(图5G)。此外，发现与用大肠杆菌OP50饲养的野生型动物相比，用大肠杆菌OP50饲养的spg-7(ad2249)突变体中的ATP水平降低。另外，Gluconacetobacterspp饲养能够恢复spg-7(ad2249)突变体的ATP含量(图1D)。类似地，发现Gluconacetobacter spp饲养能够部分恢复nduf-7(et19)突变体的ATP含量(图1E)。
通过使用MitotrackerTMCMXRos进行评估，发现与用大肠杆菌OP50饲养的野生型动物相比，用大肠杆菌OP50饲养的spg-7(ad2249)、gas-1(fc21)和nduf-7(et19)突变体中的线粒体膜电位显著下降(图1F)。MitotrackerTMCMXRos对线粒体进行染色，并且其在活细胞中的累积依赖于膜电位。Gluconacetobacter spp饲养能够部分恢复spg-7(ad2249)、gas-1(fc21)和nduf-7(et19)突变体的线粒体膜电位(图1F)。使用另一染料四甲基罗丹明乙酯(TMRE，其被活跃的线粒体螯合)，发现与用大肠杆菌OP50饲养的动物相比，用Gluconacetobacter spp饲养的spg-7(ad2249)突变体具有显著增加的染料水平(图5H)，表明线粒体膜电位增加。
接下来评估了不同线粒体毒物对用Gluconacetobacter spp饲养的动物的ATP产生增加表型的影响。发现与用大肠杆菌OP50饲养并用鱼藤酮或百草枯或叠氮钠处理的动物相比，用Gluconacetobacter spp饲养并用鱼藤酮或百草枯或叠氮钠处理的动物具有显著较高的生物发光水平(图1G-图1H、图5I)。百草枯(1,1'-二甲基-4,4'-联吡啶二氯化物)和鱼藤酮均为线粒体电子传递链中复合物I的抑制剂，而叠氮钠和抗霉素是复合物III的抑制剂。
发现与用大肠杆菌OP50饲养的动物相比，用Gluconacetobacter spp饲养的动物对鱼藤酮或百草枯的耐受性较高(图6A)。然而，与用大肠杆菌OP50饲养的动物相比，用Gluconacetobacter spp饲养的动物对叠氮钠或抗霉素的耐受性并不较高(图6A)。
线粒体的未折叠蛋白反应(UPRmt)由线粒体应激引发，并激活数种核基因(包括hsp-6线粒体伴侣)的表达14。使用hsp-6::gfp转基因动物品系确定了Gluconacetobacterspp是否影响UPRmt的诱导。将用大肠杆菌OP50或Gluconacetobacter spp饲养的转基因hsp-6::gfp动物用MPP+或6-OHDA或百草枯进行处理，并在处理24小时后评估GFP表达的诱导。MPTP[1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)]和6-羟多巴胺(6-OHDA)是诱导ROS产生的神经毒素，并用于帕金森氏病(PD)的动物模型。尽管用大肠杆菌OP50饲养并用MPP+或6-OHDA或百草枯处理的蠕虫诱导了GFP表达，用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫无法诱导GFP表达(图2A)。gas-1(fc21)、nduf-7(et19)、mev-1(kn1)和isp-1(qm150)的遗传突变组成性诱导hsp-6::gfp表达。用Gluconacetobacter spp饲养这些突变体未阻抑hsp-6::gfp表达。尽管UPRmt期间hsp-6::gfp的诱导通过ATFS-1转录因子介导15，但UPRmt中上调的基因的子集以ATFS-1非依赖性模式被激活。最近，证实了线粒体ETC破坏后，编码未表征的β-微管蛋白的tbb-6独立于ATFS-1而被上调16。生成了tbb-6::gfp转基因品系，并且发现该GFP在spg-7(ad2249)突变体中被诱导(图6B、图2B)。用Gluconacetobacter spp饲养spg-7(ad2249)；tbb-6::gfp动物阻抑了tbb-6::gfp表达(图6B、图2B)。
为解决Gluconacetobacter spp饲养如何改善线粒体功能，测试了多种转基因蠕虫品系，包括携带编码融合蛋白的构建体的蠕虫，所述融合蛋白包含GFP报告蛋白以及涉及应激反应、线粒体活性、过氧化物酶体功能、固有免疫应答和不同信号转导途径的基因产物(表1、图2C-图2K、图6C-图6L、图7A-图7D)。
表1
Figure BDA0002694172010000641
Figure BDA0002694172010000651
Figure BDA0002694172010000661
在该筛选中，发现Gluconacetobacter spp饲养诱导了线粒体功能或过氧化物酶体活性所需的基因的子集的表达。这些基因包括B0303.3(人HADHB[3-酮酯酰-coA硫解酶β亚基]的直系同源物)(图2D、图6H)、prx-11(人PEX11G[过氧化物酶体生物发生因子11G]的直系同源物)(图2E)、cpt-2(人CPT2[肉碱棕榈酰转移酶]的直系同源物)(图2F、图6C)、acox-1.2(人ACOX1[酰基CoA氧化酶1]的直系同源物)(图2G、图6D、图6J)、ech-1.2(人HADHA[3-酮酯酰-coA硫解酶α亚基]的直系同源物))(图2H、图6G)、acdh-7(人ACADM[酰基CoA脱氢酶，中链]的直系同源物)(图2I、图6F、图6I)、pmp-4(人ABCD1[过氧化物酶体膜ABC转运体]的直系同源物)(图2J、图6E)、prx-6(人PEX6[过氧化物酶体生物发生因子6]的直系同源物))(图2K)、cpt-1(人CPT1[肉碱棕榈酰转移酶]的直系同源物)(图6K)、和icl-1(编码异柠檬酸裂解酶/苹果酸合成酶)(图7A)。在用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫中，一种基因hphd-1(人ADHFE1[醇脱氢酶]的直系同源物)的表达显著减少(图2C)。CPT(肉碱O-棕榈酰转移酶)和ACADM(中链酰基CoA脱氢酶)在线粒体脂肪酸摄取和β-氧化(从脂肪酸产生能量的两个关键步骤)中均发挥关键作用。同样地，HADHA和HADHB编码线粒体羟酰基CoA脱氢酶/3-酮酯酰-CoA硫解酶/烯酰-CoA水合酶(三功能蛋白，其催化长链脂肪酸的线粒体β氧化)的α亚基和β亚基。ACOX1催化酰基CoA去饱和为2-反式-烯酰-CoA，是过氧化物酶体脂肪酸β-氧化途径的第一酶。ICL-1在乙醛酸支路中发挥作用，其使用乙醛酸作为中间体将异柠檬酸和乙酰-CoA转化为琥珀酸、苹果酸和CoA17。发现Gluconacetobacter spp饲养诱导了cpt-2::gfp，ech-1.2::gfp表达依赖于tcer-1(TCERG1[转录延伸调节因子1]的直系同源物)18,19(图2F和图2H)，而acox-1.2(图2G)、acdh-7(图2I)、pmp-4(图2J)和prx-6(图2K)表达依赖于nhr-49(编码具有与HNF4α有相似性的序列的核激素受体，但在功能上更类似于过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα))20。与用Gluconacetobacter spp饲养的野生型蠕虫相比，用Gluconacetobacter spp饲养的tcer-1(tm1452)和nhr-49(nr2041)动物生长得较慢(图3A)，表明TCER-1和NHR-49活性促进了发育生长速度的加速。nhr-49的肠特异性过表达足以加速用Gluconacetobacter spp饲养的nhr-49(nr2041)突变体的生长速度(图7E)。此外，在用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫中观测到了强的nhr-49::gfp诱导(图7F)。为了测试NHR-49本身是否足以加速发育生长速度，在nhr-49(et7)、nhr-49(et8)、nhr-49(et13)21中确定了功能获得性等位基因。当用大肠杆菌OP50饲养时，这些品系均不具有生长速度加速表型，而用Gluconacetobacter spp饲养时它们则显示出加速的生长。
此外，与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，在用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫的肠细胞中观测到强的TCER-1::GFP核定位(图7G)。
由于与过氧化物酶体功能相关的基因响应于Gluconacetobacter spp饲养而上调，对过氧化物酶体基因的RNAi是否影响发育生长速度加速表型进行了测试。prx-5(PXR1或PEX5[I型过氧化物酶体靶向信号蛋白的人受体]的直系同源物)或prx-11(人PEX11G[过氧化物酶体生物发生因子11G]的直系同源物)的RNAi阻抑了用Gluconacetobacter spp饲养的野生型蠕虫的发育生长速度加速表型(图3A)。发现tcer-1、nhr-49和prx-5的RNAi阻抑Gluconacetobacter spp饲养诱导的生物发光表型的增加(图3B)，表明这些基因是Gluconacetobacter spp饲养时ATP生产增加所需的。此外，nhr-49或prx-5的RNAi能够阻抑用Gluconacetobacter spp饲养的spg-7(ad2249)和nduf-7(et19)突变蠕虫的发育进程加速表型(图3C-图3D)。与野生型蠕虫相比，通过使用Mito CMXRos进行评估，spg-7(ad2249)突变体具有降低的线粒体膜电位，并且nhr-49RNAi进一步加剧了这一降低(图3E)。在用nhr-49RNAi饲养的野生型蠕虫中观测到线粒体膜电位的部分降低(图3E)。
为了检查Gluconacetobacter spp饲养对线粒体形态学的影响，使用了表达秀丽隐杆线虫线粒体输入受体亚基TOMM-20和单体红色荧光蛋白(mRFP)的融合蛋白的转基因品系，并且通过myo-3启动子在体壁肌细胞中驱动该表达22。与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，在用Gluconacetobacter spp饲养的转基因蠕虫中，线粒体看起来更融合(图3F)。使用对线粒体进行染色的罗丹明6G染料确定了与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫的皮下组织中的线粒体看起来更融合(图7H)。线粒体是不断发生融合和分裂事件的动态细胞器。伸长的形态学与增加的ATP生产效率23和减少的ROS形成相关24。因此，不希望受理论束缚，用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫中的融合线粒体表型数量增加可解释ATP生产表型增加。线粒体的分裂和融合动力学受drp-1(人DNML1[动力相关蛋白]的直系同源物)和fzo-1(人MFN1[Mitofusin]/FZO1GTP酶的直系同源物)严格调控25。当用大肠杆菌OP50或Gluconacetobacter spp饲养时，fzo-1(tm1133)或drp-1(tm1108)突变体生长极为缓慢(从L1阶段至成年期要6天)。不希望受理论的束缚，这些数据表明Gluconacetobacter spp对线粒体功能的有益作用可能是经由对线粒体动力学的调节。
由于Gluconacetobacter spp饲养诱导了过氧化物酶体生物发生因子的表达，使用转基因品系检测了过氧化物酶体，所述转基因品系在vha-6肠启动子的控制下表达N端标记有绿色荧光蛋白(GFP)的DAF-22融合蛋白26。在该品系中观测到点状信号，表明GFP-DAF-22融合蛋白的过氧化物酶体靶向。在用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫中观测到点状结构的增加，表明过氧化物酶体的增加(图3G)。在用prx-5(PXR1或PEX5[I型过氧化物酶体靶向信号蛋白的人受体]的直系同源物，其为GFP-DAF-22融合蛋白靶向过氧化物酶体所必需的)的RNAi处理并用大肠杆菌OP50或Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫中未观测到点状的过氧化物酶体结构(图8A)。过氧化物酶体数量的此种增加是特异性的，未观测到其它亚细胞结构例如高尔基体、肠道溶酶体颗粒和内质网(图8B-图8D)的数量或形态的变化。由于过氧化物酶体是过氧化氢(H2O2)的主要内源性来源，检查了Gluconacetobacter spp饲养是否增加H2O2。为测量内源性H2O2水平，用Gluconacetobacter spp和大肠杆菌OP50饲养表达HyPer传感器的转基因jrIs1[Prpl-17::HyPer]蠕虫27。与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫具有略低的H2O2水平，表明Gluconacetobacterspp未增加内源性H2O2产生(图3H)。甚至与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，在用Gluconacetobacter spp饲养并用H2O2处理的HyPer传感器蠕虫中也具有略低的H2O2水平(图3H)，表明H2O2解毒的效率提高。与此观测一致，通过使用Amplex red测定进行评估，与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，用Gluconacetobacter spp饲养并用H2O2处理的蠕虫具有略低的H2O2水平(图8E)。有机体处理ROS(例如H2O2)的主要方式之一是通过谷胱甘肽氧化27。使用表达Grx1-roGFP2(检测谷胱甘肽氧化还原电位的比率式生物传感器)的转基因蠕虫品系27，发现与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫中的谷胱甘肽细胞内浓度未受影响(图8F)。不希望受到理论的束缚，用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫可能具有较高的过氧化物酶体过氧化氢酶(将H2O2解毒)水平。
线粒体中与衰老相关的变化与线粒体活性下降相关28。在衰老的动物中，观测到线粒体功能的损害，例如氧化能力下降、ATP产生减少、氧化磷酸化减少和ROS产生增加29。在秀丽隐杆线虫中观测到ATP产生、代谢、线粒体含量和功能的年龄依赖性下降30,31。在衰老的蠕虫中评估了Gluconacetobacter spp饲养对线粒体功能的影响。发现在用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫中，ATP水平随蠕虫衰老而显著降低(图4A)。然而，即使随着蠕虫衰老，与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，用Gluconacetobacter spp饲养的蠕虫也具有显著较高的ATP含量(图4A)。Gluconacetobacter spp饲养的效果是明显的，因为Gluconacetobacter spp与大肠杆菌OP50的混合物足以诱导ATP生产增加(图4B)。
为测试与Gluconacetobacter spp饲养相关的表型是否为菌株特异性的，评估了响应于其它葡糖醋杆菌菌株的ATP生产。发现与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，其它葡糖醋杆菌菌株(包括汉氏葡糖醋杆菌(MGH分离株)、经典汉氏葡糖醋杆菌ATCC 23769和汉氏葡糖醋杆菌ATCC23769的非产纤维素突变体)均诱导ATP生产增加(图4C)。
此外，通过选择产生酸并在含有CaCO3的培养基板周围形成特征性清晰晕圈的细菌，从腐烂的苹果和葡萄中分离出多种葡糖杆菌和醋杆菌菌株7(图8G)。与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比，所有这些微生物均能够诱导ATP生产增加(图4D)，除了G.kondonii和G.frateurii(其对秀丽隐杆线虫而言是致病性的)(图4D)。
本发明人想要回答的关键问题之一是Gluconacetobacter spp饲养如何阻抑与线粒体突变体相关的缺陷。为解决此问题，对无法阻抑spg-7(ad2249)突变体的发育生长表型的突变微生物菌株进行了正向遗传转座子筛选。由于Gluconacetobacter spp生长非常缓慢，对氧化葡糖杆菌进行了突变体筛选。分离了～2000种氧化葡糖杆菌转座子突变体，并分别用其饲养同步化L1阶段spg-7(ad2249)突变体。孵育3天后，按达到L4阶段或成年期的蠕虫的百分比对蠕虫进行评分。在此筛选中，鉴别出无法阻抑spg-7(ad2249)突变体的发育生长缓慢表型的11种突变体(图8H-图8I)。此外，这11种突变体无法加速野生型蠕虫的发育生长速度(图9A)。此外，与用野生型氧化葡糖杆菌饲养的蠕虫相比，在用膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(GOX0265；mGDH)、细胞色素o泛醇氧化酶亚基II(GOX1911)以及泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基突变体饲养的蠕虫中，ATP生产减少(图4E)。然而，在用碳氮水解酶以及TonB依赖型外膜受体蛋白的突变体饲养的蠕虫中，ATP水平与用野生型氧化葡糖杆菌饲养的蠕虫类似(图4E)。
接下来使用CaCO3清除测定(clearance assay)测试了氧化葡糖杆菌突变体是否影响产生酸的能力。发现膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(GOX0265；mGDH)、细胞色素o泛醇氧化酶亚基II(GOX1911)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基和碳氮水解酶的突变体无法在含有CaCO3的培养基板周围形成清晰晕圈(图5B)。
分离出编码膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(其将D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸，并可将D-葡萄糖酸进一步氧化为两种不同的酮-D-葡萄糖酸2-酮-D-葡萄糖酸和5-酮-D-葡萄糖酸，以及2,5-二酮-D-葡萄糖酸32,33)的基因的6种独立等位基因(表2)。
表2
Figure BDA0002694172010000711
由另一实验室分离的氧化葡糖杆菌34的葡萄糖脱氢酶中的单独的缺失突变也无法阻抑spg-7(ad2249)突变体的发育生长缓慢表型(图9C)。
醋酸细菌(包括氧化葡糖杆菌)的特征属性之一是其将多种底物(包括糖)不完全氧化的能力33。此种不完全氧化由多种膜结合脱氢酶(包括膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶)催化34。测试了多种脱氢酶的独立的等位基因缺失，并且发现与用野生型氧化葡糖杆菌饲养的蠕虫相比，用膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶、FAD依赖型膜结合脱氢酶以及膜结合PQQ依赖型脱氢酶3的缺失突变体饲养的spg-7(ad2249)突变蠕虫生长较慢(图9C)。FAD依赖型膜结合脱氢酶为D-葡萄糖酸-2-脱氢酶，其可将D-葡萄糖酸氧化为2-酮-葡萄糖酸34。膜结合PQQ依赖型脱氢酶3的功能尚不清楚。此外，发现与用野生型氧化葡糖杆菌饲养的蠕虫相比，用膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶、FAD依赖型膜结合脱氢酶以及膜结合PQQ依赖型脱氢酶3的缺失突变体饲养的蠕虫的ATP生产降低(图4F)。
为确定Gluconacetobacter spp在人中是否具有类似的生物学作用，将人原代真皮成纤维细胞暴露于Gluconacetobacter spp和大肠杆菌OP50。与模拟处理的细胞相比，将人原代真皮成纤维细胞暴露于大肠杆菌OP50导致ATP产生的显著减少，而Gluconacetobacter spp未影响ATP产生(图9D-图9E)。由于ATP水平是代谢活跃细胞的指标(其为细胞活力的度量)，暴露于大肠杆菌OP50的细胞中ATP水平的降低是细胞死亡或活力降低的标志。不希望受到理论的束缚，降低的活力可为感染的结果。有趣的是，即使在较高剂量的细菌下，Gluconacetobacter spp也未降低细胞ATP产生(图S5E)，表明Gluconacetobacter spp对细胞不是毒性或致病性的。PGC-1α(过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α)是线粒体生物发生的主要调节因子，并且它通过与核激素受体PPARα的相互作用来调节参与能量代谢的数个基因35。使用RT-QPCR发现与模拟处理的细胞相比，暴露于Gluconacetobacter spp的人原代真皮成纤维细胞中PGC-1α基因表达增加(图4H)。PGC-1α诱导核呼吸因子1的转录，导致线粒体转录因子A(TFAM)的表达增加36,37。TFAM是线粒体转录和线粒体基因组复制所需的线粒体磷酸化氧化(mOXPHOS)的主要调节因子38。使用RT-QPCR发现与模拟处理的细胞相比，在暴露于Gluconacetobacter spp的人原代真皮成纤维细胞中TFAM基因表达增加(图4H)。由于TFAM诱导线粒体DNA复制，对线粒体DNA拷贝数(mtDNA)进行了QPCR。发现与模拟处理的细胞相比，在暴露于Gluconacetobacter spp的人原代真皮成纤维细胞中，mtDNA拷贝数增加(图4I)。PGC-1α和TFAM表达以及mtDNA拷贝数的增加揭示了线粒体活性的整体增强。
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实施例2：材料和方法
如所述，将秀丽隐杆线虫品系在20℃下维持在NGM板和OP50大肠杆菌细菌中1。野生型品系为N2 Bristol。表3中描述了使用的品系。
表3
Figure BDA0002694172010000751
Figure BDA0002694172010000761
Figure BDA0002694172010000771
Figure BDA0002694172010000781
将大肠杆菌OP50、氧化葡糖杆菌DSM 2343(621H)以及它们的突变衍生物在含有含1％葡萄糖的LB培养基的培养基中培养。将培养物离心并接种到不含任何抗生素的NGM培养基上。
葡糖醋杆菌菌株通常在标准Hestrin-Schramm琼脂(D-葡萄糖20g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨5g/L、磷酸氢二钠2.7g/L、柠檬酸1.15g/L以及琼脂15g/L)中生长，并在30℃下孵育4天。对于液体培养，省略培养基中的琼脂。大肠杆菌OP50也在30℃下在相同培养基中生长。将液体培养物点样至不含任何抗生素的NGM培养基板上，并使其在室温下生长至少3天。
筛选对响应于Gluconoacetobacter spp诱导代谢基因负有责任的转录因子
为鉴别响应于葡糖醋杆菌饲养而介导代谢基因的诱导的转录因子，本发明人对先前与代谢有关联的基因进行了择优挑选(cherry-picked)的RNAi筛选2-13。
饲养对应于dsRNA对照、daf-16、pha-4、hlh-30、skn-1、hsf-1、daf-12、nhr-80、nhr-49、tcer-1、sbp-s、nhr-69和nhr-64的RNAi克隆在含有25μg/ml羧苄青霉素的LB培养基中生长过夜，并接种至含有1mM IPTG的RNAi琼脂板上。将板在层流罩中干燥并在室温下孵育过夜以诱导dsRNA表达。将表达pmp-4::gfp、cpt-2::gfp、ech-1.2::gfp、acox-1.2::gfp、acdh-7::gfp和prx-6::gfp的动物的各200只同步化L1幼虫置于各种含RNAi的琼脂板上，允许其在20℃下发育4天。当动物达到成年阶段时，将蠕虫进行漂白预备(bleach-prepped)。然后将20只同步化L1幼虫置于葡糖醋杆菌接种板上，并对诱导GFP表达的失败情况进行评分。将经dsRNA对照RNAi处理的蠕虫(在接种了葡糖醋杆菌的板上饲养)作为对照。
筛选阻抑spg-7(ad2249)突变体的发育生长速度缓慢表型的微生物
使～200种微生物菌株单独生长并接种至NGM培养基板上。将～20只同步化L1阶段spg-7(ad2249)突变动物置于24孔板上，并在60小时时可视化筛选含有如下动物的孔：所述动物与用大肠杆菌OP50饲养的蠕虫相比生长较快。在筛选中回收了6种微生物菌株。
氧化葡糖杆菌Tn5转座子突变体的分离
使用从英国诺丁汉大学Stephan Heeb教授处获得的载体pME9978进行氧化葡糖杆菌的Tn5转座子诱变。将pME9978转化至大肠杆菌S17-1中，并在庆大霉素和氨苄青霉素LB培养基板上进行选择。通过接合，将大肠杆菌S17-1细胞中存在的pME9978转移至氧化葡糖杆菌中。所述接合通过以下进行：将带有pME9978的大肠杆菌S17-1和氧化葡糖杆菌悬浮混合，将它们置于LB培养基上，并在30℃下孵育4小时。从LB板刮下培养物，并重悬于10ml M9缓冲液中。将得到的细胞悬液连续稀释至10-6并铺在选择培养基板(含有1％葡萄糖、10μg/ml-1庆大霉素和50μg ml-1头孢西丁的LB培养基)上。氧化葡糖杆菌天然耐受头孢西丁，而大肠杆菌S17-1对头孢西丁敏感。在30℃下孵育4天后，出现庆大霉素耐受性氧化葡糖杆菌菌落。将～2000个此种菌落挑入充满液体选择培养基(含1％葡萄糖、10μg/ml-1庆大霉素和50μg ml-1头孢西丁的LB培养基)的96孔板中，在30℃下生长2天并储存于-80℃。
筛选未能阻抑spg-7(ad2249)突变体的发育生长速度缓慢表型的氧化葡糖杆菌突变体
将氧化葡糖杆菌Tn5突变体在含有1％葡萄糖、10μg/ml-1庆大霉素和50μg ml-1头孢西丁的LB液体培养基中生长，并点样至24孔NGM培养基板上。将～20个同步化L1阶段spg-7(ad2249)突变动物置于24孔板上，并在60小时时可视化筛选含有以下动物的孔：所述动物与用野生型氧化葡糖杆菌饲养的蠕虫相比生长较快。在筛选中回收了11种突变体。
氧化葡糖杆菌Tn5突变体中转座子插入位点的鉴定
将转座子突变细菌在含有1％葡萄糖、10μg/ml-1庆大霉素和50μg ml-1头孢西丁的100ml LB液体培养基中生长，并在2500g下离心15分钟。使用商业基因组DNA分离试剂盒(Qiagen)进行基因组DNA分离。使用NcoI(不切割pME9978质粒)对分离的基因组DNA进行限制性消化，并进行热灭活。用T4 DNA连接酶使限制性片段自连接，并电穿孔至pir大肠杆菌菌株中，在37℃下在含有庆大霉素的LB培养基板上过夜进行选择。由于转座子含有复制起点R6Kγori，它可作为独立的质粒在pir大肠杆菌菌株中生长。将来自庆大霉素板的多个菌落合并在一起，并在37℃下在含有庆大霉素的LB培养基板中生长过夜。将培养物进行离心并进行质粒分离。使用以下引物对质粒进行测序以寻找转座子插入位点：
tpnRL17(SEQ ID NO：11)：5′-AACAAGCCAGGGATGTAACG-3′
tpnRL13(SEQ ID NO：12)：5′-CAGCAACACCTTCTTCACGA-3′
突变体中的转座子插入位点
葡萄糖脱氢酶_G7(SEQ ID NO：13)：
Figure BDA0002694172010000801
葡萄糖脱氢酶_G9(SEQ ID NO：14)：
Figure BDA0002694172010000802
细胞色素O泛醇氧化酶亚基_G1(SEQ ID NO：15)：
Figure BDA0002694172010000803
葡萄糖脱氢酶_G6(SEQ ID NO：16)：
Figure BDA0002694172010000811
tonB_G2(SEQ ID NO:17)：
Figure BDA0002694172010000812
泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基_G3(SEQ ID NO：18)：
Figure BDA0002694172010000813
葡萄糖脱氢酶_G14(SEQ ID NO：19)：
Figure BDA0002694172010000814
葡萄糖脱氢酶_启动子_G15(SEQ ID NO:20)：
Figure BDA0002694172010000815
tonB_G11(SEQ ID NO:21)：
Figure BDA0002694172010000816
葡萄糖脱氢酶_G13(SEQ ID NO:22)：
Figure BDA0002694172010000817
碳氮水解酶_G5(SEQ ID NO:23)：
Figure BDA0002694172010000818
从水果中分离醋杆菌科
醋杆菌科成员的特征在于产生酸，导致CaCO3的清除以及在含碳酸钙的培养基上的菌落周围形成晕圈2。将腐烂的苹果、葡萄和橙的样品无菌粉碎并与9ml M9缓冲液混合并连续稀释至10-6稀释液。将100μl稀释液铺在CaCO3培养基(8％葡萄糖、0.5％酵母提取物、0.2％甘露醇、0.05％硫酸镁、10％碳酸钙、100μg/ml环己酰亚胺、10μg/ml制霉菌素)上。
将板在有氧条件下于30℃下孵育3-4天。选择显示清晰晕圈的菌落。使用以下引物进行菌落PCR：
27F(SEQ ID NO:24):AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
1492R(SEQ ID NO:25):TACGGYTACCTTGTTACGACTT
用于降落菌落PCR的条件如下：95℃10分钟，然后95℃30s、65℃30s(每个循环-1℃的降低)以及72℃1分钟，15个循环。随后为以下的40个循环：95℃30s、50℃30s以及72℃1:30分钟。
对分离物进行16S rRNA测序以进行分离株的鉴定。
显微镜检查
为了高倍率的微分干涉相衬和荧光图像，将经适当条件处理的蠕虫安装在琼脂垫上，并使用装有Zeiss AxioCamTMHRc照相机和AxiovisionTM软件的Zeiss AXIOTMImager Z1显微镜获取图像。将荧光图像转换为16位图像，使用ImageJ给出其界线(thresholded)并进行量化。使用学生t检验确定统计学显著性。使用GraphPadTMPrism 8.0进行这些计算以及生成图表。使用AxiovisionTM软件以及使用配备Hammamatsu OrcaTM闪光4.0数码照相机的Zeiss AxioZoomTMV16显微镜获取低倍率明场图像。使用装有由Delta Vision系统(AppliedPrecision，Pittsburgh，PA)驱动的冷却CCD照相机(CH350；Roper Scientific)的IX-70显微镜(Olympus，Waltham，MA)获取免疫荧光图像(如图2所示)。使用SoftWoRx 3.3.6软件(Applied Precision)对图像进行去卷积。
使用HyPer品系测量内源性过氧化氢水平
为测量内源性过氧化氢水平，使用了如所述的表达HyPer的转基因jrIs1[Prpl-17::HyPer]蠕虫3。将同步化L1阶段转基因jrIs1[Prp-17::HyPer]动物在大肠杆菌OP50和汉氏葡糖醋杆菌(G.hansenii)中生长，并在96微量滴定孔板中收获约1000只L4阶段蠕虫。对于H2O2处理实验，将H2O2添加至96孔中的蠕虫自身并在15分钟内进行测量。用535nm的发射滤光片，分别使用490nm或405nm的激发波长测量氧化或还原的HyPerTM探针荧光。使用620nm处的吸光度将蠕虫数量归一化。通过使用非配对t检验确定条件之间差异的统计学显著性。使用GraphPadTMPrism 8.0进行这些计算。
测量内源性GSSG/2GSH比
为测量体内GSSG/2GSH比，使用了如所述的表达Grx1-roGFP2的转基因jrIs2[Prpl-17::Grx1-roGFP2]蠕虫3。将同步化L1阶段转基因jrIs2[Prpl-17::Grx1-roGFP2]动物在大肠杆菌OP50和汉氏葡糖醋杆菌(G.hansenii)中生长，并在M9缓冲液中洗涤至少6次后在96微量滴定孔板中收获约1000只L4阶段蠕虫。对于H2O2处理实验，将H2O2添加至96孔中的蠕虫自身并在15分钟内进行测量。用535nm的发射滤光片，分别使用490nm或405nm的激发波长测量还原或氧化的Grx1-roGFP2探针荧光。使用620nm处的吸光度将蠕虫数量归一化。通过使用非配对t检验确定条件之间差异的统计学显著性。使用GraphPadTMPrism 8.0进行这些计算。
使用AmplexTMRed测定测量内源性过氧化氢水平
如所述使用AmplexTM Red测定测量内源性过氧化氢水平4。
为测量ROS产生，将同步化L1阶段蠕虫在大肠杆菌OP50和汉氏葡糖醋杆菌(G.hansenii)中生长，在M9缓冲液中洗涤至少6次后，在96微量滴定孔板中收获约1000只L4阶段蠕虫，然后用AmplexTMRed过氧化氢/过氧化物酶测定试剂盒提供的反应缓冲液进行3次洗涤。然后将等体积的AmplexTMRed反应缓冲液添加至孔中，3小时后用读板器(SpectraMaxTM读板器)读取540nm处的吸光度。对于H2O2处理实验，将H2O2添加至96孔中的蠕虫自身并在2小时后进行测量。使用620nm处的吸光度将蠕虫数量归一化。将所有的值归一化至未经处理的对照蠕虫的值。通过使用非配对t检验确定条件之间差异的统计学显著性。使用GraphPadTMPrism 8.0进行这些计算。
人mtDNA拷贝数估计
使用含10％胎牛血清、1％MEM非必需氨基酸以及1％青霉素-链霉素的EMEM，将人真皮原代成纤维细胞(Coriell GM25438)在6孔板中在37℃、5％CO2的加湿培养箱中生长，直至细胞～90％汇合。用模拟处理或106CFU的汉氏葡糖醋杆菌(G.hansenii)处理对细胞处理24小时，并使用商品化DNA分离试剂盒(Qiagen)分离基因组DNA。使用NanodropTM2000分光光度计(Thermo Scientific，Wilmington，DE，美国)测定分离的DNA的量和纯度，并将样品存储于-70℃直至使用。如所述通过qPCR测量相对mtDNA拷贝数5。如所述将该值归一化至单拷贝核DNA基因。使用的引物序列为：
L394(SEQ ID NO：26)，5′-CACCAGCCTAACCAGATTTC-3′
H475(SEQ ID NO：27)，5′-GGGTTGTATT-GATGAGATTAGT-3′
HBG1F(SEQ ID NO：28)，5′-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3′
HBG1R(SEQ ID NO：29)5′-CACCAACTTCATCCACGTTCACC-3′
L394/H475用于mtDNA含量，HBG1F/R引物用于核β-珠蛋白基因5。使用iQ SYBRMaster Mix(Bio-Rad)用iCyclerTM机器(Bio-Rad)进行qPCR，并在以下条件下进行测定：95℃下变性10分钟，然后进行95℃10s、60℃30s以及72℃30s的循环40次。使用每反应10ngDNA模板，以三重复进行所有测定。所有反应在3个生物学重复上以三重复进行。使用ΔCt法计算相对mtDNA拷贝数。
PGC-1和TFAM的RNA分离和定量RT-PCR分析
使用含10％胎牛血清、1％MEM非必需氨基酸以及1％青霉素-链霉素的EMEM将人原代成纤维细胞在6孔板中在37℃、5％CO2的加湿培养箱中生长，直至细胞～90％汇合。用模拟处理或106CFU的汉氏葡糖醋杆菌(G.hansenii)处理对细胞进行处理24小时。在各条件下孵育24h后，使用商品化RNA分离试剂盒(Qiagen)从细胞中分离出总细胞RNA。使用TURBO无DNA试剂盒(Applied Biosystems)对总RNA进行DNA酶处理。使用来自Invitrogen的第一链cDNA合成试剂盒制备cDNA。在以下条件下进行qRT-PCR分析：95℃下变性10分钟，然后进行95℃10s、55℃30s以及72℃30s的循环40次。使用的引物序列为6，7：
hTfamF(SEQ ID NO：30)：TGTTCACAATGGATAGGCAC
hTfamR(SEQ ID NO：31)：TCTGGGTTTTCCAAAGCAAG
hPGC-1αF(SEQ ID NO：32)：TGAAGACGGATTGCCCTCATT
hPGC-1αR(SEQ ID NO：33)：GCTGGTGCCAGTAAGAGCTT
所有反应在3个生物学重复上以三重复进行。所有值均归一化至核β-珠蛋白基因(作为内参)以及经模拟处理的细胞中的转录本水平。
ATP测定分析
如所述进行ATP测定8。为测量ATP水平，将同步化L1阶段蠕虫在大肠杆菌OP50和汉氏葡糖醋杆菌(G.hansenii)中生长，并在M9缓冲液中洗涤至少6次后收获，并在液氮中将100μl M9中的约1000只蠕虫冷冻并在-80℃下存储直至分析。将样品立即置于沸水浴中15分钟。加入两倍量的蒸馏水后，以14,000rpm离心5分钟并将上清液转移至第二管中。加入等体积的荧光素酶试剂(PromegaTM)并使用读板器(SpectraMaxTM读板器)测量发光。使用BCA法测量蛋白含量。将ATP浓度归一化至样品中的蛋白含量。将所有值归一化至用大肠杆菌OP50饲养的野生型。
使用荧光素酶品系进行ATP测定分析
描述了使用荧光素酶品系的ATP测定分析9。为测量体内ATP产生，将同步化L1阶段Psur-5::luc+::gfp蠕虫在大肠杆菌OP50和汉氏葡糖醋杆菌(G.hansenii)中生长，在M9缓冲液中洗涤至少6次后在96微量滴定孔板中收获约1000只成年阶段蠕虫/孔。将100μM D-荧光素添加至孔，并在5分钟内在SpectraMaxTM酶标仪中测量发光。使用485nm激发和520nm发射滤光片在SpectraMaxTM酶标仪中对GFP荧光进行定量。从读数中减去背景测量结果。将发光值归一化至样品的GFP荧光。将所有值归一化至用大肠杆菌OP50饲养的野生型。对于RNAi实验，使同步化L1阶段Psur-5::luc+::gfp蠕虫在携带相应dsRNA的大肠杆菌HT115菌株中生长，直至成年期和准备产卵。然后将L1阶段蠕虫转移至接种有大肠杆菌OP50或汉氏葡糖醋杆菌的培养基板中。对于使用鱼藤酮、百草枯、叠氮化物和抗霉素的实验，将在大肠杆菌OP50或汉氏葡糖醋杆菌上生长的蠕虫洗涤至少6次并转移至含有药物的大肠杆菌OP50板上。在使用前一天制作带有适当浓度药物的大肠杆菌OP50板。所有测定在大肠杆菌OP50板上进行以避免汉氏葡糖醋杆菌的潜药物解毒。
Mitotracker CMXRos染色
对于使用MitotrackerTMCMXRos的实验，将在大肠杆菌OP50或汉氏葡糖醋杆菌(G.hansenii)上生长的蠕虫洗涤至少6次并转移至含有10μM MitotrackerTMCMXRos的大肠杆菌OP50板上。24小时后，将蠕虫洗涤至少6次以去除染料并滴至大肠杆菌OP50板上，以清除非特异性肠道染色。2小时后，将蠕虫洗涤至少6次并转移至琼脂板进行成像。
四甲基罗丹明乙酯(TMRE)染色
对于使用TMRE的实验，将在大肠杆菌OP50或汉氏葡糖醋杆菌(G.hansenii)上生长的蠕虫洗涤至少6次并转移至含有1μm TMRE的大肠杆菌OP50板上。24小时后，将蠕虫洗涤至少6次以去除染料，并滴至大肠杆菌OP50板上以清除非特异性肠道染色。2小时后，将蠕虫洗涤至少6次并将～1000只蠕虫转移至96孔板的每个孔中，并使用549nm激发和575nm发射滤光片在SpectraMaxTM酶标仪中对荧光进行定量。
代谢物生产的优化
发现当细菌在0％-5％酵母提取物肉汤中生长时不产生代谢物。此外，已发现为产生代谢物，需要向3％酵母提取培养基中添加葡萄糖或其它可代谢单糖例如果糖或二糖(如蔗糖)。另外，已发现仅0.5％的此类糖足以得到最佳的代谢物生产。因此，推荐用于代谢物产生的任何培养基包含至少0.5％-5％的可代谢糖源。
进一步的实验表明3％的玉米浆足以实现最佳的代谢物生产，因此，推荐0.5％-5％的玉米浆用于最佳的代谢物生产。本文预期当细菌以商业规模生长时，3％的玉米浆可为优选的发酵方法。
实施例2的参考文献
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实施例3：帕金森氏病的治疗
帕金森氏病(PD)是中晚期生命疾病中最常见的运动相关紊乱，全世界～620万人受到影响1。PD的特征在于神经元中α-突触核蛋白内含物的累积以及多巴胺能神经元的变性和/或丢失。PD的主要临床症状包括运动缓慢、静止性震颤、僵硬和姿势不稳2。尽管大多数PD病例来源不明且散发，一些基因中的突变与该疾病的罕见的家族性形式相关。PD的病因学和发病机理中数条证据链暗示线粒体呼吸缺陷。首先，MPTP(电子传递链中复合物I的抑制剂)可诱导PD3，4。复合物I的抑制导致线粒体ATP生产降低、线粒体来源的活性氧(ROS)生产增加以及线粒体依赖性凋亡途径的激活。其次，PD患者的死后研究发现，多巴胺能神经元中氧化应激标志物/产物5-7的水平升高。第三，在PD患者的脑和外周组织中观测到线粒体复合物I活性降低了30％8，9。第四，鱼藤酮、百草枯和6-羟多巴胺(6-OHDA)等神经毒素诱导了线粒体功能障碍，导致动物模型中的PD相关表型10。最后，PD相关基因(例如α-突触核蛋白、LRRK2(富含亮氨酸重复激酶2)、parkin、PINKl和DJ-1)影响线粒体动力学、运输、自噬和质量控制11,12。
所有细胞都需要线粒体满足其能量需求，包括严重依赖于正常线粒体功能的神经元。神经元具有高的代谢活性，并且它们在其生物能需求方面非常依赖线粒体。多种因素使神经元(特别是多巴胺能神经元)通常易于变性；其中包括ROS(由多巴胺代谢和线粒体功能障碍引起)、低内源性抗氧化剂水平以及高水平的铁和钙(已知可促进ROS形成)13。此外，神经元组织含有高水平的多不饱和脂肪酸，其易于发生脂质过氧化以及生成毒性产物14。不管是原发性还是继发性原因，线粒体功能障碍有望成为潜在治疗靶标。衰老是PD的最大危险因素15，因此随着全球平均预期寿命的增加16，在不久的将来受PD影响的人数将大大增加。因此，对于不仅可用于减缓PD、而且还可作为衰老人群的预防性措施的新治疗方法，有着急需满足的临床需求。
线粒体是细胞能量产生、响应于氧化应激以及凋亡所需的高度动态的细胞器。因此，特征在于电子传递链效率的丧失以及ATP合成减少的线粒体功能障碍是衰老以及与衰老有关的神经退行性疾病的特征不足为奇17,18。尽管具有独特的病理学和临床特征，其它数种神经退行性疾病(包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和肌萎缩侧索硬化)也与线粒体功能障碍来源的氧化应激19相关；这提示了导致神经元变性的常见机制20。
尽管多数关于PD的早期研究完全集中在脑病理学上，胃肠(GI)系统现被认为是PD发病机理的重要来源21-23。GI症状(如便秘)影响～80％的PD患者，并且特发性便秘是PD的重要危险因素24。在PD中，便秘与肠神经系统中的α-突触核蛋白累积25、肠道炎症以及肠道通透性增加相关26。此外，认为肠粘膜炎症导致肠神经中的突触核蛋白累积，其可经由自主连接以朊病毒样方式扩散至中枢神经系统27-29。甚至在神经元症状发作前观测到许多GI道变化30；因此，PD发病机理可能主要经由GI道起作用31,32。
秀丽隐杆线虫作为充分准备的模型在与PD相关的发现中发挥重要作用33。秀丽隐杆线虫包含明确定义的多巴胺能(DA)神经元，所述神经元在荧光显微镜下是可见的，并且具有一系列自发活动34。除α-突触核蛋白外，所有与家族性PD相关的直系同源基因都存在于秀丽隐杆线虫中。α-突触核蛋白的异位过表达产生神经毒性作用，该作用可被神经保护基因所阻断。通过将蠕虫暴露于神经毒素(例如MPP+或6-OHDA)或者通过引入PD的遗传形式中有关的突变或人基因35-41生成了许多PD蠕虫模型。这些蠕虫模型表现出与PD相关的表型，包括多巴胺神经元的变性或丢失、低多巴胺水平、多巴胺依赖性行为缺陷以及运动缺陷。
在DA神经元特异性启动子的控制下人α-突触核蛋白的过表达导致年龄依赖性神经变性42。关于潜在的神经保护作用，使用该品系筛选了超过30个微生物菌株。至成年期第10天时，多巴胺能神经元中人α-突触核蛋白的表达诱导该神经元的完全变性和丢失。观测到当与1μM鱼藤酮组合时，多巴胺能神经元丢失更快地在4天内实现。鱼藤酮为已被证明在动物模型中诱导PD样症状并伴有DA能神经元的选择性破坏的广谱杀虫剂。在秀丽隐杆线虫中，长期暴露于鱼藤酮引起多巴胺能神经变性43。鱼藤酮通过抑制线粒体呼吸复合物I来发挥作用44。在筛选中，从第一幼虫阶段开始在单菌株微生物菌苔上任意饲养人α-突触核蛋白动物，并在第四幼虫阶段进行鱼藤酮处理。鱼藤酮处理60小时后，对动物的前CEP(头部)多巴胺能神经元的存活情况进行筛选，经由多巴胺能神经元驱动的GFP的共表达使其可视化。虽然～75％的用对照大肠杆菌OP50饲养的蠕虫丢失了CEP神经元，但用葡糖醋杆菌EBT405饲养的蠕虫的CEP神经变性减少(图10A-图10B)。
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实施例4：阿尔茨海默氏病的治疗
AD是致命的神经退行性疾病，其特征在于记忆和认知功能的逐步减退。与APP或γ-分泌酶基因突变相关的早发性家族性AD占全部病例的不到5％，而95％的散发性或晚发性AD的病因学尚不清楚1。AD的病理学特征是AD患者脑中细胞内神经原纤维缠结(NFT)以及细胞外老年斑的累积。老年斑以β-淀粉样肽(Aβ)为主要组分，而NFT以异常的纤维状形式的微管相关蛋白tau为主要组分2。认为Aβ的累积以及NFT表明神经元功能障碍以及即将发生的神经元死亡。
在人AD患者中一致地观测到线粒体功能障碍和能量代谢缺陷3，4。Aβ和tau病理学与AD中的线粒体功能障碍密切相关。Aβ和tau直接影响线粒体功能，导致ATP生产损害、活性氧(ROS)生产增加、氧消耗降低以及线粒体复合物I和复合物IV功能降低5。发现线粒体功能障碍是AD的早期事件。在散发性AD的情况中，显示氧化应激随年龄增长而逐渐增加导致Aβ沉积和NFT形成6。这可导致事件的连续循环，其中Aβ和tau加剧线粒体功能障碍，从而导致快速进展的AD症状。因此，旨在在衰老人群中恢复线粒体功能或保护线粒体免受Aβ诱导的损伤或补充线粒体数量和功能的治疗努力是鉴别AD治疗剂的有希望的途径。
秀丽隐杆线虫作为充分准备的模型在与AD相关的发现中发挥重要作用。与AD的病因相关的基因的直系同源物(包括淀粉样前体蛋白(APP)和tau)在秀丽隐杆线虫中是保守的。通过引入AD中有关的人基因或突变，生成了许多AD蠕虫模型7-9。这些蠕虫模型表现出与AD相关的表型，包括淀粉样蛋白沉积、氧化应激增加以及进行性麻痹7-9。此外，与AD患者中观测到的相似，在秀丽隐杆线虫AD模型中发现了电子传递链功能损害和线粒体功能障碍10,11。此外，这些模型已被成功用于鉴别神经保护化合物9。
当今临床中使用的约三分之一的药物最初是分离自植物或微生物。尽管化合物的化学合成取代了制药工业成为鉴别新型疗法的来源，但生物勘探天然来源(如植物和微生物)继续作为治疗剂发挥重要作用。最近的研究已开始探索作为药物来源的人微生物组12。人体是良性的、共栖的、共生的和致病性的微生物社群(被统称为微生物组)的宿主。这些微生物可经由肠脑轴以及数种代谢物(例如GABA、谷氨酸盐/酯和血清素)的产生来调控宿主脑的功能和行为。
微生物组来源的代谢物信号转导的功能障碍可导致包括AD在内的神经紊乱13,14。总之，微生物组为挖掘将与AD有关的新型神经保护化合物或活性生物治疗药物提供了未开发的丰富资源。
本发明人开发了高通量筛选(HTS)测定以快速地优先确定“单一”微生物种类，以使用秀丽隐杆线虫全动物模型系统鉴别基于微生物组的AD疗法。在所有神经元中表达与AD有关的人致病性Aβ或tau的转基因品系中，发现许多组织(包括肠道)中线粒体未折叠蛋白反应开启(通过(UPRmt)报告子构建体phsp-6::gfp进行评估，图11和图12)。hsp-6编码线粒体基质伴侣HSP70，其可响应于受损的线粒体结构或功能而被特异性上调15，并且可使用phsp-6::gfp品系(其中hsp-6基因的启动子标记有GFP)进行评估。这些数据与先前的研究一致，所述研究显示了秀丽隐杆线虫中Aβ的表达导致异常线粒体的累积16以及包括hsp-6在内的Aβ诱导的线粒体应激基因的肌肉特异性表达11。使用神经元特异性(unc-119)启动子的神经元中Aβ或tau的表达主要在肠道中诱导线粒体应激报告子表达(UPRmt)(图11和图12)，此反应本质上是细胞非自主性的。同样，其它实验室也观测到UPRmt的神经元至肠道的细胞非自主性诱导，并提出在秀丽隐杆线虫中通过神经肽和血清素信号转导途径发挥作用17-19。
有趣的是，血清素信号转导的调控被认为是AD中认知症状的潜在对症治疗20,21。为确定UPRmt的激活是否为Aβ聚集体的直接结果，将表达Aβ和phsp-6::gfp报告子的转基因蠕虫用硫黄素T(结合淀粉样原纤维的黄酮类)处理，其显示在体内Aβ聚集减少并挽救麻痹表型22。发现在用经硫黄素T处理的蠕虫中，UPRmt的诱导减少，表明UPRmt的诱导直接归因于Aβ聚集。因此，可能筛选出将通过调控Aβ聚集或Aβ对线粒体的毒性来减少UPRmt诱导的干预措施。
为进行筛选，将30种微生物菌株(包括阴性对照细菌大肠杆菌OP50)在适当的培养基条件中生长，并将其点样至标准线虫类生长培养基板上。将～30只在泛神经元中表达Aβ1-42或tau的同步化L1-幼虫阶段转基因蠕虫滴至接种的板上，并在4天后在荧光显微镜下对phsp-6::gfp表达的变化进行可视化评分(图13)。为使蠕虫同步化，使用一种漂白预备方法，该方法还创建了用单一培养(monocultures)饲养的无菌动物。本发明人筛选了phsp-6::gfp报告子表达的变化，并发现用葡糖杆菌EBT 405细菌饲养的蠕虫显示出由Aβ1-42表达或转基因tau诱导的phsp-6::gfp表达显著降低(图11和图12)。
为评价体内Aβ聚集状态，使用了在体壁肌肉中表达缀合的人Aβ3-42的转基因品系23；在此模型上测试了EBT405细菌，并发现与用阴性对照细菌饲养的转基因蠕虫相比，Aβ沉积显著减少(图14)。此品系将用于Aβ沉积减少的HTS筛查的命中进行测试。
为评价葡糖杆菌EBT 405阻抑Aβ诱导的麻痹表型的能力，本发明人使用了在体壁肌肉细胞中表达全长人Aβ1-42肽的品系24。将L4或年轻成年动物从20℃转移至25℃导致用对照细菌饲养的蠕虫麻痹，而用葡糖杆菌EBT 405饲养的蠕虫中的麻痹发作时间显著延迟。
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Claims (94)

1.一种组合物，所述组合物包含测定量的一种或多种细菌，所述细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述细菌来自醋杆菌科。
3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述细菌为Gluconobacter spp.、Acetobacterspp.、Gluconoacaetobacter spp.、Acidomonas spp.、Ameyamaea spp.、Asaia spp.、Granulibacter spp.、Kozakia spp.、Neoasaia spp.、Neokomagataea spp.、Saccharibacter spp.、Swaminathania spp.或Tanticharoenia spp.。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述核酸序列中的一种或多种为外源性核酸序列。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中，所述细菌包含并表达编码以下每种的核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中，所述测定量的一种或多种细菌为冻干的细菌。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中，所述测定量为当给予有需要的受试者时有效诱导人细胞中线粒体转录因子A(TFAM)或过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(PGC)的表达和/或活性的量。
8.如权利要求7所述的组合物，其中，所述有效诱导人细胞中TFAM或PGC的表达和/或活性的量为至少1×106个细菌。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含选自于由以下所组成的组中的一种或多种添加的细菌代谢物：葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中，所述细菌是活的、减毒的或热灭活的。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中，将所述组合物配制为食品、饮料、饲料组合物、益生菌、营养补充剂或药物组合物。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含益生元。
13.如权利要求12所述的组合物，其中，所述益生元包括低聚果糖、菊粉、低聚异麦芽糖、lactilol、lactosucrose、乳果糖、大豆寡糖、反式低聚半乳糖或低聚木糖。
14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中，将所述组合物配制用于口服给予。
16.如权利要求15所述的组合物，其中，所述组合物为肠溶包衣制剂。
17.一种组合物，所述组合物包含治疗有效量的提取物或级分，所述提取物或级分来源于至少一种细菌，所述细菌包含并表达编码选自于由以下所组成的组中的酶的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
18.如权利要求17所述的组合物，其中，所述至少一种细菌包含并表达以下酶的每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
19.如权利要求18所述的组合物，其中，所述提取物或级分包含选自于葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸的一种或多种代谢物。
20.如权利要求17、18或19所述的组合物，其中，所述提取物或级分来自培养基中培养的细菌细胞，所述培养基包含：
(i)含有1％葡萄糖的标准溶原性肉汤(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化钠)；
(ii)标准Hestrin-Schramm肉汤(2％D-葡萄糖、0.5％酵母提取物、0.5％蛋白胨、0.27％磷酸氢二钠、0.115％柠檬酸)；或
(iii)含有8％葡萄糖、0.5％酵母提取物、0.2％甘露醇、0.05％硫酸镁和10％碳酸钙的CaCO3培养基。
21.如权利要求17-20中任一项所述的组合物，其中，所述提取物或级分包含代谢物或细菌副产物，所述代谢物或细菌副产物促进给予所述组合物的宿主哺乳动物的至少一种细胞类型中的ATP生产。
22.如权利要求17-21中任一项所述的组合物，其中，所述提取物或级分不包含活的细菌细胞。
23.如权利要求17-22中任一项所述的组合物，其中，所述提取物或级分缺乏可检测的细菌。
24.如权利要求17-23中任一项所述的组合物，其中，所述提取物或级分进一步包含减毒的或热灭活的细菌。
25.如权利要求17-24中任一项所述的组合物，其中，所述细菌来自醋杆菌科。
26.如权利要求25所述的组合物，其中，所述细菌为Gluconobacter spp.、Acetobacterspp.、Gluconoacaetobacter spp.、Acidomonas spp.、Ameyamaea spp.、Asaia spp.、Granulibacter spp.、Kozakia spp.、Neoasaia spp.、Neokomagataea spp.、Saccharibacter spp.、Swaminathania spp.或Tanticharoenia spp.。
27.如权利要求17-26中任一项所述的组合物，其中，所述核酸序列中的一种或多种为外源性核酸序列。
28.如权利要求17-27中任一项所述的组合物，其中，将所述组合物配制为食品、饮料、饲料组合物、营养补充剂或药物组合物。
29.如权利要求17-28中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
30.如权利要求17-29中任一项所述的组合物，其中，将所述组合物配制用于口服给予。
31.一种用于增加有需要的受试者的至少一种细胞类型中的细胞ATP生产的方法，所述方法包括向所述受试者给予组合物，所述组合物包含有效增加至少一种细胞类型中的细胞ATP生产的量的至少一种非致病性细菌或其提取物或级分，所述非致病性细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
32.如权利要求31所述的方法，其中，所述至少一种细菌表达以下每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
33.如权利要求31或32所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
34.如权利要求31、32或33所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
35.如权利要求31-34中任一项所述的方法，其中，所述核酸序列中的一种或多种对所述细菌而言是外源性的。
36.如权利要求31-35中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种细胞类型中的线粒体电子传递链的复合物I和/或复合物II的活性增加。
37.如权利要求31-36中任一项所述的方法，其中，所述给予使线粒体膜电位增加。
38.如权利要求31-37中任一项所述的方法，其中，所述受试者为人。
39.如权利要求31-38中任一项所述的方法，其中，过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子l-α(PGC-lα)和/或线粒体转录因子A(TFAM)的表达增加。
40.如权利要求31-39中任一项所述的方法，其中，AMP激活的蛋白激酶(AMPK)磷酸化水平、核呼吸因子-2(Nrf2)蛋白水平、PGCαmRNA水平、TFAM mRNA水平和/或线粒体DNA复制增加。
41.如权利要求31-40中任一项所述的方法，其中，使线粒体DNA拷贝数(mtDNA)增加。
42.如权利要求31-41中任一项所述的方法，其中，所述方法使携带线粒体呼吸复合物INADH:泛醌还原酶的突变的受试者的发育生长速度增加。
43.如权利要求31-42中任一项所述的方法，其中，使至少一种线粒体β-氧化的酶的表达增加。
44.如权利要求31-43中任一项所述的方法，其中，所述至少一种线粒体β-氧化的酶为B0303.3、cpt-2、cpt-1、ech-1.2或acdh-7。
45.如权利要求31-44中任一项所述的方法，其中，使所述受试者的寿命增加。
46.如权利要求31-45中任一项所述的方法，其中，维持或增加线粒体生物发生。
47.如权利要求31-46中任一项所述的方法，其中，与给予所述组合物前的细胞ATP生产相比，细胞ATP生产增加至少10％。
48.一种用于制造细菌提取物的方法，所述方法包括在培养基中对至少一种细菌进行培养，所述细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II，所述培养基包含：
(i)含有1％葡萄糖的标准溶原性肉汤(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化钠)；
(ii)标准Hestrin-Schramm肉汤(2％D-葡萄糖、0.5％酵母提取物、0.5％蛋白胨、0.27％磷酸氢二钠、0.115％柠檬酸)；或
(iii)含有8％葡萄糖、0.5％酵母提取物、0.2％甘露醇、0.05％硫酸镁和10％碳酸钙的CaCO3培养基。
49.如权利要求48所述的方法，其中，所述至少一种细菌包含并表达编码以下每种的核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
50.如权利要求48或49所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
51.一种组合物，所述组合物包含有效增加给予所述组合物的宿主哺乳动物的至少一种细胞类型中的细胞ATP生产的量的葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
52.一种组合物，所述组合物包含有效增加给予所述组合物的人受试者的至少一种细胞类型中的线粒体转录因子A(TFAM)或过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(PGC)的表达和/或活性的量的葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
53.如权利要求51或52所述的组合物，其中，所述组合物包含细菌提取物或其活性级分。
54.如权利要求51或52所述的组合物，其中，
(i)将所述组合物配制为食品、饮料、饲料组合物、营养补充剂或药物组合物；和/或
(ii)所述组合物包含以下每种：葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
55.一种治疗帕金森氏病的方法，所述方法包括向患有帕金森氏病的受试者给予含有治疗有效量的至少一种细菌或其提取物或级分的组合物，从而减轻帕金森氏病的至少一种症状，所述细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
56.如权利要求55所述的方法，其中，所述至少一种细菌表达以下每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
57.如权利要求55或56所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
58.如权利要求55-58中任一项所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
59.如权利要求55-59中任一项所述的方法，其中，所述至少一种症状选自于由以下所组成的组：震颤、睡眠障碍、活动能力损害、不自主运动、肌强直、节律性肌肉收缩、身体运动缓慢、缓慢的曳行步态、疲劳、头晕、平衡受损、躁动、遗忘、精神混乱、痴呆、认知损害、言语受损、焦虑、情感淡漠、嗅觉失真或丧失、尿失禁、面部表情减少、重量减轻以及便秘。
60.一种治疗线粒体电子传递链紊乱的方法，所述方法包括向具有线粒体电子传递链紊乱的受试者给予含有治疗有效量的至少一种细菌或其提取物或级分的组合物，从而减轻所述线粒体电子传递链紊乱的至少一种症状，所述细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
61.如权利要求61所述的方法，其中，所述线粒体电子传递链紊乱包括复合物I和/或复合物II的活性受损或紊乱。
62.如权利要求61或62所述的方法，其中，所述线粒体电子传递链紊乱为NADH脱氢酶(NADH-CoQ还原酶)缺陷、琥珀酸脱氢酶缺陷、Leigh病、线粒体DNA耗竭或线粒体机能不全。
63.如权利要求61-63中任一项所述的方法，其中，所述至少一种症状选自于由以下所组成的组：肌病、线粒体脑肌病、发育停滞、发育迟缓、张力减退、嗜睡、呼吸衰竭、共济失调、肌阵挛、乳酸酸中毒、癫痫发作、疲劳、眼球震颤、反射不良、进食或吞咽困难、呼吸困难、共济失调、先天性肌病、婴儿肌病以及肝病。
64.如权利要求61-64中任一项所述的方法，其中，所述至少一种细菌表达以下每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
65.如权利要求61-65中任一项所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
66.如权利要求61-66中任一项所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
67.一种治疗过氧化物酶体紊乱的方法，所述方法包括向具有过氧化物酶体紊乱的受试者给予含有治疗有效量的至少一种细菌或其细菌提取物的组合物，从而减轻所述过氧化物酶体紊乱的至少一种症状，所述细菌包含一种或多种核酸序列以使得所述细菌表达下列酶：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
68.如权利要求68所述的方法，其中，所述过氧化物酶体紊乱为Zellweger综合征谱系(PBD-ZSD)或肢近端型点状软骨发育不良1型(RCDP1)。
69.如权利要求68或69所述的方法，其中，所述PBD-ZSD为婴儿Refsum病、新生儿肾上腺脑白质营养不良或Zellweger综合征。
70.如权利要求68、69或70所述的方法，其中，所述至少一种症状选自于由以下所组成的组：骨骼和颅面畸形、肝功能障碍、进行性感觉神经性听力损失以及视网膜病变。
71.如权利要求68-71中任一项所述的方法，其中，所述至少一种细菌表达以下每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
72.如权利要求68-72中任一项所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
73.如权利要求68-73中任一项所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
74.一种用于增加细胞线粒体或过氧化物酶体的生物发生的方法，所述方法包括向受试者给予含有有效增加细胞线粒体或过氧化物酶体的生物发生的量的至少一种细菌或其级分或提取物的组合物，所述细菌包含并表达编码以下的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
75.如权利要求75所述的方法，其中，使过氧化物酶体的尺寸和/或数量增加。
76.如权利要求75或76所述的方法，其中，使线粒体活性增加。
77.如权利要求75所述的方法，其中，所述至少一种细菌表达编码以下的每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
78.如权利要求75-78中任一项所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
79.如权利要求75-79中任一项所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
80.一种治疗阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括向患有阿尔茨海默氏病的受试者给予含有治疗有效量的至少一种细菌或其提取物或级分的组合物，从而减轻阿尔茨海默氏病的至少一种症状，所述细菌包含并表达编码以下一种或多种的一种或多种核酸序列：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
81.如权利要求81所述的方法，其中，所述至少一种细菌表达以下每种：膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(mGDH)、泛醇-细胞色素c还原酶铁硫亚基、TonB依赖型受体、碳氮水解酶和泛醇氧化酶亚基II。
82.如权利要求81或82所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的一种或多种。
83.如权利要求81、82或83所述的方法，其中，所述至少一种细菌产生葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸中的每种。
84.如权利要求81-84中任一项所述的方法，其中，所述至少一种症状选自于由以下所组成的组：认知减退、精神混乱、妄想、定向障碍、健忘、难以集中精神、无法生成新的记忆、无法做简单的数学、无法识别常见物品、攻击性、烦躁、易怒、无意义地重复自己的话、人格改变、躁动、缺乏约束、神志恍惚、愤怒、情感淡漠、普遍的不满、孤独、情绪波动、抑郁、幻觉、偏执、食欲不振、无法组合肌肉运动以及言语混乱。
85.组合物在治疗帕金森氏病或阿尔茨海默氏病中的用途，所述组合物包含葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
86.如权利要求1或权利要求17所述的组合物在帕金森氏病或阿尔茨海默氏病的治疗中的用途。
87.组合物在增加细胞ATP生产中的用途，所述组合物包含葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
88.如权利要求1或权利要求17所述的组合物在增加细胞ATP生产中的用途。
89.组合物在治疗线粒体电子传递链紊乱或过氧化物酶体紊乱中的用途，所述组合物包含葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
90.如权利要求1或权利要求17所述的组合物在线粒体电子传递链紊乱或过氧化物酶体紊乱的治疗中的用途。
91.组合物在增加线粒体或过氧化物酶体的细胞生物发生中的用途，所述组合物包含葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
92.如权利要求1或权利要求17所述的组合物在增加线粒体或过氧化物酶体的细胞生物发生中的用途。
93.组合物在增加TFAM或过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(PGC-1)的表达和/或活性中的用途，所述组合物包含葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸和/或2,5-二酮-D-葡萄糖酸。
94.如权利要求1或权利要求17所述的组合物在增加TFAM或过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(PGC-1)的表达和/或活性中的用途。
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